PT1341813E - Utilização de l- carnitina como agente estabilizador de proteínas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE L-CARNITINA COMO AGENTE ESTABILIZADOR DE PROTEÍNAS" A presente invenção refere-se ao campo técnico das proteínas estabilizadoras, em particular, aos aspectos terapêuticos da estabilização de proteínas.

Antecedentes da invenção

Na produção de proteínas e polipéptidos, tanto por extracção ou por técnicas de biotecnologia recombinantes, existe o problema de manutenção da conformação correcta da proteína, de modo a manter a sua actividade desejada. A não conformação ou as conformações incorrectas ou de outro modo modificadas podem ocorrer devido à manipulação técnica ou ao sistema de processamento geral para a produção das proteínas.

Outro problema no processamento de material proteináceo é dado pela agregação de proteínas. São apresentadas muitas soluções no estado da técnica. Algumas delas são peculiarmente guímicas, significando isto que são utilizados reagentes químicos, tais como, por exemplo, misturas particulares de sais, mesmo em soluções tampão. 1 0 documento US 5728804, da Research Corporation Technologies, divulga um método para a renaturação de proteínas por intermédio de ciclodextrinas isentas de detergente. O documento US 5563057, para Wisconsin Alumni Research Foundation, para além da ciclodextrina ensina a utilização de determinados detergentes para a reconformação ("refolding") de enzimas mal enroladas. O documento US 5874075, de Amgen, divulga complexos de proteína:fosfolípidos úteis para a estabilização de proteínas contra a agregação induzida termicamente, desnaturação e perda de actividade. O documento US 5.756.672, para Genentech, fornece uma composição compreendendo um polipéptido num determinado tampão, sendo o citado tampão apropriado para a reconformação de polipéptidos enrolados inadequadamente. Uma forma de realização particular é dada para a reconformação de factor de crescimento I de tipo insulina mal enrolado.

Os métodos mencionados anteriormente podem ser convenientes, dado que são utilizados químicos facilmente disponíveis, podem levantar alguns objecções para determinados químicos utilizados, por exemplo, os sais de cobre ou manganês (documento US 5756672). A reconformação também ocorre através de técnicas cromatográficas, ver Altamirano M.M. et al., Nat. Biotechnol. Fev. 1999; 17 (2):187-91. A descoberta de chaperoninas abriu um novo campo para a tecnologia de processamento de proteínas. 2

As chaperoninas, também conhecidas por proteínas de choque térmico ou HSP, são proteínas naturais que exercem um papel biológico na conformação de proteínas. Ver, para um estudo mais aprofundado http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/000021015h.htm por Julia C. Ranford, Anthony R.M. Coates e Brian Handerson.

Tecnicamente, as chaperoninas são estudadas intensivamente, como meio para fazer face ao problema anteriormente mencionado de estabilização e reconformação de proteínas.

Esta procura conduz às chaperoninas recentemente descobertas e à sua utilização para a estabilização de proteínas, ver por exemplo, o documento US 5428131, da Universidade de Yale. Para uma ideia sobre chaperoninas para o problema técnico enfrentado pela presente invenção ver, por exemplo, o documento US 5688651, da Universidade de RAMOT; documento US 5646249, do Departamento de Saúde dos E.U.; documento US 5561221, da Nippon Oil Company Limited, documento WO 00/20606, de Reiman e Schirmbeck, documento JP 11266865, de Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK, documento WO 99/40435, de Netzer; documento JP 10327869, de Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK; documento WO 00/71723, de Roche Diagnostics; documento WO 00/55183 e WO 99/05163, da Medicai Research Council.

As chaperoninas são uma ferramenta útil para a estabilização e reconformação de proteínas, mas decorrem alguns inconvenientes técnicos da sua utilização. Apesar de serem proteínas, são propensas à alteração, tal como a térmica, pelo que também necessitam de algum factor protector.

Para o campo técnico de estabilização de proteínas, este problema é também muito importante para a preparação de vacinas de HSP contra o cancro. Observou-se que a imunogenicidade de um 3 dado antigénio é tornada muito mais eficaz quando é apresentado a células imunitárias num complexo com HSP (Requena JM et al., Arspharm 1997, 38 (23): 191-208; Castellino, F. et al., J Exp Med 2000, 191 (11):1957- 1964). Particularmente, a resposta imunitária ao cancro é estimulada com HSP (i. e., HSP70 ou gp96), que estão ligadas a um péptido antigénico ("padrões antigénicos específicos"), as quais são obtidas a partir de células cancerosas do doente (Yedavelli Sp et al. Int J Mol Med 1999, 4(3):243-248). É, em consequência, importante ter HSP estáveis e/ou bem conservadas para vacinas contra o cancro.

De modo interessante, algumas chaperoninas, tais como as proteínas alfa-cristalinas do cristalino ocular, são membros da familia das pequenas proteínas de choque térmico (sHSP). As sHSP têm mostrado que funcionam num determinado número de diferentes processos, desde a estabilização do ARN à inibição da elastase e interacção como o citoesqueleto. A alfaA-cristalina está principalmente localizada no cristalino, com níveis muito baixos encontrados noutros tecidos, enquanto a alfaB-cristalina é actualmente conhecida como sendo essencialmente ubíqua através de todo o corpo (Haley DA et ai., J Mol Biol 1998, 277:27-35). A importância biológica da alfaB-cristalina é relevada pelos seus níveis elevados em corações isquémicos e em cérebros de doentes com esclerose múltipla, doença de Alzheimer e outras doenças neurológicas. Consistente com a sua classificação como uma HSP, a expressão da alfaB-cristalina tem mostrado ser induzida por uma variedade de stresses fisiológicas, incluindo calor, stresse osmótico e toxicidade de metais. A importância biológica da alfaA-cristalina no cristalino é relevada pela sua supressão eficaz da agregação não controlada de proteínas danificadas. 4

Swamy-Mruthinti et al. (FASEB Journal, vol. 14, n° 4, 15 Março de 2000, página A504) relatam a inibição da glicação e de alterações mediadas por glicação pela L-carnitina em cristalinos de ratos diabéticos, sugerindo uma utilização terapêutica potencial da L-carnitina no tratamento de complicações oculares diabéticas.

Peluso et al. (Journal of Cellular Biochemistry, 80:1-10 (2000)) divulga o papel metabólico da L-carnitina como osmólito.

Como é visivel dos exemplos anteriores, a estabilização de chaperoninas é muito importante no campo da medicina, quer para a sua utilização ou para estabilizá-las naqueles estados patológicos em que estão alteradas.

Resumo da invenção

Verificou-se agora que a L-carnitina possui um efeito surpreendente na estabilização de proteínas e, num aspecto particularmente favorável para o campo da medicina, a L-carnitina possui um efeito surpreendente na protecção da actividade de chaperonas, sendo esta actividade protectora exercida através de um efeito estabilizante pela L-carnitina dirigida à actividade de chaperonas.

Em consequência, constitui um objectivo da presente invenção a utilização da L-carnitina ou de um sal desta, na estabilização de proteínas, em particular, como factor auxiliar na protecção da actividade de chaperonas.

De acordo com a presente invenção, a L-carnitina é utilizada para preservar a actividade da proteína chaperona 5 alterada, alfa-cristalina, em particular alfa A- ou alfa B-cristalina, como mencionado nas reivindicações. 0 objectivo anterior da presente invenção será ilustrado em pormenor por intermédio de exemplos.

Descrição pormenorizada da invenção

Por sal farmaceuticamente aceitável da L-carnitina, pretende-se designar qualquer sal, orgânico e inorgânico, apropriado para utilização no campo da medicina, humana e veterinária. No campo geral da estabilização de proteínas, pode ser utilizado qualquer sal, com a condição de que seja compatível com a aplicação específica.

Os exemplos de sais farmacologicamente aceitáveis de L-carnitina, apesar de não exclusivamente estes, são cloreto; brometo; iodeto; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartarato; tartarato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato; fumarato ácido; glicerofosfato; glucose fosfato; lactato; maleato; maleato ácido; mucato; orotato, oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metanossulfonato; pamoato e pamoato ácido.

Descrição pormenorizada da forma de realização preferida 0 cristalino ocular é um órgão transparente constituído por uma matriz altamente concentrada e altamente ordenada de proteínas estruturais, designadas por "cristalinas", que são provavelmente as proteínas de vida mais longa do corpo (Wistow, G. e Piatigorsky, J. (1988), Ann. Rev. Biochem, 57, 479-504; 6

Blomendal, Η: (1982) Biochem. 12, 1-38; Bettelheim, F.A. (1985) The Ocular Lens. Structure, Function, and Pathology, (ed. Maisel H.) pp. 265-300, Mareei Dekker, Inc, Nova Iorque; Tardieu, A., e Delay, M. (1988), Ann. Rev. Biophys. Chem. 17, 47-70).

As modificações pós-translacionais da proteina do cristalino, consequentes ao envelhecimento ou doenças tais como a diabetes, podem resultar em alterações não conformacionais e agregação destas proteínas, e conduzir à opacificação do cristalino e formação de catarata (Harding, D. (1981), Molecular and Cellular Biology of the Eye Lens (ed. Bloemendal, H.) pp. 327-365, John Wiley and Sons, Nova Iorque). Apesar dos mecanismos de cataratogénese não estarem bem compreendidos, a oxidação das proteínas do cristalino está associada à catarata em mamíferos (Francis, P.J. (1999), Trends in Genetics 15, 191-196) . O cristalino sofre um grande stresse oxidativo devido a estar constantemente exposto à luz e oxidantes (Varma, S.D., et al. (1984), Curr Eye Res 3, 35-57, Spector, A. (1995), FASEB J. 9, 1173-1182; Taylor, A. e Davies, KJ. (1987), Free Radie Biol

Med 3, 371-377; Zigman, S. (1981), Mechanisms of Cataract

Formation in the Human Lens (ed. Ducan G) pp. 117-149, Academic press, Nova Iorque; I. Dillon, J. (1985), The Ocular Lens. Structure, function, and Pathology, ed. Maisel H., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 349-366; Zigman, S. (1985), The Ocular Lens. Structure, Function and Pathology. (ed. Maisel H.) pp. 301-347 Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque). As modificações oxidativas incluem a oxidação selectiva de aminoácidos específicos, que resulta em alterações de cargas, degradação de proteínas, reticulação e insolubilização de proteínas e fluorescência acrescida de não triptofanos (Spector, A., e Gamer, W.H. (1981), Exp Eye Res. 33, 673-681; Andley, U.P. 7 (1987), Photochem. Photobiol. 46, 1057-1066; Davies, K.J.A., et al. (1987), J Biol Chem. 262, 9914-9920; Augusteyn, R.C. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (ed. Ducan, G.) pp. 72-115, Academic Press, Londres; Zigler, J.S. Jr et al. (1989) , Free Radie Biol Med. 7, 499-505) . Consequentemente, o cristalino desenvolveu sistemas anti-oxidantes e mecanismos de reparação para neutralizar o efeito de oxidantes. A primeira linha de defesa contra o stresse da oxidação é constituída por anti-oxidantes de captura de radicais, que reduzem o insulto oxidativo. Por exemplo, glutationa (GSH) e taurino, que estão ambos altamente representados no tecido do cristalino, exercem efeitos protectores num modelo in vitro de catarata diabética (Richard, R.C. et al. (1998), Proc Soc Exp Biol Med 217, 397- 407; Jones, R.A.V. e Hothersall, J.S. (1999), Exp Eye Res. 69, 291-300). Além disso, a α-cristalina, que constitui até 50% da massa de proteína total do cristalino dos mamíferos, actua como uma chaperona molecular que impede a agregação induzida termicamente de numerosas proteínas e é necessária para a renaturação de proteínas quimicamente desnaturadas (Jones, R.A.V. e Hothersall, J.S. (1999), Exp Eye Res. 69, 291-300). Um elemento-chave da função da α-cristalina é a sua capacidade para impedir associações aberrantes de proteínas, pela ligação a superfícies de proteínas hidrófobas expostas transitoriamente (van den Ussel P.R. et al. (1996), Ophthalmic Res. 28, 39-43).

Devido à α-cristalina impedir tanto a agregação in vitro de proteínas induzida por radiação ultravioleta e radicais livres (Groenen, P.J. et al. (1994) Eur. J Biochem. 225, 1-19; Andley, U.P. et al. (1998) J Biol Chem. 273, 31252-31261; Lee, J.S. et al. (1997) J Protein Chem. 16, 283-289; Kramps, J.A. et al. (1978), Biochem Biophys Acta 533, 487-495; Van Kleef, F.S.M., et al. (1976), Eur J Biochem 66, 477-483; Smulders, R.H.P.H. et al. 8 (1996), J Biol Chem 271, 2 90 60-2 90 66), pode também proteger as proteínas do cristalino de alterações foto-oxidativas in vivo. A Patente US N° 5037851, emitida a 06.08.1991, com uma reivindicação de prioridade de 15.11.1988 em nome do mesmo titular da presente invenção, reivindica um método terapêutico para o tratamento da catarata, que compreende a administração por via oral ou parentérica, a um indivíduo possuindo uma catarata, de 1000 a 2000 mg/dia de acetil-D-carnitina ou uma quantidade equivalente de um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis. O ensinamento desta patente é limitado à acetil-D-carnitina . O presente inventor e colegas mostraram anteriormente que na diabetes animal experimentais, a diminuição na carnitina do cristalino, uma molécula ubíqua envolvida em muitas vias biológicas, é um evento precoce importante e selectivo, relacionado possivelmente à formação da catarata (Pessotto P., et al. (1997) Exp. Eye Res. 64,195-201). Neste artigo, é divulgado como, nos estados diabéticos, existe uma perda de L-carnitina no cristalino e os níveis de carnitina nos restantes tecidos oculares parecem substancialmente não afectados. Os autores concluem que o papel da L-carnitina no cristalino não está ainda claro, mas a sua perda pode estar relacionada com a ocorrência da catarata. Existe uma forte sugestão nesta referência para se utilizar acetil-carnitina, dando uma boa razão para expectativa de sucesso para a prevenção da ocorrência da catarata por uma acção farmacológica, tal como foi mostrado para a aspirina. A razão para uma expectativa de uma acção favorável pela acetil-carnitina, à luz da acção bem conhecida da aspirina, é que ambos os compostos possuem propriedades acetilantes que, por sua vez, são responsáveis pela protecção das proteínas do cristalino. 9

Além da sua função principal como transportador de ácidos gordos de cadeia longa desde o citoplasma para os sítios de β-oxidação, foi previsto que a L-carnitina possa também servir para manter a homeostase celular.

Swamy-Mruthinti, S. e Cárter, A.L. (1999), Exp Eye Res 69, 109-115 demonstraram que a L-carnitina resulta ineficaz na glicação in vitro dos cristalinos oculares, enquanto a acetil-L-carnitina e o ácido acetilsalicílico diminuíram a glicação de cristalino. Estas considerações explicam porque os níveis de L-carnitina em vários tecidos animais não se correlacionam invariavelmente com os requisitos de energia dos tecidos ou com o metabolismo lipídico. Por exemplo, o cristalino ocular, um tecido não vascularizado cuja principal fonte de energia é a glucose absorvida dos fluidos oculares, possui concentrações de L-carnitina mais elevadas do que outros compartimentos do olho (Pessotto, P. et al. (1994) J Ocul. Pharmacol. 10, 643-651).

Pretende-se utilizar a L-carnitina e os seus sais farmacologicamente aceitáveis para produzir uma composição farmacêutica oftálmica para o tratamento terapêutico da catarata, em particular, a catarata de origem não diabética. Na prática, uma quantidade terapeuticamente eficaz de L-carnitina ou uma quantidade equivalente de um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis é administrada ao olho, compreendendo opcionalmente um outro ingrediente activo útil para o tratamento da catarata de origem não diabética.

De uma forma preferida, a composição está sob a forma de um colírio. O colírio é aplicado na extensão da necessidade terapêutica, como determinado pelo especialista e dependendo do estado do doente, da severidade da enfermidade e de qualquer 10 outro factor considerado pelo especialista. Por exemplo, 2-3 gotas 3-4 vezes ao dia, pode ser apropriado.

As composições para o colírio compreendem a solução isotónica estéril usual. A escolha dos excipientes apropriados está dentro das capacidades de um especialista em tecnologia farmacêutica. Por exemplo, é feita a utilização de excipientes, tais como o cloreto de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de potássio monobásico, cloreto de benzalcónio e álcool etílico. A composição é levada ao volume correcto com água destilada.

EXEMPLO

Materiais e Métodos

Cultura de órgãos de cristalino

Anestesiaram-se ratos Sprague-Dawley de quatro meses de idade com 5 mg/kg de xilazina e 65 mg/kg de cetamina, e decapitaram-se. Imediatamente de seguida, os olhos foram enucleados, extraídos e colocados em 2 mL de meio TC-199 modificado. A integridade do cristalino foi avaliada pela medição da proteína lixiviada no meio após 30-60 min. de cultura; os cristalinos danificados foram descartados. Um cristalino de cada par foi colocado em meio de cultura sem H202 e utilizado como controlo. Após 24 h de cultura, os cristalinos de controlo não diferiam dos cristalinos recentemente enucleados, para qualquer dos parâmetros avaliados neste estudo. O cristalino contralateral de cada par foi colocado em meio e, após equilíbrio sob 5% de C02 a 37 °C, foi exposto a 500 μΜ de H202 na ausência ou presença de 300 μΜ de L-carnitina. Após 24 h de incubação, registaram-se as características e alterações 11 morfológicas e fotografaram-se os cristalinos. Os cristalinos incubados foram enxaguados com solução salina, transferidos para papel de filtro, pesados e, em seguida, imediatamente processados, para análise bioquímica. Para determinar a fuga de lactato desidrogenase (LDH), incubaram-se os cristalinos individualmente em cada meio diferente, e o meio foi recolhido diariamente e guardado, para análise de LDH.

Extracção de proteínas do cristalino

Os cristalinos desencapsulados foram homogeneizados com almofarizes descartáveis e, em seguida, sonificados em tampão de extracção (20 mM de HEPES, 0,2 mM de EDTA, 0,5 mM de ditiotreitol, 450 mM de NaCl, 25% de glicerol, 0,5 μΜ/mL de leupeptina, 0,5 yg/mL de protinina, 0,5 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo) em gelo. Removeram-se alíquotas do homogenato de cada um dos cristalinos incubados, para análise de GSH e L-carnitina. O restante foi centrifugado durante 25 min. a 20.000 x g, para separar o sobrenadante do sedimento. O sedimento foi lavado com 1,0 mL de tampão e seco sob azoto. Esta fracção foi designada por "fracção insolúvel em água". A fracção sobrenadante foi separada por diálise duas vezes contra 3 mL de 0,025 mol/L de tampão de fosfato, pH 7,4, durante 48 h e liofilizada. Esta fracção foi designada por "fracção solúvel em água". Os lípidos foram removidos das fracções solúveis em água e insolúveis em água com 3,0 mL de clorofórmio :metanol (2:1) durante 16 h sob agitação, seguida por centrifugação a 2.000 x g durante 5 min.

Após o solvente orgânico ser descartado, o resíduo foi tratado com 2,0 mL de éter dietílico, deixado em repouso durante 12 5 min. e, em seguida, centrifugado a 2.000 x g durante 5 min. O sedimento foi seco sob ar e armazenado a 4 °C num excicador.

Preparação de cristalinas

As fracções de cristalinas solúveis em água foram isoladas por cromatografia de permeação em gel Sephacryl S-300-HR preparativa, como descrito anteriormente (Smulders, R.H.P.H. et al. (1996), J Biol Chem 271, 29060-29066; de Jong, et al. (1974), Eur J Biochem. 48, 271-276). De modo breve, a proteína solúvel foi aplicada a uma coluna de 100 x 1,5 cm e revelada isocraticamente com tampão de fosfato. As fracções totais dos cristalinos de controlo e dos tratados com H202±L-carnitina foram concentrados por ultrafiltração num aparelho Diaflo e a sua pureza foi verificada por SDS-PAGE, efectuada de acordo com Laemmli, através da utilização de um Sistema Mini Protean II da Bio-Rad. As concentrações de proteína foram medidas com um estojo de ensaio de proteínas Bradford (Bio-Rad).

Transferências de Western O homogenato de cristalino total foi aplicado em géis de dodecil-sulfato de sódio (SDS) em gradientes de 4-20%, através da utilização de tampões de Tricine e, em seguida, transferido para membranas de difluoreto de polivinilideno. A transfarência de western foi realizada como descrito em qualquer outra parte (Kim, S.Y. et al. (1995), J Invest Dermatol 104, 211-217). A concentração de anticorpos foi de 5 yg/mL para o anticorpo primário (isopéptido anti-y-glutamil-e-lisina) e 0,1 yg/mL para o anticorpo secundário. A mancha foi em seguida revelada por quimioluminescência aumentada (Pierce, Milão, Itália). 13

Subsequentemente, as bandas de peso molecular muito elevado foram cortadas, eluídas em tampão de SDS contendo Tricine, livre de SDS por extracção por pares iónicos (Konigsberg, W.H. e Henderson, L. (1983) Proc Natl Acad Sei USA. 80, 2467-2471) e submetida a análise de aminoácidos.

Medição de reticulações de isopéptidos em proteínas insolúveis em água

Suspenderam-se as proteínas insolúveis em água em 0,2 M de acetato de N-etilmorfolina (pH 8,1). Utilizou-se uma alíquota (10%) para quantificar a quantidade de proteína total. As amostras foram digeridas pela adição sequencial de enzimas proteolíticas (colagenase, pronase, aminopeptidase e carboxipeptidase A, carboxipeptidase B e carboxypeptidase y) , directamente à mistura reaccional a 37 °C, na presença de 0,02% de azida de sódio. Após digestão enzimática, a reticulação do (isopéptido N-(γ-glutamil)lisina foi revelada por HPLC e quantificada por análise de aminoácidos (Hohl, D. et al. (1991), J Biol Chem. 266, 6626-6636). Num conjunto relacionado de experiências, o teor em isopéptido dos cristalinos foi determinado sem extracção prévia.

Fluorescência do triptofano A perda de fluorescência do triptofano das proteínas, um indicador da oxidação do triptofano, aparenta ser um marcador da integridade do cristalino. Em consequência, mediu-se a fluorescência do triptofano no cristalino (espectrofotómetro Perkin-Elmer 650-40), de acordo com um método descrito anteriormente (Jones, R.H.V. e Hothersall, J.S. (1993), Exp Eye 14

Res 57, 783-790) . O comprimento de onde de excitação foi fixado para 295 nm, e a emissão de fluorescência detectada a 330 nm.

Avaliação da actividade molecular de chaperonas de a-cristalinas de cristalinos de rato de controlo e de tratados in vi tro

Realizaram-se as seguintes experiências essencialmente como descrito em qualquer outra parte (Horwitz, J. (1992) Proc Natl Acad Sei USA. 89, 10449-10453). A actividade do tipo chaperona da α-cristalina dos cristalinos de controlo e dos tratados com H202±L-carnitina foi determinada por estudos de desnaturação térmica. A extensão a que a preparação de α-cristalina não modificada ou modificada protegeu a BL-cristalina (utilizada como proteina alvo) da desnaturação e agregação induzidas termicamente foi avaliada como se segue: 100 yg ou 200 yg de α-cristalina foram adicionados a 200 yg de BL-cristalina numa cuveta de 1,5 mL e perfez-se para um volume final de 1 mL com 50 mM de tampão de fosfato, pH 7,0. A cuveta foi colocada num suporte celular de temperatura regulada, fixo a um espectrofotómetro de UV. A dispersão da luz devido à desnaturação e agregação das proteínas foi monitorizada a 360 nm de absorvância durante 3.000 s a 55 °C ou durante 1.800 s a 58 °C.

União de filamentos intermédios e ensaios de viscosidade envolvendo a-cristalinas O ensaio de sedimentação idealizado por Nicholl e Quinlan (Nicholl, I.D. e Quinlan, R.A. (1994), EMBO J 13, 945-953) foi utilizado para avaliar a inibição induzida pela α-cristalina da assemblagem de filamentos intermédios. Utilizou-se proteina 15 glial fibrilar acidica de porcino purificada (GFAP) para estes estudos; foi purificada a partir de medula espinal de porcino, por flotação axonal, como descrito anteriormente (Pemg, M.D. et al. (1999), J Cell Sei. 112, 2099-2112; MacLean-Fletcher, S. e

Pollard, T.D. (1980), Biochem Biophys Res Commun 96, 18-27). O ensaio de formação de gel foi baseado num método utilizado para monitorizar a actividade proteica de ligação da actina por viscosimetria de esfera descendente (Pemg, M. D. et al. (1999), J Cell Sei. 112, 2099-2112). As α-cristalinas foram misturadas com GFAP em 8 M de ureia, 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM de

EDTA, 25 mM de 2-mercaptoetanol e, em seguida, separada por diálise passo a passo, em 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 25 de mM 2-mercaptoetanol. A assemblagem dos filamentos intermédios da GFAP, na presença ou ausência de α-cristalina, foi induzida pela adição de um tampão concentrado 20 vezes, para dar uma concentração final de 100 mM imidazole-HCl, pH 6,8, 0,5 mM de DTT. Carregou-se uma aliguota de amostra de 100 yL num tubo de vidro e utilizou-se para o ensaio de viscosidade. O tubo foi em seguida imerso num banho de água a 37 °C durante 1 h antes do ensaio de formação de gel. Colocou-se em seguida uma esfera dentro do tubo e monitorizou-se a capacidade da solução para suportar a esfera.

Observação ao microscópio dos cristalinos

Após uma incubação de 24 h com ou sem H202 na presença ou ausência de L-carnitina, os cristalinos foram submetidos a processos padrão, para análise histológica. Para microscopia óptica, os cristalinos foram removidos do meio de cultura, imersos em fixador (formalino com tampão neutro), desidratados em etanol, limpos em xileno e embutidos em cera de parafina, para seccionamento. Prepararam-se secções de cinco micrómetros e 16 coraram-se com hematoxilina e eosina. Para microscopia electrónica de varrimento, os cristalinos foram fixos por imersão, durante pelo menos 24 h à temperatura ambiente, numa solução de glutaraldeido a 2,5% e sacarose a 6%, tamponada para pH 7,2 com 50 mM de cacodilato de sódio. As amostras foram desidratadas através de séries graduadas de etanol, secas por ponto crítico utilizando C02, montadas em suportes de alumínio, revestidas por deposição com ouro, e observadas com um microscópio Leica Stereoscan 440 para uma tensão de aceleração de 3-7 kV.

Para microscopia electrónica de transmissão, os cristalinos foram fixos como descrito anteriormente para o processo de microscopia electrónica de varrimento, pós-fixados em 0s04 tamponado com 150 mM de fostato de sódio-potássio (pH 7,4), embutidos, seccionados e corados para microscopia electrónica. Foram observados num microscópio electrónico JEOL 100B.

Resultados

Alterações na morfologia dos cristalinos

Após 24 h de incubação, os cristalinos incubados sem H202 (cristalinos de controlo) retinham a sua nitidez, mas os expostos a 500 mM de H202 tornaram-se uniformemente nublados por toda a região cortical externa e estavam inchados (dados não mostrados) . Como se mostra na Tabela 1, no final da incubação, os cristalinos tratados com H202 eram significativamente mais pesados dos que os cristalinos de controlo (47 ± 0,2 mg versus 25 ± 0,1 mg). Não existiam diferenças de peso entre os cristalinos de controlo e cristalinos tratados tanto com L-carnitina como com H202 . Os cristalinos tratados apenas com H202 17 tornaram-se opacos, enquanto os cristalinos tratados com L-carnitina e H202 permaneceram nítidos. A microscopia óptica e electrónica mostraram que a forma das células permaneceu inalterada e que as células das fibras estavam intactas nos cristalinos de controlo e nos cristalinos tratados com L-carnitina e H202 · Observa-se balonização, liquefacção e vários graus de inchação de fibras nos cristalinos expostos apenas a H202 .

Concentrações de L-carnitina e de GSH nos cristalinos de controlo e nos tratados com H202

Sob as condições experimentais do requerente, não existiu diferença significativa entre nas concentrações de L-carnitina e de GSH nos cristalinos de controlo, enquanto que o tratamento com 500 mM H202 causou uma queda abrupta nos níveis de GSH e de L-carnitina (Tabela 1). A adição de L-carnitina (300 mM) ao meio de incubação do cristalino antes do tratamento com H202 não impediu a perda de GSH, mas manteve a concentração de carnitina quase ao nível encontrado nos cristalinos de controlo. Para determinar se a diminuição de GSH e L-carnitina estava relacionada com a danificação dos cristalinos, mediu-se a fuga de LDH para o meio. Como esperado, após o tratamento com H202, a diminuição dos níveis de GSH e L-carnitina foi acompanhado por um aumento significativo de LDH nos sobrenadantes, indicando que o esgotamento destes factores estava na verdade associado à danificação dos cristalinos. Para determinar o efeito protector da L-carnitina, incubaram-se cristalinos em meio de cultura contendo 300 mM da molécula. Como esperado, a concentração de GSH nos cristalinos tratados com L-carnitina e H202 diminuiu para cerca do mesmo nivel de nos cristalinos expostos apenas a H202, mas a concentração de LDH no meio do cristalino tratado com L-carnitina e H202 foi semelhante ao observado nos cristalinos de 18 controlo. Isto indica que a L-carnitina pode suportar esta concentração de H202.

Recuperação de proteínas de elevado peso molecular em fracções de cristalinos insolúveis em água contendo reticulações de isopéptidos.

As proteínas insolúveis em água constituíram apenas 5% das proteínas totais em cristalinos de controlo, mas aumentaram para 41% proteínas totais em cristalinos tratados com H202 (Tabela 1). As concentrações de proteínas insolúveis em água nos cristalinos tratados com L-carnitina e H202 foram as mesmas do que as observadas em cristalinos de controlo.

Função do tipo chaperona da a-cristalina

As propriedades das chaperonas da α-cristalina solúvel em água purificada foram determinadas pelo ensaio de agregação da cristalina (proteína alvo). De modo característico, a BL-cristalina agrega-se a temperaturas elevadas. A adição de α-cristalina ou impede ou diminui a agregação induzida termicamente da LL-cristalina, que é medida pela dispersão da luz a 360 nm. Uma vez que a razão entre α e β determina o grau de protecção contra a agregação induzida termicamente, utilizaram-se 100 yg ou 200 μ de α-cristalina e 200 yg de BL-cristalina. Como esperado, a α-cristalina dos cristalinos de controlo exerceram a actividade de chaperones. Após incubação com H202, verificou-se uma diminuição significativa na capacidade da α-cristalina em impedir a agregação induzida termicamente da LL-cristalina, enquanto a presença de L-carnitina na mistura de incubação do cristalino impediu este efeito negativo. 19

Ensaio de formação de gel

Dado que os filamentos intermédios tais como as GFAP são um alvo fisiológico das α-cristalinas, testou-se a actividade de chaperonas da α-cristalina através da utilização de viscosimetria de esfera descendente no ensaio de formação de gel (MacLean-Fletcher, S. e Pollard, T.D. (1980), Biochem Biophys Res Commun 96, 18-27). A GFAP é um alvo apropriado devido à propriedade da α-cristalina para desagregar as inclusões citoplásmicas de GFAP. Na ausência da α-cristalina, a GFAP forma um gel proteico que suporta a esfera utilizada no ensaio de viscosidade. Para determinar se o tratamento com H202 afectou a capacidade da α-cristalina do cristalino em quebrar a rede de GFAP, adicionou-se α-cristalina do controlo ou do cristalino tratado com H202±L-carnitina ao ensaio de formação de gel. A α-cristalina dos cristalinos de controlo inibiram completamente a formação e manutenção do gel de GFAP no ensaio de viscosidade, enquanto a a-cristalina dos cristalinos tratados apenas com h2o2 não afectaram a formação de gel. Além disso, a a- -cristalina dos cristalinos tratados tanto com L-carnitina como com H202 bloquearam a formação de gel de GFAP na mesma extensão do que a α-cristalina dos cristalinos de controlo.

Medições da fluorescência do triptofano

Mediu-se a fluorescência do triptofano em fracções de α-cristalina dos cristalinos de controlo e tratados, para identificar as alterações de conformação. Numa α-cristalina dos 20 cristalinos tratados com H202 verificou-se uma perda de 2,7 vezes de fluorescência do triptofano; de novo, a L-carnitina restaurou o valor basal.

Os cristalinos expostos à L-carnitina e stresse oxidativo permaneceram transparentes. Apesar dos presentes requerentes não pretenderem ater-se a qualquer teoria, o efeito protector da L-carnitina não é facilmente explicado, devido à L-carnitina per se não ser conhecida como possuindo actividade anti-oxidante (Arduini, A. et al. (1992), J Biol Chem. 267, 12673-81). Nem a L-carnitina resgatou o esgotamento de GSH, o que significa que o efeito benéfico não foi mediado por um aumento de GSH através de, por exemplo, um efeito efeito anaplerótico sobre o NADPH, um cofactor da enzima glutationa redutase (Pemg, M.D., (1999), J Biol. Chem 47, 33235-33243. Wuensch, S.A. e Ray, P.D. (1997), Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 118, 599-605) . Em vez disso, o facto da fuga de LDH para o meio não ter aumentado no cristalino tratado com L-carnitina e exposto ao stresse oxidativo, indica que a molécula pode sustentar a integridade do cristalino. Mostra-se aqui que a actividade de chaperonas da α-cristalina dos cristalinos é diminuída pelo stresse oxidativo in vitro, e fornece suporte para a proposta de que as proteinas do cristalino sujeitas a insulto oxidativo, sustentam um alto grau de modificações pós-translacionais (Cherian, M.e Abraham, E.C. (1995), Biochem Biophys Res Commun. 212, 184-189). A L-carnitina não apenas reduziu as modificações pós-translacionais aumentadas das proteinas do cristalino, como também proporcionou uma protecção significativa contra a actividade diminuida de chaperonas da α-cristalina. A α-cristalina mostrou suprimir a agregação de proteinas desnaturadas em estudos em que a misturas de β-cristalinas com stresse térmico serviram como substrato (Kramps, J.A. et al. (1978), Biochem Biophys Acta 533, 487-495). Demonstrou-se que o 21 oxidativo quebra a stresse oxidativo quebra a actividade de chaperonas α-cristalina, que é crucial para a manutenção da transparência do cristalino (Zigler, J.S. Jr et al. (1989), Free Radie Biol Med. 7, 499-505; Richard RC et al. (1998), Proc Soc Exp Biol Med 217, 397-407). Em consequência, a L-carnitina afecta de modo benéfico a transparência do cristalino, actuando directamente na α-cristalina.

Tanto a α-cristalina como a β-cristalina são acetiladas no terminal N. Utilizando análises de manchas de pontos de rastreio combinadas com espectrometria de massa, Takernoto et ai. forneceram evidências de que a metionina de terminal N acetilado da α-cristalina pode ser oxidada para sulfóxido de metionina in vivo (Sims, N.R. et ai. (2000), Brain Res Mol Brain Res. 77, 176-184). Esta oxidação da metionina de terminal N, que está exposta do lado exterior do polipéptido, pode afectar de modo negativo a função da proteina. Além da acetilação do terminal NH3, os grupos amino dos resíduos da lisina (Lys) estão sujeitos à acetilação. Todos os sete resíduos de Lys da α-cristalina de bovino reagem com a aspirina, variando a extensão da acetilação de 10% para o Lys 88, o menos reactivo, a 60% para o Lys 166, o mais reactivo (Takernoto, L. et al. (1992), Curr. Eye Res. 11, 651-655; Rao, G.N. et al. (1985), Biochem. Biophys. Res. Commun. 128, 1125-1127). A aspirina inibe tanto a glicação como a carbamoilação assim com a agregação de proteínas do cristalino, presumivelmente através da acetilação de resíduos de Lys (Hasan, A. et al. (1993), Exp Eye Res. 57, 29-35; Cromptonm, Rixon, K.C. e Harding, J .J. (1985), Exp . Eye Res . 40, 297 -311; Rao, . G.N. e Cotlier, E. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 151, 991-996; Huby, R. e Harding, J.J. (1988), Exp Eye Res. 47, 53-59; Ajiboye, R. e Harding D. (1989), Exp Eye Res. 49, 31-41;

Blakytin, R. e Harding J.J. (1992), Exp Eye Res. 54, 509-518). 22

Recentemente, mostrou-se que a acetil-L-carnitina inibe a glicação da α-cristalina, numa extensão maior do que de outras cristalinas, através de acetilação dos sítios de glicação potencial (Groenen, P.J. et al. (1993), Biochem J. 295, 399-404). A glicação aparenta ser mais prejudicial do que a acetilação devido a apenas os produtos da glicação estarem envolvidos na reticulação proteica e numa diminuição significativa da actividade de chaperonas α-cristalina (Groenen, P.J. et al. (1993), Biochem J. 295, 399-404, Blakytin, R. e

Harding J.J. (1992), Exp Eye Res. 54, 509-518). TABELA 1:

Alterações de alguns parâmetros bioquímicos em cristalinos de controlo e em cristalinos tratados com H202±L-carnitina Peso do cristali no (mg) Proteína insolúvel em água (%) Glutationa (pmoles/g PP) Carnitina livre (nmoles/g PP) Acetil- carnitina (nmoles/g PP) LDH (unidades/mL meio condicionado) Carnitina total (nmoles/g PP) Controlos 25 +0,1 5 ±1,1 4,87 ±0,23 156 ±3 29 ±1 ND 187 ±5 H202 47 ±0,2* 41 ±1,9* 2,44 ±0,69* 27 ±2* 6 ±1* 53 ±6 36 ±3* H2O2 + L-CAR 27 ±0,9 5 ±2,0 2,71 ±0,73* 151 ±2 37 ±2** ND 189 ±2 *P < 0,001; **P < 0,005; ND: não detectável

Lisboa, 24 de Novembro de 2006 23

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de L-carnitina ou de um sal seu para da actividade da proteina chaperona a-cristalina
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, referida α-cristalina é alfaA-cristalina.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, referida α-cristalina é alfaB-cristalina. Lisboa, 24 de Novembro de 2006 preservação alterada. em que a em que a 1