HU225855B1

HU225855B1 - Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof

Info

Publication number: HU225855B1
Application number: HU0002426A
Authority: HU
Inventors: Michel Revel; Judith Chebath; Tsvee Lapidot; Orit Kollet
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2007-11-28
Also published as: EE05519B1; DE69836217D1; NO20000086L; WO1999002552A3; SK62000A3; EE200000012A; CA2295936A1; BG64680B1; HUP0002426A3; SK287039B6; KR20010021522A; KR100505172B1; AR013201A1; IL122818A0; US7374912B2; AU8127198A; CZ302488B6; ATE342915T1; ES2271999T3; PT991661E

Description

A találmány tárgya az interleukin-6 (IL—6) biológiai aktivitásaival függ össze, melyek az oldható IL-6-receptor (slL-6R) agonista működésével kapcsolatosak. Közelebbről, a találmány tárgyát olyan slL-6R/IL-6-kiméraproteinek képezik, amelyek lényegében az slL-6R és IL-6 természetben előforduló alakja (illetve biológiailag aktív analógjaik) fuzionáltatásával vannak előállítva. Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti kiméraproteineket kódoló DNS-szekvenciák, a találmány szerinti DNS-eket hordozó vektorok, a találmány szerinti vektorokkal transzformált gazdasejtek, valamint eljárások a találmány szerinti kiméraproteinek előállítására és alkalmazására.

A találmány szerinti kiméraproteinek (a rákos sejtek szaporodásának gátlása révén) különösen előnyösen alkalmazhatók rák kezelésére, továbbá csontvelő-átültetés hatékonyságának fokozására, májbetegségek kezelésére, valamint egyéb, IL—6-tal összefüggő állapotok kezelésére.

Az interleukin-6 (IL—6) jól ismert citokin, amelynek biológiai aktivitásait egy membránreceptor-rendszer közvetíti, amely két különböző proteinből áll: az egyik az IL-6-receptor (IL-6R vagy gp80), a másik a gp130 [áttekintést lásd Hirano és munkatársai (1994)]. Az IL—6receptor oldható alakjai (slL—6R) - melyek a gp80 extracelluláris doménjének felelnek meg - az emberi szervezet természetes termékei, melyek a vérben és vizeletben glikoproteinekként találhatók meg [Novick és munkatársai (1990), (1992)]. Az slL-6R-molekulák kivételes tulajdonsága, hogy számos sejttípuson (köztük humán sejteken) az IL-6 hatásos antagonistáiként funkcionálnak [Taga és munkatársai (1989); Novick és munkatársai (1992)]. Ez annak köszönhető, hogy az slL-6R az IL-6-ra reagálva - még a gp80 citoplazmán belüli doménjének hiányában is - képes a gp130 dimerizációjának kiváltására, ami végül az IL-6-specifikus szignáltranszdukcióhoz és biológiai hatásokhoz vezet [Murakami és munkatársai (1993)]. Az aktív IL-6-receptor komplex valójában egy hexamer struktúra, amely két gp130-láncból, két IL-6R-molekulából és két IL—6-ligandumból áll [Ward és munkatársai (1994); Paonessa és munkatársai (1995)]. A komplexben az slL-6R a gp130cal kétféle kölcsönhatásban áll, s mindkettő nélkülözhetetlen az IL-6-specifikus biológiai aktivitások kifejtéséhez [Halimi és munkatársai (1993)].

A slL-6R-rel végzett kezelés számos sejttípusban növeli az IL—6 biológiai aktivitásait. Egyik példaként tumorsejtek említhetők, amelyek szaporodását az IL—6 slL-6R jelenlétében nagyobb mértékben gátolja; ilyen tumorsejtek, például az egéreredetű mieloleukémiás M1-sejtek [Taga és munkatársai (1989)], a T47D humán emlőkarcinóma-sejtek [Novick és munkatársai (1992)] és a humán nem kissejtes tüdőkarcinóma-sejtek [Ganapathi és munkatársai (1996)]. Az IL—6 in vivő metasztázist gátló hatású [Katz és munkatársai (1995)], és az slL-6R ezt az in vivő aktivitást is képes serkenteni [Mackiewicz és munkatársai (1995)]. Az IL—6 egy másik - slL-6R adagolásával fokozható - aktivitása a vérképzési őssejteket többvonalas kolóniák képzésére serkenti [Sui és munkatársai (1995)]. Megfigyeltük, hogy az agyi oligodendrociták primer tenyészeteinek túlélését elősegíti az slL-6R és az IL—6 kombinált alkalmazása [Oh (1997)], míg az IL-6 önmagában az ilyen tenyészetekben alig mutat aktivitást [Kahn és De Vellis (1994)]. Ez a felismerés arra utal, hogy az IL—6 (slL-6R-rel kombinálva) képes más neurotrop citokinek - mint például a Csilló Neurotrop Faktor („Ciliary Neurotropic Factor”; CNTF) vagy a Leukémiagátló Faktor („Leukémia Inhibitory Factor”; LIF) - aktivitásának utánzására, melyek szintén a gp130-on keresztül fejtik ki hatásukat, csakúgy, mint ahogy az IL—11 és az Oncostatin M esetében is megfigyelhető [Hirano és munkatársai (1994)].

Az IL—6 és slL-6R fentebb említett funkcióit egyesítő molekula létrehozására tett kísérletek kapcsán beszámoltak a humán IL-6R egy lerövidített szakaszából és IL-6-ból - s a kettő között egy glicinben gazdag kapcsolószekvenciából - álló fúziós protein rekombináns élesztősejtekben végrehajtott előállításáról [Fischer és munkatársai (1997)]. Ez a fúziós protein lényegében az IL-6R citokinreceptor csupán N- és C-terminális doménjét tartalmazza, s így csaknem a teljes immunglobulinszerű dómén és a premembránrégió (azaz a C-domén és a transzmembrándomén közötti régió) hiányzik belőle. Mivel ez az slL-6R csonkított alakját reprezentálja, a fúziós proteinben lévő csonkított slL-6R a fentebb említett, glicinben gazdag kapcsolószekvencián keresztül lényegében a teljes, érett IL-6-hoz van kapcsolva. Azonfelül, hogy a fúziós protein a természetes slL-6R bizonyos részeit nem tartalmazza, e fúziós protein glikozilációs mintázata - mivel élesztösejtek termelik - eltér attól a mintázattól, amilyen akkor lenne, ha emlőseredetű sejtek (például humán sejtek) termelnék. Az élesztősejtek által termelt fúziós protein molekulatömege mindössze 57 kD, szemben azzal a fúziós termékkel, amely a természetes slL-6R és IL—6 lényegében valamennyi aminosavát tartalmazza, és amely (emlőseredetű, például humán sejtekben) teljes glikoziláltságú (ennek várt molekulatömege kb. 85 kD; lásd 2. példa).

Az emberek kezelésére alkalmazható rekombináns proteinek kifejlesztése során általános szempont, hogy megtartsuk a proteinek természetes - emberi szervezetben megtalálható - alakjához lehető legnagyobb mértékű hasonlóságot, miáltal elkerülhető a nem természetes rekombináns termékek elleni antitestek termelődése és kiküszöbölhetők az egyéb mellékhatások. Ennek elérése érdekében a glikozilált proteinek [például interferon-β vagy granulocita-telepképződést stimuláló faktor; Chemajovsky és munkatársai (1984); Holloway (1994)] előállítására előnyösen rekombináns emlőssejtrendszereket alkalmaztak, amelyek a természetes humán termékhez lehető legnagyobb mértékben hasonlító proteinek termelődését tették lehetővé. A nem megfelelő glikozilációt biztosító baktériumok vagy mikroorganizmusok (például az élesztők) a proteinláncok hibás hajtogatódását („folding) eredményezik, ami immunreakciók beindulásához vezet. Ez különösen jelentős az IL—6 esetében, amely transzlációt követően - N- vagy O-glikozilációval, illetve foszforilá2

HU 225 855 Β1 cióval - jelentős mértékű módosuláson esik át [áttekintést lásd Revei (1989)], és hasonlóan nagyjelentőségű az emberi vérből és vizeletből származó természetes slL-6R esetében, amely egy olyan glikoprotein, melynek N- és C-terminális aminosavai állandóak és azonosítva vannak [Novick és munkatársai (1990); valamint a jelen feltalálók által jegyzett 5 216 128 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás és az annak megfelelő EP 413908 B1 számú európai szabadalmi leírás].

Ennek megfelelően, úgy tűnik, hogy a fentebb említett, korábbi - az slL-6R egy részét és IL-6-ot tartalmazó - fúziós termékeknek számos hátrányos tulajdonságuk van, különösen humán gyógyászatban történő felhasználásukat illetően, ami annak köszönhető, hogy az slL-6R egyes szakaszai hiányoznak, illetve élesztősejtekben történő termelődésük miatt - glikozilációjuk nem megfelelő.

Mindezidáig nem írtak le olyan fúziós molekulát, amely humán testfolyadékokban található, természetes slL-6R-ből és természetes IL-6-ból áll, és amelyet humán vagy egyéb emlőseredetű sejt termel.

Ilyenformán, a találmány kidolgozása során olyan fúziós molekula előállítását tűztük ki célul, amely - bármilyen sorrendben - természetes slL-6R-t és természetes IL—6-ot tartalmaz, és amelyet emlőseredetű sejtekkel termeltetünk.

További célul tűztük ki az slL-6R/IL-6 fúziós protein nagymértékben metasztázisos melanomasejtek (melyek rezisztensek az önmagában alkalmazott IL-6-ra vagy slL-6R-re) szaporodásának gátlására - nagyon kis koncentrációban - történő alkalmazását.

További célul tűztük ki az sIL—6R/IL—6 fúziós protein humán vérképzési őssejtek - csontvelő-átültetéssel kapcsolatos - in vivő átültetésére történő alkalmazását.

További célul tűztük ki a találmány szerinti fúziós protein más IL-6-tal kapcsolatos rendellenességek (például májrendellenességek vagy neurológiai állapotok) kezelésére történő alkalmazását.

A találmány kidolgozása során további célul tűztük ki olyan - természetes slL-6R-ből és természetes IL—6-ból álló - fúziós proteint tartalmazó gyógyászati készítmények létrehozását, amelyek rák kezelésére, csontvelő-átültetés elősegítésére és egyéb, IL—6-tal kapcsolatos rendellenességek (például májrendellenességek vagy neurológiai állapotok) kezelésére alkalmasak.

A találmány egyéb célkitűzéseit és megvalósítási módjait a következő, részletes leírásban ismertetjük.

A találmány kidolgozása során számos fúziós proteint (kimérát) állítottunk elő, melyek az emberi testfolyadékokból származó slL-6R lényegében teljes egészét, illetve a természetes humán IL—6 érett alakjának lényegében teljes egészét tartalmazzák. E fúziós proteinekben az slL-6R és az IL—6 rövid kapcsolópeptideken keresztül kapcsolódik egymáshoz, mely kapcsolópeptid 3-13 aminosavas lehet (lásd 1. és 2. példa). Megjegyezzük azonban, hogy ezekben a fúziós proteinekben a kapcsolópeptidek elhagyhatók, és az slL-6R közvetlenül kapcsolható az IL-6-hoz. Mivel a nem természetes aminosavszekvenciát reprezentáló kapcsolópeptidek immunogén epitópok lehetnek, melyek a páciensekben antitestek termelődését válthatják ki, előnyös, ha a kimérában az slL-6R és az IL—6 közvetlenül van egymáshoz kapcsolva, miáltal kiküszöbölhető a nemkívánatos immunreakciók kialakulása.

A kiméra proteintermékek esetleges immunogenitásának csökkentése szempontjából lényeges a teljes slL-6R aminosavszekvenciájának (beleértve az immunglobulinszerű domént is) természetes molekulában megtalálható állapotban történő megőrzése, valamint a humán vagy emlőseredetű sejtek által véghezvitt pontos glikoziláció és egyéb poszttranszlációs módosítások megléte (ha a kiméra ilyen sejtekben termelődik).

Mindazonáltal a kiméraproteinben alkalmazhatunk nagyon rövid - kb. három aminosavas - kapcsolópeptidet is. Az ilyen rövid kapcsolópeptid nem funkcionálhat immunogén epitópként, így nem vált ki immunreakciót. A kiméraprotein két komponensének elválasztása céljából természetesen alkalmazhatunk hosszabb (egészen 30 aminosavig terjedő) kapcsolópeptidet is, de ilyen esetben óvatosnak kell lenni, és biológiai hatékonysági és biztonsági teszteket kell végezni, hogy az ilyen kapcsolópeptideket hordozó kiméramolekulák biztosan ne legyenek immunogének.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során váratlanul bebizonyosodott, hogy a kiméraprotein aktivitásának kifejtéséhez az ilyen hosszabb kapcsolópeptidek nem kulcsfontosságúak, ami arra utal, hogy a kiméra pontos hajtogatódása („folding”) nem igényli a hosszú kapcsolópeptid jelenlétét, különösen olyan esetben nem, ha a kiméramolekulában az slL-6R és IL—6 lényegében teljes - természetben előforduló szekvenciája jelen van [Id. 3. példa és 5. ábra, amelyen egy nagyon rövid (3 aminosavas) kapcsolópeptidet tartalmazó slL-6/IL-6-kimérát és egy hosszabb (30 aminosavas) kapcsolópeptidet tartalmazó sIL—6/IL—6 kimérát hasonlítunk össze].

Ezek a fúziós proteinek vagy slL-6R/IL-6-kimérák a találmány szerinti megoldás értelmében hatékonyan termeltethetők emlőssejtes expressziós rendszerekben, miáltal olyan glikozilált termékek képződnek, amelyek hatásosak az olyan tumorsejtekkel szemben, melyek az önmagában alkalmazott IL-6-ra vagy slL-6R-re nem érzékenyek. Az ilyen termékek képesek biztosítani az emberi csontvelő-átültetés sikerességét (lásd később, illetve 1-4. példák). Az ilyen csontvelő-átültetéseknél az slL-6R/IL-6-kimérák a transzplantált pluripotens vérképzési őssejtek életben maradása és proliferációja tekintetében kulcsfontosságúak. Ezenfelül, a későbbiekben bemutatott kísérleti eredményekből, illetve más vizsgálatok eredményeiből arra következtethetünk, hogy a találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein különféle analógjai állíthatók elő, melyek biológiai aktivitása lényegében azonos az slL-6R/IL-6-kiméraproteinével. Az ilyen analógok olyan slL-6R/IL-6-kimérák, amelyek egy vagy több aminosavat érintő deléciót, addíciót vagy szubsztitúciót hordoznak. Ezekkel az analógokkal szemben az az egyetlen követelmény, hogy tartalmazniuk kell a természetes slL-6R és IL—6 aminosavszek3

HU 225 855 Β1 venciájának legnagyobb részét. Például az slL-6R és IL—6 természetes szekvenciájához legfeljebb 20 aminosav adható hozzá, és ezek az addíciók előnyösen az slL-6R és az IL—6 kapcsolódása között, azaz a kapcsolópeptidben valósíthatók meg. Hasonlóan, az SIL-6R és az IL—6 aminosavszekvenciájának deléciói és szubsztitúciói egyaránt legfeljebb 20-30 aminosavat érintenek. A találmány szerinti megoldás értelmében valamennyi fentebb említett deléció, addíció és szubsztitúció elfogadható, feltéve, ha az ilyen módosítások következtében létrejött analógok képesek a lényegében természetes aminosavszekvenciákat tartalmazó sIL—6R/IL-6-kiméra biológiai aktivitásának kifejtésére, és - emlőssejtekben expresszálódva - a lényegében természetes aminosavszekvenciákból álló kiméra glikolizációs állapotát (mintázatát) mutatják.

Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi egy glikozilált, oldható interleukin-6-receptor (slL-6R)/interleukin-6 (IL—6) kiméraprotein, valamint annak biológiailag aktív analógjai, mely kiméraprotein az slL-6R természetben előforduló alakjának lényegében teljes egészét és az IL—6 természetben előforduló alakjának lényegében teljes egészét - a természetes slL-6R, illetve IL—6 glikozilációs mintázatához hasonló glikozilációs állapotban - tartalmazza.

A találmány szerinti kiméraprotein megvalósítási módjai a következők:

(i) slL-6R/IL-6-kiméraprotein és biológiailag aktív analógjai, amelyekben az slL-6R kapcsolópeptiden keresztül van az IL-6-hoz fuzionálva.

(ii) az (i) pontban említett slL-6R/IL-6-kiméraprotein és biológiailag aktív analógjai, amelyek kapcsolópeptidként nagyon rövid (kb. 3-4 aminosavas), és nem immunogén hatású peptidet tartalmaznak.

(iii) az (ii) pontban említett slL-6R/IL-6-kiméraprotein és biológiailag aktív analógjai, amelyek kapcsolópepiidként egy E-F-M (Glu-Phe-Met) aminosavszekvenciájú tripeptidet tartalmaznak.

(iv) az (i) pontban említett slL-6R/IL-6-kiméraprotein és biológiailag aktív analógjai, amelyek kapcsolópeptidként egy 13 aminosavból (E-F-G-A-G-L-V-L-GG-Q-F-M, azaz Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-GlyGly-GIn-Phe-Met; 1. azonosító számú szekvencia) álló peptidet tartalmaznak.

(v) slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely az slL-6R8Val/IL-6 elnevezésű fúziós protein, mely az SIL-6R C-terminális, 356. valinja és az IL-6 N-terminális, 29. prolinja között E-F-M kapcsolópeptidet tartalmaz (e kiméraprotein aminosavszekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be).

(vi) slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely az slL-6R8Val/L/IL-6 elnevezésű fúziós protein, mely az slL-6R C-terminális, 356. valinja és az IL—6 N-terminális, 29. prolinja között 13 aminosavas (E-F-G-A-G-L-VL-G-G-Q-F-M) kapcsolópeptidet tartalmaz (e kiméraprotein aminosavszekvenciája megegyezik a 3. ábrán bemutatott aminosavszekvenciával, azzal a különbséggel, hogy a 357-359. pozíciókban lévő E-F-M tripeptidszekvencia helyett az E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M szekvenciát tartalmazza).

(vii) slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely emlőssejtekben, teljesen érett alakban van termeltetve.

(viii) slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely humán sejtekben van termeltetve.

(ix) slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely CHO-sejtekben van termeltetve.

(x) a fenti slL-6R/IL-6-kiméraprotein és biológiailag aktív analógjai, melyekre az jellemző, hogy képesek a nagymértékben malignus ráksejtek szaporodásának gátlására.

(xi) a fenti slL-6R/IL-6-kiméraprotein és biológiailag aktív analógjai, melyekre az jellemző, hogy képesek a nagymértékben malignus melanomasejtek szaporodásának gátlására.

(xii) a fenti slL-6R/IL-6-kiméraprotein és biológiailag aktív analógjai, melyekre az jellemző, hogy csontvelő-átültetés során képesek a humán vérképzési sejtek in vivő átültetésének elősegítésére.

(xiii) a fenti slL-6R/IL-6-kiméraprotein és biológiailag aktív analógjai, melyekre az jellemző, hogy képesek a máj hepatotoxikus hatóanyagokkal szembeni védelmére.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy DNS-szekvencia, amely a találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraproteint és annak biológiailag aktív analógjait kódolja.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy DNS-vektor, amely a találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraproteint és annak biológiailag aktív analógjait kódoló DNSszekvenciát tartalmaz, és alkalmas a találmány szerinti kiméraprotein emlőssejtekben történő expresszáltatására.

A találmány szerinti DNS-vektor megvalósítási módjai a következők:

(i) DNS-vektor, amely alkalmas a találmány szerinti kiméraprotein humán sejtekben történő expresszáltatására.

(ii) DNS-vektor, amely emlőseredetű vagy humán sejtben expresszáltatva olyan kiméraprotein termelődését eredményezi, amelynek aminosavszekvenciája az emlőseredetű vagy humán sejtben lehetővé teszi, hogy a kiméraprotein teljes érési folyamaton menjen keresztül, és hogy a teljesen érett kiméraprotein a sejtekből a tenyésztő tápközegbe szekretálódjon.

(iii) A fenti DNS-vektor, mely a pcDNAsIL—6R/IL—6 elnevezésű plazmid, amely - sIL—6R/IL—6kiméraproteint kódoló DNS-szekvenciát citomegalovírus (CMV)-promoter szabályozása alatt tartalmazó pcDNA3-vektort tartalmaz.

(iv) A fenti DNS-vektor, mely a pcDNAslL—6R/L/IL—6 elnevezésű plazmid, amely - az slL-6R/IL-6-kiméraproteint kódoló DNS-szekvenciát citomegalovírus (CMV)-promoter szabályozása alatt tartalmazó - pcDNA3-vektort tartalmaz, és a DNSszekvenciában az slL-6R-t kódolószekvencia-szakasz és az IL—6-ot kódolószekvencia-szakasz közötti EcoRIfelismerési helyen egy kapcsolópeptidet kódoló kapcsolószekvencia van inszertálva.

Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti DNS-vektort tartalmazó transzformált emlőssejtek, amelyek képesek a vektor által kódolt sIL—6R/IL—64

HU 225 855 Β1 kiméraprotein expresszáltatására, továbbá az expresszált protein teljes érési folyamatának lebonyolítására és a kiméraprotein tenyésztő tápközegbe történő kiválasztására.

A találmány szerinti transzformált sejtek egyik megvalósítási módját képezik a pcDNAslL-6R/IL-6-vektorral transzformált embrionális 293-as vesesejtek (HEK293), amelyek képesek az slL-6R/IL-6-kiméraprőtéin expresszáltatására, továbbá az expresszált protein teljes érési folyamatának lebonyolítására és a kiméraprotein - kb. 85 kD-os glikoprotein formájában tenyésztő tápközegbe történő kiválasztására.

A találmány szerinti transzformált sejtek egy másik megvalósítási módját képezik a pcDNAslL-6R/IL-6vektorral transzformált kínai hörcsög petefészek (CHO-) sejtek, amelyek képesek az slL-6R/IL-6-kiméraprotein expresszáltatására, továbbá az expresszált protein teljes érési folyamatának lebonyolítására és a kiméraprotein - kb. 85 kD-os glikoprotein formájában tenyésztő tápközegbe történő kiválasztására.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás kiméraprotein vagy biológiailag aktív analógjai előállítására, melynek során a fentebb említett, transzformált sejteket a protein vagy analógja expresszáltatásához, éréséhez és kiválasztásához megfelelő feltételek mellett tenyésztjük, és a proteint vagy analógjait a sejtek tenyésztő tápközegéből - az slL-6R-re specifikus monoklonális antitestek alkalmazásával végzett - immunaffinitási kromatográfiával tisztítjuk.

A találmány szerinti kiméraproteinnek számos alkalmazási lehetősége van:

(i) az slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy analógjai, illetve ezek sói vagy elegyei ráksejtek inhibitoraiként alkalmazhatók.

(ii) az slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy analógjai, illetve ezek sói vagy elegyei nagymértékben malignus melanomasejtek inhibitoraiként alkalmazhatók.

(iii) az slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy analógjai, illetve ezek sói vagy elegyei csontvelő-átültetés során a humán vérképzési őssejtek átültetését elősegítő aktív hatóanyagként alkalmazhatók.

(iv) az slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy analógjai, illetve ezek sói vagy elegyei aktív hatóanyagként alkalmazhatók a vérképződés fokozására, májbetegségek és neurológiai állapotok kezelésére, valamint olyan alkalmazásokban, ahol IL-6-ot vagy slL-6R-t alkalmaznak.

Hasonlóan, a találmány szerinti kiméraprotein számos gyógyászati területen alkalmazható gyógyszer előállítására is felhasználható. Ennek megfelelően, az slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy analógjai, illetve ezek sói vagy elegyei olyan gyógyszerek előállítására alkalmazhatók, amelyek - a rákos sejtek szaporodásának gátlása révén - rák kezelésére; továbbá - a humán vérképzési sejtek átültetésének kiváltása révén csontvelő-átültetés sikerességének növelésére; valamint a vérképződés fokozására; neurológiai rendellenességek kezelésére; illetve egyéb, IL-6-tal és slL-6R-rel összefüggő esetekben alkalmasak.

Ezen túlmenően a találmány tárgyát képezi egy gyógyászati készítmény, amely aktív összetevőként slL-6R/IL-6-kiméraproteint vagy analógjait, továbbá gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, hígítószert vagy kötőanyagot tartalmaz.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény megvalósítási módjai közé tartoznak a következők:

(i) Emlősök rákbetegségeinek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény.

(ii) Csontvelő-átültetés sikerének fokozására alkalmas gyógyászati készítmény.

(iii) Gyógyászati készítmény májbetegségek és neurológiai rendellenességek kezelésére vagy vérképződés fokozására, illetve más, olyan esetekben alkalmas gyógyászati készítmény, ahol IL-6-ot vagy slL-6R-t alkalmaznak.

Szintén a találmány tárgyához tartozik egy eljárás rákbetegség kezelésére emlősben; eljárás csontvelőátültetés sikerének fokozására; eljárás májbetegségek és neurológiai rendellenességek kezelésére; eljárás vérképződés fokozására; illetve egyéb olyan esetekben, ahol IL-6-ot vagy slL-6R-t alkalmaznak. Ezen eljárások során a páciensnek - megfelelő dózisalakban és megfelelő beadási módon találmány szerinti gyógyászati készítményt adagolunk.

A félreértések elkerülése érdekében; a találmány tárgyát olyan - IL—6-ból és slL-6R-ből álló - kiméraprotein képezi, melyben az IL—6 és slL-6R sorrendje tetszőleges, vagyis az N-terminális és C-terminális molekularész sorrendje felcserélhető, így slL-6R/IL-6proteinről és IL-6/slL-6R-proteinről egyaránt beszélhetünk, bár a leírásban mindkettőt slL-6R/IL-6-nek nevezzük.

A találmány egyéb szempontjait és megvalósítási módjait a következő, részletes leírásban ismertetjük.

A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.

Az 1/A-1/C. ábrákon a találmány szerinti kiméraproteint (amelyben meg van őrizve az slL-6R 356. valinnal végződő, természetes alakjának szerkezetét és a természetes IL—6 érett alakjának szerkezete) kódoló kiméra DNS-molekula előállítása során alkalmazott vektorokat, reagenseket és az eljárás lépéseit mutatjuk be (lásd 1. példa).

A 2/A. és 2/B. ábrán az slL-6R5Val/IL-6 p86-kiméra azonosítása céljából végzett poliakrilamid-gélelektroforézis eredményeit (A), illetve bioaktivitási profilját mutatjuk be. A 2/A. ábrán a kiméraproteinnel transzfektált sejtek tenyészetéből származó, szekretált proteinmintával feltöltött affinitási oszlopról eluált, immuntisztított frakciók poliakrilamid-gélen, Coomassie-színezékkel láthatóvá tett sávjait mutatjuk be. A 2/B. ábrán grafikonon mutatjuk be az affinitási kromatográfiás oszlopról eluált frakciók (F10.9melanomasejtek szaporodásának gátlására kifejtett) biológiai aktivitását (lásd 2. és 3. példa).

A 3. ábrán az slL-6RöVal/IL-6-kiméra (egy betűs kóddal írt) aminosavszekvenciáját mutatjuk

HU 225 855 Β1 be, feltüntetve a molekula különféle doménjeit. Az N-terminális szignálpeptidet a szekvencia feletti vonallal jelöltük, ezt követi az immunglobulinszerű (Ig-szerű) dómén, a citokinreceptor N-domen (melyet aláhúzással jelöltünk), a citokin C-domén (melyet a szekvencia feletti vonallal jelöltünk), és a receptor premembrán régió (a C-domén és a transzmembrándomén közötti régió; az eddig felsoroltak a kiméra slL-6R-komponensének részei), végül az érett IL-6-molekularész (melyet aláhúzással jelöltünk). Részletes leírást lásd 1. és 2. példa.

A 4/A. ábrán tenyészetben lévő F10.9-melanomasejteket, míg a 4/B. ábrán ugyanilyen tenyészet slL-6R/IL-6-kiméraproteinnel négy napig végzett kezelés utáni képét mutatjuk be. A 4/B. ábrán jól láthatók a metasztázisos F10.9-melanomasejtekben az slL-6R/IL-6-kiméraproteinnel végzett kezelés által indukált morfológiai változások (lásd 3. példa).

Az 5. ábrán kétféle slL-6R/IL-6-kiméraprotein [a három aminosavas kapcsolópeptidet tartalmazó IL-6RIL-6 (lásd 3. példa) és a 13 aminosavas kapcsolópeptidet tartalmazó IL—6RLIL—6] különböző - kb. 0,12 ng/mltől kb. 150 ng/ml-ig terjedő - koncentrációival végzett kezelések F10.9-melanomasejtek szaporodására gyakorolt hatásának grafikus ábrázolását mutatjuk be.

A 6. ábrán azt mutatjuk be, hogy az izolált IL—6-tal (0-40 ng/ml koncentrációtartományban) önmagában végzett kezelés (felső, szaggatott vonallal és üres négyzetekkel jelölt görbe), illetve az slL-6R-rel önmagában végzett kezelés (a függőleges tengelyen - ahol az IL—6 koncentráció nulla - egybeeső görbék) nem gátolja az F10.9-melanomasejtek szaporodását, míg az IL—6 (10-40 ng/ml) és slL-6R (100, 200 és 400 ng/ml) együttes alkalmazása gátló hatást eredményezett [Id. a három alsó görbe; két szaggatott vonalas görbe (üres körök és háromszögek), illetve a folytonos vonallal meghúzott görbe (sötét négyzetek)]. A kísérlet leírását lásd a 3. példában.

A 7. ábrán Southern-blot-analízis autoradiogramját mutatjuk be, melyen az látható, hogy az SCID-NOD-egerekben végrehajtott csontvelő-átültetés során a humán vérképzési őssejtek sikeres átültetéséhez szükség van az slL-6R/IL-6-kiméraproteinre (lásd 4. példa). A két jobb oldali sávon az slL-6R/IL-6-kiméraprotein, valamint két további, szükséges faktorral, az SCF-fel és az FLT-3-mal kezelt egerek eredményei, míg a három bal oldali sávon a csak SCFfel és FLT-3-mal, illetve SCF-fel, FLT-3-mal és izolált (vagyis nem fuzionált IL—6-tal és slL-6R-rel kezelt egerek eredményei láthatók.

A 8. ábrán az slL-6R/IL-6-kiméraprotein és az IL—6 és slL-6R elegyének affinitási jellemzőinek Scatchard-görbéit mutatjuk be. A kiméra értékeit sötét négyzetek, míg az IL-6/slL-6R elegy értékeit sötét rombuszok jelzik. A két görbe meredekségének aránya 4:1.

A 9. ábrán grafikonon mutatjuk be, hogy az slL-6R/IL-6-kiméra nagyobb aktivitással hat az F10.9-melanomasejtekre, mint az SIL-6R+IL-6 elegy, illetve az IL—6 nélkül alkalmazott slL-6R.

A 10. ábrán grafikonon mutatjuk be, hogy az slL-6R/IL-6-kiméra védelmet biztosít a májtoxicitással szemben. A négyzetek IL-6-/-egerek túlélési arányát, a rombuszok az IL—6-tal kezelt IL-6-/-egerek túlélési arányát, míg a csillagok a kiméraproteinnel kezelt IL-6-/-egerek túlélési arányát jelzik.

A 11. ábrán az IL-6/slL-6R8Val 3e-kiméra aminosavszekvenciáját mutatjuk be (egy betűs kóddal). A kapcsolópeptidet aláhúzással jelöltük.

A 12. ábrán a 3e-kiméra (sötét csillagok), az slL-6R/IL-6-kiméraprotein (sötét négyzetek), és két mutáns [Mutt39 (HD); sötét rombuszok] és Mutt-NHD (világos csillagok) F10.9-melanomasejtekre gyakorolt biológiai aktivitását mutatjuk be (lásd 9. példa).

A találmány szerinti megoldás értelmében slL-6R/IL-6-kiméraproteint és annak biológiailag aktív analógjait tárjuk fel, amelyek - egymáshoz kapcsolva az slL-6R természetben előforduló alakjának lényegében teljes egészét és az IL—6 természetben előforduló alakjának lényegében teljes egészét - a természetes slL-6R és IL—6 glikozilációs mintázatához hasonló glikozilációs állapotban - tartalmazza. A kiméraprotein komponensei egymáshoz kapcsolópeptiden keresztül kapcsolódhatnak, amely akár mindössze három aminosavas is lehet. Azt találtuk, hogy találmány szerinti megoldás szerint emlőssejtekben - közelebbről, humán sejtekben (lásd 1-4. példák) vagy CHO-sejtekben (lásd 6. példa) - előállított slL-6R/IL-6-kiméraprotein az ilyen sejtekben hatékonyan expresszálódik, nagymértékben glikozilálódik, és hatásos az olyan tumorsejtek szaporodásának gátlására, melyek az önmagában alkalmazott IL-6-ra vagy slL-6R-re egyáltalán nem érzékenyek.

Felismertük, hogy a találmány szerinti sIL—6R/IL—6kiméraprotein kisebb koncentrációban gátolja a nagymértékben malignus emlőssejtek (például F10.9-melanomasejtek) szaporodását, mint a nem fuzionált slL-6R és IL—6 elegyének hasonló mértékű gátlás eléréséhez szükséges koncentrációja. Ez különösen nagy jelentőségű annak ismeretében, hogy az F10.9melanomasejtek a csak IL—6-tal vagy csak slL-6R-rel végzett kezelés esetén normális szaporodást mutatnak, és szaporodásuk akkor kerül gátlás alá, ha a sej6

HU 225 855 Β1 teket a nem fuzionált IL—6 és slL-6R elegyének viszonylag nagy koncentrációjával érintkeztetjük. Ilyenformán, a találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, meglepő módon, hatásosabb inhibitora a nagymértékben malignus melanomasejteknek, mint különálló komponensei (vagyis a nem fuzionáltatott IL—6 és slL-6R) elegye. Ennek megfelelően, a találmány szerinti kiméraprotein aktív hatóanyagként különösen alkalmas különböző rákbetegségek kezelésére.

A találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein nagyobb affinitását az biztosítja, hogy a gp130-ra vonatkozó affinitása nagyobb, mint a nem fuzionáltatott IL—6 és SIL-6R elegyének affinitása (lásd 7. példa).

Felismertük továbbá, hogy a találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein különösen hasznos a csontvelő-átültetés eredményességének fokozására (lásd 4. példa). Humán csontvelősejtek súlyos, kombinált immundeficiens (SCID) egerekbe történő átültetésére ismert eljárást alkalmazva [melynek során a legprimitívebb - a recipiens csontvelőben hosszú időtartamú megtelepedésre képes - pluripotens vérképzési őssejtek életben maradásának és proliferációjának elősegítésére stem-sejt faktort (SCF) és Flt3-ligandumot használunk], azt találtuk, hogy ez a két faktor (SCF és Flt3-ligandum) nem elégséges a humán sejtek recipiens egér csontvelőjébe történő átültetésének elősegítésére, és az átültetés csak akkor volt sikeres, ha a találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraproteint Is alkalmaztuk. Ez a felismerés azt jelzi, hogy a kiméraprotein kulcsfontosságú az ilyen átültetési eljárásokban. Egy hasonló kísérletben a nem fuzionáltatott IL-6-ot és slL-6R-t külön-külön alkalmazva azt találtuk, hogy nem segítették elő a sikeres csontvelő-átültetést, sőt, együttesen adagolva is sokkal kisebb hatásuk volt, mint az slL-6R/IL-6-kiméraproteinnek (az slL-6R/IL-6-kiméraprotein 100 ng/ml hatékony koncentrációjánál sikeres csontvelő-átültetést tett lehetővé, míg a nem fuzionáltatott slL-6R és IL—6 sokkal nagyobb koncentrációban - az slL-6R 125-1250 ng/ml, az IL—6 50-200 ng/ml - együttesen adagolva is sokkal kisebb aktivitású volt).

A találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein előnyösen rekombináns, glikozilált slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely humán sejtekben vagy bármely alkalmas - a humán sejtekhez hasonló glikozilációt és poszttranszlációs módosításokat biztosító - emlőssejt expressziós rendszerben (például CHO-sejtekben) van előállítva. Az így előállított kiméra glikoprotein lényeges sajátsága, hogy ugyanolyan érési folyamaton és módosításokon megy keresztül, mint az emberi szervezetben az eredeti, természetes slL-6R- és IL-6-molekula (rövidülés, illetve nem természetes polipeptidszekvenciák hozzákapcsolódása nélkül), azzal a különbséggel, hogy a kiméraprotelnben az SIL-6R- és IL—6molekularész közé hosszabb-rövidebb kapcsolópeptid van beiktatva.

A találmány szerinti kiméraprotein előállításakor a természetben előforduló slL-6R és IL—6 következő tulajdonságait kell figyelembe venni. Ismert, hogy a humán sejtmembránokban lévő IL-6R-t egy 468 aminosavas aminosavszekvenciát (amely szignálpeptidből, immunglobulinszerű doménből, citokinkötő doménből, transzmembrán régióból és citoplazmikus doménből áll) kódoló cDNS kódolja [Yamasaki és munkatársai (1988)]. A testfolyadékokban az IL-6R oldékony alakja (sIL—6R) található meg, amely - hasonlóan a sejtmembránból származó, érett IL-6R-hez - a 20. leuclnnak megfelelő N-terminálist [Novick és munkatársai (1990)] és (közvetlenül az IL-6R transzmembrán régiója előtti, 356. valinnak megfelelő C-terminálist tartalmaz [Id. a jelen feltalálók által jegyzett 5 216 128 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás és EP 413.908 B1 számú európai szabadalmi leírás]. Az slL-6R szekvenciájának IL-6-hoz történő kapcsolása céljából a cDNS-be - a 356. valint kódoló kodon után EcoRI-felismerési helyet iktattunk be. A cDNS-be az EcoRI-hely után az érett IL—6 szekvenciáját iktattuk be (amely az IL-6-cDNS 29. prolinjával kezdődik és 212. metioninjával végződik). Ennél az EcoRI-helynél iktatható be a kívánt hosszúságú kapcsolópeptid-szekvencia, amely a kiméraproteinben elválasztja az slL-6Rés IL-6-molekularészt. Ahogy azt a későbbi kísérleti példákban leírjuk, a találmány szerinti megoldás értelmében előállítható, lehetséges kiméraproteinek példáiként két különböző kiméramolekulát állítottunk elő; az egyik egy három aminosavas tripeptid kapcsolószekvenciát, míg a másik egy 13 aminosavas kapcsolószekvenciát tartalmaz (s mindkettő lényegében azonos biológiai aktivitást fejt ki).

A találmány tárgyához tartoznak a találmány szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein analógjai is, amelyek a - lényegében az slL-6R és IL—6 természetben előforduló aminosavszekvenciáját tartalmazó - kiméraproteinnel gyakorlatilag azonos biológiai aktivitásúak. Az ilyen analógok annyiban különböznek az eredeti kiméramolekulától, hogy az slL-6R- és/vagy IL-6-molekularészben legfeljebb kb. 30 aminosavat érintő deléciót, addíciót vagy szubsztitúciót hordozhatnak, azzal, hogy az ilyen módosítások a kiméraprotein-analóg biológiai aktivitását az eredeti kiméramolekula aktivitásához képest gyakorlatilag nem változtatják meg, és az ilyen analógokban az slL-6R-komponens szerkezete lényegében megegyezik a természetes SIL-6R szerkezetével (az érési folyamat előtt, lásd 3. ábra), azaz szignálpeptidet, Ig-szerű domént, citokinreceptor N-domént, citokinreceptor C-domént és receptor premembrán domént tartalmaz. Hasonlóan, a kiméraprotein-analógok IL-6-komponense lényegében azonos az IL—6 természetben előforduló, érett alakjával. A szóban forgó analógok egymástól és a kiindulási (lényegében csak természetben előforduló slL-6R- és IL-6-szekvenciát tartalmazó) kiméramolekulától legnagyobb mértékben az slL-6R- és IL-6-komponenst összekötő kapcsolópeptidben térnek el. A kapcsolópeptid legfeljebb kb. 30 aminosavas lehet, és a kiméraproteinben az slL-6R- és IL-6-molekularész elkülönítésére szolgál. A kiméraprotein-analógok előállítása során figyelmet kell fordítani a kapcsolópeptid szekvenciájának megválasztására (és az egyes analógok - megfelelő, standard vizsgálati eljárással végzett - biológiai tesztelésé7

HU 225 855 Β1 re), hogy kiküszöböljük a kiméraprotein nem megfelelő „folding”-ját (ami inaktivitást okozhat), és hogy ne hozzunk létre olyan kiméraprotein-analógot, amely immunogénként működhet, ami a kezelni kívánt páciensben immunreakció kiváltását eredményezné, és ezáltal az analóg - legalábbis a közép- és hosszú távú gyógykezelésekben - hatástalanná válna.

A találmány szerinti kiméraproteinek analógjaiban az eredeti (lényegében csak természetben előforduló SIL-6R- és IL-6-szekvenciából álló) kiméraprotein egy vagy több - de legfeljebb 30 aminosava - más aminosawai van helyettesítve (vagy delécióval el van távolítva), vagy az ilyen analógok egy vagy több további aminosavat tartalmaznak, azzal, hogy a találmány szerinti, eredeti kiméraproteinhez képest aktivitásuk nem változik meg jelentős mértékben. Ezek az analógok ismert szintetizálási és/vagy helyspecifikus mutagenizálási technikák (vagy más alkalmas eljárások) alkalmazásával állíthatók elő.

Az ilyen analógok - a találmány szerinti kiméraproteinéhez lényegében hasonló biológiai aktivitás kifejtése érdekében - előnyösen olyan aminosavszekvenciát tartalmaznak, amelyek a kiindulási slL-6R/IL-6-kiméraprotein aminosavszekvenciájának elégségesen közeli másai. Ilyenformán, az analógokat a 2-4. példákban leírt biológiai aktivitási tesztekkel vizsgálva meghatározhatjuk, hogy egy adott analóg lényegében azonos aktivitású-e, mint az eredeti kiméraprotein.

A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazható kiméraprotein-analógok (illetve az azokat kódoló nukleinsavak) közé tartozik a lényegében egymásnak megfelelő szekvenciák (szubsztítuált peptidek, illetve polinukleotidok) véges számú sorozata, amelyek előállítása a találmány leírása és kitanítása alapján szakember számára - elvárható mennyiségű kísérleti munka elvégzésével - könnyen végrehajtható. A proteinek kémiáját és szerkezetét illetően lásd Schulz és munkatársai: „Principles of Protein Structure”, Springer-Verlag, New York (1978), Creighton: „Proteins: Structure and Molecular Properties”, Freeman & Co., San Francisco (1983), mely forrásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni. A nukleotidszekvencia szubsztitúcióinak (így a kodonpreferenciák) leírását illetően lásd Ausubel és munkatársai, lásd fentebb, §§ A.1.1-A.1.24; Sambrook és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology”, Interscience, N. Y„ §§ 6.3 és 6.4 (1987, 1992), C és D függelék.

A találmány szerinti kiméraprotein-analógok előnyös módosításai a „konzervatív” szubsztitúciókként ismert aminosavhelyettesítések. A lényegében csak természetes slL-6R és IL-6-szekvenciákat tartalmazó kiméraprotein konzervatív aminosavszubsztitúciói közé tartoznak a hasonló fizikokémiai tulajdonságokkal bíró aminosavak közötti szubsztitúciók; a hasonló tulajdonságú aminosavak csoportjain belüli szubsztitúciók nem módosítják a molekula biológiai funkcióját [Grantham: Science 185, 862 (1974)]. Kézenfekvő, hogy a fenti szekvenciákban aminosavinszerciók és -deléciók is végrehajthatók, anélkül, hogy az analóg funkciója megváltozna, különösen, ha az inszerciók vagy deléciók csak néhány (például harmincnál kevesebb, előnyösen tíznél kevesebb) aminosavat érintenek, és nem érintenek olyan aminosavakat, amelyek a funkcionális konformáció fenntartása szempontjából alapvető jelentőségűek [mint például a ciszteinek; Anfinsen: „Principles That Govem The Folding of Protein Chains, Science 181, 223 (1973)]. Az ilyen deléciókkal és/vagy inszerciókkal létrehozott analógok szintén a találmány tárgyához tartoznak.

A rokon aminosavak találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös csoportjait az 1. táblázatban; a még előnyösebb csoportokat a 2. táblázatban, s a legelőnyösebb csoportokat a 3. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

A rokon aminosavak előnyös csoportjai

Aminosav	Rokon aminosavak csoportja
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Alá, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Alá, Gly, His, Gin, Thr
Alá	Gly, Thr, Pro, Alá
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Alá, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, He. Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

2. táblázat

A rokon aminosavak még előnyösebb csoportjai

Aminosav	Rokon aminosavak csoportja
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Alá, Pro
Thr	Thr
Alá	Pro, Alá
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	He, Met, Phe, Val, Leu

HU 225 855 Β1

2. táblázat (folytatás)

Aminosav	Rokon aminosavak csoportja
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp

3. táblázat

A rokon aminosavak legelőnyösebb csoportjai

Aminosav	Rokon aminosavak csoportja
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Alá	Alá
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Trp

A találmány szerinti kiméraprotein analógjainak létrehozására alkalmas aminosavszubsztitúciók bármely ismert eljárással végrehajthatók [Id. például RE 33 653,

959 314, 4 558 585 és 4 737 462 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Mark és munkatársai);

116 943 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Koths és munkatársai); 4 965 195 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Namen és munkatársai); 4 879 111 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Chong és munkatársai); és 5 017 691 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Lee és munkatársai); a lizinnel szubsztituált proteineket illetően lásd

904 584 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Shaw és munkatársai).

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti kiméraprotein bármely analógja olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely lényegében megfelel a találmány szerinti eredeti kiméraprotein aminosavszekvenciájának. Az eredeti kiméraprotein aminosavszekvenciájának „lényegében megfelelő” kifejezés olyan analógokra vonatkozik, amelyek az eredeti kiméraprotein szekvenciájához képest csak minimális módosításokat hordoznak, melyek nem befolyásolják alapvető sajátságaikat (különösen a rákos sejtek proliferációját gátló vagy a csontvelő-átültetés sikerét elősegítő képességüket). Az eredeti kiméraprotein aminosavszekvenciájának „lényegében megfelelő” kifejezés értelmébe tartozó módosítások azok, amelyek a találmány szerinti kiméraproteint kódoló DNS hagyományos mutagenizálási technikáival létrehozhatók, s amelyek csak néhány kisebb változáshoz vezetnek.

A találmány szerinti analógok közé tartoznak a találmány szerinti kiméraproteint kódoló - az SIL-6R és IL—6 természetben előforduló kódolószekvenciáinak lényegében teljes egészét tartalmazó - DNS-sel vagy RNS-sel sztringens feltételek mellett hibridizálódó DNS, illetve RNS által kódolt analógok. Például az ilyen hibridizálódó DNS vagy RNS a 3. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó, találmány szerinti proteinnel azonos proteint kódolhat, miközben nukleotidszekvenciája - a genetikai kódol degeneráltságának köszönhetően - eltér a természetben előforduló nukleotidszekvenciától; azaz egy némileg eltérő nukleinsavszekvencia - a degeneráltság révén - ugyanazon aminosavszekvenciát kódolhatja. Az ilyen analógokban az aminosawáltozások (deléciók, addíciók és szubsztitúciók) száma legfeljebb kb. 30 lehet, vagyis még a maximális számú módosult aminosavat tartalmazó, találmány szerinti analógoknak is tartalmazniuk kell az slL-6R vezetőszekvenciáját [érés („Processing”) előtt], Ig-szerű doménjét, citokinreceptor N- és C-doménjét és a receptor premembrán régiót (a C-domén és a transzmembrán dómén közötti régió), illetve lényegében a teljes IL-6-ot. Az ilyen nukleinsav különösen alkalmas annak eldöntésére, hogy a találmány szerinti kiméraprotein funkcionális aktivitását megtartó polipeptidet kódol-e. A „sztringens feltételek” kifejezésen olyan hibridizációs és mosási feltételeket értünk, amelyet szakember általában sztringensnek nevez [Id. Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology”, Interscience, N. Y. § 6.3 és 6.4 (1987, 1992); és Sambrook és munkatársai, lásd fentebb]. A sztringens feltételek példáiként említhetők, többek között, a vizsgált hibrid számított olvadáspontjánál 12-20 °C-kal kisebb hőmérsékleten, például 2*SSC és 0,5% SDS elegyében 5 percig, majd 2*SSC és 0,1% SDS elegyében 15 percig végzett mosás; majd 37 °C-on, 0,1*SSC és 0,5% SDS elegyében 30-60 percig végzett mosás, végül 68 °C-on, 0,1*SSC és 0,5% SDS elegyében 30-60 percig végzett mosás. Szakember számára kézenfekvő, hogy a sztringens feltételek a kérdéses

HU 225 855 Β1

DNS-szekvenciák, oligonukleotidpróbák (például 10-40 bázis) vagy kevert oligonukleotidpróbák hosszúságától is függnek. Kevert próbák alkalmazása esetén SSC helyett előnyösen tetrametil-ammónium-kloridot (TMAC) alkalmazhatunk (Ausubel és munkatársai, lásd fentebb).

A „sók” kifejezésen a találmány szerinti kiméraprotein (vagy analógjai) karboxilcsoportjainak sóit és aminocsoportjainak savadd íciós sóit értjük. A karboxilcsoportok sói ismert eljárásokkal állíthatók elő; az ilyen sók közé szervetlen sók [például nátrium-, kalcium-, ammónium-, vas(lll)- vagy cinksók], illetve szerves bázisokkal [például aminokkal (például trietanol-aminnal), argininnel vagy lizinnel, piperidinnel, prokainnal stb.] képzett sók tartoznak. A savaddíciós sók között említhetők az ásványi savakkal (például sósavval vagy kénsawal) alkotott sók, valamint a szerves savakkal (például ecetsavval vagy oxálsawal) képzett sók. Természetesen az ilyen sóknak a találmány szerinti kiméraprotein (vagy annak analógjai) biológiai aktivitásával lényegében hasonló aktivitást kell kifejteniük.

Szintén a találmány tárgyához tartoznak a találmány szerinti kiméraproteint és analógjait kódoló DNSszekvenciák, valamint az ilyen DNS-szekvenciákat hordozó DNS-vektorok, melyek megfelelő emlőseredetű előnyösen humán eredetű - sejtekben történő expresszáltatásra alkalmasak. A találmány szerinti vektor egyik megvalósítási módját képezi a pcDNAslL-6R/IL-6-plazmid, amely - slL-6R/IL-6-kiméraproteint kódoló DNS-szekvenciát citomegalovírus (CMV)promoter szabályozása alatt tartalmazó - pcDNA3vektort (Invitrogen) tartalmaz.

A találmány tárgyát képezik a transzformált emlőseredetű - előnyösen humán eredetű - sejtek, amelyek képesek a találmány szerinti kiméraproteinek expresszáltatására. Az ilyen transzformált sejtek egyik megvalósítási módját képezik a - pcDNAslL-6R/IL-6plazmiddal transzfektált - 293-as humán embrionális vesesejtek (HEK 293; ATCC CRL 1573), amelyek az slL-6R/IL-6-kiméraproteint 85 kD-os glikoprotein alakjában szekretálják.

A találmány szerinti vektor egy másik megvalósítási módja a pcDNAslL-6R/L/IL-6-plazmid, amely annyiban tér el a fenti pcDNAslL-6R/IL-6-plazmidtól, hogy EcoRI-helyén tíz további aminosavat kódoló kapcsolószekvenciát tartalmaz. A kiméraprotein slL-6R és IL—6 komponense közötti távolság optimalizálása céljából különböző hosszúságú kapcsolószekvenciák iktathatok be.

A találmány tárgyához tartozik az sIL—6R/IL—6-kiméraprotein azon változata, amelyben az IL-6-komponens az slL-6R előtt helyezkedik el (ahogy a 11. ábrán látható).

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti kiméraprotein (illetve analógjai) előállítására és tisztítására, melynek során a fentebb leírt, transzformált sejteket olyan feltételek mellett tenyésztjük, melyek elősegítik a kiméraprotein-termék expresszióját és a tenyésztő tápközegbe történő kiválasztódását, majd a kiválasztott proteint - monoklonális anti-sIL—6R 34.4-antitestek alkalmazásával - immunaffinitási kromatográfiával tisztítjuk (lásd 2. és 5. példa).

Szintén a találmány tárgyát képezi egy gyógyászati készítmény, amely aktív komponensként SIL-6R/IL-6kiméraproteint, annak analógjait, ezek elegyeit vagy sóit, illetve gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, hígítószert vagy kötőanyagot tartalmaz. A találmány szerinti gyógyászati készítmény egyik megvalósítási módját olyan gyógyászati készítmény képezi, amely fokozott IL—6 típusú hatás kifejtésére, rák kezelésére, csontvelő-átültetés elősegítésére, vérképződés (elsősorban a trombopoiesis) fokozására, neurológiai rendellenességek kezelésére, májrendellenességek kezelésére, illetve az IL—6 és a vele rokon citokinek egyéb alkalmazási területein történő felhasználásra alkalmas.

A találmány szerinti gyógyászati készítményeket az adagolhatóság céljából úgy állítjuk elő, hogy a kiméraproteint vagy analógjait fiziológiai szempontból elfogadható hordozókkal és/vagy stabilizálószerekkel és/vagy kötőanyagokkal elegyítjük, majd az elegyet dózisalakokká formáljuk (például fiolákban liofilizáljuk). Az adagolás a hasonló hatóanyagok bármely elfogadott beadási módján végrehajtható (a kezelni kívánt állapottól függően), így például intravénásán, intramuszkulárisan, szubkután, helyileg vagy infúzióval stb. Az adagolni kívánt aktív hatóanyagok mennyisége a beadás módjától, a kezelni kívánt betegségtől és a páciens állapotától függően határozható meg. Például helyi injektáláshoz kisebb mennyiségű proteinre van szükség, mint intravénás infúzió esetén.

A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti kiméraprotein vagy analógjai (vagy azok elegyei) alkalmazása rákbetegségek kezelésére, csontvelő-átültetés elősegítésére, vérképződés (elsősorban a trombopoiesis) fokozására, neurológiai állapotok kezelésére, májszövet vegyszerek (például szén-tetraklorid, alkohol, paracetamol) vagy más hatások (például vírusok, sebészeti beavatkozások) okozta nekrózissal szembeni védelmére, valamint a találmány szerinti kiméraprotein vagy analógjai (vagy azok elegyei) alkalmazása az IL-6 és a rokon citokinek egyéb felhasználási területein. Szintén a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti kiméraprotein vagy analógjai (vagy azok elegyei) a felsorolt rendellenességek kezelésére, illetve a fentebb említett indikációk esetén alkalmas gyógyszerek előállítására történő alkalmazásra.

A fenti kezelési eljárásokon kívül a találmány tárgyához tartoznak a találmány szerinti kimérával és/vagy az azt kódoló DNS-sel végzett ex vivő eljárások, illetve génterápiás eljárások.

A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a kísérleti példák, illetve a mellékelt ábrák segítésével szemléltetjük.

1. példa

Az slL-6RöVal/IL-6-kiméraprotein expressziós vektorának előállítása

Az 1. ábrán az slL-6R5Val/IL-6-kiméraproteint kódoló nukleotidszekvenciát hordozó expressziós vektor

HU 225 855 Β1 előállításának folyamatábráját mutatjuk be, feltüntetve a különböző kiindulási és köztestermék-vektorokat, a felhasznált reagenseket és reakciólépéseket. E vektor létrehozása során lényegében az expressziós vektorok előállítására általánosan alkalmazott technikákat alkalmaztuk [Id. például Sambrook és munkatársai (1989)]. Az eljárás rövid leírását a következőkben ismertetjük.

T47D humán emlőkarcinóma-sejtekből származó cDNS-könyvtárat Xgt 11-bakteriofágba klónoztunk, és a könyvtárat Yamasaki és munkatársai (1988) által leírt IL-6R-szekvenciából származó oligonukleotidpróbák alkalmazásával szkríneltük. Izoláltunk egy Xgt11cDNS-klónt, amely a teljes humán IL-6R-kódolószekvenciát tartalmazta. Az inszertet EcoRI-endonuklázzal kivágtuk a Xgt11-ből, és a BlueScript pBS/SK E. coli fágemid (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornia) sok felismerési helyet tartalmazó régiójába („multiple cloning site”, MCS) klónoztuk. Az így kapott pBS/SK-IL6R-plazmidot (lásd 1. ábra) EcoRI-gyel hasítottuk, majd a fragmenst tompa végűvé alakítottuk, és EcoRV-tel visszavágtuk, miáltal - az IL-6R EcoRV-helyével (1203. bp) végződő - 959 bázispáros IL-6R 5’-fragmenst izoláltuk. Ezt a fragmenst agarózgélelektroforézissel izoláltuk, majd - az MCS EcoRV-helyén felnyitott - új pBS/SK-vektorba klónoztuk (pBS/SK-slL-6R-RV; lásd 1. ábra).

A korábban kapott pBS/SK-IL-6R-DNS-t polimerázláncreakciónak (PCR) vetettük alá, miáltal a 1137-1156. 5’-láncindító és a 1505-1488. 3’-láncindító közötti 368 bp-os fragmenst amplifikáltuk. Olyan 3'-láncindítót szintetizáltunk, amely közvetlenül az IL-6R 356. valinjának [amelyről korábban meghatározták, hogy az emberi vizeletbe kiválasztott, oldható slL-6R természetes alakjának C-terminális aminosava; lásd Novick és munkatársai (1990); Oh és munkatársai (1996); a jelen feltalálók által jegyzett 5 216 128 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás és EP 413908 B1 számú európai szabadalmi leírás] kodonja után EcoRI-helyet tartalmaz (lásd 1. ábra). A kapott pBS-slL-6R-őVal-RI-plazmidot - az 5'-oldali nem transzlálódó szekvenciák eltávolítása érdekében - lerövidítettük, oly módon, hogy az MCS Hindlllhelyét az IL-6R 410. bázispárjánál lévő Ncol-helyhez ligáitok (mindkét helyet előzetesen tompa végűvé alakítva), miáltal a pBS-slL-6R-8Val-RI-Ncol-plazmidot kaptuk (lásd 1. ábra).

Az IL-6-szekvenciát a pKK62-7-plazmidból származtattuk, mely plazmidot korábbi leírás szerint [Chen és munkatársai (1988)], a BstNI-gyel hasított IFNp2/IL-6-cDNS-nek [Zilberstein és munkatársai (1986)] a pKK223-3 expressziós vektor (Pharmacia, Uppsala, Svédország) EcoRI-helyére történő inszertálásával állítottunk elő, melynek során - EcoRI-helyet, metioninkodont, az IL—6 29, prolinját kódoló kodont tartalmazó, és a BstNI (EcoRII) felismerési hellyel végződő - szintetikus oligonukleotidot alkalmaztunk. A pKKp2-7-plazmid IL-6-cDNS-inszertje a lánczáró kodon után 7 bázispárral, NlalV-hellyel végződik, és azt 11 bázispárnyira a pKK223-3-vektor HindiIl-helye követi (1. ábra). A pKKp2-7-DNS-t Hind11l-mal hasítottuk, tompa végűvé alakítottuk, majd EcoRI-gyel visszavágtuk, és az IL—6cDNS-t a pBS-slL-8Val-RI-Ncol-plazmidba inszertáltuk, miáltal az érett - 29. prolinnal kezdődő - IL—6szekvenciát közvetlenül az IL-6R-szekvencia 356. valinja után kapcsoltuk, s a két szekvencia között csak három kodon (Glu-Phe-Met) helyezkedett el. Az így kapott pBS/SK-slL-6R/IL-6-plazmidot (1. ábra) a sokszoros klónozóhelyén (MCS) lévő Sáli- és Notl-helyén hasítottuk, és a kivágott szakaszt a pcDNA3-plazmid (Invitrogen Corporation, San Diego, Kalifornia, USA) EcoRV-helyére klónoztuk. Az így kapott pCDNA3slL-6R/IL-6-plazmid (1. ábra) a hatékony citomegalovírus (CMV)-promotertől 3’-irányban lévő inszertet tartalmaz, melyet poliadenilációs hely követ, ami az slL-6R8Val/IL-6-kiméra hatékony transzkripcióját biztosítja. A kimérában az slL-6R 5’-végének konzerváltsága biztosítja, hogy emlőssejtekben történő expressziót követően a szignálpeptid funkciója és a kiméraprotein-N-terminálisának érése a természetes slL-6R-éhez hasonló legyen.

Ahogy fentebb említettük, az slL-6R8Val/IL-6konstrukció előnyös tulajdonsága, hogy lényegében az slL-6R és az IL—6 - emberi szervezetben megtalálható - természetes alakjának fúziójából áll, külső eredetű polipeptidszekvenciák nélkül. Mindazonáltal, az slL-6R8Val/IL-6-konstrukcióban meglévő EcoRI-hely (1. ábra) lehetővé teszi, hogy az SIL-6R- és IL-6-komponens közé kapcsolópeptid-szakaszokat lehessen beiktatni. Előállítottunk egy olyan konstrukciót, amely az slL-6R 356. valinja és az IL—6 29. prolinja között 13 aminosavas kapcsolószekvenciát (Glu-Phe-Gly-AlaGly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-Phe-Met) tartalmaz, s ezt slL-6R6Val/L/IL-6-nak neveztük el.

2. példa

Az slL-6R8Val/IL-6-kiméra expresszáltatása humán sejtekben

Az 1. példában leírtak szerint előállított plazmidkonstrukciót humán sejtek transzfektálására alkalmaztuk, melynek során az emlőseredetű sejtek tenyésztésének és transzfektálásának standardeljárásait alkalmaztuk, és a transzferált sejtekben vizsgáltuk a bejuttatott DNS-szekvencia expresszióját. Az alkalmazott eljárásokat a következőkben ismertetjük.

Humán HEK293-sejteket (ATCC CRL 1573; transzformáit, primer humán embrionális vesesejtek) az 1. példában leírtak szerint előállított pCDNA3-slL-6R/IL-6DNS-sel transzferáltunk. A logaritmikus szaporodási fázisban lévő HEK293-sejteket tripszinnel kezeltük, és cm-es Nunc-tálcákra (2,5* 10⁶ sejt/tálca) helyeztük. Egy nappal később a sejteket kalcium-foszfátos precipitáció [Sambrook és munkatársai (1989) alkalmazásával pg pCDNA3-slL-6R/IL-6-DNS-sel transzferáltuk, majd egy nappal később a tápközeget 10% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM-tápközeggel helyettesítettük, és a tenyésztést további 16 óra hosszat folytattuk. Ezt követően a tápközeget 2% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM-tápközegre cseréltük, és a kiválasztott proteineket két egymást követő, 48 órás periódusban összegyűjtöttük. A sejttörmeléket 10 percig 1000-es percenkénti fordulatszámmal végzett centrifugálással le11

HU 225 855 Β1 ülepítettük, és a felülúszót - nyúleredetű poliklonális anti-sIL—6R antitest és egéreredetű McAB17.6 antitest [Novick és munkatársai (1991)] alkalmazásával ELISAvizsgálattal slL-6R-re teszteltük. A mintában 1,2 pg/ml slL-6R-egyenértéket mértünk, ami arra utal, hogy a transzfektált humán sejtekben az slL-6R/IL-6-kiméraprotein nagyon hatékonyan expresszálódott.

A kiválasztott slL-6R/IL-6-kiméraprotein immunológiai tisztítását a humán slL-6R extracelluláris doménjének egyik epitópjára specifikus 34.4-es monoklonális antitest [Novick és munkatársai (1991); Halimi és munkatársai (1995)] alkalmazásával hajtottuk végre. A 34.4-es hibridómasejteket egerek hasüregében szaporítottuk, és az egerek hasűri folyadékából - ammónium-szulfátos precipitációval - immunglobulin-frakciót tisztítottunk. A 34.4-es monoklonális antitestet „Affigel10” gyantán (Bio-Rad Labs., Richmond, Kalifornia, USA) immobilizáltuk (15 mg lg/1 ml Affigel-10). A pCDNA3-slL-6R/IL-6-plazmiddal transzfektált HEK293-sejtek által kiválasztott proteineket tartalmazó felülúszót az immobilizált 34.4-es monoklonális antitestet tartalmazó oszlopokon (15 ml felülúszó/0,3 ml oszloptérfogat) abszorbeáltuk. Foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) végzett mosás után a megkötődött proteineket 25 mM citromsavval (pH=2,5) eluáltuk, majd az eluátumot 1 M Hepes-pufferrel (pH=8,5) semlegesítettük és egy éjszakán keresztül (kb. 8-12 óra hosszat) foszfátpufferelt sóoldattal szemben dializáltuk.

Az immuntisztított protein SDS-PAGE elektroforézissel végzett analízisét követően, „Coomassie-blue” színezékkel végzett festést követően egyetlen proteinsávot kaptunk (lásd 2. ábra). E protein molekulatömege - az slL-6R8Val glikozilált alakjának (60 kD; lásd Oh és munkatársai (1996)] és a glikozilált IL—6 (23-26 kD; Zilberstein és munkatársai (1986)] fúziója alapján várt molekulatömegnek megfelelően - 85 kD volt. Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein aminosavszekvenciája 543 aminosavat tartalmaz, ami a szignálpeptidek leválása után 524 aminosavas protein (kb. 58 kD) proteint eredményez (3. ábra). A humán sejtekben rekombináns DNS-ből előállított slL-6R/IL-6-kiméraprotein sokkal nagyobb mérete azt jelzi, hogy a glikoziláció a molekula jelentős méretnövekedését eredményezi.

3. példa

Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein gátolja a metasztázisos melanomasejtek szaporodását és azok differenciálódását indukálja

A B16-melanomasejtekből származó F10.9-klón C57Black/6-egerekben nagymértékben metasztázisos tumorokat képez, melyek eredményeként az állatok 2-3 hónapon belül tüdőmetasztázis következtében elpusztulnak [Katz és munkatársai (1995)]. Ha az F10.9sejtek tenyészetéhez slL-6R/IL-6-kiméraproteint adtunk, a sejtek morfológiája jelentős mértékben megváltozott, s szaporodásuk leállt (4. ábra). A kiméraproteinnel kezelt F10.9-sejtek meghosszabbodtak, és dendritszerű nyúlványok jelentek meg rajtuk, ami az embrionális melanociták vagy gliasejtek orsószerű differenciálódására emlékeztet.

A sejtek szaporodásának meghatározása céljából 96 üregű mikrotitertálca üregeibe - 10% magzati borjúszérumot tartalmazó 0,2 ml RPMI1640-tápközegben 3*10^{3 *} sejtet helyeztünk, és a sejtek szaporodását négy nap elteltével értékeltük. A sejteket 12,5% glutáraldehiddel 30 percig fixáltuk, vízzel mostuk, majd 30 percig 0,1 %-os kristályibolyával festettük. Alapos mosás és szárítás után a festéket 10% ecetsavval kivontuk, és 540 nm-nél meghatároztuk az optikai denzitást. A kiméra a szaporodás dózisfüggő gátlását eredményezte; a teljes gátlás már 10 ng/ml kiméra(p85-) koncentrációnál jelentkezett (lásd 5. ábra). A két kiméraprotein, az slL-6RőVal/IL-6 és az slL-6R6Val/L/IL-6 (mely utóbbi a két komponens között hosszabb kapcsolószekvenciát tartalmaz, lásd 1. példa), hasonló aktivitást mutatott. Ez az eredmény azt is jelzi, hogy a kiméra slL-6Rés IL-6-molekularésze közötti kapcsolópeptidnek a kiméra aktivitása szempontjából nincs kulcsfontosságú jelentősége, hiszen az slL-6R5Val/IL-6-kiméra csak nagyon rövid, három aminosavas kapcsolópeptidet tartalmaz, az slL-6RöVal/L/IL-6 kapcsolópeptidje pedig 13 aminosavas, mégis, a két kiméraprotein a metasztázisos sejtek szaporodását lényegében azonos aktivitással gátolja. Ezzel szemben, önmagában sem az IL—6, sem az slL-6R5Val nem gátolja e melanomasejtek szaporodását (lásd 6. ábra), ami az sIL—6R/IL—6(p85-) kiméraprotein egyedülálló aktivitását bizonyítja. A p85-kiméraproteinéhez hasonló gátló aktivitás eléréséhez 200-400 ng/ml IL—6 és 125 ng/ml slL-6R6Val elegyének alkalmazására van szükség (lásd 6. ábra). Moláris koncentrációban számítva az F10.9-sejtek szaporodásának maximális gátlásához 7,5 nM IL—6- és 2 nM slL-6R8Val-koncentrációra van szükség, míg az slL-6R/IL-6-kiméraproteinből ugyanehhez csupán 0,12 nM is elegendő.

Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein (p85) szaporodást gátló aktivitását az immobilizált 34.4-es monoklonális antitestet tartalmazó oszlopokon végzett immuntisztítás folyamán végig követtük (lásd 2. példa). Az aktivitás mintázata megfelelt az SDS-PAGE-géleken vizsgált különböző frakciókból kapott p85-sávok 2. ábrán látható intenzitásának.

4. példa

Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein alapvető jelentőségű a humán csontvelő-átültetés sikerének elősegítésében

A humán csontvelőből származó vérképzési őssejtek átültetésének sikerességét súlyos, kombinált immundeficienciában (SCID) szenvedő [Vormoor és munkatársai (1994)] történő transzplantációt követően vizsgáltuk. SCID-NOD-egereket letális küszöb alatti dózisú sugárzásnak vetettünk alá, és az egerek farki vénájába 3*10⁵ humán CD34⁺ csontvelősejtet injektáltunk. Az injektálást megelőzően a tisztított CD34⁺-sejteket három napig - különböző koncentrációjú citokineket tartalmazó - folyadéktenyészetekben tartottuk. Egy hónap elteltével az egereket leöltük, és csontjaikat - a csontvelősejtek kinyerése céljából - kioperáltuk. A humán sejtek recipiens SCID-NOD-egerekben történő

HU 225 855 Β1 megtelepedését humán eredetű ismétlődő DNS-sel végzett Southern-blot hibridizációval értékeltük.

A stem-sejt faktort (SCF; „steel” faktor vagy c-kitligandum) és az Flt3-ligandumot (flt3/flk2 tirozinkináz receptorligandum) lényegesnek bizonyult a recipiens csontvelőben való hosszú időtartamú megtelepedésre képes, primitív pluripotens vérképzést őssejtek többségének életben maradása és proliferációja szempontjából [McKenna és munkatársai (1995)]. Mindazonáltal, ahogy a 7. ábrán látható, és a két faktor önmagában nem elégséges a humán vérképzési őssejtek recipiens SCID-NOD-egerek csontvelőjében történő megtelepedésének elősegítésére. Nagyobb mértékű megtelepedés eléréséhez az slL-6R/IL-6-kiméraprotein hozzáadására volt szükség. Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein 100 ng/ml koncentrációban sokkal aktívabb volt, mint az izolált IL-6 (50-200 ng/ml) és SIL-6R (125-1250 ng/ml; lásd 7. ábra). Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein szükségessége azt jelzi, hogy ez a protein kulcsfontosságú a pluripotens vérképzési őssejtek életben maradása és proliferációja szempontjából, amelyek képesek megtelepedni és újranépesíteni a csontvelőkörnyezetet. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a találmány szerinti kiméraprotein hasznos lehet a klinikai csontvelő-átültetési eljárásokban.

Kísérleteink eredményei elsőként bizonyítják, hogy az slL-6R/IL-6-kiméraprotein legalább a következő két - újonnan felismert - aktivitással bír:

(i) A kiméraprotein - primitív humán vérképzési őssejteknek az SCF-fel és az Flt3-ligandummal együtt adagolva - elősegíti túlélésüket és proliferációjukat; és (ii) Humán csontvelő-átültetés immundeficiens egérben létrehozott in vivő modelljében aktivitást mutat (s e tekintetben nyilvánvalóan kulcsfontosságú jelentőséggel bír).

5. példa

Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein aktivitást fejt ki a nagymértékben tisztított, primitív vérképzési őssejtekre

Humán köldökzsinórból származó egymagvú vérsejteket - Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország), majd „mini-MACS reagenskészlet (Miltney Biotec, Bergisch Gladbach, Németország) alkalmazásával - a kis denzitású egymagvú sejtek (NMC) frakcionálásának vetettük alá, miáltal CD34⁺-sejtek 80%-ban tiszta populációját kaptuk. Ezeket a sejteket immobilizált anti-CD38 monoklonális antitestet tartalmazó oszlopon engedtük át vagy fluoreszcencia-aktiválta sejtosztályozással osztályoztuk, miáltal - az eredeti sejtek kb. 0,1%-át kitevő CD34⁺CD38~ populációt kaptuk. Ezeket a tisztított őssejteket (20 000 db) - 10% magzati borjúszérumot és 1% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó - 0,5 ml RPMI-tápközegben [50 ng/ml stem-sejt faktor (SCF) és 100 ng/ml flt3-ligandum (FL; mindkettő az R&D Systems-től származik, Minneapolis, MN, USA) jelenlétében] szuszpenziós tenyészetbe helyeztük. A tenyészetek felét 100 ng/ml slL-6R/IL-6-kiméraproteinnel egészítettük ki, míg a másik felét kiméraprotein nélkül tenyésztettük. Az inkubálást 5% CO₂ jelenlétében, 37 °C-on hat napig végeztük. A csontvelőt újratelepítő sejtek számának meghatározása érdekében az in vitro tenyészetekből származó összes sejtet intravénásán - letális küszöb alatti dózisú sugárzással kezelt - NOD-SCID-egerekbe injektáltuk, majd az egereket csíramentes körülmények között tartottuk. Hat hét után az egereket leöltük, s hosszú csontjaikból kinyertük a csontvelőt. A kinyert csontvelősejteket - 30% magzati borjúszérumot, 50 μΜ β-merkapto-etanolt, 50 ng/ml SCF-et, 5 ng/ml IL-3-at, 5 ng/ml GM-CSF-et, 6 egység/ml eritropoietint (valamennyi az R&D Systems terméke) tartalmazó félszilárd 0,9% metil-cellulóz lemezekre szélesztettük. A tenyészetek humán vérszérumot is tartalmaztak, ami olyan feltételeket biztosít, melyek meggátolják az egéreredetű sejtek telepképződését. A 4. táblázatban bemutatott eredmények azt jelzik, hogy az sIL—6R/IL-6kiméraprotein szuszpenziós tenyészethez történő hozzáadása 30-50-szer nagyobb arányban növelte a transzplantáción átesett egerekből kinyert humán telepképző sejtek (CFU) számát, mint a csak CSF-fel és Flt3-ligandummal kezelt tenyészetből származó humán őssejtekkel beoltott egerekből kinyert csontvelőben. Ez azt jelzi, hogy a szuszpenziós tenyészetekben az SCID-egerek csontvelőjét újratelepítő őssejtek száma a 6. napon sokkal nagyobb volt, mint a 0. napon. Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein hiányában az SCF és az Flt3-ligandum (FL) - a hat napos szuszpenziós tenyésztés során - nem növelte az őssejtek számát. A transzplantáción átesett NOD/SCID-egerekből kinyert csontvelősejtek DNS-ét a 4. példában leírtak szerint Southem-blot hibridizációval vizsgáltuk. A kiméraproteinnel tenyésztett sejtekkel beoltott egerek csontvelősejtjeiben a humán DNS mennyisége kb. 10-szer nagyobb volt, mint a kiméra nélkül tenyésztett sejtekkel beoltott egerekből származó csontvelősejtekben.

A NOD/SCID-egerek csontvelőjéből származó CFU-őssejtek csak akkor alakulnak át különböző myeloid vonalú vérképzési sejtekké (makrofág és granulocita), illetve erythroid és lymphoid vonalú sejtekké (például CD19⁺ és CD56⁺), ha a humán eredetű vérsejteket a transzplantáció előtt slL-6R/IL-6-kiméraproteinnel együtt tenyésztettük (lásd 4. táblázat).

4. táblázat

NOS/SCID-egerek csontvelőjének újratelepítésére képes humán őssejtek

Köldökzsinórvérből származó CD34⁺CD38⁺ sejtek tenyészetéhez hozzáadott hatóanyagok	Tenyésztés időtartama (nap)	A transzplantáción átesett NOD/SCID-egerek csontvelőjéből képződött humán vérképzési sejtkolóniák száma
	0	4
SCF+FL	6	2-3
SCF+FL+SIL-6R/IL-6	6	50-1000

További kísérletekben az slL-6R/IL-6-kiméraprotein köldökzsinórvérből származó CD34⁺CD38⁺ sejtpo13

HU 225 855 Β1 pulációra gyakorolt hatását nagymértékben tisztított CD34⁺CD38⁺ sejtekre gyakorolt hatásával hasonlítottuk össze. Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein a nagymértékben tisztított sejtek in vitro szaporodását sokkal nagyobb arányban serkentette, mint a kevésbé tiszta sejtekét (lásd 5. táblázat). Ez arra utal, hogy az slL-6R/IL-6-kiméraprotein sejtszaporodásra gyakorolt hatásának elsődleges célpontjai a legprimitívebb őssejtek.

5. táblázat

Vérképzési őssejtek in vivő szaporítása

Kiindulási sejtpopuláció (20 000 sejt)	Sejtszám a 6. napon SC+FL jelenlétében	Sejtszám a 6. napon SC+FL+SIL-6R/I L-6 jelenlétében
1. kísérlet
CD34⁺CD38⁺	780 000	675 000 (0,86szoros gyarapodás)
CD34+CD38-	42 000	153 000 (3,6-szeres gyarapodás)
2. kísértet
CD34⁺CD38⁺	330 000	507 000 (1,5-szeres gyarapodás)
CD34⁺CD38-	3 000	18 000 (6,0-szeres gyarapodás)

A csontvelő-újratelepítési aktivitás in vitro fennmaradását úgy mértük, hogy a NOD/SCID-egerekbe történő injektálás előtt növeltük a nagymértékben tisztított CD34⁺CD38~ őssejtek szuszpenziós tenyésztésének időtartamát. Az átültetés sikerességét a tenyésztett sejtek recipiens egerekbe történő intravénás beadását követően hat héttel, az egerek csontvelősejtjeiben lévő humán DNS aránya alapján értékeltük. Ha a szuszpenziós tenyésztés során a sejtekhez - az SCF és FL mellett - slL-6R/IL-6-kiméraproteint adtunk, még két hetes tenyésztési időtartam alkalmazásával is eredményes átültetést tapasztaltunk (>1% humán DNS), és az átültetés (megtelepedés) aránya nagyobb volt, mint a nem tenyésztett sejtekkel végzett transzplantáció esetében. Ezzel szemben, az SCF-et, FL-t, GM-CSF-et és IL-3-at tartalmazó tenyészetekkel végzett kísérletek eredményei azt mutatták, hogy egy hetes tenyésztés után nem maradt SCID-egerek csontvelőjének újratelepítésére képes sejt [Bhata és munkatársai J. Exp. Med. 186, 619 (1997)].

Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az slL-6R/IL-6-kiméraprotein elősegíti a recipiens csontvelőben újratelepítésére képes primitív humán őssejtek szaporodását és életben maradását. Az őssejtek osztódásuk során aktív, differenciálatlan állapotban maradnak. Az slL-6R/IL-6-kiméraprotein új lehetőséget biztosít a transzplantációra alkalmas vérképzési sejtek tenyésztésére. Ez lehetővé teszi azt is, hogy az átültetendő őssejtekbe retrovírusvektorok alkalmazásával génterápiás eljárásokkal - géneket juttassunk be; mind ez idáig a humán őssejtekkel ez nem volt lehetséges, mivel a primitív sejtek in vitro nem tarthatók fenn a retrovírus-DNS beépüléséhez szükséges - ciklikus stádiumban, azonban az slL-6R/IL-6-kiméraprotein megoldja ezt a problémát.

6. példa

IL-6R/IL-6-kiméra előállítása CHO-sejtekben

Az sIL—6R/IL—6 pcDNA3-plazmid DNS-ét (lásd 1. ábra) a pDHFR-plazmid [Mory és munkatársai: DNA 5, 181 (1986)] DNS-ével együtt kínai hörcsög petefészek (CHO-) sejtekbe transzfektáltuk. Az 50 nM metotrexátban szaporított transzfektánsok közül egy L12[IL—6R/IL—6] transzfektánst izoláltunk. Ez a klón sok passzálás után is stabil maradt, és 50%-ban konfluens tenyészetei a tenyésztő tápközegbe 2,5 pg/ml IL-6R/IL-6-kiméraproteint választanak ki.

Az IL-6R/IL-6-kiméra tisztítása céljából az L12klón 2%-os szarvasmarhaszérumban készített tenyészetének 3,25 liter térfogatú tápközegét 200 ml-re töményítettük. A tápközeget immobilizált humán SIL-6R elleni antitestet hordozó „Affigel 10” gyantát tartalmazó, 18 ml-es oszlopon abszorbeáltuk, majd Novick és munkatársai leírása szerint [Hybridoma 10, 137 (1991)] eluáltuk. A 25 mM citromsavval készített eluátumot azonnal 1-szeres Hepes-pufferrel (pH=8,6) semlegesítettük. A proteineket 10 kD-os áteresztési küszöbű Amicon-membránon 1 mg/ml végkoncentrációra töményítettük. SDS-PAGE analízissel egy 85 kD-os IL-6R/IL-6-kimérának megfelelő - sávot detektáltunk. A glikoziláltság tényét glikozidázos (Boehringer-Mannheim) kezelés utáni méretcsökkenéssel igazoltuk. A CHO-sejtek által termelt IL-6R/IL-6-kiméra biológiai aktivitása 4 °C-on legalább öt hónapig stabilnak bizonyult. A tárolás szokásos hőmérséklete -70 °C.

7. példa

Az IL-6R/IL-6-kiméra gp130-ra vonatkozó affinitása

A CHO-sejtek által termelt IL-6R/IL-6-kimérát, valamint a humán IL—6 és SIL-6R elegyét - az IL—6 receptorrendszerének második láncát képező gp130 oldható alakjához (sgp130) történő kötődésük alapján hasonlítottuk össze. 96 üregű mikrotitertálcát (Nunc) humán gp130 elleni monoklonális antitesttel (R&D Systems, Minneapolis) vontunk be, és az üregekhez 50 ng/ml sgp130-at (R&D Systems, Minneapolis) adtunk. Foszfátpufferelt sóoldatban végzett mosást követően az IL-6R/IL-6-kimérát az egyes üregekhez különböző - 0,1 ng/ml-től 50 ng/ml-ig terjedő - koncentrációban adtuk. Külön üregekbe - 2 ng/ml-től 500 ng/ml-ig terjedő koncentrációjú humán slL-6R6Val-proteinnel együtt - 500 ng/ml rhulL-6-ot (Ares-Serono, Genf) adtunk. 4 °C-on egy éjszakán át végzett inkubálást követően az üregekhez nyúleredetű poliklonális anti-IL-6R antitestet (Oh és munkatársai: Cytokine 8, 401 (1996)], majd tormaperoxidázhoz kapcsolt, kecskeeredetű anti-nyúl-lg antitestet adtunk, mely utóbbit színváltozási reakcióval (Sigma, St. Louis) detektáltunk. A 8. ábrán bemutatjuk az eredmények Scatchard-görbéit. Az IL-6R/IL-6-kiméra gp130-ra vo14

HU 225 855 Β1 natkozó affinitása több mint négyszer nagyobbnak bizonyult, mint a külön adagolt IL-6R és IL—6 elegyének affinitása (6,3* 10^-11 M, illetve 2,6* 1O~¹⁰ M). Ez az eredmény összhangban van a korábbiakkal, és megmagyarázza a kiméra melanomasejtekre és vérképző- 5 sejtekre gyakorolt - IL—6 és slL-6R kombinációjához képest - nagyobb aktivitását (lásd 9. ábra és 4. példa).

8. példa

Az IL-6R/IL-6-kiméra májtoxicitással szemben 10 biztosított védő hatása

Az egereknek szén-tetrakloridot (CCI₄) injektálva súlyos májnekrózis idézhető elő, ami az állatok pusztulásához vezet [Slaterés munkatársai: Philos. Trans. R.

Soc. Bioi. Sci. 311, 633 (1985)]. Ha az IL—6 tekinteté- 15 ben genetikailag deficiens (IL—6~^/—) egereknek intraperitoneális injekcióval viszonylag kis dózisú szén-tetrakloridot (2-3 ml/testtömeg-kilogramm) adunk, 24 óra elteltével a halálozási arány kb. 70%-os (lásd 10. ábra). Ha az egereknek a szén-tetraklorid beadása 20 előtt egy órával, majd a szén-tetrakloridos injekció után négy órával CHO-sejtek által termelt IL-6R/IL-6-kimérát adtunk be, 24 óra múlva egy állat sem pusztult el (lásd 10. ábra). Az IL-6R/IL-6-kiméra 2-3 pg/injekció dózisban volt hatásos, ami moláris koncentrációt te- 25 klntve 10-szer kisebb, mint az IL—6 alkalmazott dózisa (amely egyébként hatástalan volt). Nagyobb szén-tetSpel Smal BamHI

5' CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG

A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG !

raklorid-dózisok (például 3,5 ml/kg, 10. ábra) alkalmazása esetén a kiméra szintén védő hatású volt, és a mortalitás kisebb volt, mint a citokin nélküli IL-6-os kezelés esetén. Az azonos mennyiségű szén-tetrakloriddal injektált, kimérával kezelt egerek, illetve kezeletlen egerek mortalitása közötti különbség p<0,01-nél szignifikáns volt. A hematoxillin-eozinnal festett májmetszetek szövettani vizsgálata igazolta, hogy a CCI₄ májszövetelhalást okozott, és hogy az IL-6R/IL-6-kiméra megvédte a májsejteket e toxikus hatástól (a metszeteket nem mutatjuk be).

Az IL-6R/IL-6-kiméra alkalmas a vegyszerek (például alkohol, paracetamol) vagy egyéb hatások (például vírusok) által okozott májnekrózisos betegségekben szenvedő páciensek májszövetének védelmére.

9. példa

IL-6/slL-6R8Val-kiméra előállítása és aktivitásának vizsgálata

Olyan kiméramolekulát állítottunk elő, amelyben az IL-6-molekularész az N-terminálison, az slL-6R-molekularész pedig a C-terminálison helyezkedik el. A pBSslL-6R6Val-plazmidot a 1086. bp-nál lévő Sau3a-helyen és a 356. valint követő stopkodon utáni Hindlll-helyen hasítottuk (lásd 1. példa). Szintetizáltunk egy kapcsolószekvenciát, amely három restrikciós felismerési helyet (Spel, Smal és BamHI) tartalmazott:

5' (2. szekvencia)

Az slL-6R Sau3a-helyét a kapcsolószekvencia BamHI-helyéhez ligáltuk, és „Bluescript” pBS/SK-plazmid sok felismerési helyet tartalmazó régiójába klónoztuk. Az IL-6-szekvenciát, templátként pKKp2-7-DNS alkalmazásával, polimeráz-láncreakcióval, a következő láncindítók felhasználásával amplifikáltuk (a kezdőko35 dönt aláhúzással jelöltük):

Spel

5'-láncindító: 5' GA CTA GTA GCT ATG AAC TCC TTC TC (3. azonosító számú szekvencia); HaelII

3'-láncindító: 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C (4. azonosító számú szekvencia).

Az Spel-gyel és Haelll-mal hasított PCR-terméket a csolószekvenciát is, amely egy belső Smal-felismerési fenti kapcsolószekvencia Spel- és Smal-helye közé in- helyet tartalmazott:

szertáltuk. Szintetizáltunk egy másik, BamHI-Ncol kap- 45

5' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC [BamHI] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG

Ez a szekvenciát az előző kapcsolószekvencia BamHI-helye és az IL-6R-szekvencia 1464. helyen lévő Ncol-helye közé klónoztuk. Az IL-6R Smal/Ncolfragmensét (867-1464.) a második kapcsolószekvencia Smal-helye és az IL-6R Ncol-hely közé inszertál- 55 tűk. Az így kapott kiméra-DNS-t megszekvenáltuk, és humán HEK293-sejtekben történő expresszáltatás céljából visszaklónoztuk a pCDNA3-plazmidba. Ezen IL-6R-IL-6-kiméra (3e) aminosavszekvenciáját a 11. ábrán mutatjuk be (a kapcsolószekvenciát aláhú- 60

Smal

GGG C [Ncol]

CCC GGT AC 5' (5. azonosító számú szekvencia).

zással jelöltük). A 3e-kimérát immobilizált anti-lL—6 monoklonális antitestet hordozó oszlopon végzett affinitási kromatográfiával tisztítottuk [Id. Novick és munkatársai: Hybridoma 8, 561 (1989)]. SDS-PAGE-elektroforézissel 75 kD-os sávot azonosítottunk.

Az IL-6R-IL-6-kiméra (3e) biológiai aktivitása gátolja az F10.9-melanomasejtek szaporodását (12. ábra). Ez a kiméra IL-6R/IL-6-kimérához viszonyítva egyértelműen hatásos, bár az 50%-os gátláshoz a 3e-kimérából nagyobb koncentrációra van szükség.

HU 225 855 Β1

Előállítottunk két mutáns IL-6R/IL-6-kimérát is; az egyikben az IL-6R 280. hisztidinjét és 281. aszparaginsavát (lásd 3. ábra) - PCR-mutagenezis alkalmazásával - szerinnel, illetve valinnal helyettesítettük (39-es vagy HD-mutáns), míg a másikban az említett mutációkon felül a 230. aszapargint aszparaginsawal helyettesítettük (NHD-mutáns). Ahogy a 12. ábrán látható, ez a két mutáns - az IL-6R/IL-6-kimérához és az IL-6-IL-6R-kimérához viszonyítva - alig mutatott aktivitást. Mivel az IL-6R-ben az említett aminosavak a gp 130-hoz való kötődésben játszanak szerepet ahogy azt molekuláris modellezéssel kimutatták [Halimi és munkatársai (1995)] -, ez az eredmény azt bizonyítja, hogy az slL-6R/IL-6-kiméraproteinben ezek a kulcsfontosságú interakciós helyek megmaradtak.

Az IL-6-IL-6R-kimérából (3e) hiányzik az IL-6R immunglobulinszerű doménje, amely az IL—6R/IL—6-kimérában megtalálható, azonban csak az Ig-domén eltávolítása nem csökkenti az IL-6-IL-6R-kiméra F10.9sejtekre kifejtett biológiai aktivitását. A 3e-kiméra gp130-hoz történő kötődésének mértéke egy másik IL-6R/IL-6-kiméra kötődésének kb. 30%-a volt (az adatokat nem szemléltetjük). Ez a kisebb kötődési affinitás összhangban van a melanomasejtek szaporodására gyakorolt kisebb aktivitással.

Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az IL—6 C-terminálisának - kapcsolószekvencián keresztül - slL-6R-hez történő kapcsolással történő blokkolása az így létrejött kimérákban megőrzi az előnyös biológiai aktivitást.

Hivatkozások listája

Chen L, Mory Y, Zilberstein A and Revei M. Growth inhibition of humán breast carcinoma and leukemia/lymphoma cell lines by recombinant interferon-beta 2/IL-6. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8037-8041, 1988.

Chemajovsky Y, Mory Y, Chen L, Marks Z, Novick D, Rubinstein M and Revei M. Efficient constitutive production of humán fibroblast interferon by hamster cells transformed with the IFN-βΙ gene fused to an SV40 early promoter. DNA, 3:297-308, 1984.

Fischer M, Goldschmitt J, Peschel C, BrakenhofF JPG, Kálién K-J, Wollmer A, Grotzinger J and Rose-John S. A bioactive designer cytokine fór humán hematopoietic progenitor cell expansion. Natúré Biotechnology 15:142-145, 1997.

Ganapathi MK, Weizer AK, Borsellino S, Bukowski RM, Ganapathi S, Rice T, Casey G and Kawamura K. Resistance to lnterleukin-6 in humán Non-small cell lung carcinoma cell lines: Role of receptor components. Cell Growth and Differentiation, 7:923-929, 1996.

Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revei M and Chebath J. Epitope peptides from interleukin-6 receptor which inhibit the growth of humán myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6:135-143,1995.

Hirano T, Yasukawa K, Harada H, Taga T, Watanabe Y, Matsuda T, Kashimura S, Nakajima K, Koyama K, Iwamatsu K, Tsunasawa S, Sakiyama F, Matsui H, Takahara Y, Taniguchi T and Kishimoto T. Complementary DNA fór a növel interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulins. Natúré, 234:73-76, 1986.

Hirano T, Matsuda T and Nakajima K. Signal transduction through gp130 that is shared among the receptors fór the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem cells, 12:262-277, 1994.

Holloway CJ. Applications of recombinant DNA technology in the production of glycosylated recombinant humán granulocyte colony stimulating factor. Eur. J. Cancer, 30:S2-6, 1994.

Kahn MA and De Vellis J. Regulation of an oligodendrocyte progenitor cell line by the interleukin-6 family of cytokines. Glia, 12:87-98, 1994.

Katz A, Shulman LM, Porgador A, Revei M, Feldman M and Eisenbach L. Abrogation of B16 melanoma metastases by long-term low-dose lnterleukin-6 therapy. J. Immunother. 13:98-109, 1993.

Mackiewicz A, Wiznerowicz M, Roeb E, Nowak J, Pawlowski T, Baumann H, Heinrich P and Rose-John S. Interleukin-6-type cytokines and their receptors fór gene therapy of melanoma. Ann. New York Acad. Sci., 762:361-374, 1995.

McKenna HJ, de Vries P, Brasel K, Lyman SD and Williams DE. Effect of flt3 ligand on the ex vivő expansion of humán CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood 86:3413-3420, 1995.

Murakami M, Hibi M, Nakagawa N, Nagakawa T, Yasukawa K, Yamanishi K, Taga T and Kishimoto T. IL—6 induced homodimerization of gp130 and associated activation of a tyrosine kinase. Science, 260:1808-1810, 1993.

Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner O, Revei M and Rubinstein M. Purification of soluble cytokine receptors from normál urine by ligand-affinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331-337, 1990.

Novick D, Engehnann H, Revei M, Leitner O and Rubinstein M. Monoclonal antibodies to the soluble IL—6 receptor: affinity purification, ELISA and inhibition of ligand binding. Hybridoma, 10:137-146,1991. Novick D, Shulman LM, Chen L and Revei M. Enhancement of interleukin-6 cytostatic effect on humán breast carcinoma cells by soluble IL—6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine. 4:6-11, 1992.

Oh J-W, Revei M and Chebath J. A soluble interleukin-6 receptor isolated from conditioned médium of humán breast cancer cells is encoded by a differentially spliced mRNA. Cytokine, 8:401-409,1996.

Oh J-W. Expression of recombinant soluble humán interleukin-6 receptors and analysis of their functions. Ph. D. Thesis Weizmann Institute of Science (Revei M, supervisor), 1997.

Paonessa G, Graziam R, DeSerio A, Savino R, Ciapponi L, Lahmm A, Salvati AL, Toniatti C and Ciliberto G. Two distinct and independent sites on IL—6 trigger gp130 dimer formation and signalling. EMBO J., 14:1942-1951, 1995.

HU 225 855 Β1

Revei M. Hőst defense against infections and inflammations: Role of the multifunctional IL—6/IFN-P2 cytokine. Experientia 45:549-557, 1989.

Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, 5 1989.

Sui X, Tsuji K, Tanaka R, Tajima S, Muraoka K, Ebihara Y, Ikebuchi K, Yasukawa K, Taga T, Kishimoto T and Nakahata T. Gp130 and c-kit signalings synergize fór ex vivő expansion of humán primitive hemopoietic progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2859-2863,1995.

Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T and Kishimoto T. Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signal transducer gp130. Cell, 58:573-581, 1989. Vormoor J, Lapidot T, Pflumio F, Risdon G, Patterson B, Broxmeyer HE and Dick JE. SCID mice as an in vivő model of humán cord blood hematopoiesis. Blood cells 20:316-320, 1994.

Ward LD, Howlett GJ, Discolo G, Yasukawa K, Hammacher A, Moritz RL and Simpson RJ. High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gp130. J. Bioi. Chem., 269:23 286-23 289, 1994.

Yamasaki K, Taga T, Hirata Y, Yawata H, Kawanishi Y, Seed B, Taniguchi T, Hirano T and Kishimoto T. Cloning and expression of the humán Interleukin-6 (BSF2/lnterferon beta-2) receptor. Science, 241:825-828, 1988.

Zilberstein A, Ruggieri R, Korn HJ and Revei M. Structure and expression of cDNA and genes fór humán interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J., 5:2529-2537, 1986.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Phe Gly Alá Gly Leu Val Leu Gly Gly Gin Phe Met 15 10

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 44 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGTGGGCC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC CTAG 44

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 25 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACTAGTAGC TATGAACTCC TTCTC 25

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGGGCCATTT GCCGAAGAGC C 21

HU 225 855 Β1

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 62 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCCGGGCG GCGGGGGAGG GGGGCCCGGG CGCCCGCCGC CCCCTCCTCC CGGGCCCGGT AC

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 14 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA

Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly

5

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 543 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA

Met 1	Leu	Alá	Val	Gly 5	Cys	Alá	Leu
Gly	Alá	Alá	Leu 20	Alá	Pro	Arg	Arg
Gly	Val	Leu 35	Thr	Ser	Leu	Pro	Gly 40
Gly	Val 50	Glu	Pro	Glu	Asp	Asn 55	Alá
Pro 65	Alá	Alá	Gly	Ser	His 70	Pro	Ser
Leu	Leu	Leu	Arg	Ser 85	Val	Gin	Leu
Tyr	Arg	Alá	Gly 100	Arg	Pro	Alá	Gly
Pro	Pro	Glu 115	Glu	Pro	Gin	Leu	Ser 120
Asn	Val 130	Val	Cys	Glu	Trp	Gly 135	Pro
Lys 145	Alá	Val	Leu	Leu	Val 150	Arg	Lys

ADATAI:

LEÍRÁSA:

Gly Gly 10 ADATAI: LEÍRÁSA:	Gly	Gly	Pro	Gly
Leu	Alá 10	Alá	Leu	Leu	Alá	Alá 15	Pro
Cys 25	Pro	Alá	Gin	Glu	Val 30	Alá	Arg
Asp	Ser	Val	Thr	Leu 45	Thr	Cys	Pro
Thr	Val	His	Trp 60	Val	Leu	Arg	Lys
Arg	Trp	Alá 75	Gly	Met	Gly	Arg	Arg 80
His	Asp 90	Ser	Gly	Asn	Tyr	Ser 95	Cys
Thr 105	Val	His	Leu	Leu	Val 110	Asp	Val
Cys	Phe	Arg	Lys	Ser 125	Pro	Leu	Ser
Arg	Ser	Thr	Pro 140	Ser	Leu	Thr	Thr
Phe	Gin	Asn 155	Ser	Pro	Alá	Glu	Asp 160

HU 225 855 Β1

Phe Gin Glu Pro Cys Gin Tyr Ser 165

Gin Leu Alá Val Pro Glu Gly Asp 180

Cys Val Alá Ser Ser Val Gly Ser 195 200

Gin Gly Cys Gly Ile Leu Gin Pro 210 215

Thr Alá Val Alá Arg Asn Pro Arg 225 230

Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe 245

Tyr Arg Alá Glu Arg Ser Lys Thr 260

Leu Gin His His Cys Val Ile His 275 280

Val Val Gin Leu Arg Alá Gin Glu 290 295

Glu Trp Ser Pro Glu Alá Met Gly 305 310

Pro Pro Alá Glu Asn Glu Val Ser 325

Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu 340

Ser Leu Pro Val Glu Phe Met Pro 355 360

Asp Val Alá Alá Pro His Arg Gin 370 375

Asp Lys Gin Ile Arg Tyr Ile Leu 385 390

Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met 405

Alá Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro 420

Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu 435 440

Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr 450 455

Glu Ser Ser Glu Glu Gin Alá Arg 465 470

Gin

Ser

185

Lys

Asp

Trp

Tyr

Phe

265

Asp

Glu

Thr

Phe

345

Val

Pro

Asp

Cys

Lys

425

Thr

Leu

Alá

Glu Ser Gin Lys Phe Ser Cys 170 175

Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met 190

Phe Ser Lys Thr Gin Thr Phe 205

Pro Pro Alá Asn Ile Thr Val 220

Leu Ser Val Thr Trp Gin Asp 235 240

Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 250 255

Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 270

Alá Trp Ser Gly Leu Arg His 285

Phe Gly Gin Gly Glu Trp Ser 300

Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 315 320

Pro Met Gin Alá Leu Thr Thr 330 335

Arg Asp Ser Alá Asn Alá Thr 350

Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys 365

Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile 380

Gly Ile Ser Alá Leu Arg Lys 395 400

Glu Ser Ser Lys Glu Alá Leu 410 415

Met Alá Glu Lys Asp Gly Cys 430

Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr 445

Glu Tyr Leu Gin Asn Arg Phe 460

Val Gin Met Ser Thr Lys Val 475 480

HU 225 855 Β1

Leu

Ile

Gin

Phe

Leu 485

Gin

Lys

Alá

Lys 490

Asn

Leu

Asp

Alá

Ile 495

Thr

Pro

Asp

Pro 500

Thr

Asn

Alá

Ser 505

Leu

Thr

Lys

Leu 510

Gin

Alá

Gin

Asn

Gin 515

Trp

Leu

Gin

Asp

Met 520

Thr

His

Leu

Ile 525

Leu

Arg

Ser

Phe

Lys 530

Glu

Phe

Leu

Gin

Ser 535

Ser

Leu

Arg

Alá

Leu 540

Arg

Gin

Met

A 8.

. AZONOSÍTÓ

SZÁMÚ

í SZEKVENCIA

ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 471 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid

LEÍRÁSA:

Pro

Val

Alá

Phe

Ser 15

Leu

A 8. Met 1

AZONOSÍTÓ :

SZÁMÚ SZEKVENCIA

Asn

Ser

Phe

Ser 5

Thr

Ser Alá

Phe

Gly 10

Gly

Leu

Val

Leu

Pro

Alá

Phe

Pro

Alá

Pro

Val

Pro

20

25

30

Gly

Glu

Asp

Ser

Lys

Asp

Val

Alá

Pro

His

Arg

Gin

Pro

Leu

Thr

35

40

45

Ser

Glu

Arg

Ile

Asp

Lys

Gin

Ile

Arg

Tyr

Ile

Leu

Asp

Gly

Ile

50

55

60

Ser

Alá

Leu

Arg

Lys

Glu

Thr

Cys

Asn

Lys

Ser

Asn

Met

Cys

Glu

Ser

65

70

75

80

Ser

Lys

Glu

Alá

Leu

Alá

Glu

Asn

Leu

Asn

Leu

Pro

Lys

Met

Alá

85

90

95

Glu

Lys

Asp

Gly

Cys

Phe

Gin

Ser

Gly

Phe

Asn

Glu

Thr

Cys

Leu

100

105

110

Val

Lys

Ile

Thr

Gly

Leu

Glu

Phe

Glu

Val

Tyr

Leu

Glu

Tyr

115

120

125

Leu

Gin

Asn

Arg

Phe

Glu

Ser

Glu

Gin

Alá

Arg

Alá

Val

Gin

130

135

140

Met

Ser

Thr

Lys

Val

Leu

Ile

Gin

Phe

Leu

Gin

Lys

Alá

Lys

Asn

145

150

155

160

Leu

Asp

Alá

Ile

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

Asn

Alá

Ser

Leu

165

170

175

Thr

Lys

Leu

Gin

Alá

Gin

Asn

Gin

Trp

Leu

Gin

Asp

Met

Thr

His

180

185

190

Leu

Ile

Leu

Arg

Ser

Phe

Lys

Glu

Phe

Leu

Gin

Ser

Leu

Arg

Alá

195

200

205

HU 225 855 Β1

Leu Arg Gin Met Gly Gly Gly Gly

Asp

Pro Gly Gly 220

Gly

210

215

Pro

Gly

Val

Pro

Glu

Pro

Gin

Leu

Ser

Cys

Phe

Arg

Lys

Ser

225

230

235

240

Pro

Leu

Ser

Asn

Val

Cys

Glu

Trp

Gly

Pro

Arg

Ser

Thr

Pro

Ser

245

250

255

Leu

Thr

Lys

Alá

Val

Leu

Val

Arg

Lys

Phe

Gin

Asn

Ser

Pro

260

265

270

Alá

Glu

Asp

Phe

Gin

Glu

Pro

Cys

Gin

Tyr

Ser

Gin

Glu

Ser

Gin

Lys

275

280

285

Phe

Ser

Cys

Gin

Leu

Alá

Val

Pro

Glu

Gly

Asp

Ser

Phe

Tyr

Ile

290

295

300

Val

Ser

Met

Cys

Val

Alá

Ser

Val

Gly

Ser

Lys

Phe

Ser

Lys

Thr

305

310

315

320

Gin

Thr

Phe

Gin

Gly

Cys

Gly

Ile

Leu

Gin

Pro

Asp

Pro

Alá

Asn

325

330

335

Ile

Thr

Val

Thr

Alá

Val

Alá

Arg

Asn

Pro

Arg

Trp

Leu

Ser

Val

Thr

340

345

350

Trp

Gin

Asp

Pro

His

Ser

Trp

Asn

Ser

Phe

Tyr

Arg

Leu

Arg

Phe

355

360

365

Glu

Leu

Arg

Tyr

Arg

Alá

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Phe

Thr

Trp

Met

370

375

380

Val

Lys

Asp

Leu

Gin

His

Cys

Val

Ile

His

Asp

Alá

Trp

Ser

Gly

385

390

395

400

Leu

Arg

His

Val

Gin

Leu

Arg

Alá

Gin

Glu

Phe

Gly

Gin

Gly

405

410

415

Glu

Trp

Ser

Glu

Trp

Ser

Pro

Glu

Alá

Met

Gly

Thr

Pro

Trp

Thr

Glu

420

425

430

Ser

Arg

Ser

Pro

Alá

Glu

Asn

Glu

Val

Ser

Thr

Pro

Met

Gin

Alá

435

440

445

Leu

Thr

Asn

Lys

Asp

Asn

Ile

Leu

Phe

Arg

Asp

Ser

Alá

450

455

460

Asn

Alá

Thr

Ser

Leu

Pro

Val

465 470

Claims

1. Oldható interleukin-6-receptor(slL-6R)/interleukin-6(IL—6) kiméraprotein (sIL—6R/IL—6), mely kiméraprotein az slL-6R természetben előforduló alakjából és az IL—6 természetben előforduló alakjából álló fúziós 60 protein, amely összetevők mindegyike megtartja azt a glikozilációs mintázatot, amellyel a természetben előforduló azonos szekvenciarészlet bír, amennyiben emlőssejtben lett expresszálva, vagy a kiméraprotein olyan analógja, amelyben az összetevők a természetben előforduló szekvenciájukhoz képest legfeljebb

HU 225 855 Β1

20 aminosavaddíciót, legfeljebb 30 aminosavdeléciót és/vagy legfeljebb 30 aminosavszubsztitúciót tartalmaznak, és amelyben az slL-6R az IL-6-hoz vagy közvetlenül van fuzionálva vagy egy olyan peptid-linkermolekulán keresztül, amely vagy egy E-F-M (GluPhe-Met) szekvenciájú tripeptid, vagy pedig egy E-FG-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-LeuVal-Leu-Gly-Gly-GIn-Phe-Met) szekvenciájú, 13 aminosavas peptid.

2. Az 1. igénypont szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amelyben az slL-6R-komponens kapcsolópeptiden keresztül van az IL-6-komponenshez fuzionálva.

3. A 2. igénypont szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely kapcsolópeptidként nagyon rövid, mintegy 3 aminosavas, nem immunogén hatású peptidet tartalmaz.

4. A 3. igénypont szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely kapcsolópeptidként E-F-M (Glu-Phe-Met) aminosavszekvenciájú tripeptidet tartalmaz.

5. A 2. igénypont szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely kapcsolópeptidként E-F-G-A-G-L-V-L-G-GQ-F-M (azaz Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-GlyGly-GIn-Phe-Met) szekvenciájú, 13 aminosavas peptidet tartalmaz.

6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely az slL-6R8Val/IL-6 elnevezésű fúziós protein, mely az slL-6R C-terminális, 356. valinja és az IL—6 N-terminális, 29. prolinja között E-F-M kapcsolópeptidet tartalmaz, és a 3. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza.

7. Az 1., 2. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely az slL-6R6Val/L/IL-6 elnevezésű fúziós protein, mely az SÍL-6R C-terminális, 356. valinja és az IL—6 N-terminális, 29. prolinja között 13 aminosavas E-F-G-A-G-L-VL-G-G-Q-F-M kapcsolópeptidet tartalmaz, és aminosavszekvenciája megegyezik a 3. ábrán bemutatott aminosavszekvenciával, azzal a különbséggel, hogy a 357-359. pozíciókban lévő E-F-M tripeptidszekvencia helyett E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M szekvenciát tartalmaz.

8. Az 1. igénypont szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely az IL—6/slL—6R elnevezésű fúziós protein, amely az IL—6 teljes aminosavszekvenciáját, s azt követően az slL-6R-szekvenciát, az IL—6 C-terminális, 212. metioninja, vagy az slL-6R 112. valinja között pedig 14 aminosavas, G-G-G-G-D-P-G-G-G-G-G-G-P-G szekvenciájú kapcsolópeptidet (6. azonosító számú szekvencia) tartalmaz, és szekvenciája megegyezik a 11. ábrán bemutatott aminosavszekvenciával.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely emlőssejtekben, teljesen érett alakban lett termeltetve.

10. A 9. igénypont szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely humán sejtekben lett termeltetve.

11. A 9. igénypont szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely CHO-sejtekben lett termeltetve.

12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely képes nagymértékben malignus ráksejtek szaporodásának gátlására.

13. A 12. igénypont szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely képes nagymértékben malignus melanomasejtek szaporodásának gátlására.

14. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely csontvelő-átültetés során képes humán hematopoietikus sejtek in vivő megtelepedésének elősegítésére.

15. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein, amely képes a máj hepatotoxikus hatóanyagokkal szembeni védelmére.

16. DNS-szekvencia, amely 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraproteint vagy annak biológiailag aktív analógját kódolja.

17. DNS-vektor, amely 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraproteint vagy annak biológiailag aktív analógját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, és alkalmas a kiméraprotein emlőssejtekben történő expresszáltatására.

18. A 17. igénypont szerinti DNS-vektor, amely alkalmas a kiméraprotein humán sejtekben történő expresszáltatására.

19. A 17. igénypont szerinti DNS-vektor, amely alkalmas a kiméraprotein CHO-sejtekben történő expresszáltatására.

20. A 17-19. igénypontok bármelyike szerinti DNSvektor, amely emlőseredetű vagy humán sejtben expresszáltatva olyan kiméraprotein termelődését eredményezi, melynek aminosavszekvenciája az emlőseredetű vagy humán sejtben lehetővé teszi, hogy a kiméraprotein teljes érési folyamaton menjen keresztül, és hogy a teljesen érett kiméraprotein a sejtekből a tenyésztő tápközegbe szekretálódjék.

21. A 17-20. igénypontok bármelyike szerinti DNSvektor, amely az 1a-1c. ábrákon bemutatott szerkezetű pcDNAslL-6R/IL-6 elnevezésű plazmid, mely - az slL-6R/IL-6-kiméraproteint kódoló DNS-szekvenciát citomegalovírus (CMV)-promoter szabályozása alatt hordozó - pcDNA3-vektort tartalmaz.

22. A 17-20. igénypontok bármelyike szerinti DNSvektor, mely az 1a-1c. ábrákon bemutatott szerkezetű pcDNAslL-6R/L/IL-6 elnevezésű plazmid, amely slL-6R/IL-6-kiméraproteint kódoló DNS-szekvenciát citomegalovírus (CMV)-promoter szabályozása alatt tartalmazó - pcDNA3-vektort tartalmaz, és a DNSszekvenciában az slL-6R-t kódoló szekvenciaszakasz és az IL—6-ot kódoló szekvenciaszakasz közötti EcoRI felismerési helyre egy kapcsolópeptidet kódoló kapcsolószekvencia van inszertálva.

23. Transzformált emlőssejt, amely 17-22. igénypontok bármelyike szerinti DNS-vektort tartalmaz, és képes a vektor által hordozott slL-6R/IL-6-kiméra szekvenciájának expresszálására, az expresszált protein teljes érési folyamatának lebonyolítására, vagy az érett protein tenyésztő tápközegbe történő szekretálására.

24. A 23. igénypont szerinti transzformált sejt, amely a pcDNAslL-6R/IL-6-vektorral transzfektált 293-as jelzésű embrionális vesesejt (HEK293), amely képes az slL-6R/IL-6-kiméraprotein expresszáltatására, továbbá az expresszált protein teljes érési folyama22

HU 225 855 Β1 tának lebonyolítására és a kiméraprotein - mintegy 85 kD-os glikoprotein formájában - tenyésztő tápközegbe történő szekretálására.

25. Eljárás 1-14. igénypontok bármelyike szerint kiméraprotein előállítására, azzal jellemezve, hogy 23. vagy 24. igénypont szerinti transzformált sejteket a protein vagy analógja expresszáltatásához, éréséhez és tenyésztő tápközegbe történő szekretálásához megfelelő feltételek mellett tenyésztjük, és a proteint vagy analógját a sejtek tenyésztő tápközegéből tisztítjuk.

26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítást slL-6R-re specifikus monoklonális antitestek alkalmazásával végzett immunaffinitási kromatográfiával hajtjuk végre.

27. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy olyan analógjai, melyekben az összetevők a természetben előforduló szekvenciájukhoz képest legfeljebb 20 aminosavaddíciót, legfeljebb 30 aminosavdeléciót és/vagy legfeljebb 30 aminosavszubsztitúciót tartalmaznak, és amelyekben az slL-6R az IL-6-hoz vagy közvetlenül van fuzionálva, vagy egy olyan peptid-linkermolekulán keresztül, amely vagy egy E-F-M (Glu-Phe-Met) szekvenciájú tripeptid, vagy pedig egy E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-PheMet) szekvenciája, 13 aminosavas peptid, vagy ezek sói vagy elegyei alkalmazása emlősráksejtek gátlása útján emlősökben rákos megbetegedés kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.

28. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy olyan analógjai, melyekben az összetevők a természetben előforduló szekvenciájukhoz képest legfeljebb 20 aminosavaddíciót, legfeljebb 30 aminosavdeléciót és/vagy legfeljebb 30 aminosavszubsztitúciót tartalmaznak, és amelyekben az slL-6R az IL-6-hoz vagy közvetlenül van fuzionálva vagy egy olyan peptid-linkermolekulán keresztül, amely vagy egy E-F-M (Glu-Phe-Met) szekvenciájú tripeptid vagy pedig egy E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-PheMet) szekvenciájú, 13 aminosavas peptid, vagy ezek sói vagy elegyei alkalmazása humán hematopietikus sejtek csontvelő-átültetés során történő megtelepedését elősegítő, és ily módon a csontvelő-átültetés hatékonyságát javító gyógyszer előállítására.

29. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy olyan analógjai, melyekben az összetevők a természetben előforduló szekvenciájukhoz képest legfeljebb 20 aminosavaddíciót, legfeljebb 30 aminosavdeléciót és/vagy legfeljebb 30 aminosavszubsztitúciót tartalmaznak, és amelyekben az slL-6R az IL-6-hoz vagy közvetlenül van fuzionálva vagy egy olyan peptid-linkermolekulán keresztül, amely vagy egy E-F-M (Glu-Phe-Met) szekvenciájú tripeptid, vagy pedig egy E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-PheMet) szekvenciájú, 13 aminosavas peptid, vagy ezek sói vagy elegyei alkalmazása vérképződés elősegítésére alkalmas gyógyszer előállítására.

30. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy olyan analógjai, melyekben az összetevők a természetben előforduló szekvenciájukhoz képest legfeljebb 20 aminosavaddíciót, legfeljebb 30 aminosavdeléciót és/vagy legfeljebb 30 aminosavszubsztitúciót tartalmaznak, és amelyekben az slL-6R az IL-6-hoz vagy közvetlenül van fuzionálva vagy egy olyan peptid-linkermolekulán keresztül, amely vagy egy E-F-M (Glu-Phe-Met) szekvenciájú tripeptid vagy pedig egy E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-PheMet) szekvenciájú, 13 aminosavas peptid, vagy ezek sói vagy elegyei alkalmazása májbetegségek vagy neurológiai rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.

31. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraprotein vagy olyan analógjai, melyekben az összetevők a természetben előforduló szekvenciájukhoz képest legfeljebb 20 aminosavaddíciót, legfeljebb 30 aminosavdeléciót és/vagy legfeljebb 30 aminosavszubsztitúciót tartalmaznak, és amelyekben az slL-6R az IL-6-hoz vagy közvetlenül van fuzionálva, vagy egy olyan peptid-linkermolekulán keresztül, amely vagy egy E-F-M (Glu-Phe-Met) szekvenciájú tripeptid, vagy pedig egy E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-PheGly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-Phe-Met) szekvenciájú, 13 aminosavas peptid, vagy ezek sói vagy elegyei alkalmazása, a 27-30. igénypontok szerintiektől eltérő, de az IL—6-tal vagy az slL-6R-rel összefüggő alkalmazási területű gyógyszer előállítására.

32. Gyógyászati készítmény, amely aktív összetevőként 1-11. igénypontok bármelyike szerinti slL-6R/IL-6-kiméraproteint vagy olyan analógját, amelyben az összetevők a természetben előforduló szekvenciájukhoz képest legfeljebb 20 aminosavaddíciót, legfeljebb 30 aminosavdeléciót és/vagy legfeljebb 30 aminosavszubsztitúciót tartalmaznak, és amelyben az slL-6R az IL-6-hoz vagy közvetlenül van fuzionálva vagy egy olyan peptid-linkermolekulán keresztül, amely vagy egy E-F-M (Glu-Phe-Met) szekvenciájú tripeptid, vagy pedig egy E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (GluPhe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-Phe-Met) szekvenciájú, 13 aminosavas peptid, továbbá gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, hígítószert vagy kötőanyagot tartalmaz.

33. A 32. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, rákbetegségek kezelésére történő alkalmazásra.

34. A 32. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, csontvelő-átültetés sikerességének fokozására történő alkalmazásra.

35. A 32. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, májbetegségek vagy neurológiai rendellenességek kezelésére, vagy vérképződés fokozására, vagy egyéb olyan esetekben történő alkalmazásra, ahol IL—6 vagy slL-6R alkalmazható.