SK287039B6 - Chimerický glykozylovaný proteín - sIL-6R/IL-6 a jeho analógy, DNA sekvencia, transformované cicavčie bunky obsahujúce DNA vektor, spôsob výroby chimerického proteínu, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie - Google Patents

Abstract

Chimerické proteíny vytvorené fúziou prirodzene sa vyskytujúcej formy rozpusteného sIL-6 receptora a IL-6, ktoré sú užitočné na liečbu rakoviny a porúch pečene, na podporu transplantácie kostnej drene a na liečbu iných stavov, ktoré sa týkajú IL-6.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález je vo všeobecnosti z oblasti biologických účinkov interleukínu-6 - IL-6, ktoré sú závislé od agonistickej účinnosti rozpustného IL-6 receptora - sIL-6R. Konkrétnejšie sa predložený vynález týka nových chimerických sIL-6R/IL-6 proteínov skonštruovaných fúziou v podstate prirodzene sa vyskytujúcich sIL-6R a IL-6 a ich biologicky účinných analógov, ktoré sú užitočné najmä na liečbu rakoviny prostredníctvom inhibície rastu rakovinových buniek, na podporu transplantácie kostnej drene, na liečbu porúch pečene a iných stavov, ktoré sa týkajú IL-6.

Doterajší stav techniky

Interleukín-6 (IL-6) je dobre známy cytokín, ktorého biologické účinky sú sprostredkované membránovým receptorovým systémom, ktorý zahŕňa dva rozdielne proteíny, jeden označený ako IL-6 receptor (IL-6R alebo gp80) a druhý ako gpl30 (zhrnuté v Hirano et al, 1994). Rozpustné formy IL-6R (sIL-6R), zodpovedajúce extracelulámej doméne gp8O, sú prirodzenými produktmi ľudského tela, ktoré sa ako glykoproteíny nachádzajú v krvi a v moči (Novick et al, 1990, 1992). To je dôvodom faktu, že aj bez intracytoplazmatickej domény gp80 je sIL-6R stále schopný spustiť dimerizáciu gpl30 ako odpoveď na IL-6, ktorá následne sprostredkúva IL-6 špecifický prenos signálu a biologické účinky (Murakami et al, 1993). V skutočnosti je IL-6 receptor hexaméma štruktúra tvorená dvoma gpl30 reťazcami, dvoma IL-6R a dvoma IL-6 ligandmi (Ward et al, 1994; Panoessa et al, 1995), v ktorej sIL-6R interaguje dvoma spôsobmi s gpl30, pričom obe tieto interakcie sú nevyhnutné pre IL-6 špecifické biologické účinky (Halimi et al, 1995).

Výsledkom ošetrenia s slL-6R je posilnenie biologických účinkov IL-6 v mnohých typoch buniek. Príkladom sú nádorové bunky, ktorých rast je vo veľkom rozsahu inhibovaný prostredníctvom IL-6, keď sa pridá sIL-6R, ako napríklad hlodavčie myeloleukemické Ml bunky (Taga et al, 1989), ľudské bunky nádoru prsníka T47D (Novick et al, 1992) alebo bunky karcinómu iných ako malých buniek pľúc (Ganapathi et al, 1996). IL-6 má in vivo antimetastatické účinky (Katz et al, 1995) a aj sIL-6R môže posilniť takéto in vivo protinádorové účinky IL-6 (Mackiewicz et al 1995). Ďalším účinkom IL-6, ktorý je posilnený pridaním sIL-6R, je stimulácia buniek hematopoetického kmeňa ku produkcii multilŕniových kolónií (Sui et al, 1995). Pôvodcovia predloženého vynálezu tiež pozorovali, že prežívanie primárnych kultúr mozgových oligodendrocytov je podporené kombináciou sIL-6R a IL-6 (Oh, 1997), zatiaľ čo samotný IL-6 je v takýchto kultúrach slabo aktívny (Kahn a De Vellis, 1994). Z tohto zistenia vyplýva, že keď sa IL-6 kombinuje s sIL-6R, môže napodobňovať aktivitu iných neurotropických cytokínov ako napríklad vláknitého neurotropického faktora (CNTF) alebo leukemického inhibičného faktora (LIF), ktoré tiež pôsobia prostredníctvom gpl30, čo je tiež prípad IL-11 a onkostatínu M (Hirano et al, 1994).

Ako snaha poskytnúť molekulu, ktorá môže kombinovať uvedené funkcie IL-6 a sIL-6R, bola v súčasnosti publikovaná produkcia proteínu vzniknutého fúziou medzi skráteným segmentom ľudskej IL-6R sekvencie a IL-6 spojených na glycin bohatým spojovníkom v rekombinantných kvasinkových bunkách (Fischer et al, 1997). Tento fiizovaný proteín obsahuje v podstate len IL-6R cytokinovú receptorovú N-doménu a cytokínovú receptorovú C-doménu, a tak mu chýba v podstate celá doména IL-6R imunoglobulínu, (Ig) podobná, a predmembránová oblasť receptora (oblasť medzi C-doménou a transmembránovou doménou). Ako taký predstavuje skrátenú formu sIL-6R. Tento skrátený sIL-6R je vo fuzovanom proteíne spojený prostredníctvom uvedeného na glycin bohatého spojovníka s v podstate celou zrelou formou IL-6. Okrem toho, že mu chýbajú časti prirodzeného sIL-6R, tento fúzovaný proteín tým, že je vyrábaný v kvasinkových bunkách, nie je glykozylovaný spôsobom, akým by bol glykozylovaný, keby bol produkovaný v cicavčích bunkách, najmä napr. v ľudských bunkách. V skutočnosti má tento v kvasinkách vyrobený fúzovaný proteín molekulovú hmotnosť len približne 57 kDa, na rozdiel od fuzovaného produktu obsahujúceho v podstate všetky aminokyselinové zvyšky prirodzeného sIL-6R a IL-6 a úplne glykozylované v cicavčích (napr. ľudských) bunkách, ktorý má predpokladanú molekulovú hmotnosť približne 85 kDa (pozri tu uvedený príklad 2).

Bežná skúsenosť vo vývoji rekombinantných proteínov, ktoré môžu byť použité na liečbu ľudských pacientov, ukázala, že je dôležité, aby proteíny ostali podobné, tak ako je to len možné, prirodzeným formám, ktoré sa nachádzajú v ľudskom tele, aby sa zabránilo spusteniu protilátok a iných vedľajších účinkov pozorovaných pri neprirodzených rekombinantných produktoch. Z tohto dôvodu bolo výhodné použiť rekombinantné cicavčie bunkové systémy na výrobu glykozylovaných proteínov, ako napríklad interferónu-β alebo faktora stimulujúceho granulocytové kolónie (Chemajovsky et al, 1984, Holloway, 1994) v chemickej forme čo najviac podobnej prirodzenému ľudskému produktu. Baktérie alebo mikroorganizmy, ako napríklad kvasinky, ktoré správne neglykozylujú, spôsobujú aj nesprávne poskladanie proteínových reťazcov, čo vedie k imunitným reakciám. To je dôležité najmä v prípade IL-6, ktorý je značne postranslačne modifikovaný N- a O-glykozyláciou ako aj fosforyláciou (Revel, 1989 ako zhrnutie) a v prípade prirodzeného sIL-6R z ľudskej krvi a moču, ktorý je glykoproteínom, ktorého N-koncové a C-koncové aminokyseliny sú konštantné a boli stanovené (Novick et al, 1990 a patenty spoločne vlastnené pôvodcami predloženého vynálezu č. US 5 216 128 a zodpovedajúci EP 413908 BI).

V súlade s tým by sa zdalo, že uvedený skorší fúzovaný produkt medzi časťou sIL-6R a IL-6 má množstvo nevýhod, najmä čo sa týka jeho použitia na liečbu ľudí a to v dôsledku skutočnosti, že mu chýba časť sIL-6R, ako aj v dôsledku jeho výroby v kvasinkách, ktorá môže spôsobiť nesprávnu glykozyláciu proteínu.

Doteraz nebola opísaná fúzovaná molekula, obsahujúca prirodzený sIL-6R, ktorý sa nachádza v ľudských telových tekutinách, a prirodzený IL-6, ktorá by bola vyrábaná v ľudských alebo iných cicavčích bunkách.

Cieľom predloženého vynálezu je preto poskytnúť takú fuzovanú molekulu, ktorá obsahuje prirodzený sIL-6R a prirodzený IL-6 (v ľubovoľnom poradí), a ktorá je produkovaná v cicavčích bunkách.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je chimerický glykozylovaný rozpustný proteín zložený z receptora interleukínu-6 - sIL-6R, a interleukínu-6 - IL-6, sIL-6R/IL6, a jeho biologicky aktívne analógy, ktorý zahŕňa fúzovaný sIL-6R a IL-6 proteínový produkt, pričom tento sIL-6R/IL-6 a jeho analógy si zachovávajú rovnaký vzor glykozylácie ako prirodzene sa vyskytujúce sekvencie, keď sú exprimované v cicavčích bunkách, pričom sIL-6R a IL-6 sú prirodzene sa vyskytujúce formy, alebo majú pridaných do 20 aminokyselín, alebo deletovaných do 30 aminokyselín a/alebo substituovaných do 30 aminokyselín do/z/v prirodzene sa vyskytujúcich sekvenciách, a pričom sIL-6R je fúzovaný s IL-6 priamo alebo prostredníctvom peptidovej spojovníkovej molekuly, ktorou môže byť tripeptid sekvencie E-F-M (Glu-Phe-Met), alebo peptid s 13 aminokyselinovými zvyškami so sekvenciou E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met).

Chimerický glykolyzovaný fúzovaný proteín (sIL-6R/IL-6 chiméra) podľa vynálezu je možné použiť na inhibíciu rastu vysoko metastatických melanómových buniek vo veľmi nízkych koncentráciách, pričom tieto bunky sú rezistentné proti samostatným IL-6 alebo sIL-6R.

Ďalším hľadiskom vynálezu je použitie takýchto fúzovaných proteínov (sIL-6R/IL-6 chiméra) na in vivo ujatie sa ľudských buniek hematopoetického kmeňa v postupoch transplantácie kostnej drene.

Ďalším hľadiskom vynálezu je použitie takýchto fúzovaných proteínov (sIL-6R/IL-6 chiméra) pri iných poruchách týkajúcich sa IL-6, napríklad pečeňových stavoch alebo neurologických stavoch.

Ďalej vynález poskytuje farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú uvedený prirodzený sIL-6R-prirodzený IL-6 fúzovaný proteín (sIL-6R/IL-6 chiméra) na liečbu rakoviny, na použitie pri postupoch transplantácie kostnej drene a na liečbu iných porúch týkajúcich sa IL-6, napr. pečeňových stavov a neurologických stavov.

Ďalšie hľadiská predloženého vynálezu budú uvedené alebo vyplynú z nasledujúceho opisu predloženého vynálezu.

Podľa predloženého vynálezu sa vyrába množstvo fúzovaných proteínov (chimér), z ktorých každý obsahuje v podstate celý prirodzene sa vyskytujúci sIL-6R z ľudských telesných tekutín a v podstate celú zrelú formu prirodzene sa vyskytujúceho ľudského IL-6, ktoré sú spojené krátkymi spojovacími peptidmi, ktoré môžu byť dlhé len 3 aminokyselinové zvyšky alebo dlhšie, napríklad dlhé 13 amino-kyselinových zvyškov (pozri nižšie príklady 1 a 2). Ale treba poznamenať, že tieto spojovacie peptidy fúzovaných proteínov je možné vynechať a sIL-6R časť môže byť priamo spojená s IL-6 časťou. Keďže spojovníky predstavujú neprirodzené aminokyselinové sekvencie, ktoré môžu byť imunogénnymi epitopmi vyvolávajúcimi protilátky u pacientov, je výhodné mať priamo fúzovanú sIL-6R/IL-6 chiméru, ktorá má požadovanú biologickú aktivitu, pričom je minimalizované riziko indukcie vytvárania potencionálne škodlivých protilátok pri podaní takejto chiméry.

Na zníženie potenciálnej imunogénnosti chimerického proteínového produktu je dôležitá aj konzervatívnosť celej sIL-6R sekvencie vrátane Ig podobnej domény, ako sa nachádza v prirodzene sa vyskytujúcej molekule, ako aj správna glykozylácia a iné post-translačné modifikácie zavádzané ľudskými alebo cicavčími bunkami, keď je uvedená chiméra produkovaná v týchto bunkách.

Ale je možné použiť veľmi krátky spojovník uvedených troch aminokyselín v spojovacom mieste medzi sIL-6R a IL-6 časťami chimerického proteínu. Takýto krátky spojovník by nemal byť imunogénnym epitopom.

V skutočnosti sa v súlade s predloženým vynálezom prekvapujúco ukázalo, že dlhšie spojovníky nie sú nevyhnutné pre aktivitu chimerického proteínu, z čoho vyplýva, že správne zloženie chiméry nevyžaduje dlhší spojovník, hlavne keď sú v chimerickej molekule zahrnuté celé prirodzene sa vyskytujúce sekvencie sIL-6R a IL-6 častí (pozri príklad 3 a obrázok 5, ktoré sa týkajú aj porovnania sIL-6R/IL-6 chiméry, ktorá má veľmi krátky (3 aminokyselinový) spojovník a podobnej chiméry, ktorá má dlhší spojovník 30 aminokyselinový).

Tieto fuzované proteíny alebo sIL-6R/IL-6 chiméry sa podľa predloženého vynálezu účinne vyrábali v cicavčích bunkových expresných systémoch, čím sa vyťažili glykozylované produkty s potenciálnou účinnosťou proti nádorovým bunkám zvyčajne nereagujúcim na samostatné IL-6 alebo sIL-6R, ktoré sú veľmi účin né pri zaistení úspechu ujatia sa transplantovaných buniek ľudskej kostnej drene (pozri príklady 1 až 4). V skutočnosti boli v takýchto transplantátoch kostnej drene sIL-6R/IL-6 chiméry nevyhnutné na prežitie a proliferáciu transplantovaných neutrálnych pluripotentných buniek hematopoetického kmeňa. Navyše z uvedených experimentálnych výsledkov ako aj z iných analýz vyplynulo, že môžu byť pripravené rôzne analógy sIL-6R/IL-6 chimerického proteínu podľa vynálezu, ktoré majú v podstate rovnaký biologický účinok ako SÍL-6R/IL-6 chiméra, pričom tieto analógy sú sIL-6R/IL-6 chimérami, v ktorých bol jeden alebo viacero amino-kyselinových zvyškov deletovaných, pridaných alebo substituovaných inými zvyškami, s jediným obmedzením, a to, že takéto analógy si zachovávajú väčšinu z prirodzene sa vyskytujúcich sIL-6R a IL-6 sekvencií.

Ďalšie uskutočnenia chimerického proteínu podľa vynálezu zahŕňajú:

i) Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín, ktorý je tu označený ako sIL-6RôVal/IL-6, a ktorý má trojpeptidový spojovník so sekvenciou E-F-M medzi C koncovým Val-356 sIL-6R a N-koncovým Pro-29 IL-6, pričom uvedený chimerický proteín má sekvenciu znázornenú na obrázku 3.

ii) Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín, ktorý je tu označený ako sIL-6R8Val/L/IL-6, a ktorý má 13 aminokyselinový peptidový spojovník so sekvenciou E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M medzi C koncovým Val-356 sIL-6R a N-koncovým Pro-29 IL-6, pričom uvedený chimerický proteín má sekvenciu znázornenú na obrázku 3, v ktorej je trojpeptidová sekvencia E-F-M medzi polohami 357 a 359 na obrázku 3 nahradená 13 aminokyselinovou peptidovou sekvenciou.

iii) Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín, ktorý je vyrábaný v cicavčích bunkách v úplne spracovanej forme.

iv) Chimerický SIL-6R/IL-6 proteín, ktorý je vyrábaný v ľudských bunkách.

v) Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky účinné analógy, ako je uvedené, ktoré sú schopné inhibovať rast vysoko malígnych nádorových buniek.

vi) Chimerický SÍL-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky účinné analógy, ako je uvedené, ktoré sú schopné inhibovať rast vysoko malígnych melanómových buniek.

vii) Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky účinné analógy, ako je uvedené, ktoré sú schopné vyvolať in vivo ujatie sa ľudských hematopoetických buniek pri transplantáciách kostnej drene.

viii) Chimerický S1L-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky účinné analógy, ako je uvedené, ktoré sú schopné chrániť pečeň proti hepatotoxickým činidlám.

Predložený vynález poskytuje aj DNA sekvenciu, ktorá kóduje chimerický sIL-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky aktívne analógy podľa vynálezu, ako bolo uvedené.

Navyše predložený vynález poskytuje aj DNA vektor, ktorý obsahuje DNA sekvenciu kódujúcu chimerický sIL-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky účinné analógy podľa vynálezu, ako bolo uvedené, pričom uvedený vektor je vhodný na expresiu chimerického proteínu v cicavčích bunkách.

Ďalšie uskutočnenia DNA vektora podľa vynálezu zahŕňajú:

i) DNA vektor, ktorý je vhodný na expresiu uvedeného chimerického proteínu v ľudských bunkách.

ii) DNA vektor, ktorý je exprimovaný v cicavčích alebo ľudských bunkách, pričom exprimovaný chimerický proteín má sekvenciu, ktorá umožňuje úplné spracovanie chimerického proteínu cicavčou alebo ľudskou bunkou a vylúčenie úplne spracovaného chimerického proteínu z buniek do kultivačného média, v ktorom bunky rastú.

iii) DNA vektor, ako bol opísaný, ktorý je tu označený ako plazmid pcDNAsIL-6R/IL-6, obsahujúci pcDNA3 vektor zahŕňajúci DNA sekvenciu, ktorá kóduje chimerický sIL-6R/IL-6 proteín pod kontrolou cytomegalovírusového (CMV) promótora, pričom v uvedenej DNA sekvencií kódujúcej chimerický sIL-6R/IL-6 proteín je začlenená spojovacia sekvencia, kódujúca spojovací peptid v EcoRI mieste umiestnenom medzi sekvenciou kódujúcou sIL-6R časť a sekvenciou kódujúcou IL-6 časť proteínu.

Podobne poskytuje predložený vynález aj transformované cicavčie bunky, ktoré obsahujú uvedený DNA vektor, a ktoré sú schopné exprimovať sIL-6R/IL-6 chimerickú proteínovú sekvenciu nesenú uvedeným vektorom a kompletne spracovať exprimovaný proteín a vylúčiť ho do kultivačného média, v ktorom rastú.

Uskutočnením týchto transformovaných buniek sú tu opísané ľudské embryonálne obličkové bunky 293 (HEK293) transfekované pcDNA sIL-6R/IL-6 vektorom, ktoré sú schopné exprimovať sIL-6R/IL-6 chimerický proteín, kompletne spracovať uvedený proteín a vylúčiť ho do kultivačného média, v ktorom rastú, vo forme približne 85 kDa glykoproteínu.

Predložený vynález tiež poskytuje spôsob výroby uvedeného chimerického proteínu alebo jeho biologicky účinných analógov, ktorý zahŕňa rast uvedených transformovaných buniek v podmienkach vhodných na expresiu, spracovanie a vylúčenie uvedeného proteínu alebo jeho analógov do kultivačného média, v ktorom rastú bunky; a purifikáciu proteínu alebo analógov z kultivačného média prostredníctvom imunoafmitnej chromatografie použitím monoklonálnych protilátok špecifických pre SÍL-6R.

Chimerický proteín podľa predloženého vynálezu má množstvo použití, ktoré zahŕňajú:

i) Použitie chimerického sIL-6R/IL-6 proteínu alebo jeho analógov, ich solí a zmesí, na výrobu liečiva na inhibíciu nádorových buniek.

ii) Použitie ako v bode i) na výrobu liečiva na inhibíciu vysoko malígnych melanómových buniek.

iii) Použitie chimerického SÍL-6R/IL-6 proteínu alebo jeho analógov, ich solí a zmesí, na výrobu liečiva na vyvolanie ujatia sa ľudských hematopoetických buniek pri transplantácii kostnej drene.

iv) Použitie chimerického sIL-6R/IL-6 proteínu alebo jeho analógov, ich solí a zmesí, na výrobu liečiva na zvýšenie hematopoézy, na liečbu pečeňových a neurologických stavov alebo na iné aplikácie, v ktorých je využívaný IL-6 alebo sIL-6R.

Podobne môže byť chimérický proteín podľa predloženého vynálezu použitý na prípravu liečiv na množstvo medicínskych indikácií, konkrétne chimérický sIL-óR/IL-ó proteín alebo jeho analógy, ich soli a zmesi môžu byť použité na prípravu liečiva na liečbu rakoviny prostredníctvom inhibície rakovinových buniek alebo na prípravu liečiva na podporu transplantácie kostnej drene prostredníctvom vyvolania ujatia sa ľudských hematopoetických buniek v transplantáte kostnej drene, alebo na prípravu liečiva na zvýšenie hematopoézy, alebo na prípravu liečiva na liečenie neurologických porúch, alebo na prípravu liečiva na iné aplikácie, v ktorých sa využíva IL-6 alebo sIL-6R.

Navyše predložený vynález poskytuje aj farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje ako účinnú zložku chimérický sIL-6R/IL-6 proteín alebo jeho analóg, ako bolo uvedené, a farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo alebo vehikulum.

Uskutočnenia farmaceutického prostriedku podľa vynálezu zahŕňajú:

i) Farmaceutický prostriedok na použitie na liečbu rakoviny cicavcov.

ii) Farmaceutický prostriedok na použitie na podporu transplantácie kostnej drene.

iii) Farmaceutický prostriedok na použitie na liečbu pečeňových a neurologických porúch alebo na zvýšenie hematopoézy, alebo na iné aplikácie, v ktorých je využívaný IL-6 alebo sIL-6R.

Aby sa odstránili pochybnosti, predložený vynález sa týka chiméry medzi IL-6 a sIL-6R v ľubovoľnom poradí, t. j. N-koncové a C-koncové časti môžu byť prehodené a chiméra je potom IL-6-sIL-6R proteín, hoci je v celom tu uvedenom texte označovaná ako sIL-6R/IL-6 proteín.

Iné aspekty a uskutočnenia predloženého vynálezu sú uvedené alebo priamo vyplývajú z nasledujúceho podrobného opisu vynálezu.

Predložený vynález sa týka chimerického sIL-6R/IL-6 proteínu a jeho biologicky účinných derivátov, ako sú opísané. Zistilo sa, že takýto chimérický sIL-6R/IL-6 proteín vyrobený podľa predloženého vynálezu v cicavčích bunkách, najmä ľudských bunkách (pozri príklady 1 až 4), sa účinne exprimuje v takýchto bunkách, je veľmi glykozylovaný a má potenciálny účinok na nádorové bunky, ktoré vôbec neodpovedajú na samostatné IL-6 alebo sIL-6R.

Konkrétnejšie bolo v súlade s predloženým vynálezom pozorované (pozri príklady 1 až 3), že uvedený chimérický sIL-6R/IL-6 proteín podľa vynálezu spôsobuje zastavenie rastu vysoko malígnych cicavčích buniek, ako napríklad F10.9 melanómových buniek, v nižších koncentráciách, ako sú koncentrácie potrebné, keď sa použije zmes nefúzovaných slL-6R a IL-6. To je veľmi významný výsledok vzhľadom na skutočnosť, že takéto F10.9 melanómové bunky ďalej rastú normálne, keď sa oddelene ošetria len s IL-6 alebo len s sIL6R, a zastavia rast len keď sú vystavené relatívne vysokým dávkam kombinácie nefúzovaných IL-6 a sIL-6R. Z toho vyplýva, že chimérický sIL-6R/IL-6 proteín podľa predloženého vynálezu je prekvapujúco účinnejším inhibítorom týchto malígnych melanómových buniek ako zmes jeho oddelených častí, t. j. zmesi nefúzovaných IL-6 a sIL-6R. Chimérický proteín podľa predloženého vynálezu je preto užitočný najmä ako aktívna zložka na liečenie rôznych druhov rakoviny.

Vysoká účinnosť chimerického sIL-6R/IL-6 proteínu sa pripisuje vyššej afinite proti gpl30, ako je afinita zmesi nefúzovaných IL-6 a sIL-6R (príklad 7).

Navyše sa v súvislosti s predloženým vynálezom (pozri príklad 4) zistilo, že chimerická sIL-6R/IL-6 molekula podľa predloženého vynálezu je užitočná najmä na podporu transplantácie kostnej drene. V skutočnosti sa zistilo, že pri známom postupe ujatia sa ľudských buniek kostnej drene v ťažko kombinovane imunodeficientných (SCID) myšiach, v ktorých je použitý kmeňový bunkový faktor (SCF) a Flt3 ligand na umožnenie prežitia a proliferácie väčšiny primitívnych pluripotentných buniek hematopoetického kmeňa, ktoré sú schopné dlhotrvajúco sa ujať v kostnej dreni príjemcu, tieto dva faktory, SCF a Flt3-ligand, nie sú postačujúce na zabezpečenie ujatia sa ľudských buniek v kostnej dreni prijímajúcej myši, a že len keď sa pridal chimerický sIL-6R/IL-6 proteín, bolo ujatie sa úspešné. Toto zistenie indikuje, že chimérický proteín môže byť nevyhnutný v takomto postupe ujímania sa. V rovnakých experimentoch neboli oddelene pridané IL-6 a sIL-6R postačujúce na zabezpečenie úspešnej transplantácie kostnej drene, a keď sa spolu pridali, boli menej aktívne ako chimérický sIL-6R/IL-6 proteín, t. j. účinná koncentrácia 100 ng/ml sIL-6R/IL-6 chimerického proteínu zabezpečilo úspešnú transplantáciu kostnej drene, zatiaľ čo spolu pridané dva oddelené nefuzované sIL-6R a IL-6, hoci aj vo vyšších koncentráciách (sIL-6R od 125 do 1250 ng/ml, IL-6 od 50 do 200 ng/ml), boli oveľa menej účinné na zabezpečenie takejto transplantácie.

Uvedený chimérický sIL-6R/IL-6 proteín podľa predloženého vynálezu je výhodne rekombinantná glykozylovaná sIL-6R/IL-6 chiméra vyrobená v ľudských bunkách alebo v akomkoľvek inom vhodnom cicavčom bunkovom expresnom systéme, ktorý je schopný glykozylovať proteíny ako ľudské bunky, a ktorý zavádza rovnaké post-translačné modifikácie ako ľudské bunky. Dôležitou charakteristikou je, že takto produ kovaný chimerický glykoproteín je spracovaný a modifikovaný rovnako, ako sú spracované a modifikované prirodzené sIL-6R a IL-6 rodičovské molekuly nachádzajúce sa v ľudskom tele, bez pridania vonkajších neprirodzených polypeptidových sekvencií s výnimkou veľmi krátkeho tripeptidu alebo dlhšieho peptidu začleneného medzi sIL-6R a IL-ô časťami chimerického proteínu.

Pri príprave uvedeného chimerického proteínu podľa vynálezu boli zvážené nasledujúce znaky prirodzene sa vyskytujúcich sIL-6R a IL-6: Je známe, že 1L-6R prítomný v ľudských bunkových membránach je produkovaný prostredníctvom cDNA kódujúcej 468 aminokyselín, ktorá obsahuje signálny peptid, doménu podobnú imunoglobulínu (Ig), cytokín viažucu doménu, transmembránovú oblasť a cytoplazmatickú doménu (Yamasaki et al, 1988). Rozpustná forma sIL-6R sa nachádza v telesných tekutinách a má, podobne ako zrelý IL6R z membrán, N-koniec zodpovedajúci Leu-20 (Novick et al, 1990) a C-koniec zodpovedajúci Val-356, tesne pred transmembránovou oblasťou IL-6R (pozri spoločne vlastnený US patent č. 5 216 128 a EP 413 908 Bl). Kvôli fúzii tejto sIL-6R sekvencie s IL-6 bolo zavedené za Val-356 EcoRI reštrikčné miesto. Sekvencia zrelého IL-6, ktorá začína na Pro-29 IL-6 cDNA a končí na Met-212 (Zilberstein et al, 1986; Hirano et al, 1986), sa zaviedla za toto EcoRI miesto. Do tohto EcoRI miesta môže byť tiež, ale nie nevyhnutne, zavedený spojovací peptid požadovanej dĺžky na vzájomné oddelenie sIL-6R a IL-6 častí v chimerickom proteíne. Ako je uvedené v príkladoch, ako príklady možných chimerických proteínov boli vyrobené dva rôzne chimerické proteíny, jeden s tripeptidovým spojovníkom a druhý so spojovníkom z 13 aminokyselinových zvyškov v tomto EcoRI mieste, pričom oba boli v podstate rovnako biologicky účinné.

Predložený vynález sa týka aj analógov uvedeného sIL-6R/IL-6 proteínu podľa vynálezu, ktoré si zachovávajú v podstate rovnakú biologickú aktivitu ako chimerický protein, ktorý má v podstate len prirodzene sa vyskytujúce sekvencie z sIL-6R a IL-6. V takýchto analógoch môže byť deletovaných, pridaných alebo substituovaných inými až do približne 30 aminokyselinových zvyškov v sIL-6R a/alebo IL-6 častiach chimerického proteínu, tak, že modifikácie tohto druhu v podstate nezmenia biologickú aktivitu chimerického proteínového analógu vo vzťahu ku samotnému chimerickému proteínu, pričom sIL-6R časť takýchto analógov si v podstate zachováva prirodzene sa vyskytujúcu štruktúru (pred spracovaním - pozri obrázok 3) signálneho peptidu, Ig-podobnej doméne, cytokínovej receptorovej N-domény, cytokínovej receptorovej C-domény a receptorovej pred-membránovej domény. Podobne by si mali takéto chimerické proteínové analógy zachovať v podstate prirodzene sa vyskytujúcu zrelú formu IL-6 časti. Rôzne analógy sa môžu navzájom a od základnej chimerickej proteínovej molekuly (molekuly s v podstate len prirodzene sa vyskytujúcimi sIL-6R a IL-6 sekvenciami) líšiť najmä v mieste spojovacieho peptidu, ktorý spája sIL-6R a IL-6 časti chimerického proteínu. Takýto spojovník môže byť dlhý až 30 aminokyselín a slúži na vzájomné oddelenie sIL-6R a IL-6 častí chimerického proteínu. Čo sa týka takéhoto spojovníka, je potrebné venovať pozornosť výberu tejto sekvencie (a teda každý z takýchto analógov aj biologicky testovať v príslušných štandardných testoch) tak, aby výsledkom nebolo napríklad nesprávne poskladanie chimerického proteínu, čo môže spôsobiť jeho neaktívnosť, alebo aby neurobil chimerický proteínový analóg imunogénnym proteinom, ktorý bude vyvolávať protilátky proti nemu v pacientovi, ktorý sa ním má liečiť, čím by takýto analóg bol neúčinný minimálne ako liečivo na strednodobé a dlhodobé užívanie.

Čo sa týka uvedených analógov chimerického proteínu podľa vynálezu, je v nich jeden alebo viacero do približne 30 aminokyselinových zvyškov základného chimerického proteínu podľa vynálezu nahradených odlišnými aminokyselinovými zvyškami alebo sú tieto deletované, alebo je jeden, alebo viacero aminokyselinových zvyškov pridaných do pôvodnej sekvencie chimerického proteínu podľa vynálezu (ktorý má v podstate len prirodzene sa vyskytujúce sIL-6R a IL-6 sekvencie) bez toho, aby sa významne zmenila aktivita výsledných produktov v porovnaní so základným chimerickým proteinom podľa vynálezu. Tieto analógy sú pripravené známymi technikami syntézy a/alebo technikami miestne špecifickej mutagenézy, alebo akýmikoľvek inými vhodnými známymi technikami.

Akýkoľvek takýto analóg má výhodne sekvenciu aminokyselín dostatočne podobnú so sekvenciou základnej sIL-6R/IL-6 chiméry tak, aby mal v podstate rovnaký účinok ako ona. Takže to, či ktorýkoľvek z daných analógov má v podstate rovnaký účinok ako základný chimerický protein podľa vynálezu, je možné stanoviť prostriedkami bežného experimentovania, ktoré zahŕňajú podrobenie sa takéhoto analógu testom na biologický účinok uvedeným v príkladoch 2 až 4.

Analógy chimerického proteínu, ktoré môžu byť použité v súlade s predloženým vynálezom alebo nukleové kyseliny, ktoré ich kódujú, zahŕňajú obmedzený súbor v podstate korešpondujúcich sekvencií substituovaných peptidov alebo polynukleotidov, ktoré sa dajú rutinne získať priemerným odborníkom v oblasti bez zložitého experimentovania na základe tu uvedeného opisu a návodu. Pre podrobný opis proteínovej chémie a štruktúry pozri Schulz, G. E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; a Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & co., San Francisco, 1983, ktoré sú tu začlenené ako citácia. Pre prezentáciu substitúcií nukleotidových sekvencií, ako aj kodónové preferencie pozri Ausubel et al, v A.l.l-A.1.24, a Sambrook et al, Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N. Y. 6.3 a 6.4 (1987, 1992) v prílohách C a D.

Výhodnými zmenami v analógoch podľa predloženého vynálezu sú zmeny známe ako „konzervatívne“ substitúcie. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie aminokyseliny chimerického proteínu, ktorý má v podstate prirodzene sa vyskytujúce sIL-6R a IL-6 sekvencie, môžu zahŕňať synonymné aminokyseliny v rámci skupiny, ktoré majú dostatočne podobné fyzikálnochemické vlastnosti, takže substitúcie medzi členmi jednej skupiny zachovajú biologickú funkciu molekuly, Grantham, Science, Vol. 185, str. 862 - 864 (1974). Je zrejmé, že aj inzercie a delécie aminokyselín sa môžu v definovaných sekvenciách uskutočniť bez meny ich funkcií, najmä ak inzercie alebo delécie zahŕňajú len niekoľko aminokyselín, napr. menej ako tridsať a výhodne menej ako desať, a neodstraňujú alebo nepremiestňujú aminokyseliny, ktoré sú dôležité pre funkčnú konformáciu, napr. cysteínové zvyšky, Anfinsen, „Principles That Govem The Foldin of Proteín Chains“, Science, zv. 181, str. 223 - 230 (1973). Analógy vyrobené takýmito deléciami a/alebo inzerciami spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.

Výhodné synonymné aminokyselinové skupiny sú uvedené v tabuľke 1. Výhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny sú uvedené v tabuľke 2 a najvýhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 1

Výhodné skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina

Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly íle Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Tip

Synonymná skupina

Ser, Thr, Gly, Asn

Arg, Gin, Lys, Glu, His íle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Gly, Ala, Thr, Pro

Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr

Gly, Thr, Pro, Ala

Met, Tyr, Phe, íle, Leu, Val

Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Met, Tyr, Phe, Val, Leu, íle

Trp, Met, Tyr, íle, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, íle, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys

Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His

Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin

Gin, Asp, Ser, Asn

Glu, Gin, His, Arg, Lys

Glu, Asn, Asp

Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu

Phe, íle, Val, Leu, Met

Trp

Tabuľka 2

Výhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina

Ser

Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly íle

Phe

Tyr

Cys His

Synonymná skupina

Ser

His, Lys, Arg

Leu, íle, Phe, Met

Ala, Pro

Thr

Pro, Ala

Val, Met, íle

Gly íle, Met, Phe, Val, Leu

Met, Tyr, íle, Leu, Phe

Phe, Tyr

Cys, Ser

His, Gin, Arg

Tabuľka 2 - pokračovanie

Aminokyselina Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp

Synonymná skupina Glu, Gin, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gin Met, Phe, Ile, Val, Leu Τη,

Tabuľka 3

Najvýhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina Synonymná skúp
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Trp

Príklady vyrábania aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré môžu byť použité na získanie analógov chimerického proteínu na použitie podľa predloženého vynálezu, zahŕňajú známe spôsobové kroky, ako je uvedené napríklad v US patentoch RE 33 653, 4 959 314, 4 588 585 a 4 737 462 v mene Mark et al; 5 116 943 v mene Koths et al., 4 965 195 v mene Namen et al; 4 879 111 v mene Chong et al; a 5 017 691 v mene Lee et al; a lyzínom substituované proteíny uvedené v US patente č. 4 904 584 (Shaw et al).

V inom výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu má analóg chimerického proteínu na použitie v predloženom vynáleze aminokyselinovú sekvenciu v podstate zodpovedajúcu uvedenému základnému chimerickému proteínu podľa vynálezu. Výraz „v podstate zodpovedajúci“ je mienený ako taký, ktorý zahŕňa analógy s malými zmenami sekvencie základného chimerického proteínu, ktoré neovplyvňujú jeho základné charakteristiky, konkrétne do takej miery, že napríklad jeho schopnosť inhibovať proliferáciu rakovinových buniek alebo schopnosť zabezpečiť transplantácie kostnej drene nie je ovplyvnená. Typ zmien, ktoré sú vo všeobecnosti považované za spadajúce do rozsahu výrazu „v podstate zodpovedajúci“ sú zmeny, ktoré by boli výsledkom bežných mutačných techník DNA kódujúcej chimerický proteín podľa vynálezu, ktorých výsledkom je niekoľko malých modifikácií, a skríningu na požadovanú aktivitu uvedeným spôsobom.

Analógy podľa predloženého vynálezu zahŕňajú analógy kódované nukleovou kyselinou, ako napríklad DNA alebo RNA, ktoré hybridizujú s DNA alebo RNA v prísnych podmienkach, a ktoré kódujú chimerický proteín podľa predloženého vynálezu, ktorý obsahuje v podstate celé prirodzene sa vyskytujúce sekvencie kódujúce sIL-6R a IL-6. Takáto hybridizujúca DNA alebo RNA môže napríklad kódovať rovnaký proteín ako proteín podľa vynálezu, ktorý má sekvenciu uvedenú na obrázku 3, ale líši sa svojou nukleotidovou sekvenciou od prirodzenej sekvencie vďaka degenerácii genetického kódu. To znamená, že určité nukleovokyselinové sekvencie môžu byť kódom pre rovnakú aminokyselinovú sekvenciu, kvôli degenerácii. Ďalej, ako bolo tiež uvedené, množstvo aminokyselinových zmien (delécií, adícií, substitúcií) je obmedzené na približne 30 aminokyselín, tak, že aj s maximom zmien si analógy podľa predloženého vynálezu v podstate zachovajú vedúcu sekvenciu (pred spracovaním), Ig-podobnú doménu, cytokínovú receptorovú N- a C- doménu a re ceptorovú pred-membránovú oblasť (oblasť medzi C-doménou a transmembránovou doménou) v sIL-6R časti a v podstate celú IL-6 časť. Takáto nukleová kyselina by bola primárnym kandidátom na stanovenie, či kóduje polypeptid, ktorý si zachováva funkčnú aktivitu chimerického proteínu podľa predloženého vynálezu. Výraz „prísne podmienky“ sa vzťahuje na hybridizačné a následné premývacie podmienky, ktoré priemerný odborník v oblasti označuje ako „prísne“. Pozri Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, N.Y., 6.3 a 6.4 (1987, 1992) a Sambrook et al., ako bolo uvedené. Bez obmedzenia príklady prísnych podmienok zahŕňajú premývacie podmienky 12 až 20 °C pod vypočítanou Tm študovaného hybridu, napr. 2 x SSC a 0,5 % SDS počas 5 minút, 2 x SSC a 0,1 % SDS počas 15 minút; 0,1 x x SSC a 0,5 % SDS pri 37 °C počas 30 až 60 minút a potom 0,1 x SSC a 0,5 % SDS pri 68 °C počas 30 až 60 minút. Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že prísnosť podmienok závisí aj od dĺžky DNA sekvencií, oligonukleotidových sond (napríklad 10 až 40 báz) alebo zmiešaných oligonukleotidových sond. Ak sa použijú zmiešané sondy, je výhodné použiť tetrametylamónium chlorid (TMAC) namiesto SSC. Pozri Ausubel, ako bolo uvedené.

Výraz „soli“ tu označuje tak soli karboxylových skupín, ako aj kyslé adičné soli aminoskupín chimerického proteínu podľa vynálezu alebo jeho analógov. Soli karboxylovej skupiny môžu byť vytvorené spôsobom známym zo stavu techniky a zahŕňajú anorganické soli, napríklad sodné, vápenaté, amónne, soli železa alebo zinočnaté soli a podobne a soli s organickými zásadami, ako napríklad soli vytvorené s amínmi, ako trietanolamínom, arginínom alebo lyzínom, piperidínom, prokaínom a podobne. Kyslé adičné soli zahŕňajú napríklad soli s minerálnymi kyselinami, ako napríklad kyselinou chlorovodíkovou alebo sírovou a soli s organickými kyselinami ako napríklad s kyselinou octovou a oxálovou. Je samozrejmé, že takéto soli musia mať v podstate podobnú aktivitu ako chimerický proteín podľa vynálezu alebo jeho analógy.

Predložený vynález sa týka aj DNA sekvencií, ktoré kódujú uvedený chimerický proteín podľa vynálezu a jeho analógy, ako aj DNA vektorov nesúcich takéto DNA sekvencie na expresiu vo vhodných cicavčích, výhodne ľudských, bunkách. Uskutočnením vektora podľa vynálezu je plazmid pcDNA sIL-6R/IL-6, ktorý obsahuje pcDNA3 vektor (Invitrogen) zahŕňajúci sIL-6R/IL-6 fúzované sekvencie pod kontrolu cytomegalovírusového (CMV) promótora.

Predložený vynález sa týka aj transformovaných cicavčích, výhodne ľudských, buniek, ktoré sú schopné exprimovať uvedené proteíny podľa predloženého vynálezu. Uskutočnením takýchto transformovaných buniek sú ľudské embryonálne obličkové bunky 293 (HEK 293, ATCC CRL 1573) transfekované pcDNA sIL-6R/IL-R, ktoré vylučujú fúzovanú sIL-6R/IL-6 chiméru ako 85 kDa glykoproteín.

Ďalším uskutočnením je plazmid pcDNA sIL-6R/L/IL-6, ktorý sa líši od uvedeného pcDNA sIL-6R/IL-6 v tom, že má v EcoRI mieste začlenený krátky spojovník kódujúci 10 prídavných aminokyselín. Na optimalizáciu vzdialenosti medzi sIL-6R a IL-6 je možné začleniť množstvo rôznych sekvencií s rôznou dĺžkou.

Vynález tiež zahŕňa chimerický proteín, v ktorom je IL-6 časť pred sIL-6R časťou (ako je ilustrované na obrázku 11).

Predložený vynález sa ďalej týka spôsobu výroby a purifikácie chimerického proteínu podľa vynálezu alebo jeho analógov, ktorý zahŕňa rast uvedených transformovaných buniek v podmienkach vhodných na expresiu a vylučovanie chimerického proteínového produktu do kultivačného média, a potom purifikáciu vylúčeného proteínu imunoafinitnou chromatografiou použitím anti-sIL-6R monoklonálnych protilátok 34.4, ako je uvedené v príkladoch 2 a 5.

Vynález sa týka aj farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje ako aktívnu zložku sIL-6R/IL-6 chiméru alebo jej analóg, alebo ich zmes, alebo ich soli a farmaceutický prijateľný nosič, rozpúšťadlo alebo vehikulum. Uskutočnenie farmaceutického prostriedku podľa vynálezu zahŕňa farmaceutický prostriedok na zosilnenie činnosti typu IL-6, na liečbu rakoviny, na transplantáciu kostnej drene, na zvýšenie hematopoézy, najmä trombopoézy, na liečbu neurologických stavov, na liečbu porúch pečene a na iné aplikácie IL-6 alebo príbuzných cytokínov.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sú pripravené na podávanie zmiešaním chimerického proteínu alebo jeho analógov s fyziologicky prijateľnými nosičmi a/alebo stabilizátormi, a/alebo vehikulami a sú pripravené v dávkovej forme, napr. lyofilizáciou v dávkovacích liekovkách. Spôsob podávania sa môže uskutočňovať akýmikoľvek prijateľnými spôsobmi podávania podobných činidiel a bude závisieť od stavu, ktorý sa má liečiť, napr. intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, lokálnou injekciou alebo topikálnou aplikáciou, alebo kontinuálne infúziou atď. Množstvo účinnej látky, ktorá sa má podávať, bude závisieť od spôsobu podávania, choroby, ktorá má byť liečená, a od stavu pacienta. Napríklad lokálna injekcia bude vyžadovať nižšie množstvo proteínu vzhľadom na telesnú hmotnosť ako intravenózna infúzia.

Predložený vynález sa týka aj použití chimerického proteínu podľa vynálezu alebo jeho analógov, alebo zmesí na liečbu rakoviny, na transplantácie kostnej drene, na zvýšenie hematopoézy, najmä trombopoézy, na liečbu neurologických stavov, na ochranu pečeňových tkanív u pacientov s nekrotickými ochoreniami z chemikálií (napr. tetrachlórmetánu, alkoholu, paracetamolu) alebo z iných dôvodov (napr. vírusových, chirurgických) a na použitie na iné aplikácie IL-6 alebo príbuzných cytokínov. Podobne, predložený vynález sa týka aj

SK 287039 Β6 chimerického proteínu alebo jeho analógov, alebo ich zmesí na použitie na prípravu liečiv na liečbu uvedených chorôb alebo na použitie pri uvedených indikáciách.

Navyše, okrem uvedených spôsobov ošetrenia, sa berú do úvahy aj ex-vivo postupy a génová terapia s chimérou a DNA, ktorá ju kóduje.

Predložený vynález bude teraz opísaný podrobnejšie v nasledujúcich neobmedzujúcich príkladoch a na pripojených výkresoch.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 (A, B) zobrazuje a schematicky znázorňuje rôzne vektory, reakčné činidlá a spôsobové kroky použité na konštrukciu chimerickej DNA molekuly, ktorá kóduje chimerický proteín, v ktorom po konzervatívnej štruktúre prirodzenej formy sIL-6R, končiacej na Val 356 zvyšku, nasleduje sekvencia prirodzenej zrelej spracovanej formy IL-6, ako je podrobne uvedené v príklade 1.

Obrázok 2 (A, B) znázorňuje výsledky získané z analýzy uskutočnenej na identifikáciu sIL-6R5Val/IL-6 p86 chiméry polyakrylamidovou gélovou elektroforézou (A) a biorádioaktivitovým profilom (B), pričom na obrázku 2A je znázornená reprodukcia Coomassie farbeného gélu, na ktorom boli elektroforeticky purifikované frakcie eluované z afinitnej chromatografickej kolóny, ktorá bola naplnená vzorkou vylúčeného proteínu získanou z bunkových kultúr transfekovaný vektorom kódujúcim chimerický proteín. Na obrázku 2B je znázornené grafické vyobrazenie biologického účinku (inhibicia rastu F 10.9 melanómových buniek) každej z uvedených frakcií eluovaných z afinitných chromatografických kolón, ako je podrobne uvedené v príkladoch 2 a 3.

Obrázok 3 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu (jednopísmenový kód) sIL-6RÔVal/IL-6 chiméry, pričom sú na ňom zobrazené rôzne domény molekuly vrátane N-koncového signálneho peptidu (čiara navrchu sekvencie), domény podobnej imunoglobulínu, cytokínovej receptorovej N-domény (podčiarknutá), cytokínovej C-domény (čiara navrchu sekvencie) a receptorovej predmembránovej oblasti (oblasť medzi C-doménou a transmembránovou doménou), celá sIL-6R časť chiméry, ako aj zrelá IL-6 časť (naspodku podčiarknutá) chiméry, ako je opísané v príkladoch 1 a 2.

Obrázok 4 (A, B) znázorňuje fotografie F10.9 melanómových buniek v kultúre bez (A) a s (B) pôsobením sIL-6R/IL-6 chimerického proteínu počas 4 dní, pričom z obrázka 4B sú zrejmé morfologické zmeny indukované v takýchto metastatických melanómových bunkách (F10.9 bunkách) prostredníctvom pôsobenia sIL-6R/IL-6 chimérou, ako je opísané v príklade 3.

Obrázok 5 je grafickým znázornením výsledkov ilustrujúcich inhibíciu rastu F10.9 melanómových buniek SIL-6R/IL-6 chimerickým proteínom v rôznych koncentráciách chiméry, ktoré sú v rozsahu od približne 0,12 ng/ml do približne 150 ng/ml, pričom chiméra s len 3 aminokyselinovým spojovníkom, IL-6RIL-6, ako je opísaná v príklade 3, je porovnávaná s chimérou s dlhým 13 aminokyselinovým spojovníkom (IL-6RLIL-6).

Obrázok 6 je grafickým znázornením výsledkov ilustrujúcich absenciu rastových inhibičných účinkov buď samotného IL-6 (čiarkovaná horná krivka s prázdnymi štvorcami) v koncentráciách v rozsahu od 0 do 40 ng/ml IL-6, alebo samotného sIL-6R (v bode, kde sa zbiehajú všetky krivky na vertikálnej osi, sa koncentrácia IL-6 rovná nule) na F 10.9 melanómové bunky, ako aj pozorované rastové inhibičné účinky, keď sa IL-6 a sIL-6R pridajú spolu v rôznych koncentráciách, pričom koncentrácia IL-6 je v rozsahu od 10 ng/ml do 40 ng/ml a sIL-6R sa pridal v troch koncentráciách 100 ng/ml, 200 ng/ml a 400 ng/ml pre každú IL-6 koncentráciu, čo je ilustrované troma spodnými krivkami (dve čiarkované krivky s prázdnymi trojuholníkmi a kruhmi a plná krivka s plnými štvorcami), ako je opísané v príklade 3.

Obrázok 7 znázorňuje autorádiogram Southemovho blotu, ktorý ukazuje nevyhnutnosť sIL-6R/IL-6 chimerického proteínu pre úspešné ujatie sa buniek ľudského hematopoetického kmeňa počas transplantácie kostnej drene v SCID-NOD myšiach (dve dráhy sprava reprezentujú myši, ktoré obdržali sIL-6R/IL-6 chimerický proteín spolu s inými nevyhnutnými faktormi, SCF, FLT-3 a to v kontraste s troma dráhami zľava, ktoré predstavujú myši, ktoré obdržali SCT a FLT-3 a SCF, FLT-3 ako aj izolované, t. j. neíuzované IL-6 a sIL-6R, ako je opísané v príklade 4.

Obrázok 8 je rozptylovým diagramom afinitných charakteristík sIL-6R/IL-6 chiméry v porovnaní so zmesou IL-6 a sIL-6R, pričom hodnoty chiméry sú znázornené plnými štvorcami a hodnoty zmesi sú znázornené plnými kosoštvorcami, pričom pomer skloňuje 4 ku 1.

Obrázok 9 znázorňuje silnejší účinok sIL-6R/IL-6 chiméry na F10.9 melanómové bunky v porovnaní s účinkom zmesi sIL-6R + IL-6 alebo účinkom sIL-6R (bez IL-6).

Obrázok 10 znázorňuje ochranu SIL-6R/IL-6 chiméry proti pečeňovej toxicite, pričom hodnoty reprezentujú priemer 4 experimentov. Plné štvorce znázorňujú IL-6-/- myši, plné kosoštvorce znázorňujú IL-6-/-myši, ktoré obdržali IL-6, a plné hviezdičky predstavujú IL-6-/- myši, ktoré obdržali chiméru.

Obrázok 11 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu (jednopísmenový kód) IL-6-sIL-6RôVal chiméry 3e, pričom spojovník je podčiarknutý.

Obrázok 12 znázorňuje účinok chiméry 3e (tmavé plné hviezdičky) na F10.9 melanómové bunky v porovnaní s účinkom sIL-6R/IL-6 chiméry (plné štvorce) a účinkom dvoch mutantov (Mutt 39 (HD) - plné kosoštvorce) a (Mutt NHD - svetlé plné hviezdičky), ako je opísané v príklade 9.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Konštrukcia sIL-6R5Val/IL-6 chimerickcho expresného vektora

Na obrázku 1 je znázornená schéma postupu výroby v krokoch, ktoré sa uskutočnili pri konštruovaní expresného vektora, ktorý nesie sekvenciu kódujúcu sIL-6RóVal/IL-6 chimerický proteín, vrátane všetkých rôznych východiskových a medziproduktových vektorov, rôznych reakčných činidiel a reakčných krokov. Tento konštrukčný postup v podstate využíval techniky na konštrukciu zvolených expresných vektorov dobre známe v oblasti (pozri napríklad Sambrook et al., 1989). V stručnosti sa proces uskutočňoval nasledovne:

cDNA knižnica z T47D buniek ľudského nádoru prsníka sa klonovala do lambda (λ) gtl 1 bakteriofágu a prehľadávala sa s oligonukleotidovými sondami odvodenými od IL-6R sekvencie podľa Yamasaki et al. (1988). Izoloval sa jeden Zgtl 1 cDNA kloň, ktorý mal celú ľudskú IL-6R kódujúcu sekvenciu. Z /.gtl 1 sa vystrihol inzert prostredníctvom EcoRI a klonoval sa do polyklonovacieho miesta (MCS) E. coli fagemidu BlueScript pBS/SK (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, Kalifornia). Tento plazmid pBS/SK-IL-6R (obrázok 1) sa rozrezal s EcoRI, potom sa zatupili jeho konce a znovu sa poštiepil s EcoR V, aby sa izoloval 5 'fragment IL-6R dlhý 959 bázových párov (bp), ktorý končí na EcoRV mieste IL-6R (súradnica 1 203). Tento fragment, extrahovaný z agarózovej gélovej elektroforézy, sa klonoval do nového pBS/SK vektora, ktorý bol otvorený v EcoRVv MCS (pBS/SK-sIL-6R-RV na obrázku 1).

Uvedená, predtým získaná pBS/SK-IL-6R DNA, sa podrobila polymerázovej reťazovej reakcii (PCR), aby sa amplifikoval 368 bp fragment medzi priamym primerom 1137-1156 a reverzným primerom 1505-1488. Reverzný primer sa syntetizoval s EcoRI miestom hneď za kodónom pre valín-356 z IL-6R (pozri obrázok 1), keďže predtým sa určilo, že valínový zvyšok je karboxy-koncovou aminokyselinou prirodzenej formy rozpustného sIL-6R vylučovaného do ľudského moču (Novick et al, 1990; Oh et al., 1996; spoločne vlastnený US patent č. 5 216 128 a európsky patent č. EP 413908 BI). PCR produkt sa poštiepil EcoRV a EcoRIa ligoval sa do pBS/SK-sIL-6R-RV medzi EcoRVmiesto v IL-6R a EcoRImiesto v MCS (obrázok 1). Výsledný plazmid pBS-sIL-6R-ôVal-RI sa potom skrátil, aby sa odstránili 5'netranslatované sekvencie, ligáciou HindlII miesta v MCS s Ncol miestom v polohe 410 v IL-6R (obe miesta boli najprv zatupené), čím vznikol pBS-sIL-6R-ôVal-RI-7Vco7 (obrázok 1).

IL-6 sekvencia sa odvodila od plazmidu ρΚΚβ2-7, ktorý, ako bolo skôr opísané (Chen et al, 1988), sa skonštruoval začlenením IFN-P2/IL-6 cDNA poštiepenej s BstNI (Zilberstein et al, 1986) do EcoRI miesta v E. coli expresnom vektore pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) použitím syntetického oligo-nukleotidu s EcoRI miestom pred metioninovým kodónom a kodónom prolínu-29 v IL-6 a končiacim BstNI (EcoRII) miestom. IL-6 cDNA inzert v ρΚΚβ2-7 končí 7 bázovými pármi za terminačným kodónom v NlalV mieste a o 11 bp ďalej sa nachádza Hind III miesto pKK223-3 vektora (obrázok 1). ρΚΚβ2-7 DNA sa poštiepila s HindlII, zatupili sa jej konce a znovu sa poštiepila s EcoRI a IL-6 cDNA sa začlenila do pBS-sIL-6R-ôVal-RI-7Vco/ tak, aby sa fúzovala zrelá sekvencia IL-6 (začínajúca na prolíne 29) hneď za valín-356 v IL-6R, a aby bola oddelená len 3 kodónmi (Glu-Phe-Met). Výsledný plazmid pBS/SK-sTL-6R/TL-6 (obrázok 1) sa potom poštiepil v Sali a Nôti miestach v MCS a inzert sa klonoval do EcoRV miesta v pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, Kalifornia). Výsledný plazmid pcDNA3-sIL-6R/IL-6 (obrázok 1) obsahuje inzert za silným cytomegalovírusovým (CMV) promótorom a za ním je polyadenylačné miesto, ktoré zabezpečuje účinnú transkripciu sIL-6RóVal/IL-6 chiméry. Zachovanie 5'konca sIL-6R v chimére zaisťuje, že pri expresii v cicavčích bunkách bude fungovať signálny peptid, a že sa N-koniec chimerického proteínu spracuje ako pri prirodzenom sIL-6R.

Ako je uvedené, výhodnou vlastnosťou sIL-6RôVal/IL-6 konštruktu je, že je v podstate fúziou prirodzenej formy sIL-6R a prirodzenej formy IL-6, ako sa nachádzajú v ľudskom tele, bez vonkajších polypeptidových sekvencií. Ale zachovanie EcoRI miesta v sIL-6RôVal/IL-6 konštrukte (obrázok 1) umožňuje, aby sa jednoducho zaviedli spojovacie polypeptidové segmenty medzi sIL-6R a IL-6 časť. Bol konštruovaný aj jeden takýto konštrukt s 13 aminokyselinovou spojovníkovou sekvenciu Glu-Phe-Gly-Ala-gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met začlenenou medzi Val-356 v sIL-6R a Pro-29 v IL-6 (sIL-6RôVaVL/IL-6).

SK 287039 Β6

Príklad 2

Expresia sIL-6RôVal/IL-6 chiméry v ľudských bunkách

Uvedený plazmidový konštrukt (príklad 1) bol použitý na transfekovanie ľudských buniek použitím v podstate štandardných techník pre cicavčie bunkové kultúry, bunkovej transfekcie a použitím analýzy transfekovaných buniek z hľadiska expresie novozačlenenej DNA sekvencie (pre postupy pozri napríklad Sambrook et al., 1989) a stanovila sa v nich jeho expresia. V stručnosti boli použité nasledujúce postupy:

Ľudské HEK 293 bunky (ATCC CRL 1573, transformované primáme ľudské embryonálne obličkové bunky) boli transfekované plazmidovým konštruktompCDNA3-sIL-6R/IL-6R DNA (uvedený v príklade 1). Kultúry HEK 293 v log fáze sa trypsínovali a nasadili sa na 9 cm Nunc platne (2,5 x 10⁶ buniek/platňu). O jeden deň neskôr sa uskutočnila transfekcia s 10 pg pCDNA3-sIL-6R/IL-6R DNA CaPO₄ precipitačným postupom (Sambrook et al, 1989) a o 1 hodinu neskôr sa vymenilo médium za DMEM-10 % FCS a počas ďalších 16 hodín pokračovala kultivácia. Po výmene média za DMEM-2 % FCS sa zozbierali vylúčené proteíny v dvoch následných 48 hodinových periódach. Zvyšky sa odstránili centrifugáciou pri 1 000 otáčkach/minútu počas 10 minút a supematant sa testoval prostredníctvom ELISA na sIL-6R, použitím polyklonálnych králičích anti-sIL-6R a myších McAB 17,6 (Novick et al., 1991). V transfekovaných ľudských bunkách sa zistila koncentrácia 1,2 pg/ml sIL-6R ekvivalentov, z čoho vyplývala veľmi účinná expresia chimerického sIL-6R/IL-6 proteínu.

Imunopurifikácia vylúčeného chimerického proteínu (sIL-6R/IL-6) sa uskutočňovala monoklonálnou protilátkou 34.4 špecifickou pre epitop v extracelulámej doméne ľudského sIL-6R (Novick et al., 1991; Halimi et al., 1995). 34.4 hybridómové bunky rástli v peritoneálnej dutine myši a imunoglobulínová (lg) frakcia sa získala z ascitickej tekutiny precipitáciou síranom amónnym. Na imobilizáciu McAB 34.4 (15 mg lg na pojených na 1 ml Affigel-10) bol použitý Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Richmond, Kalifornia). Supematanty obsahujúce proteíny vylúčené z HEK 293 buniek transfekovaných s pCDNA3-sIL-6R/IL-6 sa absorbovali na kolónu McAB 34.4 (0,3 ml kolóna na 15 ml supematant). Po premytí s PBS sa naviazané proteíny eluovali 25mM kyselinou citrónovou pri pH 2,5, potom sa okamžite neutralizovali 1 M Hepes tlmivým roztokom s pH 8,5 a cez noc sa dialyzovali (približne 8 až 12 hodín) oproti PBS.

Analýza imunoprifikovaného proteínu polyakrylamidovou gélovou elektroforézou v SDS ukázala jediný proteínový pás farbený Coomassie modrou (obrázok 2). Molekulová hmotnosť proteínu bola 85 kilodaltonov, ako sa očakávalo od fúzie glykozylovaných foriem sIL-6R8Val (60 kDa, ako je uvedené v Oh et al., 1996) a glykozylovaného IL-6 (23-26 kDa, ako je uvedené v Zilberstein et al., 1986). Aminokyselinová sekvencia sIL-6R/IL-6 je 543 aminokyselín, ktoré by, po spracovaní signálnych peptidov, indikovali proteín s 524 aminokyselinami alebo s molekulovou hmotnosťou 58 kDa (obrázok 3). Z oveľa väčšej veľkosti sIL-6R/IL-6 chiméry vyrobenej z rekombinantnej DNA v ľudských bunkách vyplýva, že na veľkosti molekuly sa podieľa glykozylácia.

Príklad 3 sIL-6R/IL-6 chiméra zastavuje rast a indukuje diferenciáciu metastatických melanómových buniek

F10.9 kloň odvodený od B16 melanómových buniek vytvára vysoko metastatické nádory v C57Black/6 myšiach, ktoré zabíjajú zvieratá v dôsledku pľúcnych metastáz do 2 až 3 mesiacov (Katz et al., 1995). Výsledkom pridania sIL-6R/IL-6 chimerického proteínu k F 10.9 bunkovej kultúre je radikálna morfologická zmena v bunkách a zastavenie ich rastu (obrázok 4). F10.9 bunky ošetrené chimérou sa začínajú predlžovať, pričom vyrastajú dendritické výbežky, čo sa podobá vretenovitej diferenciácii embryonických melanocytov alebo gliových buniek.

Rast buniek sa kvantifikoval 4 dni po nasadení 3 x 10³ buniek do jamiek 96-jamkovej mikroplatničky do 0,2 ml RPMI 1640 média s 10 % FCS. Bunky sa fixovali v 12,5 % glutaraldehyde počas 30 minút, premyli sa vodou a farbili sa 0,1 % kryštalickou violeťou počas 30 minút. Po dôkladnom premytí a vysušení sa farba extrahovala 10 % kyselinou octovou a optická hustota sa stanovila pri 540 nm. Chiméra mala od dávky závislú inhibiciu rastu s úplnou rastovou inhibíciou v koncentráciách už 10 ng/ml chimerického (p85) proteínu (obrázok 5). Oba chimerické proteíny, sIL-6RôVal/IL-6 a sIL-6RôVal/L/IL-6 (chiméra s dlhším spojovníkom medzi sIL-6R a IL-6 časťami, pozri príklad 1), mali podobný účinok. Tento výsledok slúži aj na dôkaz toho, že spojovací peptid medzi sIL-6R a IL-6 časťami v chimére nie je nevyhnutný pre aktivitu chiméry, keďže uvedená sIL-6R5Val/IL-6 chiméra má len veľmi krátky 3 aminokyselinový spojovník, zatiaľ čo uvedený sIL-6RôVal/L/IL-6 má dlhší, 13 aminokyselinový spojovací peptid, a oba mali v podstate rovnaký účinok pri inhibícii rastu metastatických buniek. Na druhej strane ani samostatný IL-6, ani samostatný sIL-6RÔVal neinhibujú rast týchto melanómových buniek (obrázok 6), čo demonštruje jedinečnú aktivitu sIL-6R/IL-6 (p85) chimerického proteínu. Na získanie podobného účinkuje potrebná zmes 200 až 400 ng/ml IL-6 a 125 ng/ml sIL-6R5Val (obrázok 6). Keď sa počíta v molámych koncentráciách, na maximálnu inhibiciu F10.9 buniek je potrebných 7,5 nM IL-6 a 2 nM sIL-6R5Val naproti len 0,12 nM sIL-6R/IL-6 chiméry.

Po imunopurifikácii na McAB 34.4 kolóne (pozri príklad 2) nasledoval rast inhibičného účinku p85 sIL-6RZ1L-6 chimerického proteinu. Spôsob účinku zodpovedá intenzite p85 pása nachádzajúceho sa v rôznych frakciách SDS polyakrylamidovej gélovej elektroforézy na obrázku 2.

Príklad 4 sIL-6R/IL-6 chiméra je nevyhnutná na ujatie sa transplantovaných buniek ľudskej kostnej drene

Ujatie sa hematopoetických kmeňových buniek z ľudskej kostnej drene je možné študovať po transplantácii do ťažko imunodeficientných kombinovaných (SCID) myší (Vormoor et al., 1994). SCID-NOD myši sa subletálne ožiarili a do chvostovej žili sa injikovalo 3 x 10⁵ ľudských CD34⁺ buniek kostnej drene. Pred injektovanim sa purifikované CD34⁺ bunky udržiavali 3 dni v kvapalných kultúrach s rôznymi kombináciami cytokínov. Po mesiaci sa myši usmrtili a odobrali sa kosti na izoláciu buniek kostnej drene. To, či sa ľudské bunky ujali v SCID-NOD recipientných myšiach, sa stanovilo Southern blot hybridizáciou s ľudskými opakujúcimi sa DNA.

Zistilo sa, že na prežitie a proliferáciu najprimitívnejších hematopoetických kmeňových buniek, ktoré sú schopné dlhotrvajúco sa ujať v príjemcovej kostnej dreni, je dôležitý faktor kmeňových buniek (SCF, obranný faktor alebo ckit-ligand) a Flt3 ligand (flt3/flk2 tyrozín kinázový receptorový ligand) (McKenna et al., 1995). Ako je znázornené na obrázku 7, samotné tieto dva faktory nepostačujú na zabezpečenie ujatia sa ľudských buniek v kostnej dreni SCID-NOD recipientných myší. Na detekciu ujatia sa buniek v signifikantných hladinách bolo nevyhnutné pridanie sIL-6R/IL-6 chimerického proteinu. sIL-6R/IL-6 chiméra v koncentrácii 100 ng/ml je oveľa účinnejšia ako izolovaný IL-6 (50 až 200 ng/ml) a sIL-6R (125 až 1250 ng/ml) (obrázok 7). Z potreby sIL-6R/IL-6 chiméry vyplýva, že tento proteín je nevyhnutný na prežitie a proliferáciu cudzích pluripotentných hematopoetických kmeňových buniek, ktoré sa môžu udomácniť a znovu rozmnožiť v prostredí kostnej drene, z čoho vyplýva, že tento proteín môže byť užitočný v klinických postupoch na transplantáciu kostnej drene.

Po prvý raz je tu demonštrované, že SÍL-6R/IL-6 chiméra má najmenej dva novo nájdené účinky:

(i) Keď sa pridá spolu s oboma faktormi, SCF a Flt3-ligandom, k ľudským hematopoetickým primitívnym progenitálnym bunkám, zabezpečuje ich prežitie a proliferáciu.

(ii) Je účinná (a zjavne nevyhnutná) v in vivo modeli transplantácie ľudskej kostnej drene do imunodeficientných myší.

Príklad 5 sIL-6R/IL-6 chiméra pôsobí na vysoko purifikované primitívne hematopoetické kmeňové bunky

Ľudské chordálne krvné mononukleáme bunky sa podrobili frakcionalizácii na mononukleáme bunky s nízkou hustotou (NMC) na Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) a nasledoval mini MACS kit (Miltney Biotec, Bergisch Gladbach, Nemecko), aby sa pripravila 80 % čistá populácia CD34 buniek. Tieto bunky sa potom pasážovali na imobilizovanej anti-CD38 monoklonálnej protilátke alebo sa rozdelili prostredníctvom fluorescenčné aktivovaného delenia aktivovaných buniek a izolovala sa CD34⁺CD38’ populácia, ktorá zodpovedá 0,1 % pôvodných buniek. Tieto purifikované kmeňové bunky (20 000 buniek) rozsuspendovali do kultúr v 0,5 ml RPMI médiu, 10 % fetálnom hovädzom sére (FCS), 1 % hovädzom sérovom albumíne, ktoré obsahovali 50 ng/ml kmeňového bunkového faktora (SCF) a 100 ng/ml flt3-ligandu (FL) (oba od RyD Systems, Minneapolis, MN). K polovici kultúr sa pridalo 100 ng/ml sIL-6R/IL-6 chiméry, zvyšok sa kultivoval bez chiméry. Inkubácia prebiehala pri 37 °C, v 5 % CO₂, 6 dní. Množstvo znovu rozmnožených buniek kostnej drene sa stanovilo injekciou (i.v.) všetkých buniek z týchto in vitro kultúr do subletálne ožiarených NOD-SCID myší. Myši sa udržiavali v sterilných podmienkach. Po 6 týždňoch sa myši usmrtili a z ich dlhých kostí sa odobrala dreň. Tieto bunky kostnej drene (BM) sa umiestnili na polotuhé 0,9 % metylcelulózové platne s 30 % FCS, 50 μΜ β-merkaptoetanolom, 50 ng/ml SCF, 5ng/ml IL-3, 5 ng/ml GM-CSF, 6 μΐ/ml erytropeotínu (všetko od R&D Systems). Kultúry obsahovali aj ľudské sérum a rástli v podmienkach, ktoré bránili rastu myších kolónií. Z výsledkov (tabuľka 4) vyplýva, že dôsledkom pridania sIL-6R/IL-6 chiméry do suspenzie kultúr je 30 až 50-násobné zvýšenie počtu ľudských buniek vytvárajúcich kolónie (CFU), ktoré sa izolujú z myší, pri ktorých prebehla transplantácia, v porovnaní so samostatnými SCF a FL. To predstavuje rozsiahle zvýšenie počtu SCID buniek, ktoré sa znovu rozmnožili a boli prítomné v suspenzných kultúrach na 6. deň, v porovnaní s dňom 0. Ak nie je prítomná SIL-6R/IL-6 chiméra, SCF a FL nespôsobujú žiadny nárast počtu kmeňových buniek počas 6 dní suspenznej kultúry. DNA z BM buniek izolovaných z NOD/SCID myších, pri ktorých došlo ku transplantácii, sa analyzovala Southern blotom, ako je uvedené v príklade 4. Získané množstvo ľudskej DNA bolo 10-krát vyššie, keď myši obdržali bunky kultivované s chimérou, v porovnaní so stavom, keď obdržali bunky kultivované bez chiméry.

Z pôvodcov CFU z kostnej drene NOD/SCID myší, ako sú uvedené v tabuľke 4, vyrástli hematopoetické bunky rôznych myeloidných línií (makrofágy a granulocyty) ako aj erytroidných a lymfoidných línií (napr. CD19⁺, CD56⁺), len ak sa ľudské krvné bunky pred transplantáciou kultivovali s SIL-6R/IL-6 chimérou.

Tabuľka 4

Ľudské kmeňové bunky, ktoré sú schopné znovu sa rozmnožiť v kostnej dreni NOD/SCID myší

Pridané počas suspenznej kultivácie CD34+CD38‘ ľudských buniek z chordálnej krvi	dni kultivácie	počet ľudských hematopoetických kolónií vytvorených z BM NOD/SCID myší, pri ktorých prebehla transplantácia
	0	4
SCF+FL	6	2 až 3
SCF + FL + sIL-6R/IL-6	6	50 až 100

Ďalšie experimenty porovnávali účinok sIL-6R/IL-6 chordálnej krvnej CD34⁺CD38‘ populácie s účinkom na purifikované CD34⁺CD38‘ kmeňové bunky. In vitro expanzia vysoko purifikovaných buniek bola oveľa viac zosilnená prostredníctvom sIL-6R/IL-6, ako expanzia menej purifikovaných buniek (tabuľka 5). Z toho vyplýva, že naj primitívnejšie kmeňové bunky sú výhodným cieľom sIL-6R/IL-6 účinku na bunkovú expanziu.

Tabuľka 5

In vitro expanzia hematopoetických kmeňových buniek

Nasadená bunková populácia (20 000 buniek)	Počet buniek na 6 deň s SC + FL	Počet buniek na 6 deň s SC + FL + sIL-6R/IL-6
Pokus 1
CD34+CD38+	780 000	675 000 (x 0,86)
CD34+CD38‘	42 000	153 000 (x 3,6)
Pokus 2
CD34+CD38+	330 000	507 000 (x 1,5)
CD34+CD38‘	3 000	18 000 (x 6,0)

In vitro pretrvanie opätovného rozmnoženia sa v kostnej dreni sa zabezpečilo prostredníctvom zvýšenia dĺžky kultivovania suspenzných kultúr vysoko purifikovaných CD34⁺CD38‘ kmeňových buniek pred injektovaním do NOD/SCID myší. Ujatie sa stanovilo prostredníctvom obsahu ľudskej DNA v kostnej dreni recipientných myší 6 týždňov po i.v. injekcii kultivovaných buniek. Keď sa sIL-6R/IL-6 pridal k SCF a FL počas kultivácie, pozorovalo sa vysoké ujatie sa (> 1 % ľudskej DNA) ešte po dvoch týždňoch kultivácie a ujatie sa bolo vyššie ako v nekultivovaných bunkách. Naproti tomu experimenty s kultúrami obsahujúcimi SCF, FL, GM-CSF, IL-3 ukázali, že po jednom týždni kultivácie neostávajú žiadne SCID opätovne rozmnožené bunky (Bhata, M. et al., J. Exp. Med. 186, 619-624, 1997).

Tieto výsledky ukazujú, že sIL-6R/IL-6 umožňuje expanziu a udržanie sa ľudských primitívnych kmeňových buniek, ktoré sú schopné ujať sa v recipientnej kostnej dreni. Pokiaľ sa zmnožujú, ostávajú kmeňové bunky aktívne v nediferencovanom stave. sIL-6R/IL-6 chiméra poskytuje nový spôsob kultivácie ujatých hematopoetických buniek. To môže umožniť aj použitie retrovírusových vektorov na zavedenie génov do ujatých kmeňových buniek v postupoch génovej terapie. Doteraz to s ľudskými kmeňovými bunkami nebolo možné, pretože primitívne bunky sa nemohli udržiavať in vitro v cyklickom stave, ktorý je potrebný na integráciu retrovírusovej DNA. sIL-6R/IL-6 chiméra rieši tento problém.

Príklad 6

Produkcia IL-6R/IL-6 chiméry v CHO bunkách

DNA plazmidu sIL-6R/IL-6 pcDNA3, ako je znázornený na obrázku 1, sa kotransfekovala do buniek vajíčok čínskeho škrečka (CHO) spolu s DNA plazmidu pDHFR, ktorý je opísaný v Mory et al. (DNA 5, 181-193, 1986). Spomedzi transfektantov rastúcich v 50 nM metotrexáte sa izoloval kloň L12-[IL-6R/IL-6], Zistilo sa, že tento kloň je stabilný počas mnohých pasáží a bežne vylučuje do kultivačného média IL-6R/IL-6 chiméru v množstve 2,5 pg/ml.

Na purifikáciu IL-6R/IL-6 chiméry sa 3,25 litra média z kultivácie L12 v 2 % hovädzom sére skoncentrovalo do 200 ml. Toto množstvo sa naabsorbovalo na 18 ml kolónu s anti-ľudskou sIL-6R monoklonálnou protilátkou 34.4 napojenou na Affigel 10 guľôčky a prebehlo eluovanie (ako je opísané v Novick et al., Hybridoma, 10, 137-146, 1991). Eluát s 25 mM kyselinou citrónovou sa okamžite neutralizoval s 1 Hepes tlmivým roztokom, pH 8,6. Proteíny sa koncentrovali na Amicon membráne so selekciou nad 10 kDa na konečnú koncentráciu 1 mg/ml. Na SDS-PAGE bol pozorovaný jeden 85 kDa pás zodpovedajúci IL-6R/IL-6 chimére. Glykozylácia sa potvrdila zmenšením veľkosti po ošetrení s glykozidázou (Boehringer, Mannhcim). Zistilo sa, že biologická aktivita IL-6R/IL-6 chiméry produkovanej v CHO bola stabilná najmenej 5 mesiacov pri °C. Bežne sa uskladňuje pre -70 °C.

Príklad 7

Afinita IL-6R/IL-6 chiméry proti gpl30

IL-6R/IL-6 chiméra vyrobená v CHO a zmes ľudského IL-6 a sIL-6R sa porovnávali z hľadiska ich viazania sa na rozpustnú formu gpl30 (sgp 130), ktorý je druhým reťazcom receptorového systému pre IL-6 (pozri Doterajší stav techniky). Mikrotitračná 96-jamková platnička (Nunc) sa pokryla anti-ľudskou gpl30 monoklonálnou protilátkou a pridalo sa 50 ng/ml sgpl30 (oba od R&D Systems, Minneapolis). Po premytí s fosfátom tlmeným fyziologickým roztokom sa pridala IL-6R/IL-6 chiméra v rôznych koncentráciách v rôznych jamkách, v rozmedzí od 0,1 do 50 ng/ml. Do iných jamiek sa pridal v koncentrácii 500 ng/ml rhuIL-6 (Ares-Serono, Ženeva) spolu s ľudským sIL-6R5Val v koncentráciách od 2 do 500 ng/ml. Po inkubácii cez noc pri 4 °C sa pridali králičie polyklonálne anti-IL-6R (Oh et al., Cytokine, 8, 401-409, 1996), a potom sa pridali kozie antikráličie Ig konjugované s chrenovou peroxidácou, ktorá sa detekovala farebnou reakciou (Sigma, St. Louis). Obrázok 8 ukazuje graf výsledkov. Zistilo sa, že afinita chiméry proti gpl30 je viac ako 4-krát vyššia ako afinita dvoch samostatne pridaných častí molekuly (6,3 x 10‘M versus 2,6 x 10'^loM). Tento výsledok je v súlade s uvedeným a vysvetľuje vyšší účinok chiméry na melanómové a hematopoetické bunky (obrázok 9 a príklad 4) v porovnaní s kombináciou IL-6 + sIL-6R.

Príklad 8

IL-6R/IL-6 chiméra chráni pred hepatotoxicitov

Injektovanie tetrachlórmetylu (CC1₄) do myší vyvoláva ťažkú nekrózu pečene, ktorá vedie ku smrti zvierat (Slater T. F. et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sci. 311, 633-645, 1985). Keď sa myšiam, ktoré sú geneticky deficientné pre IL-6 (IL-6' ·), podajú relatívne nízke dávky Ccl₄ (2 až 3 ml/kg telesnej hmotnosti) intraperitoneálnou injekciou, je letalita po 24 hodinách približne 70 % (obrázok 10). IL-6R/IL-6 chiméra bola účinná v dávkach 2 až 3 pg na injekciu, čo je v molámom pomere 10 krát menej ako dávka IL-6, ktorá nie je účinná. Chiméra chránila aj pri vyšších dávkach CC1₄ (napr. 3,5 ml/kg na obrázku 10), pričom mortalita bola nižšia ako s IL-6 alebo bez cytokínu. Rozdiel v mortalite medzi myšami ošetrenými s chimérou a neošetrenými myšami, pričom obe skupiny dostali CC1₄, bol významný pri p<0,01. Histologické pozorovanie pečeňových sekcií farbených s hematoxilín-eozínom potvrdili, že CC1₄ spôsobuje nekrózu pečeňových tkanív, a že IL-6R/IL-6 chiméra chráni hepatocyty pred týmto chemickým toxickým účinkom (neuvedené).

Príklad 9

Konštrukcia a aktivita lL-6/sIL-6R5Val chiméry

Skonštruovala sa chimerická molekula, v ktorej je IL-6 časť na N-konci, zatiaľ čo sIL-6R časť je na C-konci. Plazmid pBS-sIL-6R8Val sa poštiepil so Sau3a (bp 1086) a s HindlII za stop kodónom, ktorý nasleduje za Val-356 (pozri príklad 1). Syntetizoval sa nasledujúci spojovník, ktorý obsahuje tri reštrikčné miesta: Spel, Smal a BamHI:

Spel Smal BamHI ’ CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG

A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' (sekv. č.: 2)

Uvedené Sau3A miesto v sIL-6R sa ligovalo s BamHI miestom spojovníka a klonovalo sa polyklonálne miesto Bluescript pBS SK plazmidu. IL-6 sekvencia sa amplifikovala prostredníctvom PCR z ρΚΚβ2-7 DNA použitím nasledujúcich primárov (iniciačný kodón je podčiarknutý):

Spel

Priamy 5' GA CTA GTA GCT ATG AAC TCC TTC TC (sekv. č.: 3)

HaelII

Spätný 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C (sekv. č.: 4)

PCR produkt sa poštiepil s Spel a HaelII sa začlenil medzi Spel a Smal miesto uvedeného spojovníka. Syntetizoval sa ďalší spojovník BamHI-Ncol s vnútorným Smalt

Smal

5' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C[/Vco7] [BamHI] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC 5' (sekv. č.: 5)

SK 287039 Β6

Tento sa klonoval medzi BamHI uvedeného spojovníka a Ncol 1464 v IL-6R sekvencii. Fragment IL-6R od Smal 867 po Ncol 1464 sa potom zaviedol medzi Smal druhého spojovníka a Ncol v IL-6R. Výsledná chimerická DNA sa sekvenovala a znovu klonovala do pCDNA3 na expresiu v ľudských HEK 293 bunkách. Aminokyselinová sekvencia tejto IL-6-IL-6R chiméry 3e je znázornená na obrázku 11 (spojovník je podčiarknutý). Chiméra 3e sa purifikovala afinitnou chromatografiou na anti-IL-6 monoklonálnej protilátke (podľa Novick et al., Hybridoma 8, 561-567,1989). Na SDS-PAGE sa pozoroval 75 kDa pás.

Biologická schopnosť IL-6-IL-6R chiméry 3e inhibovať rast F10.9 melanómových buniek je znázornená na obrázku 12. V rovnakom experimente ako s IL-6R/IL-6 chimérou (prípravy 1 až 3) je evidentne aktívna, hoci v porovnaní s ňou je na 50 % inhibíciu rastu potrebné väčšie množstvo.

Boli vyrobené dva mutanty IL-6R/IL-6, v ktorých boli aminokyseliny His-280 a Asp-281IL-6R časti v IL-6R/IL-6 (obrázok 3) zamenené za Ser a Val prostredníctvom PCR mutagenézy (mutant 9 alebo HD), alebo kde bol navyše Asn-230 zamenený za Asp (mutant NHD). Ako je možné vidieť z obrázka 12, tieto dva mutanty boli skoro neaktívne v porovnaní s IL-6R/IL-6 a IL-6-IL-6R chimérami. Keďže v IL-6R interagujú tieto aminokyseliny s gpl30, ako je ukázané v molekulovom modeli (Halimi et al., 1995), demonštruje to skutočnosť, že SIL-6R/IL-6 chiméra si zachováva tieto nevyhnutné interakčné miesta.

IL-6-IL-6R chimére 3e chýba imunoglobulínu podobná doména v IL-6R, ktorá je prítomná v IL-6R/IL-6. Ale odstránenie len tejto Ig-domény z IL-6R/IL-6 neznížilo jej biologický účinok na F10.9 bunky. Väzba IL-6-IL-6R chiméry 3e na gpl30 predstavovala len približne 30 % väzby druhej chiméry IL-6R/IL-6 (neukázané). Toto znížené viazanie saje v súlade so slabším účinkom na rast melanómových buniek.

Tieto výsledky demonštrujú, že blokovanie IL-6 karboxykonca fúziou prostredníctvom spojovníka s sIL-6R zachováva v takýchto nových chimérach biologickú aktivitu.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Yeda Research and Development Co. Ltd.

(B) Ulica: Weizmann Inštitúte of Science, P.O.B. 95 (C) Mesto: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76100 (G) Telefón: 972-8-9344093 (H) Fax: 972-8-9470739 (A) Meno: REVEL, Michel (B) Ulica: Beit Brazil 5, Weizmann Inštitúte of Science (C) Mesto: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76100 (A) Meno: CHEBATH, Judith (B) Ulica: Rehov Miller 13 (C) Mesto: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76284 (A) Meno: LAPIDOT, Tsvee (B) Ulica: Rehov Boxer 6 (C) Mesto: Ness-Ziona (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 74046 (A) Meno: KOLLET, Orit (B) Ulica: Rehov Ramat Chen 14 (C) Mesto: Ramat Gan (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 52232 (ii) Názov vynálezu: Chimérický interleukín-6 rozpustný receptorový/ligandový proteín, jeho analógy a jeho použitie (iii) Počet sekvencií: 8 (iv) Forma čitateľná počítačom:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version#1.30 (EPO) (vi) Údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: IL 121284 (B) Dátum podania: 10-JUL-1997 (vi) Údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: IL 122818 (B) Dátum podania: 30-DEC-1997 (2) Informácie o sekv. č.: 1:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 13 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 1:

Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gin Phe Met

5 10 (2) Informácie o sekv. č.: 2:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 44 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 2:

CTAGTGGGCC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC CTAG 44 (2) Informácie o sekv. č.: 3:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 25 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 3:

GACTAGTAGC TATGAACTCC TTCTC 25 (2) Informácie o sekv. č.: 4:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 21 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 4:

AGGGCCATTT GCCGAAGAGC C 21 (2) Informácie o sekv. č.: 5:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 62 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 5:

GATCCGGGCG GCGGGGGAGG GGGGCCCGGG CGCCCGCCGC CCCCTCCTCC CGGGCCCGGTAC 62 (2) Informácie o sekv. č.: 6:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 6:

Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly

5 10 (2) Informácie o sekv. č.: 7:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 543 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 7:

Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro

1015

Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gin Glu Val Ala Arg

2530

Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro

4045

Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys

5560

Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg

70 7580

Leu Leu Leu Arg Ser Val Gin Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys

9095

Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val

100 105110

Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser

115 120125

Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 130 135140

Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155160

Phe Gin Glu Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys Phe Ser Cys

165 170175

Gin Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr íle Val Ser Met

180 185190

Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gin Thr Phe

195 200205

Gin Gly Cys Gly íle Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn íle Thr Val 210 215220

Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gin Asp

225 230 235240

Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg

245 250255

Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp

260 265270

Leu Gin His His Cys Val íle His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His

275 280285

Val Val Gin Leu Arg Ala Gin Glu Glu Phe Gly Gin Gly Glu Trp Ser

290 295300

Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser

305 310 315320

Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gin Ala Leu Thr Thr

325 330335

Asn Lys Asp Asp Asp Asn íle Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr

340 345350

Ser Leu Pro Val Glu Phe Met Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys

355 360365

Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gin Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg íle 370 375380

Asp Lys Gin íle Arg Tyr íle Leu Asp Gly íle Ser Ala Leu Arg Lys

385 390 395400

Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu

405 410415

Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys

420 425430

SK 287039 Β6

Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr 435 440445

Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gin Asn Arg Phe 450 455460

Glu Ser Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Val Gin Met Ser Thr Lys Val

465 470 475480

Leu Ile Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr

485 490495

Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gin Ala 500 505510

Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser 515 520525

Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gin Met 530 535540 (2) Informácie o sekv. č.: 8:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 471 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 8:

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 15 1015

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 2530

Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gin Pro Leu Thr 35 4045

Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gin Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile

5560

Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 7580

Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 9095

Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105110

Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120125

Leu Gin Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Val Gin 130 135140

Met Ser Thr Lys Val Leu íle Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155160

SK 287039 Β6

Leu Asp Ala íle Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu

165 170175

Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr His

180 185190

Leu íle Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala 195 200205

Leu Arg Gin Met Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly 210 215220

Pro Gly Val Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser

225 230 235240

Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser

245 250255

Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro 260 265270

Ala Glu Asp Phe Gin Glu Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys 275 280285

Phe Ser Cys Gin Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr íle 290 295300

Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr

305 310 315320

Gin Thr Phe Gin Gly Cys Gly íle Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn

325 330335 íle Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr

340 345350

Trp Gin Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe

355 360365

Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met 370 375380

Val Lys Asp Leu Gin His His Cys Val íle His Asp Ala Trp Ser Gly

385 390 395400

Leu Arg His Val Val Gin Leu Arg Ala Gin Glu Glu Phe Gly Gin Gly

405 410415

Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu

420 425430

Ser Arg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gin Ala

435 440445

Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asp Asp Asn íle Leu Phe Arg Asp Ser Ala 450 455460

Asn Ala Thr Ser Leu Pro Val

465470

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Chimerický glykozylovaný rozpustný proteín zložený z receptora interleukínu-6 - sIL-6R a interleukínu-6 - IL-6, sIL-6R/IL6 a jeho biologicky aktívne analógy, ktorý zahŕňa fuzovaný sIL-6R a IL-6 proteínový produkt, pričom tento sIL-6R/IL-6 a jeho analógy si zachovávajú rovnaký vzor glykozylácie ako prirodzene sa vyskytujúce sekvencie, keď sú exprimované v cicavčích bunkách, pričom sIL-6R a IL-6 sú prirodzene sa vyskytujúce formy, alebo majú pridaných do 20 aminokyselín, alebo deletovaných do 30 aminokyselín, a/alebo substituovaných do 30 aminokyselín do/z/v prirodzene sa vyskytujúcich sekvenciách, a pričom sIL-6R je fúzovaný s IL-6 priamo alebo prostredníctvom peptidovej spojovníkovej molekuly, ktorou môže byť tripeptid sekvencie E-F-M (Glu-Phe-Met) alebo peptid s 13 aminokyselinovými zvyškami so sekvenciou E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met).
2. 2. Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín podľa nároku 1, tu označovaný ako sIL-6RSVal/IL6, majúci trojpeptid so sekvenciou E-F-M medzi C-koncovým Val-356 v sIL-6R a N-koncovým Pro-29 v IL-6, pričom má sekvenciu uvedenú na obrázku 3.
3. 3. Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín podľa nároku 1, ktorý je tu označený ako sIL-6RôVal/L/IL-6 a má 13 aminokyselinový peptidový spojovník so sekvenciou E-F-G-A-G-L-V-G-G-Q-F-M medzi C koncovým Val-356 v sIL-6R a N-koncovým Pro-29 v IL-6 a jeho sekvencia je uvedená na obrázku 3, pričom tripeptidová sekvencia E-F-M medzi polohami 357 až 359 je na obrázku 3 nahradená uvedenou 13 aminokyselinovou peptidovou sekvenciou.
4. 4. Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorý je produkovaný in vitro v cicavčích bunkách v úplne spracovanej forme.
5. 5. Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín podľa nároku 4, ktorý je produkovaný v ľudských bunkách.
6. 6. Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky účinné analógy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, ktoré sú schopné inhibovať rast vysoko malígnych nádorových buniek, vyvolať in vivo ujatie sa ľudských hematopoetických buniek pri transplantáciách kostnej drene alebo chrániť pečeň pred hepatotoxickými činidlami.
7. 7. Chimerický sIL-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky účinné analógy podľa nároku 6, pričom malígnymi rakovinovými bunkami sú malígne melanómové bunky
8. 8. DNA sekvencia, ktorá kóduje chimerický sIL-6R/IL-6 proteín a jeho biologicky účinné analógy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
9. 9. DNA vektor obsahujúci DNA sekvenciu podľa nároku 8, ktorý je vhodný na expresiu uvedeného chimerického proteínu v cicavčích bunkách.
10. 10. DNA vektor podľa nároku 9, ktorý je vhodný na expresiu uvedeného chimerického proteínu v ľudských bunkách.
11. 11. DNA vektor podľa nároku 9 alebo 10, ktorý sa exprimuje v uvedených bunkách, pričom exprimovaný chimerický proteín má sekvenciu, ktorá umožňuje úplné spracovanie chimerického proteínu uvedenými bunkami a vylúčenie úplne spracovaného chimerického proteínu z buniek do kultivačného média, v ktorom bunky rastú.
12. 12. Transformované cicavčie bunky obsahujúce DNA vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 11, ktoré sú schopné exprimovať SIL-6R/IL-6 chimerickú proteínovú sekvenciu nesenú vektorom a úplne spracovať exprimovaný proteín a vylúčiť ho do kultivačného média, v ktorom rastú.
13. 13. Spôsob výroby chimerického proteínu alebo jeho biologicky aktívnych analógov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa rast transformovaných buniek podľa nároku 12 v podmienkach vhodných na expresiu, spracovanie a vylúčenie proteínu alebo jeho analógov do kultivačného média, v ktorom bunky rastú; a purifikáciu proteínu alebo jeho analógov z kultivačného média.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že purifikácia sa uskutočňuje imunoafinitnou chromatografiou použitím monoklonálnych protilátok špecifických pre sIL-6R.
15. 15. Použitie chimerického sIL-6R/IL-6 proteínu alebo jeho analógov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, solí ktoréhokoľvek z nich a ich zmesí na výrobu liečiva na inhibíciu nádorových buniek ex vivo.
16. 16. Použitie podľa nároku 15, pričom nádorovými bunkami sú vysoko malígne melanómové bunky.
17. 17. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako aktívnu zložku chimerický sIL-6R/IL-6 proteín alebo jeho analógy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, ich soli alebo zmesi, alebo DNA sekvenciu podľa nároku 8, a farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo alebo vehikulum.
18. 18. Použitie chimerické SÍL-6R/IL-6 proteínu alebo jeho analógov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, soli ktoréhokoľvek z nich a ich zmesi, alebo DNA sekvencie podľa nároku 8, na prípravu liečiva na liečenie cicavčej rakoviny prostredníctvom inhibície cicavčích nádorových buniek, na podporu transplantácie kostnej drene prostredníctvom vyvolania ujatia sa ľudských hematopoetických buniek pri transplantácii kostnej drene, na zvýšenie hematopoézy, na liečenie porúch pečene alebo neurologických porúch, alebo na iné aplikácie, v ktorých sa používa IL-6 alebo sIL-6R.
19. 19. Použitie podľa nároku 18, pričom cicavčími rakovinovými bunkami sú vysoko malígne melanómové bunky.