JP2007068437A - 変異型アスパルトキナーゼとその利用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】L-リジン及びL-スレオニンによる協奏的なフィードバック阻害活性が低下した変異型アスパルトキナーゼを遺伝子組換えによって作製し、L-リジンまたはε-ポリ-L-リジンの大量合成を可能にすること。
【解決手段】ストレプトマイセス属細菌またはコリネ属細菌におけるアスパルトキナーゼが有するアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなる変異型アスパルトキナーゼをコードする発現ベクターを作製し、ε-ポリ-L-リジン生産菌に導入して発現させる。
【選択図】 図５
【解決手段】ストレプトマイセス属細菌またはコリネ属細菌におけるアスパルトキナーゼが有するアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなる変異型アスパルトキナーゼをコードする発現ベクターを作製し、ε-ポリ-L-リジン生産菌に導入して発現させる。
【選択図】 図５
Description
本発明は、変異型アスパルトキナーゼとその利用方法に関する。
現在、食品保存料として広く利用されているε-ポリ-L-リジンは、ストレプトマイセス属に属するε-ポリ-L-リジン生産菌を用いた発酵法により製造されている。発酵法による物質生産において生産性を高めるためには、NTGや紫外線など化学的及び物理的な変異処理を施すことにより、変異株を取得することが一般的である。ε-ポリ-L-リジンの場合においても、このような変異処理を施し、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下ＡＥＣと略記する）耐性変異株（例えば、特許文献１参照）、AEC及びグリシン耐性変異株（例えば、特許文献２参照）やバリン、イソロイシン要求性変異株（例えば、特許文献３参照）を取得することにより、野生株と比較してより高い生産性を有する菌株を得られる。
細菌類において、L-リジンは主にジアミノピメリン酸経路により生合成されるが、この生合成経路の一連の酵素群の中で、アスパルトキナーゼがL-リジンの合成量を調節する重要な酵素である。ε-ポリ-L-リジン生産株においてもＡＥＣ耐性変異株を用いることによって生産性が高まることから、L-リジンがε-ポリ-L-リジンの前駆体となっており、ＡＥＣ耐性変異株はアスパルトキナーゼのL-リジンに対するフィードバック阻害に対する感受性が低下することによりL-リジンの蓄積量が増加し、その結果としてε-ポリ-L-リジン生産量が増大したと考えられている（例えば、非特許文献１参照）。
このようにε-ポリ-L-リジン生産においてアスパルトキナーゼが重要な酵素であることが示唆されていたが、ε-ポリ-L-リジン生産菌のアスパルトキナーゼ遺伝子の構造は明らかにされておらず、遺伝子組み換え技術を用いて直接的に変異を導入することはできなかった。また、アスパルトキナーゼのどの部分に変異を導入することにより、L-リジンによるフィードバック阻害活性を低下させることができるのかについても全く知られていなかった。
特許公報３５２５１９０号
特許公報１７１３６３０号
特開平１０―２９０６８８号
平木ら、日本生物工学会誌 ７６巻 １９９８年
本発明は、上記の問題点に鑑み、L-リジン及びL-スレオニンによる協奏的なフィードバック阻害活性が低下した変異型アスパルトキナーゼを遺伝子組換えによって作製し、L-リジンまたはε-ポリ-L-リジンの大量合成を可能にすることを目的とする。
本発明者らは、まず、ε-ポリ-L-リジン生産菌であるストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)から、L-リジン及びε-ポリ-L-リジン生合成の制御に重要な役割を果たしているアスパルトキナーゼ遺伝子をクローニングした。そのアスパルトキナーゼ遺伝子に対してランダムに変異を導入し、変異酵素の活性を調べたところ、配列番号１を有するアスパルトキナーゼにおいて第６８番目のメチオニン残基をバリン残基に置換することにより、L-リジン及びL-スレオニンによる協奏的なフィードバック阻害活性が低下したアスパルトキナーゼを得られることを見出した。そして、この変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を外来遺伝子として有するε-ポリ-L-リジン生産菌の形質転換体を作製したところ、野生株よりもε-ポリ-L-リジンの生産性が高まることを見出し、本発明の完成に至った。なお、本明細書において、「フィードバック阻害活性 」とは「フィードバック阻害を受ける感受性」をいう。
本発明は、以下の各項によって構成される。
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（２）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、第６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、第６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異し、第６８番目のメチオニン残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、第６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、第６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異し、第６８番目のメチオニン残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（３）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）ストレプトマイセス属細菌またはコリネ属細菌における、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが有するアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）（ａ）に記載のタンパク質が有するアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）ストレプトマイセス属細菌またはコリネ属細菌における、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが有するアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）（ａ）に記載のタンパク質が有するアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（４）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における６８番目のメチオニン残基が保存されているタンパク質が有するアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなる、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）（ａ）に記載のタンパク質が有するアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における６８番目のメチオニン残基が保存されているタンパク質が有するアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなる、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）（ａ）に記載のタンパク質が有するアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（５）第６８番目のメチオニン残基がバリン残基に変異したアミノ酸配列からなることを特徴とする第２〜４項のいずれかに記載のタンパク質。
（６）第１〜５項のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７）配列番号２〜６のいずれかに記載の塩基配列を有することを特徴とする第６項に記載のＤＮＡ。
（８）第６または７項に記載のＤＮＡを含有し、第１〜５項のいずれかに記載のタンパク質を発現するように構築された発現ベクター。
（９）第８項に記載のベクターを有する形質転換細胞。
（１０）第９項に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞が生産したL-リジンを単離することを特徴とするL-リジンの製造方法。
（１１）第９項に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞が生産したε-ポリ-L-リジンを単離することを特徴とするε-ポリ-L-リジンの製造方法。
本発明により、L-リジン及びL-スレオニンによる協奏的なフィードバック阻害活性が低下した変異型アスパルトキナーゼを遺伝子組換えによって作製することができる。これにより、L-リジンまたはε-ポリ-L-リジンの大量合成が可能になる。
＝＝L-リジンまたはε-ポリ-L-リジン合成に用いるためのＤＮＡの合成＝＝
本発明にかかる変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡを作製する元となる野生型アスパルトキナーゼは、配列番号１記載のアミノ酸配列における６８番目のメチオニン残基が保存されているアスパルトキナーゼであればよいが、６８番目のメチオニン残基の周囲のアミノ酸配列も保存されていることが好ましい。そのようなアスパルトキナーゼとして、ストレプトマイセス属細菌またはコリネ属細菌における、配列番号１記載のアスパルトキナーゼのホモログを例示できる。図１には、S. coelicolor A3(2) (NP_627820)、S. avermitilis MA-4680(NP_825736)、Streptomyces sp. NRRL 5331 (CAD24815) C. glutamicium (S15276)が例示されており、それ以外にも、S. noursei(FERM P-9797)、Streptomyces sp. SP-72株（FERM P-16810）などが挙げられる。なお、配列番号１記載のアスパルトキナーゼは、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)が内在的に有する酵素である。
本発明にかかる変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡを作製する元となる野生型アスパルトキナーゼは、配列番号１記載のアミノ酸配列における６８番目のメチオニン残基が保存されているアスパルトキナーゼであればよいが、６８番目のメチオニン残基の周囲のアミノ酸配列も保存されていることが好ましい。そのようなアスパルトキナーゼとして、ストレプトマイセス属細菌またはコリネ属細菌における、配列番号１記載のアスパルトキナーゼのホモログを例示できる。図１には、S. coelicolor A3(2) (NP_627820)、S. avermitilis MA-4680(NP_825736)、Streptomyces sp. NRRL 5331 (CAD24815) C. glutamicium (S15276)が例示されており、それ以外にも、S. noursei(FERM P-9797)、Streptomyces sp. SP-72株（FERM P-16810）などが挙げられる。なお、配列番号１記載のアスパルトキナーゼは、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)が内在的に有する酵素である。
これらの野生型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡは、コドン表から塩基配列を決定し、化学合成によって製造することができるが、データベースに記載の各遺伝子配列を利用し、各遺伝子を有する細菌から、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲや、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングなどの常法を用いてクローニングすることが好ましい。例えば、図１に記載のアスパルトキナーゼの場合、各菌から、カッコ内に記載のデータベース情報を用いてクローニングすることができる。ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)が有する配列番号１記載のアスパルトキナーゼの場合は、配列番号２に記載の塩基配列を利用して、クローニングすることができる。
これらアスパルトキナーゼのアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなる変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡは、野生型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、例えばin vitro mutagenesisを用い、６８番目のメチオニン残基に変異を導入することによって作製できる。実施例に記載されているように、６８番目のメチオニン残基がバリン残基に変異した変異型アスパルトキナーゼは、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下していたことから、６８番目のメチオニン残基が、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性に重要な役割を有することが明らかになった。従って、本発明に用いられる変異型アスパルトキナーゼにおいては、６８番目のメチオニン残基にフィードバック阻害活性を低下させるような変異を導入しさえすれば、どんな変異を導入しても構わない。
さらに、配列番号１のアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基以外に、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていても、アスパルトキナーゼ活性を有し、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した変異型アスパルトキナーゼであれば、どのような変異体でも構わない。
このようにして得られたＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。得られた塩基配列についてはDNASIS(日立ソフトエンジニアリング社製)やGENETIX(ソウフトウエア開発社製)等の塩基配列解析ソフトによる解析を行うことにより、ＤＮＡ中のアスパルトキナーゼ遺伝子のコード領域を特定することもできる。
＝＝アスパルトキナーゼの細胞内での発現＝＝
以上のようにして得られた野生型アスパルトキナーゼ及び変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を常法により発現ベクターに組み込み、細胞内に導入し、発現させることができる。その際、発現ベクターはプラスミド、ウイルスベクターなど特に限定されず、宿主細胞との関係で適宜選択される。宿主細胞はストレプトマイセス属細菌に限らず、大腸菌やほ乳動物細胞など、とくに限定されない。
以上のようにして得られた野生型アスパルトキナーゼ及び変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を常法により発現ベクターに組み込み、細胞内に導入し、発現させることができる。その際、発現ベクターはプラスミド、ウイルスベクターなど特に限定されず、宿主細胞との関係で適宜選択される。宿主細胞はストレプトマイセス属細菌に限らず、大腸菌やほ乳動物細胞など、とくに限定されない。
このようにして作製された形質転換細胞を培養し、この形質転換細胞が生産したL-リジンまたはε-ポリ-L-リジンを、イオン交換樹脂法及び晶析法等の従来からの公知の方法及びその組み合わせにより精製する。
＜＜実施例＞＞
（１）ε-ポリ-L-リジン生産菌からのアスパルトキナーゼ遺伝子のクローニング
ε-ポリ-L-リジン生産菌であるストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）IFO14147株をトリプトン１０ｇ/L、イーストエキス５ｇ/L、NaCl ５ｇ/Lからなる培地100mlに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を回収し、常法に従い染色体DNAを調製した。この染色体DNAを鋳型とし、ストレプトマイセス属由来のアスパルトキナーゼで高く保存されているアミノ酸配列を元に、以下の２種類のプライマーを設計し、タカラバイオ社製PCRキット（TaKaRa LA Taq with GC Buffer）を用い、そのプロトコールに従ってPCR反応溶液を調製した（プライマー濃度は１００μＭ）。反応条件は、ステップ１（９４℃、２分）、ステップ２（９４℃、１分）、ステップ３（５０℃、１分）、ステップ４（７２℃、１分）、ステップ５（ステップ２〜４、３０サイクル）、ステップ６（７２℃、１０分）の計６ステップで行った。
（１）ε-ポリ-L-リジン生産菌からのアスパルトキナーゼ遺伝子のクローニング
ε-ポリ-L-リジン生産菌であるストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）IFO14147株をトリプトン１０ｇ/L、イーストエキス５ｇ/L、NaCl ５ｇ/Lからなる培地100mlに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を回収し、常法に従い染色体DNAを調製した。この染色体DNAを鋳型とし、ストレプトマイセス属由来のアスパルトキナーゼで高く保存されているアミノ酸配列を元に、以下の２種類のプライマーを設計し、タカラバイオ社製PCRキット（TaKaRa LA Taq with GC Buffer）を用い、そのプロトコールに従ってPCR反応溶液を調製した（プライマー濃度は１００μＭ）。反応条件は、ステップ１（９４℃、２分）、ステップ２（９４℃、１分）、ステップ３（５０℃、１分）、ステップ４（７２℃、１分）、ステップ５（ステップ２〜４、３０サイクル）、ステップ６（７２℃、１０分）の計６ステップで行った。
ASK-1：５’−ＣＴＳＧＴＳＧＴＳＣＡＧＡＡＧＴＡＣＧＧＳＧＧ−３’（配列番号７）
ASK-2：５’−ＧＡＴＣＴＴＳＳＣＳＡＹＣＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＹ−３’（配列番号８）
ASK-2：５’−ＧＡＴＣＴＴＳＳＣＳＡＹＣＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＹ−３’（配列番号８）
得られた約１ｋｂの増幅断片から、ECL標識キット（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて標識プローブを調製し、本菌株の染色体DNAから作製したコスミドライブラリーに対してスクリーニングを行った。そしてアスパルトキナーゼ遺伝子の全長を含む４．５ｋｂのBamHI断片を得た。この断片の塩基配列を決定し、アスパルトキナーゼ遺伝子のＯＲＦ（配列番号２）を決定した。
（２）大腸菌における組換えアスパルトキナーゼの発現
この塩基配列を元に、以下の2種類のプライマーを作製し、タカラバイオ社製ＰＣＲキット（TaKaRa LA Taq with GC Buffer）を用い、そのプロトコールに従ってＰＣＲ反応溶液を調製した（プライマー濃度は１０μＭ）。また、反応条件は、ステップ１（９４℃、２分）、ステップ２（９４℃、１分）、ステップ３（６５℃、１分）、ステップ４（７２℃、１分）、ステップ５（ステップ２〜４、３０サイクル）、ステップ６（７２℃、１０分）の計６ステップで行った。
この塩基配列を元に、以下の2種類のプライマーを作製し、タカラバイオ社製ＰＣＲキット（TaKaRa LA Taq with GC Buffer）を用い、そのプロトコールに従ってＰＣＲ反応溶液を調製した（プライマー濃度は１０μＭ）。また、反応条件は、ステップ１（９４℃、２分）、ステップ２（９４℃、１分）、ステップ３（６５℃、１分）、ステップ４（７２℃、１分）、ステップ５（ステップ２〜４、３０サイクル）、ステップ６（７２℃、１０分）の計６ステップで行った。
ASK-N4：５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＣ−３’（配列番号９）
ASK-C4：５’−ＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＴＡ−３’（配列番号１０）
ASK-C4：５’−ＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＴＡ−３’（配列番号１０）
この増幅断片を制限酵素BamHIおよびHindIIIで処理した後、制限酵素BamHIおよびHindIIIで処理したｐＱＥ３０（キアゲン社）に挿入することにより、アスパルトキナーゼのＮ末端側にヒスチジンタグが付加された融合タンパク質をコードするプラスミドask/pQE30を構築した。作製したプラスミドを大腸菌（M15 pREP4）に導入して、トリプトン１０ｇ／Ｌ、イーストエキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌからなる培地５０ｍＬに植菌し、３７℃で３時間振盪培養した。培養液を氷中にて冷却した後、最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに低温（１８℃）にて培養を１６時間行った。菌体を回収し、菌体破砕用緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭβメルカプトエタノール、１０ｍＭイミダゾール）にて懸濁後、超音波破砕した。遠心分離後、可溶性画分をＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅカラム（キアゲン社）に通し、洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭβメルカプトエタノール、２０ｍＭイミダゾール）にてカラムを洗浄した。続いて、溶出用緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭβメルカプトエタノール、２５０ｍＭイミダゾール）をカラムに通し、アスパルトキナーゼを溶出させ、精製アスパルトキナーゼを得た。
この精製アスパルトキナーゼに対し、アスパルトキナーゼ活性をブラックの方法（Methods in Enzymology,Vol. 5,p820-827, Academic Press Inc., New York(1962)）により、アスパラギン酸ヒドロキサム酸として測定することにより、得られた遺伝子がアスパルトキナーゼをコードすることを確認した。すなわち、最終液量１ｍＬ中に１００ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ 硫酸マグネシウム、６００ｍＭ ヒドロキシルアミン・塩酸塩、６００ｍＭ 硫酸アンモニウム、５０ｍＭ L−アスパラギン酸、及び精製アスパルトキナーゼを加え、３０℃、１５分間反応させた後、１０％塩化鉄（ＩＩ）６水和物−３．３％トリクロロ酢酸−０．７Ｎ塩酸液１．５ｍＬを加え、遠心分離で沈殿物を除去した液を、５４０ｎｍの吸光度を測定して酵素活性を求めた。
次に、得られたアスパルトキナーゼを用いてフィードバック様式を解析した。上記ブラックの方法によってアスパルトキナーゼ活性を測定する際、L-リジン及び／またはL-スレオニンの様々な量を反応液中に加え、各試料の相対活性を求めてグラフにしたのが図２である。この結果より、アスパルトキナーゼに対するフィードバック阻害は、L-リジンとL-スレオニンによる協奏的なフィードバック阻害であることが明らかになった。
（３）変異型アスパルトキナーゼ遺伝子の作製
上記のようにして取得したε-ポリ-L-リジン生産菌由来のアスパルトキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片に対し、エラープローンＰＣＲによって、ランダムに変異が導入された増幅断片を得た。エラープローンＰＣＲは上記２種類のプライマー（ＡＳＫ-Ｎ４およびＡＳＫ-Ｃ４）および鋳型ＤＮＡとしてプラスミドask/pQE30を用い、表１のようにＰＣＲ反応溶液中の各種デオキシリボヌクレオチドの濃度バランスを変化させた４種類のＰＣＲ溶液（１〜４）および低濃度のマグネシウムを含むＰＣＲ溶液（５）の計５種類のＰＣＲ溶液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は、ステップ１（９４℃、２分）、ステップ２（９４℃、１分）、ステップ３（６５℃、１分）、ステップ４（７２℃、１分）、ステップ５（ステップ２〜４、３０サイクル）、ステップ６（７２℃、１０分）に従った。
上記のようにして取得したε-ポリ-L-リジン生産菌由来のアスパルトキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片に対し、エラープローンＰＣＲによって、ランダムに変異が導入された増幅断片を得た。エラープローンＰＣＲは上記２種類のプライマー（ＡＳＫ-Ｎ４およびＡＳＫ-Ｃ４）および鋳型ＤＮＡとしてプラスミドask/pQE30を用い、表１のようにＰＣＲ反応溶液中の各種デオキシリボヌクレオチドの濃度バランスを変化させた４種類のＰＣＲ溶液（１〜４）および低濃度のマグネシウムを含むＰＣＲ溶液（５）の計５種類のＰＣＲ溶液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は、ステップ１（９４℃、２分）、ステップ２（９４℃、１分）、ステップ３（６５℃、１分）、ステップ４（７２℃、１分）、ステップ５（ステップ２〜４、３０サイクル）、ステップ６（７２℃、１０分）に従った。
各反応で増幅したＤＮＡ断片を混合し、制限酵素BamHIおよびHindIIIで処理した後、制限酵素BamHIおよびHindIIIで処理したｐＱＥ３０に挿入し、変異ライブラリーを構築した。
大腸菌XL1-blue MRF’に本ライブラリーを導入し、８ｍＭ、１６ｍＭ、３２ｍＭのＡＥＣおよびＡＨＶを含むＭ９最小培地に塗布した。ＡＥＣおよびＡＨＶは、それぞれL-リジンおよびL-スレオニンの構造アナログであり、多くの微生物の生育を阻害する。実際、S. albulus のアスパルトキナーゼにおいても、L-リジンおよびL-スレオニンの構造アナログとしてＡＥＣおよびＡＨＶが作用し、それらの共存下において弱いフィードバック阻害を示すことが試験管内で明らかになった（図２参照）。大腸菌においても同様にこれらアナログは生育阻害を示し、それぞれ８ｍＭのＡＥＣおよびＡＨＶを含むＭ９最小培地上では生育不能である。ところが、アスパルトキナーゼのフィードバック阻害活性の低下したL-リジンまたはL-スレオニンの高生産変異株においては、細胞内のＡＥＣまたはＡＨＶのL-リジンまたはL-スレオニンに対する相対濃度が低下し、これら構造アナログを含む培地においても生育可能となることが知られている。従って、変異ライブラリーの中で、フィードバック阻害活性が低下したアスパルトキナーゼの遺伝子が大腸菌に導入されれば、その形質転換体はL-リジンまたはL-スレオニンの高生産菌となり、ＡＥＣおよびＡＨＶを含むＭ９最小培地上にて生育可能になると考えられた。このように、ＡＥＣおよびＡＨＶの存在下における増殖を指標に、フィードバック阻害活性の低下した変異型アスパルトキナーゼを有する細胞を同定することができ、実際、ＡＥＣおよびＡＨＶを８ｍＭずつ含む培地で生育する多数の形質転換体を得た。これら形質転換体のうち４株（ＡＳＫ ｅｒ２、１３、１６、１７）はＡＥＣおよびＡＨＶを１６ｍＭずつ含む培地上においても生育可能であった（図３）。このことは、とりもなおさず、これら４株がL-リジンまたはL-スレオニンの高生産株であることを示すものである。
次に、これら形質転換体からプラスミドを調製し、変異部位の同定を行ったところ、４株全てにおいて全く同じ変異パターン（Ｉ１９Ｖ， Ｍ６８Ｖ， Ｔ３０９Ａ）であることが判明した。そこで、上記と同様に精製した変異型アスパルトキナーゼASK er2を用い、フィードバック阻害活性について解析した。その結果、ASK er2は、L-リジンおよびL-スレオニンが１００ｍＭの存在下においても約８０％の活性を維持しており、フィードバック阻害活性が低下していることが明らかになった（図４）。そこで、プラスミドask/pQE30を鋳型とし、QuickCange XL Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社）および以下のプライマーを用い、in vitro mutagetesisによって、部位特異的変異酵素を各種作製し、フィードバック阻害活性について同様に解析したところ、Ｍ６８Ｖ変異が導入された全ての変異型アスパルトキナーゼ（以下、Ｍ６８Ｖ変異型アスパルトキナーゼと称する）、すなわち図４におけるＡＳＫ（Ｍ６８Ｖ）（配列番号３）、ＡＳＫ（Ｉ１９Ｖ，Ｍ６８Ｖ）（配列番号４）、ＡＳＫ（Ｍ６８Ｖ，Ｔ３０９Ａ）（配列番号５）、及びＡＳＫ（Ｉ１９Ｖ，Ｍ６８Ｖ，Ｔ３０９Ａ）（配列番号６）は、フィードバック阻害活性の低下が検出された（図４）。また、Ｍ６８Ｖ変異型アスパルトキナーゼは野生型アスパルトキナーゼと比較し、２倍以上の比活性向上が観察された（表２）。即ち、アスパルトキナーゼにＭ６８Ｖ変異を導入すると、フィードバック阻害活性を低下させることができ、アスパルトキナーゼ活性を向上させることが可能となる。
ASKt309a-sense; ５’−ＣＣＡＣＣＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡ−３’ （配列番号１１）
ASKt309a-anti; ５’−ＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＧＧ−３（配列番号１２）’
ASKm68v-sense; ５’−ＧＣＧＡＧＴＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣ−３’ （配列番号１３）
ASKm68v-anti; ５’−ＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＣＧＡＡＣＴＣＧＣ−３’ （配列番号１４）
ASKi19v-sense; ５’−ＴＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＴＴＧＣＣ−３’ （配列番号１５）
ASKi19v-anti; ５’−ＧＧＣＡＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣＣＴＣＧＧＣＡ−３’ （配列番号１６）
ASKt309a-anti; ５’−ＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＧＧ−３（配列番号１２）’
ASKm68v-sense; ５’−ＧＣＧＡＧＴＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣ−３’ （配列番号１３）
ASKm68v-anti; ５’−ＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＣＧＡＡＣＴＣＧＣ−３’ （配列番号１４）
ASKi19v-sense; ５’−ＴＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＴＴＧＣＣ−３’ （配列番号１５）
ASKi19v-anti; ５’−ＧＧＣＡＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣＣＴＣＧＧＣＡ−３’ （配列番号１６）
（４）ε-ポリ-L-リジン生産菌における変異型アスパルトキナーゼ遺伝子の発現
本研究で得られたＭ６８Ｖ変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子をε-ポリ-L-リジン生産菌で発現させるため、この遺伝子を接合用プラスミドpLAE003に挿入した。
まず、野生型アスパルトキナーゼ遺伝子を含む１．９ｋｂのApaI断片を、プラスミドpGEM 11Zf(+)のApaIサイトに挿入し、プラスミドask/pGEM 11Zを構築した。また、１．９ｋｂのApaI断片に存在する０．２ｋｂのClaI断片をＭ６８Ｖ変異が導入された０．２ｋｂのClaI断片と置換し、プラスミドask(M68V)/pGEM 11Zを構築した。次に、これらのプラスミドをBamHIおよびHindIIIで消化し、野生型アスパルトキナーゼ遺伝子またはＭ６８Ｖ変異型アスパルトキナーゼ遺伝子を有する１．９ｋｂ断片をそれぞれ取得し、BamHIおよびHindIIIで消化したpLAE003に挿入した。このように構築したプラスミド、ask/pLAE003またはask(M68V)/pLAE003を濱野らの方法（Journal of Bioscience and Bioenginering vol. 99, No. 6, 636-641(2005)）に従い大腸菌と接合させることによって、S. albulus CR1に導入した（図５）。５００ｍＬ坂口フラスコにε-ポリ-L-リジン生産培地（培地１Ｌ当たり、グリセロール ５０ｇ、イーストエキス ５ｇ、硫酸アンモニウム １０ｇ、リン酸水素二ナトリウム １．５８ｇ、リン酸二水素カリウム １．３６ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．５ｇ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．０４ｇ、硫酸鉄・七水和物 ０．０３ｇを含有）を５０ｍＬ入れ、得られた導入株を３０℃で６日間振盪培養し、ε-ポリ-L-リジン生産量を測定した結果、ベクターのみまたは野生型アスパルトキナーゼ遺伝子を導入した株と比較し、約１０％のε-ポリ-L-リジン生産性の向上が認められた（図５）。
なお、培養液中に蓄積したε-ポリ-L-リジンは、メチルオレンジを用いたItzhakiの方法（Analitical Biochemistry vol. 50, 569-574(1972)）によって定量した。すなわち、培養液上清０．１ｍＬに０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．９）１．９ｍＬを加えた液に１ｍＭメチルオレンジ水溶液２ｍＬを混合し、３０℃で３０分放置後、生じたε-ポリ-L-リジンとメチルオレンジの複合体を遠心分離によって除去し、その上清の４６５ｎｍにおける吸光度を測定した。一方、ε-ポリ-L-リジンの標準品を用いて作製した検量線から、ε-ポリ-L-リジン量を算出した。
本研究で得られたＭ６８Ｖ変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子をε-ポリ-L-リジン生産菌で発現させるため、この遺伝子を接合用プラスミドpLAE003に挿入した。
まず、野生型アスパルトキナーゼ遺伝子を含む１．９ｋｂのApaI断片を、プラスミドpGEM 11Zf(+)のApaIサイトに挿入し、プラスミドask/pGEM 11Zを構築した。また、１．９ｋｂのApaI断片に存在する０．２ｋｂのClaI断片をＭ６８Ｖ変異が導入された０．２ｋｂのClaI断片と置換し、プラスミドask(M68V)/pGEM 11Zを構築した。次に、これらのプラスミドをBamHIおよびHindIIIで消化し、野生型アスパルトキナーゼ遺伝子またはＭ６８Ｖ変異型アスパルトキナーゼ遺伝子を有する１．９ｋｂ断片をそれぞれ取得し、BamHIおよびHindIIIで消化したpLAE003に挿入した。このように構築したプラスミド、ask/pLAE003またはask(M68V)/pLAE003を濱野らの方法（Journal of Bioscience and Bioenginering vol. 99, No. 6, 636-641(2005)）に従い大腸菌と接合させることによって、S. albulus CR1に導入した（図５）。５００ｍＬ坂口フラスコにε-ポリ-L-リジン生産培地（培地１Ｌ当たり、グリセロール ５０ｇ、イーストエキス ５ｇ、硫酸アンモニウム １０ｇ、リン酸水素二ナトリウム １．５８ｇ、リン酸二水素カリウム １．３６ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．５ｇ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．０４ｇ、硫酸鉄・七水和物 ０．０３ｇを含有）を５０ｍＬ入れ、得られた導入株を３０℃で６日間振盪培養し、ε-ポリ-L-リジン生産量を測定した結果、ベクターのみまたは野生型アスパルトキナーゼ遺伝子を導入した株と比較し、約１０％のε-ポリ-L-リジン生産性の向上が認められた（図５）。
なお、培養液中に蓄積したε-ポリ-L-リジンは、メチルオレンジを用いたItzhakiの方法（Analitical Biochemistry vol. 50, 569-574(1972)）によって定量した。すなわち、培養液上清０．１ｍＬに０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．９）１．９ｍＬを加えた液に１ｍＭメチルオレンジ水溶液２ｍＬを混合し、３０℃で３０分放置後、生じたε-ポリ-L-リジンとメチルオレンジの複合体を遠心分離によって除去し、その上清の４６５ｎｍにおける吸光度を測定した。一方、ε-ポリ-L-リジンの標準品を用いて作製した検量線から、ε-ポリ-L-リジン量を算出した。
Claims (11)
- 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。 - 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）（ａ）に記載のタンパク質が有するアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。 - 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）ストレプトマイセス属細菌またはコリネ属細菌における、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが有するアミノ酸配列において、６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）（ａ）に記載のタンパク質が有するアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。 - 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における６８番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列からなる、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）（ａ）に記載のタンパク質が有するアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、L-リジン及びL-スレオニンによるフィードバック阻害活性が低下した、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。 - ６８番目のメチオニン残基がバリン残基に変異したアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載のタンパク質。
- 請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２〜６のいずれかに記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡ。
- 請求項６または７に記載のＤＮＡを含有し、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質を発現するように構築された発現ベクター。
- 請求項８に記載のベクターを有する形質転換細胞。
- 請求項９に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞が生産したL-リジンを単離することを特徴とするL-リジンの製造方法。
- 請求項９に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞が生産したε-ポリ-L-リジンを単離することを特徴とするε-ポリ-L-リジンの製造方法。
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- 2005-09-05 JP JP2005256886A patent/JP2007068437A/ja active Pending
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