SK283478B6

SK283478B6 - Gén, ktorý kóduje lyzínovú dekarboxylázu, mikroorganizmus a spôsob výroby L-lyzínu

Info

Publication number: SK283478B6
Application number: SK702-97A
Authority: SK
Inventors: Yoshimi Kikuchi; Tomoko Suzuki; Hiroyuki Kojima
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 1994-12-09
Filing date: 1995-12-05
Publication date: 2003-08-05
Also published as: DE69534801D1; PL320645A1; CN100357431C; PL182903B1; AU703308B2; US5827698A; CZ290070B6; AU703308C; ES2256850T5; EP0796912B9; EP0796912A1; CA2207271A1; CA2207271C; WO1996017930A1; DK0796912T4; EP0796912B1; MY113738A; CZ174697A3; PE59996A1; EP0796912A4

Abstract

L-lyzín sa hospodárne vyrobí kultiváciou mikroorganizmu patriaceho k rodu Escherichia, ktorý má zníženú alebo potlačenú lyzínovú dekarboxylázovú aktivitu, relevantnú pre rozklad L-lyzínu. Výhodne kultiváciou baktérií patriacich k rodu Escherichia s potlačenou expresiou génu, kódujúceho lyzínovú dekarboxylázu, a/alebo génu cadA v tekutom prostredí, umožňujúcom tvorbu a akumuláciu L-lyzínu v kultivačnom médiu a oddelením L-lyzínu. ŕ

Description

Oblasť vynálezu

Vynález sa týka nového lyzínového dekarboxylázového génu Escherichia coli, relevantného pre rozklad L-lyzínu, ďalej sa týka mikroorganizmu, ktorý patrí k rodu Escherichia a ktorý má potlačenú expresiu uvedeného génu a/alebo iného lyzínového dekarboxylázového génu, známeho ako gén cadA a ďalej sa týka spôsobu prípravy L-lyzínu s využitím uvedeného mikroorganizmu. V poslednom období sa stále zvyšuje dopyt po L-lyzínu ako prísady do krmív.

Doterajší stav techniky

Lyzínová dekarboxyláza, ktorá katalyzuje reakciu vzniku kadaverínu dekarboxyláciou L-lyzínu je známa ako enzým, ktorý rozkladá L-lyzín v Escherichia coli. Nukleotidová sekvencia tohto génu sa označuje ako cadA a sekvencia aminokyselín, kódovaná uvedeným génom už bola opísaná (Meng, S. a Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174. 2659 (1992)). O lyzínovej dekarboxylázc, kódovanej iným génom ako cadA z Escherichia coli, sú známe dve práce, v ktorých sa opisuje, že taká lyzínová dekarboxyláza má v mutantnom kmeni Escherichia coli iba slabú účinnosť (Goldemberg, S. H., J. Bacteriol., 141, 1428 (1980); Wertenheimer, S. J. a Leifer, Z., Biochem. Biophys. Comm., 114, 882 (1983)). Pritom však Goldemberg, S. H. uvádza, že sa účinnosť enzýmu znižuje po tepelnom spracovaní pri 60 °C počas 4 minút v rozsahu asi o 30 %, zatiaľ čo Wertheimer, S. J. so spolupracovníkmi uvedený jav nepozorovali. Podľa toho je prítomnosť druhej lyzínovej dekarboxylázy neurčitá.

Na druhej strane sa L-lyzín vyrába známymi spôsobmi s použitím Escherichia coli vrátane spôsobu, ktorý zahŕňa kultiváciu mutantného kmeňa, odolného k lyzínovému analógu alebo rekombinantný kmeň, kotviaci vektor s vloženou deoxyribonukleovou kyselinou, ktorá nesie genetickú informáciu, relevantnú k biosyntéze L-lyzinu (zverejnený japonský patent číslo 56-18 596). Nie je však známa nijaká informácia o produkcii L-lyzínu s použitím mikroorganizmu, ktorý patrí k rodu Escherichia a ktorý má potlačenú expresiu lyzínového dekarboxylázového génu.

Podstata vynálezu

Podstatou tohto vynálezu je získať nový lyzínový dekarboxylázový gén od Escherichia coli, vytvoriť mikroorganizmus produkujúci L-lyzín, ktorý patrí do rodu Escherichia a ktorý má potlačenú expresiu uvedeného génu a/alebo cadA génu a poskytnúť spôsob prípravy L-lyzínu, založený na kultivácii uvedeného mikroorganizmu, ktorý patrí k rodu Escherichia.

Keď autori tohto vynálezu vytvorili kmeň Escherichia coli, v ktorom bol zničený cadA ako známy lyzínový dekarboxylázový gén, zistilo sa, že v tomto mikrobiálnom kmeni sa stále ako rozkladný produkt L-lyzínu účinkom lyzínovej dekarboxylázy produkoval kadaverín. Autori tohto vynálezu usúdili, že v Escherichia coli musí byť prítomný nový lyzínový dekarboxylázový gén a tento môže pri fermentácii s použitím mikroorganizmu patriaceho k rodu Escherichia značne ovplyvňovať produkciu L-lyzínu. V pokusoch o dosiahnutie klonovania uvedeného génu boli autori tohto vynálezu úspešní v tom, že ako výsledok získali nový lyzínový dekarboxylázový gén, odlišný od génu cadA. Tiež sa zistilo, že potlačením expresie uvedeného génu v mikroorganizme Escherichia coli, produkujúcom L

-lyzín, sa významne znížila účinnosť rozkladu L-lyzínu a že sa významne zvýšila produktivita tvorby L-lyzínu. Tým sa súčasný vynález dokončil.

Tento vynález menovite uvádza nový gén, ktorý kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu, vznikajúcu v Escherichia coli. Tento gén sa označil ako gén „ldc“.

Z iného pohľadu súčasný vynález poskytuje mikroorganizmus, ktorý patri k rodu Escherichia, schopný produkcie L-lyzínu, ktorý má v bunkách zníženú alebo potlačenú účinnosť lyzínovej dekarboxylázy.

Ešte z iného hľadiska poskytuje tento vynález spôsob prípravy L-lyzinu, zahŕňajúci výrobné kroky: krok kultivácie mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia a opísaného skôr, v kvapalnom prostredí, umožňujúcom vznik a akumuláciu L-lyzínu v uvedenom prostredí a krok oddelenie L-lyzínu.

Uvedený mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia a opísaný skôr zahŕňa mikroorganizmus, v ktorého bunkách je znížená alebo potlačená účinnosť lyzínovej dekarboxylázy potlačením expresie génu ldc a/alebo génu cadA.

Podrobnejší opis vynálezu je v ďalšom texte.

<1> Príprava fragmentu DNA, ktorý obsahuje nový lyzínový dekarboxylázový gén

Fragment DNA, ktorý obsahuje nový lyzínový dekarboxylázový gén (ldc) podľa tohto vynálezu sa môže získať ďalej uvedeným spôsobom z dostupného kmeňa Escherichia coli, napríklad z kmeňa K-12, alebo z kmeňa od neho odvodeného.

Najprv sa z chromozomálnej DNA kmeňa W3110, vznikajúceho z Escherichia coli K-12, s použitím polymerázovej reťazcovej reakcie (v ďalšom texte označovanej ako „spôsob PCR“) získa gén cadA. čo jc známy gén lyzínovej dekarboxylázy. Nukleotidová sekvencia génu cadA, ako aj sekvencia aminokyselín, kódovaná uvedeným génom sa uvádza v SEQ ID NO: 5 a 6 Zoznamu sekvencii na konci textu. Fragmenty DNA, ktoré majú podobné sekvencie ako gén cadA sú klonované z chromozomálnej knižnice DNA Escherichia coli W3110 spôsobom, využívajúcim plazmidový vektor alebo fágový vektor na potvrdenie, či je, alebo nie je vo fragmentoch DNA obsiahnutý nový lyzínový dekarboxylázový gén. Potvrdenie skutočnosti, že predmetný gén je obsiahnutý, sa môže vykonať Southemovým hybridizačným spôsobom s použitím vzorky pripravenej spôsobom PCR.

Nukleotidová sekvencia génu v takto získanom fragmente DNA sa stanovila nasledovne. Najprv sa fragment DNA podrobil ligácii s autonómne replikovateľným (v bunkách Escherichia coli) vektorom, aby sa pripravila rekombinantná DNA, ktorá sa vložila do príslušných buniek Escherichia coli. Získaný transformant sa kultivoval v kvapalnom prostredí a z rozmnožených buniek sa získala rekombinantná DNA. Úplná nukleotidová sekvencia fragmentu DNA, obsiahnutého v získanej rekombinantnej DNA sa stanovila spôsobom dideoxy (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)). Štruktúra DNA sa analyzovala tak, aby sa zistili polohy promótora, operátora, SD sekvencie, iniciačného kodóna, otvoreného čítacieho rámca a podobne.

Nový lyzínový dekarboxylázový gén podľa tohto vynálezu má sekvenciu od 1005. až 1007. ATG až po 3141 až 3143. GGA úplnej nukleotidovej sekvencie DNA fragmentu, uvedenú v Zozname sekvencii v SEQ ID NO: 3. Tento gén kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu, ktorá má sekvenciu aminokyselín, uvedenú v SEQ ID NO: 4 Zoznamu sekvencii. Zistilo sa, že homológia medzi novou lyzí novou dekarboxylázou a lyzínovou dekarboxylázou, kódovanou génom cadA je 69,4 %.

Gén podľa tohto vynálezu môže byť taký, ktorý kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu a ktorý má sekvenciu aminokyselín, uvedenú v SEQ ID NO: 4 Zoznamu sekvencií, a ktorého nukleotidová sekvencia nie je obmedzená na nukleotidovú sekvenciu uvedenú skôr. Lyzinová dekarboxyláza, kódovaná génom podľa tohto vynálezu, môže mať v uvedenej sekvencií aminokyselín substitúciu, deléciu, alebo inzerciu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov bez podstatného poškodenia lyzinovej dekarboxylázovej účinnosti. Gény, ktoré kódujú pre lyzínovú dekarboxylázu, ktorá má takú deléciu, inzerciu, alebo substitúciu sa môžu získať z variantov, spontánne mutantných kmeňov, alebo z umelých mutantných kmeňov Escherichia coli, alebo z mikroorganizmov, iných ako Escherichia coli, ktoré patria k rodu Escherichia. Mutantné gény, ktoré kódujú pre lyzínovú dekarboxylázu a ktoré majú deléciu, inzerciu, alebo substitúciu sa môžu tiež získať vykonaním mutácie in vitro, alebo polohovo usmernenou mutagenézou pre gény, kódujúce pre lyzínovú dekarboxylázu, ktorá má sekvenciu aminokyselín uvedenú v SEQ ID NO:4. Tieto mutácie sa môžu vykonať uvedenými spôsobmi, ktoré sú dobre známe odborníkom, skúseným v danej oblasti.

Gén, ktorý kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu a ktorý má substitúciu, deléciu, alebo inzerciu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov ako sa tu uvádza, zahŕňa však gény, ktoré vznikajú z „ldc génu“ a môžu byť považované za v podstate rovnaké ako gén ldc. Nie je zámerom rozširovať rozsah na také gény, ktoré majú rozdielny pôvod. Je nemožné celkom presne vyznačiť určitý rozsah výrazu „viaceré“. Odborníkom v danej oblasti je však ľahko pochopiteľné, že napríklad gén cadA. ktorý kóduje pre proteín, a je rozdielny v nie menej ako v 200 aminokyselinových zvyškoch od génu, ktorý má sekvenciu aminokyselín uvedenú v SEQ ID NO: 3, je potom rozdielny od génu z tohto vynálezu; a gény, ktoré kódujú pre proteíny a ktoré majú rovnocennú lyzínovú dekarboxylázovú účinnosť, sú v tomto vynáleze zahrnuté, aj keď sú rozdielne od génu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 3, napríklad v dvoch alebo troch zvyškoch aminokyselín.

<2> Vytvorenie mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia, s potlačenou expresiou lyzinového dekarboxylázového génu

Mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia podľa tohto vynálezu je mikroorganizmus, ktorý patrí k rodu Escherichia, v ktorom je v bunkách znížená alebo celkom potlačená aktivita lyzinovej dekarboxylázy. Mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia zahŕňa Escherichia coli. Aktivita lyzinovej dekarboxylázy je v bunkách znížená alebo celkom potlačená napríklad potlačením expresie niektorého alebo obidvoch génov, génu lyzinovej dekarboxylázy (ldc) a známeho génu cadA, opísaného skôr. Voliteľne sa aktivita lyzinovej dekarboxylázy v bunkách môže znížiť alebo celkom potlačiť znížením alebo vynechaním špecifických aktivít lyzinových dekarboxylázových enzýmov, kódovaných týmito génmi, prostredníctvom modifikácie štruktúry enzýmov.

Prostriedky na potlačenie expresie génu ldc a známeho génu cadA zahŕňajú napríklad spôsob potlačenia expresie génov na úrovni transkripcie vyvolaním substitúcie, delécie, inzercie, adície, alebo inverzie jedného alebo viacerých nukleotidov v sekvenciách promótora týchto génov a spôsob znížením promótorových aktivít (Rosenberg, M. a Court, D., Ann. Rev. Genetics 13, 319 (1979) a Youderian,

D., Bouviere, S., a Susskind, M., Celí 30, 843 až 853 (1982). Expresia uvedených génov môže byť voliteľne potlačená na translačnej úrovni vyvolaním substitúcie, delécie, inzercie, adície, alebo inverzie jedného alebo viacerých nukleotidov v oblasti medzi sekvenciou SD a iniciačným kodónom (Dunn, J. J., Buzash - Pollert, E., a Studier, F., W., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2743 (1978)). Na zníženie alebo zrušenie špecifickej aktivity lyzinového dekarboxylázového enzýmu je navyše využiteľný spôsob, v ktorom je kódujúca oblasť lyzinového dekarboxylázového génu modifikovaná alebo zrušená vplyvom substitúcie, delécie, inzercie, adície, alebo inverzie jedného alebo viacerých nukleotidov v sekvencií nukleotidov v kódujúcej oblasti.

Uvedené gény, na ktorých môže nastať substitúcia, delécia, inzercia, adícia, alebo inverzia ich nukleotidov môžu byť gén ldc alebo gén cadA. ako aj gény ldc alebo cadA gény, ktoré majú substitúciu, deléciu, alebo inzerciu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov, ktorá však nepoškodzuje základnú aktivitu kódovanej lyzinovej dekarboxylázy.

Spôsob, ktorým sa v géne vyvolá nukleotidová substitúcia, delécia, inzercia, adícia, alebo inzercia zahŕňa spôsob polohovo orientovanej mutagenézy (Kramer, W. a Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154. 350 (1987)) a spôsob s použitím chemického činidla, ako je ditioničitan sodný a hydroxylamín (Shortle, D. a Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 270(1978)).

Spôsob plohovo orientovanej mutagenézy je spôsob využívajúci syntetický oligonukleotid, čo je technika, umožňujúca vloženie voliteľnej substitúcie, delécie, inzercie, adície, alebo inverze do voliteľného a obmedzeného nukleotidového páru. Aby sa tento spôsob mohol využiť, najprv sa pripraví jedno vlákno denaturáciou plazmidu, ktorý má predmetný gén klonovaný určitou nukleotidovou sekvenciou DNA. Potom sa syntetizuje syntetický oligonukleotid komplementárne k časti, o ktorej sa uvažuje, že spôsobí mutáciu. V tomto postupe však nie je dovolené, aby syntetický oligonukleotid mal úplnú komplementárnu sekvenciu, ale je navrhnutý tak, aby mal voliteľnú nukleotidovú substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu. Potom sa na jednovláknovú DNA nechá pôsobiť syntetický oligonukleotid, ktorý má voliteľnú nukleotidovú substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu, alebo inverziu. Úplný dvojvláknový plazmid sa syntetizuje použitím T4 ligázy a Klenowho fragmentu DNA polymerázy I, ktorá sa vloží do príslušných buniek Escherichia coli. Niektoré z takto získaných transformantov majú plazmid obsahujúci gén, v ktorom je fixovaná voliteľná nukleotidová substitúcia, delécia, inzercia, adícia, alebo inverzia. Ako podobný spôsob, schopný umožniť vloženie mutácie do génu na jeho modifikáciu alebo zničenie, je spôsob rekombinantnej PCR (PCR Technology, Stockton Press (1989)).

Spôsob, využívajúci chemické činidlo je spôsob, v ktorom sa mutácia nukleotidovou substitúciou, deléciou, inzerciou, adíciou, alebo inverziou náhodne vloží do fragmentu DNA, obsahujúceho predmetný gén, priamo ditioničitanom sodným, hydroxylamínom alebo podobnými činidlami.

Expresia génu ldc a/alebo génu cadA v bunkách môže byť potlačená substitúciou normálneho génu na chromozóme mikroorganizmu, ktorý patrí do rodu Escherichia, s modifikovaným alebo znehodnoteným génom, získaným vložením mutácie, ako sa opisuje skôr. Spôsob substitúcie génu zahŕňa spôsoby, ktoré využívajú homológnu rekombináciu (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. a Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)). Homológna re kombinácia je založená na spôsobilosti, ktorú mikroorganizmus patriaci k rodu Escherichia vo všeobecnosti má. Keď sa plazmid alebo podobná časť, ktoré majú homológiu k sekvencii na chromozóme, vloží do buniek, s určitou početnosťou nastáva rekombinácia v polohe sekvencie, ktorá má homológiu. Vkladaný plazmid sa ako celok zabuduje na chromozóm. Ak potom nastáva ďalšia rekombinácia v mieste sekvencie, ktorá má homológiu na chromozóme, plazmid znova z chromozómu odpadne. V priebehu tohto procesu však gén s vloženou mutáciou sa príležitostne fixuje prednostne na chromozóme, v závislosti od polohy, v ktorej nastala rekombinácia a pôvodný normálny gén spolu s plazmidom z chromozómu odpadne. Selekcia takýchto mikrobiálnych kmeňov umožňuje získať mikrobiálny kmeň, v ktorom je normálny gén na chromozóme substituovaný modifikovaným alebo znehodnoteným génom, získaným vložením mutácie, ktorá má nukleotidovú substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu.

Uvedený mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia, ktorý sa má podrobiť substitúcii génu je mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia, ktorý produkuje L-lyzín; napríklad mikrobiálny kmeň Escherichia coli sa môže získať použitím mutácie kmeňa, ktorý neprodukuje I.-lyzín tak, aby získal odolnosť k analógom lyzínu, ako je S-(2-aminoetyl)-L-cysteín (v ďalšom texte označovaný ako „AEC“). Spôsoby mutácie zahŕňajú spôsoby, pri ktorých sa bunky Escherichia coli vystavia pôsobeniu chemického činidla, ako je N-metyl-N-mtro-N-nitrózoguanidín a kyselina dusitá, alebo ožiareniu ultrafialovým svetlom, radiácii a podobne. Uvedený mikrobiálny kmeň špecificky zahŕňa Escherichia coli AJ13069 (FERM P-14690). Tento kmeň bol skonštruovaný dodaním AEC rezistencie do kmeňa W3110, vznikajúceho zEscherichia coli K-12. Escherichia coli AJ13069 bol 6. decembra 1994 uložený v Národnom ústave pre Biologické vedy a humánne technológie Agentúry pre priemyselnú vedu a technológiu (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, poštový kód 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) pod prístupovým číslom FERM P-14690) a prevedený na medzinárodné uloženie podľa Budapeštianskej dohody 29. septembra 1995 s prideleným prístupovým číslom FERM BP-5252.

Mikrobiálny kmeň Escherichia coli, ktorý produkuje L-lyzín sa môže tiež skonštruovať vložením posilnenej DNA, ktorá nesie genetickú informáciu, relevantnú k biosyntéze L-lyzínu, spôsobmi génovej rekombinantnej technológie. Vkladaný gén je z génov, ktoré kódujú pre enzýmy biosyntetickej cesty tvorby L-lyzínu, ako sú aspartokináza, dihydropikolinátová syntetáza, dihydropikolinátová reduktáza, sukcinyldiaminopimelátová transamináza a sukcinyldiaminopimelátová deacyláza. V prípade génu enzýmu, ktorý podlieha spätnej inhibícii L-lyzínom, ako je aspartokináza a dihydropikolinátová syntetáza, treba použiť mutatný typ génu, kódujúceho pre enzým, ktorý je znecitlivený proti uvedenej inhibícii. Na vloženie a posilnenie génu je dostupný spôsob, v ktorom sa gén liguje s vektorom, autonómne replikovateľným v bunkách Escherichia coli, čím sa pripraví rekombinantná DNA, s ktorou sa transformuje Escherichia coli. Voliteľne sa gén môže tiež zabudovať do chromozómu hostiteľa spôsobom, využívajúcim transdukciu, transpozón (Berg, D. E. a Berg, C. M., Bio/Technol. 1, 417 (1983)), Mufág (japonský zverejnený patent číslo 2-109985), alebo homológnu rekombináciu (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).

Ďalšie spôsoby získavania mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia s potlačenou funkciou génu, zahŕňajú spôsob vyvolania genetickej mutácie využitím účinku chemického Činidla, ako je N-metyl-N-nitro-N-nitrózoguanidín a kyselina dusitá, alebo ožiarenia ultrafialovým svetlom, radiáciou a podobných spôsobov na bunky mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia, ktoré obsahujú uvedený gén.

V ďalej uvedenom príklade sa kmeň Escherichia coli s potlačenou funkciou lyzínovej dekarboxylázy vytvoril deléciou časti jej kódujúcej oblasti a jej nahradením génom odolným proti liečivu, aby sa získal lyzínový dekarboxylázový gén, ktorý sa potom použil na substitúciu lyzínového dekarboxylázového génu na chromozóme Escherichia coli v zhode s opísaným spôsobom, využívajúcim homológnu rekombináciu.

V jednom mikrobiálnom kmeni možno potlačiť expresiu niektorého z lyzínových dekarboxylázových génov, nového génu podľa tohto vynálezu alebo génu cadA. alebo potlačiť expresiu obidvoch uvedených génov. Expresia lyzínového dekarboxylázového génu sa môže potlačiť v mikroorganizme, patriacom k rodu Escherichia, ktorý produkuje L-lyzín, alebo sa môže produkcia L-lyzínu vyvolať u mikroorganizmu, patriacemu k rodu Escherichia, ktorý’ má potlačenú expresiu lyzínového dekarboxylázového génu spôsobom opísaným skôr.

<3> Produkcia L-lyzínu mikroorganizmom, ktorý patrí k rodu Escherichia a ktorý' má potlačenú expresiu lyzínového dekarboxylázového génu

Kultiváciou mikroorganizmu patriaceho k rodu Escherichia, ktorý má potlačenú expresiu lyzínového dekarboxylázového génu a získaného uvedeným spôsobom, sa produkuje významné množstvo L-lyzínu a akumuluje sa v kultivačnom prostredí. Akumulované množstvo L-lyzínu sa zvýšilo iba potlačením expresie známeho cadA génu. Na zvýšenie akumulovaného množstva L-lyzínu je oveľa účinnejšie potlačiť expresiu nového lyzínového dekarboxylázového génu podľa tohto vynálezu. Najpriaznivejšie výsledky produkcie L-lyzínu sa dosiahli použitím mikrobiálneho kmeňa, v ktorom bola potlačená expresia obidvoch génov, génu cadA aj nového génu podľa tohto vynálezu.

Na kultiváciu sa použije kultivačné prostredie, ktoré sa bežne používa, obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a voliteľne ďalšie stopové množstvá organickej mikrovýživy. Ako zdroj uhlíka možno použiť cukry, ako je glukóza, laktóza, galaktóza, fruktóza, a škrobové hydrolyzáty; ďalej možno použiť alkoholy, ako je glycerol a sorbitol; organické kyseliny, ako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantárová.

Ako zdroj dusíka možno použiť anorganické soli, ako je síran amónny, chlorid amónny a fosforečnan amónny; organický dusík, ako je sójový hydrolyzát; plynný amoniak a vodný roztok amoniaku. Ako anorganické ióny sa v malých množstvách pridávajú fosforečnan draselný, síran horečnatý, železitý ión, mangánatý ión.

Čo sa týka zdrojov organickej mikrovýživy, vyžaduje sa, aby v dostatočných množstvách obsahovali látky, ako je vitamín B, alebo kvasinkový extrakt alebo podobné látky.

Kultivácia sa výhodne vykonáva v aeróbnych podmienkach počas 16 až 72 hodín. Teplota kultivácie je v priebehu kultivácie výhodne udržiavaná na 30 °C až 45 °C. pH sa v priebehu kultivácie výhodne udržiava na hodnotách 5 až 7. Na udržiavanie pil sa môžu použiť anorganické alebo organické látky, kyslé alebo zásadité látky, alebo plynný amoniak a iné podobné látky.

L-lyzín sa môže od kultúry oddeľovať bežným spôsobom viazaním na ionexovej živici, zrážacím spôsobom a ďalšími známymi spôsobmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje stavbu plazmidu pUC6F5HH5, obsahujúceho nový lyzínový dekarboxylázový gén.

Obr. 2 znázorňuje stavbu teplotné citlivého plazmidu pTS6F5HH5, obsahujúceho nový lyzínový dekarboxylázový gén a konštrukciu plazmidu pTS6F5HH5Cm, v ktorom časť génu je substituovaná fragmentom, obsahujúcom gén, odolný chloramfenikolu.

Obr. 3 znázorňuje porovnanie aktivity pri rozklade L-lyzínu v kmeni WC196, kotviacom normálny lyzínový dekarboxylázový gén a v kmeňoch WC196C, WC196L a WC196LC s potlačenými génmi lyzínovej dekarboxylázy.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález sa podrobnejšie vysvetľuje v ďalšom texte pomocou príkladov.

Príklad 1 (1) Klonovanie nového lyzínového dekarboxylázového génu

Z buniek kmeňa W3110 Escherichia coli K-12 sa bežným spôsobom extrahovala chromozomálna DNA. Uvedený kmeň sa získal z Národného ústavu pre genetiku (National Inštitúte of Genetics, Yata 1111, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko). Ďalej sa syntetizovali dva syntetické DNA priméry, ako sú uvedené v SEQ ID NO: 1 a 2 Zoznamu sekvencií. Syntéza sa vykonala bežným spôsobom na základe nukleotidovej sekvencie génu cadA (pozri SEQ ID NO: 5), opísanej v práci autorov Meng, S. a Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174, 2659 (1992). Uvedené priméiy mali sekvencie homológne k 5-koncovej protismemej časti a k 3-koncovej časti cadA génu. Uvedená chromozomálna DNA a priméry DNA sa použili pri PCR, spôsobom podľa Erlicha et al. (PCR Technology, Stockton Press (1989). Získal sa tak fragment DNA o 2,1 kbp, obsahujúci takmer všetky časti génu cadA. Tento fragment sa na prípravu vzorky na hybridizáciu označil pomocou súpravy Random Primer Labeling Kit (vyrábanej firmou Takara Shuzo) a [a-³²P]dCTP (vyrábanej firmou Amersham, Japonsko).

Ďalej sa bežným spôsobom (Molecular Cloning, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) vykonala hybridizácia pripravenej vzorky s Escherichia co/í/génovou zobrazovacou membránou (Gene Mapping Membráne, vyrábanou firmou Takara Shuzo). Knižnica Koharu et al. (lambda fágová knižnica chromozomálnej DNA Escherichia coli: pozri Kohara, Y., et al., Celí, 50, 495 až 508 (1987)) sa adsorbovala na Escherichia co/í/génovej zobrazovacej membráne. Po ukončení hybridizácie sa Lambda-fágové klony, ktoré mali podobné sekvencie ako gén cadA, vytrieďovali pomocou zmierňovania podmienok pri premývaní vzorky (2x SSC, 55 °C, 30 minút). Výsledkom bolo úspešné zaznamenanie slabých signálov z troch klonov E2B8, 6F5H a 10F9 popri silných signáloch z klonov, obsahujúcich génovú oblasť cadA (21H11, 5G7). Inzerčné sekvencie uvedených lambda fágových klonov E2B8, 6F5H a 10F9 pokračujú na chromozóme Escherichia coli, kým sa neprekrýva jedna s druhou. Lambda fágová

DNA 6F5H, patriaca do knižnice Koharu et. al. (Kohara, Y. et al., Celí, 50, 495 až 508 (1987)) sa potom bežnými spôsobmi oddelila a digerovala s rôznymi reštrikčnými enzýmami na vykonanie hybridizácie Southemovým prenosom použitím opísanej vzorky podobným spôsobom, ako bol opísaný. Výsledkom bolo zistenie, že vo fragmente o približne 5 kbp, získanom digesciou s HindlII bola prítomná sekvencia podobná génu cadA.

Fragment o približne 5 kbp, získaný digesciou lambda fágovej DNA z 6F5H s HindlII, sa podrobil ligácii s digestom HindlII plazmidu pUC19 (vyrábaný firmou Takara Shuzo) s použitím T4 DNA ligázy. Táto reakčná zmes sa použila na transformáciu Escherichia coli JM109 (vyrábaný firmou Takara Shuzo) na získanie kmeňov rezistentných proti ampicilínu, ktoré rástli na úplnom tuhom médiu (obsahujúcom 10 g polypeptónu, 5 g kvasinkového extraktu a 5 g chloridu sodného v 1 dm³ vody) s prídavkom 50 mg.mľ¹ ampicilínu. Z toho sa získal mikrobiálny kmeň, ktorý kotvil plazmid s inzerciou fragmentu o približne 5 kbp, získaný digesciou lambda fágovej DNA z 6F5H s HindlII. Z jeho buniek sa extrahoval plazmid. Tak sa získal plazmid pUC6F5HH5. Na obr. 1 je znázornená stavba plazmidu pUC6F5HH5.

Escherichia coli JM109/pUC6F5HH5, kotviaci tento plazmid sa označil ako AJ13068 a bol uložený 6. decembra 1994 v Národnom ústave pre Biologické vedy a humánne technológie Agentúry pre priemyselnú vedu a technológiu (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, poštový kód 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) pod prístupovým číslom FERM P-14689) a prevedený na medzinárodné uloženie podľa Budapeštianskej dohody 29. septembra 1995 s prideleným prístupovým číslom FERMBP-5251.

(2) Stanovenie nukleotidovej sekvencie nového lyzínového dekarboxylázového génu

Nukleotidová sekvencia oblasti medzi enzýmovými reštrikčnými miestami Clal a HindlII získaného pUC6F5HH5 sa stanovila spôsobom, opísaným v Molecular Cloning, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Výsledkom bolo zistenie, že bola kódovaná nukleotidová sekvencia, uvedená v SEQ ID NO: 3. Táto sekvencia DNA obsahuje otvorený čítací rámec, ktorý kóduje pre sekvenciu aminokyselín, uvedenú v SEQ ID NO: 4 zo Zoznamu sekvencií.

(3) Príprava Escherichia coli, ktorá produkuje lyzín

Na ďalšie spracovanie mutáciou sa najprv kultivovali Escherichia coli W3110 pri 37 °C počas 4 hodín v úplnom médiu (obsahujúcom 10 g polypetónu, 5 g kvasinkového extraktu a 5 g chloridu sodného v 1 dm³ vody). Získané mikrobiálne bunky sa podrobili mutácii pri 37 °C počas 30 minút v roztoku N-metyl-N-nitro-N-nitrózoguanidínu s koncentráciou 200 pg.mľ¹, premyli a potom sa použili do tuhého minimálneho média (obsahujúceho 7 g hydrogenfosforečnanu disodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 1 g chloridu amónneho, 0,5 g chloridu sodného, 5 g glukózy, 0,25 g heptahydrátu síranu horečnatého a 15 g agaru v 1 dm³ vody) s prídavkom 5 g.dm³ AEC. Po 48 hodinovej kultivácii pri 37 °C a oddelení kolónií sa získali kmene, odolné proti AEC. Medzi nimi bol aj kmeň WC196, ktorý produkoval L-lyzín. Kmeň WC196 sa označil ako AJ13069 a bol uložený 6. decembra 1994 v Národnom ústave pre Biologické vedy a humánne technológie Agentúry pre priemyselnú vedu a technológiu (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, poštový kód 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) pod prístupovým číslom FERM P-14690) a prevedený na medzinárodné uloženie podľa Budapeštianskej dohody 29. septembra 1995 s prideleným prístupovým číslom FERM BP-5252.

(4) Vytvorenie kmeňa WC196 s potlačenou funkciou nového lyzinového dekarboxylázového génu

Opísaný fragment o približne 5 kbp, získaný digesciou lambda fágovej DNA 6F5H s HindlII sa podrobil ligácii s digestom HINDIII teplotné citlivého plazmidu pMANO31 (Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)) a použitím T4 DNA ligázy. Táto reakčná zmes sa použila na transformáciu Escherichia coli JM109 na kmeň rezistentný proti ampicilínu, ktorá sa vykonala kultiváciou pri 37 °C počas 24 hodín na úplnom tuhom médiu s prídavkom 50 mg.dm'³ ampicilínu. Transformáciou sa získal mikrobiálny kmeň, ktorý kotvil plazmid s vloženým fragmentom o približne 5 kbp, získaným digesciou lambda fágovej DNA z 6F5H s HindlII. Z buniek tohto kmeňa sa extrahoval plazmid, čím sa získal plazmid pTS6F5HH5. Uvedený plazmid pTS6F5HH5 sa digeroval s EcoRV, aby sa odstránil fragment DNA o približne 1 kbp. Ďalej sa na vloženie fragmentu, ktorý má gén odolný proti chloramfenikolu o približne 1 kbp a ktorý sa získal digesciou pHSG399 (vyrábanej firmou Takara Shuzo) s Accl, použila T4 ligáza. Tak sa skonštruoval plazmid pTS6F5HH5Cm. Výsledkom uvedených operácií bola úspešná konštrukcia plazmidu, ktorý má fragment DNA s potlačenou funkciou nového lyzinového dekarboxylázového génu. Na obr. 2 je znázornená stavba plazmidov pTS6F5HH5 a pTS6F5HH5Cm.

Ďalej sa vytvoril kmeň, v ktorom bol nový lyzínový dekarboxylázový gén na chromozóme kmeňa WC196 nahradený fragmentom DNA s potlačenou funkciou z nového dekarboxylázového génu, spôsobom bežnej homológnej rekombinácie (Matsuyama, S. a Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) s využitím teplotnej citlivosti plazmidu pTS6F5HH5Cm. Bližšie, kmeň WC196 sa transformoval s plazmidom pTS6F5HH5Cm, čím sa najprv získal kmeň, ktorý' bol odolný proti ampicilínu a odolný proti chloramfenikolu pri 30 °C. Potom sa tento kmeň použil na prípravu kmeňa, ktorý bol odolný proti ampicilínu a odolný proti chloramfenikolu pri 42 °C, Tento kmeň sa ďalej použil na prípravu kmeňa, ktorý’ bol citlivý na ampicilín a odolný proti chloramfenikolu pri 30 °C.

Tak sa získal uvedený kmeň, v ktorom bol lyzínový dekarboxylázový gén na chromozóme kmeňa WC196 nahradený fragmentom DNA s potlačenou funkciou nového lyzinového dekarboxylázového génu. Tento kmeň sa označil ako kmeň WC196L.

(5) Vytvorenie kmeňa WC196 a kmeňa WC196L s deficitným génom cadA

Escherichia coli, v ktorom je potlačený dekarboxylázový gén cadA. je známy vrátane napríklad kmeňa GNB10181, pochádzajúceho z kmeňa K-12 Escherichia coli (pozri Auger, E. A. et al., Mol. Microbiol. 3, 609 (1989); tento mikrobiálny kmeň je dostupný napríklad z Genetického úložného strediska E. coli (E. coli Genetic Stock Center, Connecticut, USA). Zistilo sa, že oblasť génu cadA tohto kmeňa je deficitná. Tento znak cadA génovej deficitnej oblasti génu GNB10181 sa transdukoval do kmeňa WC196 bežným spôsobom s použitím fága Pl (A Short

Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992)), čím sa vytvoril kmeň WC196C. Deficit v cadA génovej oblasti kmeňa WC196 sa potvrdil Soutbernovým hybridizačným prenosom. Ďalej sa ešte vytvoril kmeň WC196LC s deficitom v oblasti cadA génu, z kmeňa WC196L podobným spôsobom, ako bol opísaný.

Príklad 2 (1) Potvrdenie vplyvu kmeňov WC196, WC196C, WC196L a WC196LC na rozkladnú reakciu L-lyzínu

Štyri uvedené vytvorené kmene sa kultivovali pri 37 °C počas 17 hodín s použitím média na produkciu L-lyzínu (ktoré obsahovalo 40 g glukózy, 16 g síranu amónneho, 1 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 2 g kvasinkového extraktu, 10 mg tetra- až pentahydrátu síranu manganatého a 10 mg heptahydrátu síranu železnatého v 1 dm³ vody; pH sa nastavilo na hodnotu 7,0 pomocou hydroxidu draselného a potom sa pridalo 30 g osobitne sterilizovaného uhličitanu vápenatého). Získané mikrobiálne bunky' sa dvakrát premyli fyziologickým soľným roztokom, suspendovali v prostredí na skúšanie rozkladnej reakcie L-lyzínu (ktoré obsahovalo 17 g dodekahydrátu hydrogenfosforečnanu disodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu sodného a 10 g hydrochloridu L-lyzínu v 1 dm³vody) a kultivovali sa pri 37 °C počas 31 hodín.

Na obr. 3 je znázornená závislosť množstva L-lyzínu, ostávajúceho v kultivačných kvapalinách od doby kultivácie. Množstvo L-lyzínu sa stanovovalo kvantitatívne s použitím analyzátora Biotech Analyzer AS-210 (vyrábaného firmou Asahi Chemical Industry). Významný rozklad L-lyzínu sa pozoroval u kmeňa WC196. Rozklad bol trocha potlačený u kmeňa WC196C s deficitom v oblasti cadA génu, ako známeho L-lyzínového dekarboxylázového génu. Rozklad L-lyzínu sa však nezistil u kmeňov WC196L a WC196LC, ktoré mali potlačenú funkciu nového lyzínového dekarboxylázového génu. Množstvo L-lyzínu, ktoré zostávalo v kultivačnej kvapaline sa znižovalo v časovom intervale do troch hodín kultivácie u všetkých mikrobiálnych kmeňov. Tento jav bol však spôsobený zabudovávaním L-lyzínu do mikrobiálnych buniek a nebol spôsobený rozkladom L-lyzínu.

(2) Produkcia L-lyzínu kmeňmi WC196, WC196C, WC196L a WC196LC

Štyri opísané kmene sa kultivovali pri 37 °C počas 20 hodín v prostredí vhodnom na produkciu lyzínu, uvedenom skôr. V kultivačnej tekutine sa stanovovali vyprodukované a akumulované množstvá L-lyzínu a kadaverínu. Množstvo L-lyzínu sa kvantitatívne stanovilo použitím zariadenia Biotech Analyzer AS-210, opísanom skôr. Množstvo kadaverínu sa kvantitatívne stanovilo použitím vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 1. V kmeni WC196C s potlačeným génom cadA sa v porovnaní s kmeňom WC196 zvýšila akumulácia L-lyzínu a znížila sa akumulácia kadaverínu ako rozkladného produktu L-lyzínu. Rovnako sa zaznamenal rozdiel medzi kmeňom WC196L s potlačenou funkciou nového lyzinového dekarboxylázového génu v porovnaní s kmeňmi WC196 a WC196C. Akumulácia L-lyzínu sa ďalej zvýšila a akumulácia kadaverínu ako rozkladného produktu L-lyzínu sa vôbec nezaznamenala v kmeni WC196LC s potlačenou funkciou obidvoch lyzínových dekarboxy lazových génov.

Tabuľka 1

Mikrobiálny kmeň	Akumulácia L-lyzínu (g.dm'³)	Akumulácia kadaverínu (g.dm^-3)
UC196	1,4	0,6
VC196C	1,9	0,4
VC196L	2,3	0,1
VC196LC	3.3	nedokázaná

Príklad 3

Na získanie kmeňa, rezistentného proti ampicilínu sa kmeň WC196LC Escherichia coli s potlačenou rozkladnou účinnosťou proti L-lyzínu transformoval plazmidom pUC6F5HH5, obsahujúcom novy- lyzínový dekarboxylázový gén. Kmeň WC196LC a kmeň WC196LC/pUC6F5HH5 sa kultivovali pri 37 °C počas 16 hodín v prostredí vhodnom na produkciu lyzínu s prídavkom 5 g.dm³ L-lyzínu a stanovovalo sa množstvo vytvoreného kadaverínu.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 2. Kmeň WC196LC nespôsobil premenu L-lyzínu na kadavcrín, zatiaľ čo kmeň WC196LC/pUC6F5HH5 mal schopnosť konvertovať L-lyzin na kadaverín.

Tabuľka 2

Mikrobiálny	Vyprodukované množstvo
kmeň	kadaverínu (g.dm ^J)
VC196LC	nedokázané
VC196LC/pUC6F5HH5	0,95

Priemyselná využiteľnosť

Nový lyzínový dekarboxylázový gén podľa tohto vynálezu sa zúčastňuje na rozklade L-lyzínu v Escherichia coli. L-lyzín sa môže vyrábať nenákladným a hospodárnym spôsobom kultivácie baktérií, patriacich k rodu Escherichia, ktorc produkujú L-lyzín a majú potlačenú expresiu uvedeného génu a/alebo génu cadA.

Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie (i) Prihlasovateľ: Ajinomoto Co., Inc.

(ii) Názov vynálezu: Nový lyzínový dekarboxylázový gén a spôsob výroby L-lyzínu (iii) Počet sekvencií: 6 (iv) Adresa pre korešpondenciu:

(A) Adresát:

(B) Ulica:

(C) Mesto:

(D) Krajina:

(E) ZIP:

(v) Počítačom čitateľný tvar:

(A) Druh média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: FastSEQ Version 1.5 (vi) Údaje o tejto prihláške (A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(C) Zatriedenie:

(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(viii) Informácia o právnom zástupcovi:

(A) Meno:

(B) Registračné číslo:

(ix) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón:

(B) Telefax:

(2) Údaje o SEQ ID NO: 1 (1) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 20 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekuíový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „Synthetic DNA“ (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

TGGATAACCA CACCGCGTCT 20 (2) Údaje o SEQ IDNO:2 (1) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „Synthetic DNA“ (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

GGAAGGATCA TATTGGCGTT 20 (2) Údaje o SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 3269 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvoj vláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (iii) Hypotetická: nie (iV) Anti-sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: W3110 (ix) Znak:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1005 až 3143 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

ATCGATTCTC T5ACTGCGGT TAGCCGTCAG GXAGTGCATC GľCTGCGTGA AAMAGCGTA GGTGCäTGGC AfiATTGCGCA ACTGGCACGC GTTCGCCTGG CATTTGATGA ATTTGACGAA AAAGCTATCG TCGGTGGTAT CGCCCGTCTC CAAAMGGTC GTGAAACCAA AGAAAAAMT GGTTACCGCA AAGCACTGCG TCTGATGCAA ACCTTIATC6 ACACCCCGGG SCCTTATCCT GAAGCCATTG CACGCAACCT GCGTGAAATG GTTATCGGTG AAGGTGGTTC TGGCGGTGCG ATGCTGCAAT ACAGCACCTA TTCCGTTATC AAGAGCGCCG ACAAAGCČCC GCTGGCGGCT AAAGAACTGA AACTGATCGA GTCCATCATC CCGGAAGCGA TGGCGGCATC GľTGAAAGCG GTGTTAAGCA CTGAAGATM AAAAAATCGT GCGTAATTCG CAAAAGTTCT GAAAAAGGGT TTTGAGCAGG CTATGATTAA GGAAGGAT1T

GATGAGAAAC TGGATATTAA CATCGATGAA€0

GAACTGACAC GTAAAATCTT CGCCGATCTC120

CATCCACÄGC GŤCCTTATAC CCTGGATTAC180

CTGGCTGGCG ACCGCGCGTA TGCAGACGAT240

GATGGTCGTC CGGTGATGAT CATTGGTCAT300

CGCCGTAACT TTGGTATGCC AGCGCCAGAA360

ATGGCTGAAC GCTTTAAGAT GCCTATCATC420

GGCGTGSGCG CAGAAGAQCG TGGTCAGTCT480

TCTCGCCTCG GCGTACCGGT AGTTTGTACG540

CTGGCGAMG GCGTGGGCGA TAAAGTGAA?600

TCGCCGGAAG GTTGTGCGTC CAITCTGTGG660

GAAGCGATGG GTATCMTGC ICCGCGTCTG720

CCGGAACCAC TGGGTGGTGC TCACCGTAAC780

CAACTGCTGG CGGATCTGGC CGATCfCGAC840

CGTTATCAGC GCCTGATGAG CTACGGTTAC900

CACTTCGGTG GCCCTJtTTT ATCGCCACGG960

TCCAGGAGGA ACAC MG AAC ATC ATT 1016

Met Asn 11« Íle

GCC

ATT

ATG

SGA

CCG

CAT

GGC

GTC

TTT

TAT

AAA

GAT

GAG CCC

ATC

AAA

1064

Ala

íle

Met

Gly

Pro

Hls

Gly

Val

Phe

Tyr

lys

Asp

Glu Pro

íle

Lya

5

10

15

20

GAA

CTG

GAG

TCG

GCG

CTG

GTG

GCG

CAA

GGC

TTT

CAG

ATT ATC

TGG

CCA

1112

Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gin Gly Phe Gin íle íle Trp Pio

3035

CAA AAC AGC GTT GAT TTG CTG AAA TTT ATC GAG CAT AAC CCT CGA ATT1160

Gin Aen Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe tie Glu Hls Asn Pro Argíle

15SO

TGC GGC GTG ATT TTT GAC TGG GAT GAG TAC AGT CTC GAT TTA TGT AGC1208

Cys Gly Val íle Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu Asp Leu CysSer

6065

GAT

ATC

AAT

CAG

CTT

AAT

GAA

TAT

CTC

CCG

CTT

TAT

GCC

TTC

ATC

AAC

125«

Asp

Ila

Asn

Gin

Leu

Asn

Glu

Tyr

Leu

Pro

Leu

Tyr

Ala

Phe

íle

Asn

70

75

80

ACC

CAC

TCG

ACG

ATG

GAT

GTC

AGC

GTG

CAG

GAT

ATG

CGG

ATG

GCG

C7C

1304

Thr

His

Ser

Thr

Met

Asp

Val

Ser

Val

Gin

Asp

Met

Arg

Met

Ala

Leu

95

90

9S

100

TGG

TTT

GAA

TAT

GCG

CTG

GGG

CAG

GCG

GAA

GAT

ATC

CCC

ATT

CGT

1352

Trp

Phe

Glu

Tyr

Ala

Leu

Gly

Gin

Ala

Glu

Asp

11«

Ala

íle

Arg

105

11Q

115

ATG

CGT

CAG

TAC

ACC

GAC

GAA

TAT

CTT

GAT

AAC

ATT

ACA

CCG

TTC

1400

Met

Arg

Gin

Tyr

Thr

Asp

Glu

Tyr

Leu

Asp

Asn

íle

Thr

Pro

Phe

L20

12S

130

ACG

AAA

GCC

TTG

TTT

ACC

TAC

GTC

AAA

GAG

CGG

AAG

TAC

ACC

TTT

TGT

1446

Thr

Lys

Ala

Leu

Phe

Thr

Tyr

Val

Lys

Glu

Arg

Lys

Tyr

Thr

Phe

cys

135

140

145

ACG

CCG

GGG

CAT

ATG

GGC

ACC

GCA

TAT

CAA

AAA

AGC

CCG

GTT

GGC

1496

Thr

Pro

Gly

MÍS

Met

Gly

Thr

Ala

Tyr

Gin

Lys

Ser

Pro

val

Gly

150

155

160

TGT

CTG

TTT

ΓΑΤ

GAT

TTT

TTC

GGC

GGG

AAT

ACT

CTT

MG

GCT

GAT

GTC

1544

Cys

Leu

Phe

Tyr

Asp

Phe

Gly

Asn

Thr

Leu

Lys

Ala

Asp

Val

165

170

175

160

TCT

ATT

TCG

GTC

ACC

GAG

CTT

GGT

TCG

TTG

CTC

GAC

CAC

ACC

GGG

CCA .

1592

ser

íle

Ser

Val

Thr

Glu

Leu

Gly

Ser

Leu

Asp

His

Thr

Gly

Pro

195

190

195

CAC

CTG

GAA

GCG

GAA

GAG

TAC

ATC

GCG

CGG

ACT

TTT

GGC

GCG

GAA

CAG

1640

His

Leu

Glu

Ala

Glu

GLU

Tyr

118

Ala

Arg

Thr

Phe

Gly

Ala

Glu

Gin

200

205

210

AGT

TAT

ATC

GTT

ACC

AAC

GGA

ACA

TCS

ACG

TCG

AAC

AAA

ATT

GTG

GGT

1688

Ser

Tyr

íle

Val

Thr

Asn

Gly

Thr

ser

Thr

Ser

Asn

Lys

íle

Val

Gly

215

220

225

ATG

TAC

GCC

GCG

CCA

TCC

GGC

AGT

ACG

CTG

TTG

ATC

GAC

CGC

AAI

TGT

1736

Met

Tyr

Ala

Pro

Ser

Gly

Ser

Thr

Leu

11«

Asp

Arg

Asn

cys

230

235

240

CAT

AAA

TCG

CTG

GCG

•CAT

CTG

TTG

ATG

AAC

GAT

GTA

GTG

CCA

GTC

1784

Hls

Lys

Ser

Leu

Ala

His

Leu

Met

Asn

Asp

Val

Pro

Val

245

250

25$

260

TGG

CTG

AAA

CCG

ACG

CGT

AAT

GCG

TTG

GGG

ATT

CTT

GGT

GGG

ATC

CCG

1832

Trp

Leu

Lys

Pro

Thr

Arg

Asn

Ala

Leu

Gly

11«

Leu

Gly

íle

Pro

265

270

275

CGC

CGT

GAA

TTT

ACT

CGC

GAC

AGC

ATC

GAA

GAG

AAA

GTC

GCT

ACC

1880

Arg

G1U

Phe

Thr

Arg

Asp

Ser

íle

G1U

Glu

Lys

Val

A) a

Ala

Thr

280

285

290

ACG

CAA

GCA

CAA

TGG

CCG

GTT

CAT

GCG

GTG

ATC

ACC

AAC

TCC

ACC

TAT

1926

Thr

Gin

Ala

Gin

Trp

Pro

Val

His

Ala

Val

Tie

Thr

Asn

Ser

Thr

Tyr

295

300

305

GAT

GGC

TTG

CTC

TAC

AAC

ACC

GAC

TGG

ATC

AAA

CAG

ACG

CTG

GAT

GTC

1976

Asp

Gly

Leu

Tyr

Asn

Thr

Asp

Trp

íle

Lys

Gin

Thr

Leu

Asp

Val

310

315

320

CCG

TCG

ATT

CAC

TTC

GAT

TCT

GCC

TGG

GTG

CCG

TAC

ACC

CAT

TTT

CAT

2024

?ra

Ser

íle

His

Phe

Asp

Ser

Ala

Trp

Val

Pro

Tyr

Thr

His

Phe

HÍS

325

330

335

340

CCG

ATC

TAC

CAG

GGT

AAA

AGT

GGT

ATG

AGC

GGC

GAG

CGT

GTT

GCG

GGA

2072

Pro

íle

Tyr

Gin

Gly

Lys

Ser

Gly

Met

Ser

Gly

Glu

Arg

Val

Ala

Gly

345

350

355

AAA

GTG

ATC

TTC

GAA

ACG

CAA

TCS

ACC

CAC

AAA

ATG

CTG

GCG

TTA

2120

Lys

Val

11«

Phe

Glu

Thr

Gin

Ser

Thr

His

Ly·

Met

Leu

Ala

Leu

350

365

370

TCG

CAG

GCT

TCG

CTG

ATC

CAC

ATT

AAA

GGC

GAG

TAT

GAC

GAA

GAG

GCC

2168

Ser

Gin

Ala

Ser

Leu

íle

His

íle

Lys

Gly

Glu

Tyr

Asp

Glu

Ala

375

380

385

TTT

AAC

GAA

GCC

TTT

ATG

CAT

ACC

TCG

CCC

AGT

TAT

CCC

2216

Phe

Asn

Glu

Ala

Phe

Met

His

Thr

Ser

Pro

Ser

Tyr

Pre

390

395

400

ATT

GTT

GCT

TCG

GTT

GAG

ACG

GCG

ATG

CTG

CGT

GGT

AAT.

CCG

2264

11«

Val

Ala

Ser

Val

Glu

Thr

Ala

Met

Leu

Arg

Gly

Asn

Pro

405

410

415

420

GGC

AAA

CGG

CTG

ATT

AAC

CGT

TCA

GTA

GAA

CGA

GCT

CTG

CAT

TTT

CGC

2312

Gly

Lys

Arg

Leu

íle

Asn

Arg

Ser

Val

Glu

Arg

Ala

Leu

His

Phe

Arg

425

430

435

AAA

GAG

GTC

CAG

CGG

CTG

CGG

GAA

GAG

TCT

GAC

GGT

TGG

TTT

TTC

GAT

2360

Lys

Glu

Val

Gin

Arg

Leu

Arg

Glu

Ser

Asp

Gly

Trp

Phe

Asp

440

445

450

ATC

TGG

CAA

CCG

CAG

GTG

GAT

GAA

GCC

GAA

TGC

TGG

CCC

GTT

GCG

: 2408

11«

Trp

Gin

Pro

Gin

Val

Asp

Glu

Ala

Glu

Cys

Trp

Pro

val

Ala

455 460 465

CCT

GGC

GAA

CAG

TGG

CAC

GGC

TTT

AAC

GAT

GCG

GAT

GCC

GAT

CAT

ATG

2456

Pro

Gly

G1U

Gin

Trp

HÍS

Gly

Phe

Asn

Asp

Ala

Aap

Ala

Asp

His

Met

470

475

480

TTT

CTC

GAT

CCG

GTT

AAA

GTC

ACT

ATT

TTG

ACA

CCG

GGG

ATG

GAC

GAG

2504

Phe

Leu

Asp

Pro

Val

Lys

Val

Thr

íle

Leu

Thr

Pre

Gly

Met

Asp

Glu

«85

490

495

50«

CAG

GGC

AAT

ATG

AGC

GAG

GGG

ATC

CCG

GCG

CTG

GTA

GCA

AAA

2552

Gin

Gly

Asn

Mat

Set

Glu

G1U

Gly

íle

Pro

Ala

Leu

Val

Ala

Lys

505

510

515

TTC

CTC

GAC

GAA

CGT

GGG

ATC

GTA

CAG

AAA

ACC

GGC

CCT

TAT

AAC

2600

Phe

Leu

Asp

Glu

Arg

Gly

íle

Val

Glu

Lys

Thr

Gly

Pro

Tyr

Asn

SŽO

$25

530

CTG

TTT

CTC

TTT

AGT

ATT

GGC

ATC

GAT

AAA

ACC

AAA

GCA

ATG

GGA

264«

Leu

Phe

Leu

Phe

Ser

íle

Gly

íle

ASp

Ly»

Thr

Lys

Ala

Met

Gly

535

$40

54$

TTA

TTG

CGT

GGG

TTG

ACG

GAA

TTC

AAA

CGC

TCT

TAC

GAT

CTC

AAC

CTG

2696

Leu

Arg

Gly

Leu

Thr

Glu

Phe

Lys

Arg

Ser

Tyr

Asp

Leu

Asn

Leu

5SD

555

560

CGG

ATC

AAA

AAT

ATG

CTA

CCC

GAT

CTC

TAT

GCA

GAA

GAT

CCC

GAT

TTC

2744

Arg

íle

Lys

Asn

Met

Leu

Pro

Asp

Leu

Tyr

Ala

Glu

Asp

Pro

Asp

Phe

565

570

575

580

TAC

CGC

AAT

ATG

CGT

ATT

CAG

GAT

CTG

GCA

CAA

GGG

ATC

CAT

AAG

CTG

2792

Tyr

Arg

Asn

Met

Arg

íle

Gin

Asp

Leu

Ala

Gin

Gly

íle

His

Lys

Leu

585

590

595

ATT

CGT

AAA

CAC

GAT

CTT

CCC

GGT

TTG

ATG

TTG

CGG

GCA

TTC

GAT

ACT

2840

íle

Arg

Lye

His

Asp

Leu

Pro

Gly

Leu

Met

Leu

Arg

Ala

Phe

Asp

Thr

600

605

610

TTG

CCG

GAG

ATG

ATC

ATG

ACG

CCA

CAT

CAG

GCA

TGG

CAA

CGA

CAA

ATT

2888

Leu

Pro

Glu

Met

íle

Het

Thr

Pro

Hla

Sln

Ala

Trp

Gin

Arg

Gin

Tie

«15

620

625

AAA

GGC

GAA

GTA

GAA

ACC

ATT

GCG

CTG

GAA

CAA

CTG

GTC

GGT

AGA

GTA

293«

Lys

Gly

Glu

Val

G1U

Thr

íle

Ala

Leu

Glu

Gin

Leu

Val

Gly

Arg

val

630

«35

640

TCG

GCA

AAT

ATG

ATC

CTG

CCT

TAT

CCA

CCG

GGC

GTA

CCG

CTG

TTG

ATC

2984

Ser

Ala

Asn

Mat

íle'

Leu

Pro

Tyr

Pro

Gly

Val

Pro

Leu

Met

645

650

«55

««0

CCT

GGA

CAA

ATG

CTG

ACC

AAA

GAG

AGC

CGC

ACA

GTA

CTC

GAT

TTT

CTA

3032

Pro

Gly

Glu

Met

Leu

Thr

Lys

G1U

Ser

Arg

Thr

Val

Leu

Asp

Phe

Leu

6£S

670

«75

CTG

ATG

CTT

TGT

TCC

GTC

GGG

CAA

CAT

TAC

CCC

GGT

TTT

GAA

ACG

GAT

3080

Leu

Mtt

Leu

Cys

Ser

Val

Gly

Gin

His

ryr

Pro

Gly

Phe

Glu

Thr

Aap

600

685

690

ATT

CAC

GGC

GCG

AAA

CAG

GAC

GAA

GAC

GCC

GTT

TAC

CGC

GTA

CGA

GTC

3128

íle

Hla

Gly

Ala

Ly»

Gin

Asp

Glu

Asp

Gly

Val

Tyr

Arg

Val

Arg

Val

69S 700 705

CTA AAA ATG GCG GGA TAACTTGCCA GAGCGGCTTC CGGGCGAGTA ACGTTCTGTT 3163 Leu Lys Met Ala Gly

710

AACAAATAAA GGAGACGTTA TGCTGGGTTT AAAACAGGTT CACCATATTG CGATTATTGC 3243 GACGGATTAT GCGGTGAGCA AAGCTT 3269

2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 713 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

Met

Asn

11«

íle

Ala

íle

Met

Gly

Pro

His

Gly

Val

Phe

Tyr

Lys

Asp

1

5

10

15

Glu

Pro

11«

Lys

Glu

Leu

Glu

Ser

Ala

Leu

Val

Ala

Gin

Gly

Phe

Gin

20

25

30

íle

Trp

Pro

Gin

Asn

Ser

val

Asp

Leu

Lys

Phe

Íle

Glu

His

35

40

«5

Asn

Pro

Arg

11«

Cys

Gly

Val

íle

Phe

Asp

Trp

Asp

Glu

Tyr

Ser

Leu

50

55

60

Asp

Leu

Cys

Ser

Asp

11«

Asn

Gin

Leu

Asn

Glu

Tyr

Leu

Pro

Leu

Tyr

65

70

75.

80

Ala

Phe

íle

Asn

Thr

His

Ser

Thr

Met

Asp

Val

Ser

Val

Gin

Asp

Met

85

90

95

Arg

Met

Ala

Leu

Trp

Phe

Glu

Tyr

Ala

Leu

Gly

Gin

Ala

Glu

Asp

100

105

110

íle

Ala

íle

Arg

Met

Arg

Gin

Tyr

Thr

Asp

Glu

Tyr

Leu

Asp

Asn

íle

115

120

125

Thr

Pro

Phe

Thr

Lys

Ala

Leu

Phe

Thr

Tyr

Val

Lys

Glu

Arg

Lys

130

L3S

140

Tyr

Thr

Phe

Cys

Thr

Pro

Gly

His

Met

Gly

Thr

Ala

Tyr

Gin

Lys

145

150

155

160

Ser

Pro

Val

Gly

Cys

Leu

Phe

Tyr

Asp

Phe

Gly

Asn

Thr

Leu

165

170

175

Lys

Ala

Asp

val

Ser

íle

ser

Val

Thr

Glu

Leu

Gly

Ser

Leu

Asp

180

185

190

His

Thr

Gly

Pro

His

Leu

Glu

Ala

Glu

Tyr

íle

Ala

Arg

Thr

Phe

195

200

205

Gly

Ala

Glu

Gin

Ser

Tyr

íle

Val

Thr

Asn

Gly

Thr

Ser

Thr

Ser

Asn

210

215

220

Lys

íle

Val

Gly

Met

Tyr

Ala

Pro

Ser

Gly

Ser

Thr

Leu

íle

225

230

235

240

Asp

Arg

Asn

Cys

His

Lya

Ser

Leu

Ala

His

Leu

Met

Asn

Asp

245

250

255

Val

Pro

Val

Trp

Leu

Lys

Pro

Thr

Arg

Asn

Ala

Leu

Gly

íle

Leu

260

265

270

Gly

íle

Pro

Arg

Glu

Phe

Thr

Arg

Asp

Ser

íle

Glu

Lys

275

280

285

Val

Ala

Thr

Gin

Ala

Gin

Trp

Pre

Val

His

Ala

Val

íle

Thr

290

295

300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Asp

Gly

Leu

Tyr

Asn

Thr

Asp

Trp

íle

Lys

Gin

305

310

315

320

Thr

Leu

Aap

Val

Pro

Ser

íle

His

Phe

Asp

Ser

Ala

Trp

Val

Pro

Tyr

325 330 335

Thr

His

Phe

His

Pro

Tie

Tyr

Gin

Gly

Lys

Ser

Gly

Met

Ser

Gly

Glu

340

345

350

Arg

Val

Ala

Gly

Lys

Val

íle

Phe

Glu

Thr

Gin

ser

Thr

His

Lys

Met

355

360

365

Leu

Ala

Leu

Ser

Gin

Ala

Ser

Leu

íle

His

íle

Lys

Gly

Glu

Tyr

370

375

3Ô0

Asp

Glu

Ala

Phe

Asn

Glu

Ala

Phe

Met

Net

His

Thr

Ser

385

390

395

400

Pro

Ser

Tyr

Pro

íle

Val

Ala

ser

val

Glu

Thr

Ala

Met

Leu

405

410

415

Arg

Gly

Asn

Pro

Gly

Lys

Arg

Leu

íle

Asn

Arg

Ser

Val

Glu

Arg

Ala

420

425

430

Leu

His

Phe

Arg

Lys

Glu

val

Gin

Arg

Leu

Arg

Glu

Ser

Asp

Gly

435

440

H5

Trp

Phe

Asp

íle

Trp

Gin

Pro

Gin

val

ÄSp

Glu

Ala

Glu

Cys

450

455

460

Trp

Pro

Val

Ala

Pro

Gly

Glu

Gin

Trp

His

Gly

Phe

Asn

Asp

Ala

Asp

465

470

475

480

Ala

Asp

His

Met

Phe

Leu

Asp·

Pro

Val

Lys

Val

Thr

íle

Leu

Thr

Pro

485

490

495

Gly

Met

Asp

G1U

Gin

Gly

Asn

Met

Ser

Glu

Gly

íle

Pro

Ala

500

SOS

510

Leu

Val

Ala

Lys

Phe

Leu

Asp

Glu

Arg

Gly

íle

Val

Glu

Lys

Thr

515

520

925

Gly

Pro

Tyr

Asn

Leu

Phe

Leu

Phe

Ser

íle

Gly

Tie

Asp

Lys

Thr

530

535

540

Lys

Ala

Met

Gly

Leu

Arg

Gly

Leu

Thr

Glu

phe

Lys

Arg

ser

Tyr

54S

550

555

560

Asp

Leu

Asn

Leu

Arg

íle

Lys

Asn

Met

Leu

Pro

Asp

Leu

Tyr

Ala

Glu

565

570

575

Asp

Pro

Asp

Phe

Tyr

Arg

Asn

Met

Arg

íle

Gin

Asp

Leu

Ala

Gin

Gly

580

585

590

íle

His

Lys

Leu

íle

Arg

Lys

His

Asp

Leu

Pro

Gly

Leu

Mat

Leu

Arg

595

600

605

Ala

Phe

Asp

Thr·

Leu

Pro

Glu

Met

íle

Met

Thr

Pro

His

Gin

Ala

Trp

610

615

620

Gin

Arg

Gin

íle

Lya

Gly

Glu

Val

Glu

Thr

Xl«

Ala

Leu

Glu

Gin

Leu

625

630

635

640

Val

Gly

Arg

Val

Ser

Ala

Asn

Met

íle

Leu

Pro

Tyr

Pro

Gly

Val

645

650

655

Pro

Leu

Het

Pro

Gly

Glu

Met

Leu

Thr

Lys

Glu

Ser

Arg

Thr

val

660

665

670

Leu

Asp

Phe

Leu

Met

Leu

Cys

ser

Val

Gly

Gin

His

Tyr

Pre

Gly

675

680

685

Phe

Glu

Thr

Asp

íle

His

Gly

Ala

Lys

Gin

Asp

Glu

Asp

Gly

Val

Tyr

690

695

700

Arg

Val

Arg

val

Leu

Lys

Met

Ala

Gly

705

710

TAT

ACT

TTC

! TGT

' ACT

¹ CCT

• GGT

CAC

: ÄfG

: GGC

: GGT

¹ ACT

GCA

. TTC

CAG

AAA

480

Tyr

Thr

Phe

i Cys

. Thr

Pro

Gly

His

Met

. Gly

< Gly

’ Thr

Ala

Phe

Gin

Lys

145

150

155

160

AGC

CCG

GTA

l GGT

¹ AGC

: CTG

TTC

TAT

GAT

TTC

: TTT

GGT

CCG

AAT

ACC

ATG

528

Ser

Pro

Val

Gly

Ser

Leu

Phe

Tyr

Asp

Phe

Gly

Pro

Asn

rhr

Het

165

170

17 5

AAA

TCT

GAT

ATT

TCC

ΑΤΓ

TCA

GTA

TCT

GAA

. CTG

GGT

TCT

CTG

GAT

576

Lys

Ser

Asp

íle

ser

íle

ser

vai

sex

Glu

. Leu

Gly

Ser

Leu

Asp

180

185

190

CAC

AGT

GGT

CCA

CAC

AAA

GAA

GCA

GAA

CAG

TAT

ATC

GCT

CGC

GTC

TTT

624

Hi·

ser

Gly

Pro

Hi·

Lya

Glu

Ala

Glu

Gin

Tyr

lle

Ale

Arg

Val

Phe

195

200

205

AAC

GCA

GAC

CGC

AGC

TAC

ATG

GTG

ACC

AAC

GGT

ACT

TCC

ACT

GCG

AAC

672

Asn

Ala

Asp

Arg

Ser

Tyr

Met

Val

Thr

Aan

Gly

Thr

Ser

Thr

Ala

Asn

210

215

220

AAA

ATT

GTT

GGT

ATG

TAC

tct

GCT

CCA

GCA

GGC

AGC

ACC

ATT

CTG

ATT

720

Lys

íle

Val

Gly

Met

Tyr

Ser

Ala

Pro

Ala

Gly

Sex

Thr

íle

Leu

íle

225

230

235

240

GAC

CGT

AAC

TGC

CAC

AAA

TCG

CTG

ACC

CAC

CTG

ATG

AGC

GAT

768

Asp

Arg

Asn

Cys

HÍS

Lys

Ser

Leu

Thr

Kis

Leu

Met

Ser

Aap

245

250

255

GTT

ACG

CCA

ATC

TAT

TTC

CGC

CCG

ACC

CGT

AAC

GCT

TAC

GCT

ATT

CTT

B16

Val

Thr

Pro

íle

Tyr

Phe

Arg

Pre

Thr

Arg

Asn

Ala

Tyr

Gly

íle

Leu

260

265

270

GGT

ATC

CCA

CAG

AGT

GAA

TTC

CAG

CAC

GCT

ACC

ATT

GCT

AAG

CGC

864

Gly

íle

Pre

Gin

Ser

Glu

Phe

Gin

His

Ala

Thr

íle

Ala

Lya

Arg

275

280

285

GTG

AAA

GAA

ACA

CCA

AAC

GCA

ACC

TGG

CCG

GTA

CAT

GCT

GTA

ATT

ACC

912

Val

Lys

GlU

Thr

Pre

Asn

Ala

Thr

Trp

Pro

Val

His

AU

Val

íle

Thr

290

295

300

AAC

TCT

ACC

TAT

GAT

GGT

CTG

TAC

AAC

ACC

GAC

TTC

ATC

AAG

AAA

960

Asn

Ser

Thr

Tyr

Asp

Gly

Leu

Tyr

Asn

Thr·

Asp

Phe

íle

Lys

tys

305

310

319

320

ACA

CTG

GAT

GTG

AAA

TCC

ATC

CAC

TTT

GAC

TCC

GCG

TGG

GTG

CCT

TAC

1008

Thr

Leu

Asp

Val

Lys

Ser

íle

His

Phe

Asp

Ser

Ala

Trp

Val

Pro

Tyr

325

330

335

ACC

AAC

TTC

TCA

CCG

ATT

TAC

GAA

GGT

AAA

TGC

GG7

ATG

AGC

GGT

GGC

1056

Thr

Asn

Phe

Ser

Pro

íle

Tyr

Glu

Gly

Lys

Cys

Gly

Met

Set

Gly

340

345

350

CGT

GTA

GAA

GGG

AM

GTG

ATT

TAC

GAA

ACC

CAG

TCC

ACT

CAC

AAA

CTG

1104

Arg

Val

Glu

Gly

Lys

Val

íle

Tyr

Glu

Thr

Gin

Ser

Thr

His

Lys

Leu

355

360

365

CTG

GCG

TTC

TCT

CAG

GCT

TCC

ATG

ATC

CAC

GTT

AAA

GGT

GAC

GTA

1152

Leu

Ala

Phe

Ser

Gin

Ala

Ser

Met

íle

HU

Val

Lys

Gly

Asp

Val

370

375

380

AAC

GAA

ACC

TTT

AAC

GAA

GCC

TAC

ATG

CAC

ACC

ACT

TCT

1200

Asn

G1U

Thr

Phe

Asn

Glu

Ala

Tyr

Met

His

Thr

Ser

385

390

395

400

CCG

CAC

TAC

GGT

ATC

GTG

GCG

TCC

ACT

GAA

ACC

GCT

GCG

GCG .

ATG

1248

Pro

His

Tyx

Gly

íle

val

Ala

Ser

Thr

Glu

Thr

Ala

Ala :

Met

403

410

415

AAA ¹

GGC .

AAT

GCA

GGT

AAG

CGT

CTG

ATC

AAC

GGT

TCT .

ATT

GAA ¹

CGT

GCG

1296

Lys ¹

Gly

Asn

Ala

Gly

Lys

Arg

Leu

íle

Asn

Gly

Ser

íle

Glu

Arg

Ala

420 425 430 (2) Údaje o SEQ ID NO: 5 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 2145 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvoj vláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (iii) Hypotetická: nie (iV) Anti-sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Escherichia coli (B) Kmeň: CS520 (ix) Znak:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1 až 2145 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

ATG

AAC

GTT

ATT

GCA

•ΛΤΑ

TTG

AAT

CAC

ATG

GGG

GTT

TAT

TTT

AAA

GAA

48

Het

Asn

Val

íle

Ala

íle

Leu

Asn

His

Met

Gly

Val

Tyr

Phe

Lys

Glu

1

5

10

15

GAA

CCC

ATC

CGT

GAA

CTT

CAT

CGC

GCG

CTT

GAA

CGT

CTG

AAC

TTC

CAG

96

Glu

Pro

Ila

Arg

G1U

Leu

Kis

Arg

Ala

Leu

Glu

Arg

Leu

Asn

Phe

Gin

20

25

30

ATT

GTT

TAC

CCG

AAC

GAC

CGT

GAC

TTA

AAA

CTG

ATC

GAA

AAC

144

íle

Val

Tyr

Pro

Asn

Asp

Arg

Asp

Leu

Lys

Leu

íle

Glu

Asn

35

40

45

AAT

GCG

CGT

CTG

TGC

GGC

GTT

ATT

TTT

GAC

TGG

GAT

AAA

TAT

AAT

CTC

192

Asn

Ala

Arg

Leu

Cys

Gly

Val

íle

Phe

Asp

Trp

Asp

Lys

Tyr

Asn

Leu

50

55

60

GAG

CTG

TGC

GAA

ATT

AGC

AAA

ATG

AAC

GAG

AAC

CTG

CCG

TTG

TAC

240

Leu

cys

G1U

Glu

íle

ser

Ly_S

Met

Asn

G1U

Asn

Leu

Pro

Leu

Tyr

65

70

75

80

GCG

TTC

GCT

AAT

ACG

TAT

TCC

ACT

CTC

GAT

GTA

AGC

CTG

AAT

GAC

CTG

288

Ala

Phe

Ala

Asn

m r

Tyr

Ser

Thr

Leu

ASp

Val

Ser

Leu

Asn

Asp

Leu

85

90

95

CGT

TTA

CAG

ATT

AGC

TTC

ttt

GAA

TAT

GCG

CTG

GGT

GCT

GAA

GAT

336

Arg

Leu

Gin

íle

Ser

Phe

Glu

Tyr

Ala

Leu

Gly

Ala

Glu

Asp

100

105

no

ATT

GCT

AAT

AAG

ATC

AAG

CAG

ACC

ACT

GAC

GAA

TAT

ATC

AAC

ACT

ATT

384

Π·

Ala

Asn

Lys

Zle

Lys

Gin

Thr

Asp

Glu

Tyr

íle

Asn

Thr

íle

115

120

125

CTC

CCT

CCG

CTG

ACT

AAA

GCA

CTG

TTT

AAA

TAT

GTT

CGT

GAA

GGT

AAA

432

Leu

Pro

Leu

Thr

Lya

Ala

Leu

Phe

Lys

Tyr

Val

Arg

Glu

Gly

Lys

130

135

140

ATC

AAA

TTC

CGT

AAA

GAG

ATC

AAA

CGT

CTG

AGA

ACG

GAA

TCT

GAT

GGC

íle

Lys

Phe

Arg

Lys

G1U

íle

Lys

Arg

Leu

Arg

Thr

Glu

Ser

Asp

Gly

435

440

445

TGG

TTC

TTT

GAT

GTA

TGG

CAG

CCG

GAT

CAT

ATC

GAT

ACG

ACT

GAA

TGC

Trp

Phe

Asp

Val

Trp

Gin

Pro

ASp

His

íle

Aap

Thr

Glu

Cys

450

455

460

TGG

CCG

CTG

CGT

TCT

GAC

AGC

ACC

TGG

CAC

GGC

TTC

AAA

AAC

ATC

GAT

Trp

Pro

Leu

Arg

Ser

Asp

Ser

Thr

Trp

His

Gly

Phe

Lys

Asn

íle

Asp

46$

470

475

4E0

AAC

GAG

CAC

ATG

TAT

CTT

GAC

CCG

ATC

AAA

GTC

ACC

CTG

ACT

CCG

Aan

Glu

His

Met

Tyr

Leu

Asp

Pre

íle

Lys

Val

Thr

Leu

Thr

Pro

485

490

495

GGG

ATG

GAA

AAA

GAC

GGC

ACC

ATG

AGC

GAC

TTT

GGT

ATT

CCG

GCC

AGC

Gly

Net

Glu

Lys

Asp

Gly

Thr

Met

Ser

Asp

Phe

Gly

íle

Pro

Ale

Ser

500

505

510

ATC

GTG

GCG

AAA

TAC

CTC

GAC

GAA

CAT

GGC

ATC

GTT

GAG

AAA

ACC

íle

val

Ala

tys

Tyr

Leu

Asp

Glu

His

Gly

íle

Val

Glu

Lys

Thr

519

520

529

GGT

CCG

TAT

AAC

CTG

TTC

CTG

TTC

AGC

ATC

GGT

ATC

GAT

AAG

ACC

Gly

Ero

Tyr

Asn

Leu

Phe

Leu

Phe

ser

íle

Gly

íle

Asp

Lys

Thr

530

535

540

AAA

GCA

CTG

AGC

CTG·

CTG

CGT

GCT

CTG

ACT

GAC

TTT

AAA

CGT

GCG

TTC

Lys

Ala

Leu

Ser

Leu

Arg

Ala

Leu

Thr

Asp

Phe

Lys

Arg

Ala

Phe

545

550

5S5

560

GAC

CTG

AAC

CTG

CGT

GTG

AAA

AAC

ATG

CTG

CCG

TCT

CTG

TAT

CGT

GAA

Asp

Leu

Aan

Leu

Arg

Val

Lys

Asn

Met

Leu

Pro

ser

Leu

Tyr

Arg

Glu

565

570

575

GAT

CCT

GAA

TTC

TAT

GAA

AAC

ATG

CGT

ATT

CAG

GAA

CTG

GCT

CAG

AAT

Asp

Pro

GLu

Phe

Tyr

Glu

Asn

Met

Arg

íle

Gin

Glu

Leu

Ala

Gin

Asn

$80

585

590

ATC

CAC

AAA

CTG

ATT

GTT

CAC

AAT

CTG

CCG

GAT

CfG

ATG

TAT

CGC

íle

His

Lys

Leu

íle

Val

Kis

His

Asn

Leu

Pro

Asp

Leu

Met

Tyr

Arg

595

6C0

605

GCA

TTT

GAA

GTG

CTG

CCG

ACG

ATG

GTA

ATG

ACT

CCG

TAT

GCT

GCA

TTC

Al*

Ph*

Glu

V*1

Leu

Pro

Thr

Met

Val

Met

Thr

Pro

Tyr

Ala

Phe

610

615

629

CAG

AAA

GAG

CTG

CAC

GGT

ATG

ACC

GAA

GTT

TAC

CTC

GAC

GAA

ATG

Gin

Lys

Glu

Leu

His

Gly

Met

Thr

Glu

Val

Tyr

Leu

A»P

Glu

Met

625

630

635

640

GTA GGT CGT ATT AAC GCC AAT ATG ATC CTT CCG TAC CCG CCG GGA GTT

Val

Gly

Arg

íle

Asn

Al*

Asn

Met

íle

Leu

Sro

Tyr

Pro

Gly

val

645

$50

655

CCT

CTG

GTA

ATG

CCG

GGT

GAA

ATG

ATC

ACC

GAA

AGC

CGT

CCG

GTT

Pro

Leu

Val

Met

Pro

Gly

Clu

Met

tie

Thr

Glu

Ser

Arg

Pro

Val

660

665

670

CTG

GAG

TTC

CTG

CAG

ATG

CTG

TGT

GAA

ATC

GGC

GCT

CAC

TAT

CCG

GGC

Leu

Glu

Phe

Leu

Gin

Met

Leu

Cya

Glu

lle

Gly

Ala

His

Tyr

Pro

Gly

675

680

685

TTT

GAA

ACC

CAT

ATT

CAC

GGT

GCA

TAC

CGT

CAG

GCT

GAT

GGC

CGC

TAT

Phe

Glu

Thr

Asp

íle

His

Gly

Ala

Tyr

Arg

Gin

Ala

Aap

Gly

Arg

Tyr

690

695

700

ACC

GTT

AAG

GTA

TTG

AAA

GAA

AGC

AAA

Thr

Val

Lys

Val

Leu

Lys

Glu

Ser

Lys

tys

705

710

715

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728 1776

1924

1872

1920

1868

016 2064 2112

2145

2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 715 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

Het

Asn

Val

íle

Ala

íle

Leu

Asn

His

Het

Gly

Val

Tyr

Phe

Lys

G1U

1

5

10

15

Glu

Pro

íle

Arg

Glu

Lau

His

Arg

Ala

Leu

Glu

Arg

Leu

Asn

Phe

Gin

20

25

30

íle

Val

Tyr

Pro

Asn

Asp

Arg

Asp

Leu

Lys

Leu

íle

Glu

Asn

35

40

45

Asn

Ala

Arg

Leu

cys

Gly

Val

Ila

Phe

Asp

Trp

Asp

Lys

Tyr

Asn

Leu

50

55

60

G1U

Leu

Cys

Glu

11·

Ser

Lys

Met

Asn

Glu

Asn

Leu

Pro

Leu

Tyr

65

70

75

80

Ala

Phe

Ala

Asn

Thr

Tyr

Ser

Thr

Leu

Asp

Val

Ser

Leu

Asn

ASP

Leu

85

90

95

Arg

Leu

Gin

íle

Ser

Phe

Glu

Tyr

Ala

Leu

Gly

Ala

Glu

ASp

100

105

110

íle

Ala

Asn

Lys

íle

Lys

Gin

Thr

Asp

Glu

Tyr

íle

Asn

Thr

íle

115

120

125

Leu

Pro

Leu

Thr

Lys

Ala

Leu

Phe

Lys

Tyr

Val

Arg

Glu

Gly

Ly»

130

135

.1^0

Tyr

Thr

Phe

Cys

Thr

Pro

Gly

His

Met

Gly

Thr

Ala

Phe

Gin

Lys

145

150

155

160

Ser

Pro

val

Gly

Ser

Leu

Phe

Tyr

Asp

Phe

Gly

Pro

Asn

Thr

Met

165

170

175

Lys

Ser

Asp

íle

Ser

íle

Ser

Val

Ser

Glu

Leu

Gly

Ser

Leu

Asp

180

185

190

His

Ser

Gly

Pro

His

Lys

Glu

Ala

Glu

Gin

Tyr

íle

Ala

Arg

Val

Phe

19S

200

203

Asn

Ala

Asp

Arg

Ser

Tyr

Met

Val

Thr

Asn

Gly

Thr

Ser

Thr

Ala

Asn

210

215

220

Lys

íle

Val

Gly

Met

Tyr

ser

Ala

Pro

Ala

Gly

Ser

Thr

íle

Leu

íle

225

230

235

240

Asp

Arg

Asn

Cys

His

Lys

ser

Leu

Thr

His

Leu

Met

Het

Ser

Asp

245

250

255

Val

Thr

Pro

íle

Tyr

Phe

Arg

Pro

Thr

Arg

Asn

Ala

Tyr

Gly

íle

Leu

260

265

270

Gly

íle

Pro

Gin

Ser

Glu

Phe

Gin

His

Ala

Thr

íle

Ala

Lys

Arg

275

280

285

Val

Lys

Glu

Thr

Pro

Asn

Ala

Thr

Trp

Pro

Val

His

Ala

Val

íle

Thr

290

295

300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Asp

Gly

Leu

Tyr

Asn

Thr

Asp

Phe

íle

Lys

305

310

315

320

Thr

Leu

Asp

Val

Lys

Ser

Jle

His

Phe

Asp

Ser

Ala

Trp

Val

pro

Tyr

325

330

335

Thr

Asn

Phe

Ser

Pro

íle

Tyr

Glu

Gly

Lys

cys

Gly

Met

Ser

Gly

340

345

350

Arg

Val

Glu

Gly

Lys

Val

íle

Tyr

Glu

Thr

Gin

Ser

Thr

Hia

Lys

Leu

355

360

365

Leu

Ala

Phe

Ser

Gin

Ala

Ser

Met

íle

His

val

Lys

Gly

Asp

val

370

375

380

Asn

Glu

Thr

Phe

Asn

Glu

Ala

Tyr

Het

Met

His

Thr

Ser

385

390

395

400

Pro

His

Tyr

Gly

íle

Val

Ala

Ser

Thr

Glu

Thr

Ala

Met

405

410

415

Lys

Gly

Asn

Ala

Gly

Lys

Arg

Leu

íle

Asn

Gly

ser

íle

Glu

Arg

Ala

420

425

430

íle

Lys

Phe

Arg

Lys

Glu

íle

Lys

Arg

Leu

Arg

Thr

Glu

Ser

Asp

Gly

435

440

445

Trp

Phe

Asp

Val

Trp

Gin

Pro

A*P

His

íle

Asp

Thr

Glu

Cys

450

455

460

Trp

Pro

Leu

Arg

Ser

Asp

Ser

Thr

Trp

His

Gly

Phe

Lys

Asn

íle

Asp

465

470

475

480

Asn

Glu

His

Met

Tyr

Leu

Asp

Pro

íle

Lys

Val

Thr

Leu

Thr

Pro

435

490

495

Gly

Met

Glu

Lys

Asp

Gly

Thr

Met

Ser

Asp

Phe

Gly

íle

Pro

Ala

Ser

500

505

510

íle

Val

Ala

Lys

Tyr

Lau

Asp

Glu

His

Gly

íle

Val

Glu

Lys

Thr

515

520

525

Gly

Pro

Tyr

Asn

Leu

Phe

Leu

Phe

Ser

íle

Gly

íle

Asp

Lys

Thr

530

535

540

Lys

Ala

Leu

Ser

Leu

Arg

Ala

Leu

Thr

Asp

Phe

Lys

Arg

Ala

Phe

545

550

555

560

Asp

Leu

Asn

Leu

Arg

Val

Lys

Asn

Met

Leu

Pro

Ser

Leu

Tyr

Arg

Glu

565

570

575

Asp

Pro

Glu

Phe

Tyr

Glu

Asn

Met

Arg

íle

Gin

Glu

Leu

Ala

Gin

Asn

580

585

590

íle

His

Lys

Leu

íle

Val

His

Asn

Leu

Pro

Asp

Leu

Met

Tyr

Arg

5 95

600

605

Ala

Phe

G1U

Val

Leu

Pro

Thr

Met

Val

Het

Thr

Pro

Tyr

Ala

Phe

610

615

620

Gin

Lys

Glu

Leu'

His

Gly

Met

Thr

Glu

Val

Tyr

Leu

Asp

Glu

Met

625

630

635

640

Val

Gly

Arg

íle

Asn

Ala

Asn

Met

íle

Leu

Pro

Tyr

Pro

Gly

Val

645

6S0

655

Pro

Leu

Val

Met

Pro

Gly

Glu

Het

íle

Thr

G1U

GLu

Ser

Arg

Pro

Val

660

665

670

Leu

Glu

Phe

Leu

Gin

Met

Leu

Cys

Glu

íle

Gly

Ala

His

Tyr

Pro

Gly

675

680

685

Phe

Glu

Thr

Asp

íle

His

Gly

Ala

Tyr

Arg

Gin

Ala

Asp

Gly

Arg

Tyr

€90

695

700

Thr

Val

Lys

Val

Leu

Lys

Glu

Sex

Lys

705

710

715

4. Mikroorganizmus, ktorý’ patrí k rodu Escherichia, ktorý produkuje L-lyzín a má v bunkách zníženú alebo potlačenú dekarboxylázová aktivitu.

5. Mikroorganizmus podľa nároku 4, v ktorom uvedený mikroorganizmus je Escherichia coli.

6. Mikroorganizmus podľa nároku 4, v ktorom je lyzínová dekarboxylázová aktivita v bunkách znížená alebo zamedzená potlačením expresie génu, ktorý je určený niektorým z nárokov 1 až 3 a/alebo génu cadA.

7. Mikroorganizmus podľa nároku 6, v ktorom je expresia uvedeného génu potlačená zničením génu, ktorý je určený niektorým z nárokov 1 až 3 a/alebo génu cadA.

8. Mikroorganizmus podľa nároku 6, v ktorom gén určený niektorým z nárokov 1 až 3 a/alebo gén cadA sú/je zničený substitúciou, deléciou, inzerciou, adíciou, alebo inverziou jedného alebo viacerých nukleotidov v sekvencií alebo sekvenciách nukleotidov.

9. Spôsob výroby L-lyzínu, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa výrobný krok kultivácie mikroorganizmu, patriaceho k rodu Escherichia, ktorý· produkuje L-lyzín a ktorý má v bunkách zníženú alebo potlačenú aktivitu lyzínovej dekarboxylázy, v tekutom prostredí, umožňujúcom tvorbu a akumuláciu L-lyzínu v kultivačnej tekutine, a výrobný krok oddelenia L-lyzínu.

10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že lyzínová dekarboxylázová aktivita je znížená alebo zničená potlačením expresie génu, ktorý· je určený niektorým z nárokov 1 až 3 a/alebo génu cadA.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Gén, ktorý kóduje pre lyzínovú dekarboxylázu a ktorý má sekvenciu aminokyselín uvedenú v SEQ ID NO: 4 zo Zoznamu sekvencií.
2. Gén podľa nároku 1, pričom uvedený gén má nukleotidovú sekvenciu kodónov od 1005. po 3143. uvedenú v SEQ ID NO: 3.
3. Gén podľa nároku 1, v ktorom uvedená sekvencia aminokyselín má substitúciu, deléciu, alebo inzerciu jedného alebo viacerých zvyškov aminokyselín bez podstatného poškodenia účinnosti lyzínovej dekarboxylázy.