SK16602002A3

SK16602002A3 - Spôsob purifikácie dvojvláknovej DNA použitím imobilizovaného oligonukleotidu

Info

Publication number: SK16602002A3
Application number: SK1660-2002A
Authority: SK
Inventors: Joel Crouzet; Daniel Scherman; Pierre Wils; Francis Blanche; Batrice Cameron
Original assignee: Gencell S. A.
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2003-06-03
Also published as: IL152860A0; SK287662B6; WO2001092511A3; EP1290156A2; ES2298239T3; CA2410263C; MXPA02011463A; HUP0302565A3; RU2315104C2; CA2410263A1; JP4803945B2; HU228891B1; JP2003534799A; CN1446258B; DE60132200D1; DE60132200T2; PT1290156E; BR0111145B1; AU2007202804B2; NO330571B1

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka spôsobu purifikácie DNA. Spôsob podľa vynálezu umožňuje rýchlu purifikáciu farmakologicky použiteľnej dvoj vláknovéj DNA. Spôsob purifikácie podľa vynálezu využíva špecifickú hybridizáciu medzi sekvenciou DNA a oligonukleotidom.

Doterajší stav techniky

Postupy génovej a bunkovej terapie zaznamenávajú v súčasnej dobe pozoruhodný rozvoj. Tieto postupy však prinášajú potrebu produkcie veľkých množstiev DNA vo farmaceutickej čistote. V týchto nových liečebných postupoch, liek často pozostáva zo samotnej DNA, alebo ju obsahuje a preto je nevyhnutné, aby sa táto DNA mohla vyrábať v potrebnom množstve, a aby sa izolovala a purifikovala takým spôsobom, aby bola vhodná na použitie v humánnej medicíne.

V súčasnosti sa v mnohých publikáciách preukázala možnosť injekcie plazmidovej DNA s cieľom génovej terapie alebo vakcinácie, kde sa preukázalo, že expresné vektory sa môžu prijímať rôznymi typmi buniek a gény kódované týmito plazmidmi sa môžu následne exprimovať (Ledley, 1995, Hum. Gene Ther. 6, 1129).

Medzi požadované gény na génovú terapiu alebo vakcináciu patria napríklad nádorové supresorové gény, tzv. „samovražedné (apoptotické) gény alebo antisense sekvencie. Môžu to byť tiež gény kódujúce proteíny, ako je napríklad alfa-fetoproteín AFP (Morinaga, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4604), enzýmy, hormóny, cytokíny, rastové faktory ako je FGF (Jouanneau et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2893) alebo VEGFB (Olofsson, B. et al., 1996, Proceedings 93, 576), koagulačné faktory ako faktor VIII s B deléciou („B-deleted factor VIII) (Truett et al., 1985, DNA 4, 333), apolipoproteíny, neurotransmitery, neurotrofické faktory, prírodné alebo chimérické imunoglobulíny. Tiež sú to aj reportérové gény, ako napr. gén lacZ kódujúci β-galaktozidázu z Escherichia coli.

Hlavnými úlohami, ktoré je potrebné riešiť pri používaní plazmidovej DNA ako vektora na prenos génov v humánnej medicíne sú i) výroba a ii) čistota produktu ako lieku. Vyvinuli sa technológie na produkciu plazmidových vektorov s vysokým počtom kópií v hostiteľovi Escherichia coli. Plazmidy používané v súčasnosti sú buď plazmidy odvodené od plazmidu ColEl, ako je napríklad pBR322, pUC alebo pBluescript (Lahijani et al., 1996, Hum. Gene Ther., 7, 1971) alebo plazmidy pCOR (Soubrier et al., 1999, Gene Therapy, 6, 1482).

Druhý súbor problémov spojených s použitím plazmidovej DNA ako vektora na génovú terapiu je čistota plazmidového vektora. Súčasné metódy purifikácie, ako je napríklad ultracentrifugácia v gradiente CsCl alebo chromatografia môžu byť neúčinné pri odstraňovaní kontaminujúcich zložiek, ako je napríklad hostiteľská genómová DNA a RNA alebo proteíny. Konkrétne, hostiteľská genómová DNA, ktorej chemická štruktúra je veľmi blízka plazmidovej DNA, sa mimoriadne ťažko odstraňuje využitím klasickej chromatografie. Typické koncentrácie hostiteľskej genómovej DNA, ktoré sú namerané v plazmidových preparátoch získaných pomocou klasickej chromatografie, sú až 0,5 až 1%. Teda na prípravu plazmidovej DNA ako bezpečného vektora na humánnu génovú terapiu je potrebná technológia purifikácie, ktorá zníži obsah hostiteľskej genómovej DNA na oveľa nižšie hladiny, typicky 0,1% alebo 0,001% alebo dokonca nižšie.

Predkladaný vynález opisuje nový, jednoduchý a obzvlášť účinný spôsob purifikácie DNA. Tento spôsob konkrétne umožňuje dosiahnuť obzvlášť vysokú čistotu súčasne s vysokým výťažkom. Tento spôsob podľa vynálezu je založený v podstate na špecifickej interakcii medzi sekvenciou, ktorá je vložená do DNA, ktorá má byť purifikované a oligonukleotidom, ktorý je zložený z prírodných alebo modifikovaných báz.

Nedávno sa ukázalo, že niektoré oligonukleotidy sú schopné špecificky interagovať so veľkým (širokým) žliabkom dvojzávitnice DNA, pričom vzniká trojzávitnicová štruktúra, ktorá má za následok inhibíciu transkripcie cieľových génov (Héléne et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Tieto oligonukleotidy selektívne rozpoznávajú dvojzávitnicu DNA v oligopurín-oligopyrimidínovej sekvencii, čo sú úseky obsahujúce oligopurínové sekvencie v jednom reťazci a oligopyrimidínové sekvencie v druhom komplementárnom reťazci a tam lokálne vytvárajú trojzávitnicu. Bázy tohoto tretieho reťazca (oligonukleotidu) vytvárajú vodíkové väzby (Hoogsteenove alebo reverzné Hoogsteenove väzby) s purínmi Watson-Crickových bázových párov. Použitie tohto typu interakcie na izoláciu plazmidu sa už opísalo v predchádzajúcom stave techniky. Ito et al. (PNAS 89 (1992) 495) opísali použitie biotinylovaného oligonukleotidu schopného rozpoznávať konkrétnu sekvenciu plazmidu a vytvárať s ňou trojzávitnicu. Takto vytvorené komplexy potom prichádzajú do kontaktu s magnetickými perličkami pokrytými streptavidínom. Interakcia medzi biotínom a streptavidínom potom umožní, aby sa plazmid izoloval pomocou magnetickej separácie perličiek a následnej elúcie. Aj tento spôsob má však niektoré nevýhody. Konkrétne potrebné sú tu dve nasledujúce špecifické interakcie, a to prvá medzi oligonukleotidom a plazmidom a druhá medzi biotinylovaným komplexom a magnetickými perličkami pokrytými streptavidinom. A taktiež môže byť konečný roztok kontaminovaný biotinylovanými oligonukleotidmi, ktoré však nesmú byť prítomné vo farmaceutickej kompozícii.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález opisuje nový, vylepšený spôsob purifikácie DNA založený na tomto type interakcie. Spôsob podlá vynálezu využíva hlavne oligonukleotidy kovalentne naviazané na nosič. Takýto spôsob purifikácie je výnimočne rýchly a poskytuje aj výnimočne vysoké výťažky a stupeň čistoty. Navyše umožňuje purifikovať DNA z komplexných zmesí, ktoré obsahujú konkrétne ďalšie nukleové kyseliny, proteíny, endotoxíny (ako sú napríklad lipopolysacharidy) , nukleázy a pod. Použitý nosič sa okrem toho môže ľahko recyklovať a DNA získaná spôsobom podlá vynálezu vykazuje vylepšené vlastnosti z hľadiska farmaceutickej bezpečnosti. Napokon, na rozdiel od stavu techniky tento spôsob podľa vynálezu predstavuje iba jediný krok.

Prvý aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu purifikácie dvoj vláknovéj (t.j. dvojzávitnicovej) DNA, ktorý je založený na tom, že sa roztok obsahujúci DNA s ďalšími zložkami filtruje cez nosič, na ktorý je kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu pomocou hybridizácie so špecifickou sekvenciou prítomnou v DNA. Pritom špecifická sekvencia môže byť sekvenciou prirodzene prítomnou v troj vláknovéj DNA alebo umelá sekvencia vnesená do DNA umelým spôsobom.

Oligonukleotidy použité v predpokladanom vynáleze sú oligonukleotidmi, ktoré hybridizujú priamo s dvoj vláknovou DNA. Tieto oligonukleotidy môžu obsahovať nasledujúce bázy:

- tymidín (T), ktorý je í s A.T dubletmi (dvojicami bá (Rajagopal et al., Biochem. 28

- adenín (A) , ktorý je dubletmi v dvoj vláknovéj DNA,

- guanin (G), ktorý' je dubletmi v dvoj vláknovéj DNA, chopný vytvárať triplety (trojice) ových párov) v dvoj vláknovéj DNA (1989) 7859), schopný vytvárať triplety s A.T schopný vytvárať triplety s G.C protonizovaný cytozín (C+) ktorý je schopný vytvárať triplety s G.C dubletmi v dvoj vláknovéj DNA (Rajagopal et al., pozri vyššie),

- uracil (U), ktorý je schopný vytvárať triplety s A.U dubletmi alebo A.T dubletmi.

Výhodne, oligonukleotid podľa predkladaného vynálezu obsahuje homopyrimidinovú sekvenciu, bohatú na cytozín a špecifická sekvencia prítomná v DNA je homopurín-homopyrimidínová sekvencia. Prítomnosť cytozínov umožňuje vytvoriť trojzávitnicu, ktorá je stabilná v kyslom pH, kde sú cytozíny protonizované, a je destabilizovaná v zásaditom pH, kde sú cytozíny neutralizované. Na to, aby sa hybridizáciou mohla vytvoriť trojzávitnica, je dôležité, aby oligonukleotid a špecifická sekvencia prítomná v DNA boli komplementárne. Na to, aby sa získal čo najlepší výťažok a dosiahla sa čo najlepšia selektivita, oligonukleotid a špecifická sekvencia, ktoré sa použili spôsobom podľa predkladaného vynálezu, sú úplne komplementárne. Môže to byť napr. konkrétne oligonukleotid poly(CTT) a špecifická sekvencia poly(GAA). Ako príklad možno spomenúť oligonukleotid so sekvenciou:

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)₇, sekvencia SEQ ID NC: 1), v ktorej bázy GAGG netvoria trojzávitnicu, ale umožňujú, že oligonukleotid je vzdialený od spojovacieho ramienka. Tiež možno uviesť oligonukleotid, ktorý má sekvenciu:

(CTT)7 (sekveneia SEQ ID NO: 26).

Tieto oligonukleotidy sú schopné vytvárať trojzávitnicu so špecifickou sekvenciou, ktorá obsahuje komplementárne jednotky (GAA.) . Požadovanou špecifickou sekvenciou potom môže byť konkrétne úsek obsahujúci 7, 14 alebo 17 GAA jednotek, tak ako to je opísané v príkladoch.

Ďalšou sekvenciou, ktorá je zaujímavá z hľadiska predkladaného vynálezu, je špecificky nasledujúca sekveneia:

5¹ —AAGGGAGGGAGGAGAGGAA— 3' (sekveneia SEQ ID NO: 5) .

Táto sekveneia vytvára trojzávitnicu s oligonukleotidmi 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (sekveneia SEQ ID NO: 6) alebo

5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (sekveneia SEQ ID NO: 7).

V tomto prípade sa oligonukleotid viaže k polypurínovému reťazcu v antiparalelnej orientácii. Tieto trojzávitnice sú stabilné iba v prítomnosti Mg²⁺ (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251, Beal a Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).

Tak, ako už bolo uvedené,, špecifickou sekvenciou môže byť sekveneia prirozene prítomná v dvojvláknovej DNA alebc umelá sekveneia, umelo vnesená do DNA. Obzvlášť výhodný je podľa predkladaného vynálezu oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu so sekvenciou prirozene prítomnou v dvoj vláknovéj DNA, napríklad v počiatku replikácie plazmidu alebo v markerovom géne. V tejto súvislosti sa uskutočňovali analýzy plazmidových sekvencii a ukázalo sa, že niektoré úseky týchto DNA, konkrétne v počiatku replikácie, môžu obsahovať homopurín-homopyrimidínové úseky. Syntéza oligonukleotidov, ktoré sú schopné vytvárať trojΊ závitnicu s týmito prírodnými homopurín-homopyrimidínovými úsekmi, výhodne umožňuje, aby sa spôsob podlá predkladaného vynálezu aplikoval na nemodifikované plazmidy, konkrétne komerčne dostupné plazmidy typu pUC, pBR322, pSV a pod. Medzi homopurín-homopyrimidínové sekvencie prirozene prítomné v dvoj vláknovéj DNA patria napríklad sekvencie obsahujúce celú alebo časť sekvencie:

5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’ (sekvencia SEQ ID NO: 2), prítomnú na počiatku replikácie X plazmidu E. coli ColEl. V tomto prípade oligonukleotid vytvárajúci trojzávitnicu má sekvenciu:

5'-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3' (	sekvencia	SEQ	ID NO:	: 3) a	viaže
sa striedavo k dvom reťazcom	dvoj závitnice,	tak	ako to	bolo
opísané v Beal and Dervan (J.	Am. Chem.	Soc.	. 1992,	, 114,	4976-
4982) a Jayasena and Johnston	(Nucleic	Acids Res	. 1532	, 20,
5279-5288). Tiež je možné uviesť	sekvenciu
5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (sekvencia SEQ ID	NO:	4)

z génu β-laktamázy z plazmidu pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508).

Dve ďalšie cieľové sekvencie, ktoré môžu vytvárať trojzávitnicové štruktúry s konkrétnymi oligonukleotidmi, boli identifikované v počiatkoch replikácie ColEl a pCOR. Plazmidy odvodené z ColEl obsahujú homopurínový 12-mér (ktorý má sekvenciu 5'-AGAAAAAAAGGA-3', sekvencia SEQ ID NO: 27), ktorý leží v protismere (upstream) od RNA-II transkriptu zúčastňujúceho sa na repiikácii plazmidu (Lacatena et al., 1981, Náture, 294, 623). Táto sekvencia vytvára stabilnú trojzávitnicovú šcruktúru s komplementárnym 12-mérnym oligonukleotidom so sekvenciou 5' -TCTTTTTTTCCT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 28). Kostra pCOR obsahuje homopurínový úsek 14 nerepetitívnych báz so sekvenciou (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (sekvencia SEQ ID NO: 29), ktorý je lokalizovaný v A+T bohatom segmente y počiatku replíkónu pCOR (Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). Táto sekvencia vytvára stabilnú trojzávitnicovú štruktúru s komplementárnym 14-mérnym oligonukleotidom so sekvenciou 5' -TTCTTTTTTTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 30). Zodpovedajúce oligonukleotidy 5 '-TCTTTTTTTCCT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 28) a 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 30) účinne a špecificky rozpoznávajú svoje zodpovedajúce komplementárne sekvencie, ktoré sú lokalizované v počiatku replikácie ColEl ori alebo pCOR (ori y) . Skutočne jednoduchá nekanonická triáda (T*GC alebo C*AT) môže mať za následok úplnú destabilizáciu trojzávitnicovej štruktúry.

Použitie oligonukleotidu schopného vytvoriť trojzávitnicu so sekvenciou, ktorá je prítomná v počiatku replikácie alebo v markerovom géne je obzvlášť výhodné, keďže to umožňuje pomocou rovnakého oligonukleotidu purifikovať akúkoľvek DNA obsahujúcu uvedený počiatok replikácie alebo uvedený markerový gén. Teda nie je nutné modifikovať plazmid alebo dvojvláknovú DNA tak, aby do nej bola vložená umelá špecifická sekvencia.

Napriek tomu, že úplne komplementárne sekvencie sú výhodné, je zrejmé, že niektoré nezhody (mismatches) medzi sekvenciou oligonukleotidu a sekvenciou prítomnou v DNA sa môžu tolerovať, ak nemajú za následok príliš veľkú stratu afinity. Ako príklad je možné uviesť sekvenciu 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3¹ (sekvencia SEQ ID NO: 8) prítomnú v géne β-laktamázy v E. coli. V tomto prípade tymín, ktorý prerušuje polypurínovú sekvenciu môže byť rozpoznávaný guanínom tretieho reťazca, čím sa vytvorí G*TA triplet, ktorý je stabilný, keď je obklopený dvomi tripletmi T*AT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834) .

Podľa konkrétneho uskutočnenia vynálezu, oligonukleotidy obsahujú sekvencie (CCT)_n, sekvencie (CT)_n alebo sekvencie (CTT)n, kde n je celé číslo 1 až 15, vrátane. Obzvlášť výhodné je použitie sekvencie typu (CT)_n alebo (CTT)_n. Pôvodca vynálezu ukázal, že výťažok purifikácie bol ovplyvnený množstvom (počtom) C v oligonukleotide. Konkrétne, tak ako je to ukázané v príklade 7, výťažok purifikácie sa zvyšuje, keď oligonukleotid obsahuje menej cytozínov. Je jasné, že oligonukleotidy podlá vynálezu môžu aj kombinovať (CCT), (CT) alebo (CTT) jednotky.

Oligonukleotidy môžu byť podlá vynálezu prírodné (zložené z nemodifikovaných prírodných báz) alebo chemicky modifikované. Predovšetkým oligonukleotidy môžu výhodne obsahovať určité chemické modifikácie, ktoré im poskytujú rezistenciu proti nukleázam alebo zosilňujú ochranu voči nukleázam alebo zvyšujú afinitu ku špecifickej sekvencii.

Oligonukleotid podľa predkladaného vynálezu znamená tiež akýkoľvek sled nukleozidov, v ktorom bola modifikovaná kostra s cieľom, aby bol odolnejší voči nukleázam. Medzi takéto modifikované oligonukleotidy patria fosfotioátové oligonukleotidy, ktoré sú schopné vytvárať trojzávitnice s DNA (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330) a tiež oligonukleotidy obsahujúce formacetálovú alebo metylfosfonátovú kostru (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 1 13, 7767-7768). Je tiež možné použiť oligonukleotidy syntetizované z α-anomérov nukleotidov, ktoré tiež vytvárajú tro j závitnicu s DNA (Le Doan et aL, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Ďalšou modifikáciou kostry je fosforamidátová väzba. Napríklad N³ -P³ internukleotidová fosforamidátová väzba, ktorú opísali Gryaznov and Chen, poskytuje oligonukleotidy, ktoré vytvárajú obzvlášť stabilnú trojzávitnicu s DNA (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144). K ďalším modifikáciám kostry patrí použitie ribonukleotidov, 2'-O-metylribózy, fosfodiesterov a pod. (Sun and Héléne, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). V neposlednom rade možno uviesť, že kostra založená na fosfore môže byť nahradená polyamidovou kostrou, tak ako v prípade PNA (peptidové nukleové kyseliny), ktoré môžu tiež vytvárať trojzávitnicu (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500, Kim et al., J. Am. Chem.

Soc., 1993, I 15, 6477-6481), alebo kostrou založenou na guanidíne, tak ako to je u DNG (deoxyribonukleoguanidín, pozri Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), alebo polykatiónovými analógmi DNA, ktoré tiež môžu vytvárať trojzávitnicu.

Tymín tretieho reťazca sa môže tiež nahradiť 5-brómuracilom, ktorý zvyšuje afinitu oligonukleotidu k DNA (Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). Tretí reťazec môže tiež obsahovať iné ako prírodné bázy, ku ktorým patrí napríklad

7-deáza-2'-deoxyxantozín (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-deoxy-(β-D-ribofuranozyl)-3-metyl-5-amino-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidín-7-ón (Koh and Dervan, T. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenin, 2-aminopurín, 2'-O-metylpseudoizocytidín alebo akékoľvek ďalšie modifikácie, ktoré sú odborníkom známe (kvôli prehľadu pozri Sun and Héléne, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356}.

Ďalší typ modifikácii oligonukleotidov má za ciel obzvlášť zlepšenie interakcie a/alebo afinity medzi oligonukleotidom a špecifickou sekvenciou. Najvýhodnejšia modifikácia podlá vynálezu je metylácia cytozínového oligonukleotidu (pozri Príklad

5). Takto metylované oligonukleotidy majú pozoruhodnú vlastnosť a to, že vytvárajú stabilnú trojzávitnicovú štruktúru so špecifickou sekvenciou pri pH blízkom neutrálnemu (> 5). To teda umožňuje pracovať pri vyšších hodnotách pH, ako to umožňovali oligonukleotidy zo stavu techniky, inými slovami pri takých hodnotách pH, kde je riziko degradácie plazmidovej DNA oveľa menšie.

Dĺžka oligonukleotidu použitého v spôsobe podlá vynálezu je aspoň 3 bázy a výhodne 5 až 30 báz. Výhodne sa používa oligonukleotid s dĺžkou väčšou ako 10 báz. DÍžku si môže odborník lahko upraviť pre každý jednotlivý prípad podlá požadovanej selektivity a stability interakcie.

Oligonukleotidy sa môžu syntetizovať podľa vynálezu akoukoľvek známou technikou. Konkrétne sa môžu pripravovať pomocou syntetizátorov nukleových kyselín. Ale samozrejme sa môžu použiť akékoľvek ďalšie spôsoby známe odborníkom.

Aby bola možná kovalentná väzba na nosič, oligonukleotid je podľa vynálezu všeobecne funkcionalizovaný. Teda je modifikovaný tiolovou, amínovou alebo karboxylovou terminálnou skupinou na 5' alebo 3' konci. Konkrétne pridanie tiolovej, amínovej alebo karboxylovej skupiny umožňuje napríklad kondenzáciu oligonukleotidu na nosič nesúci disulfidovú, maleimidovú, amínovú, karboxylovú, esterovú, epoxidovú, bromkyánovú alebo aldehydovú skupinu. Ku kondenzácii dochádza tým, že sa vytvárajú disulfidové, tioéterové, esterové, amidové alebo amínové väzby medzi oligonukleotidom a nosičom. Samozrejme sa môže použiť akýkoľvek ďalší spôsob známy odborníkovi, ako je napríklad použitie bifunkčného kondenzačného činidla.

Navyše sa môže výhodne použiť oligonukleotid obsahujúci sekvenciu báz zvanú ramienko (arm) a oddeľovač („spacer), aby sa zlepšila hybridizácia s naviazaným oligonukleotidom. Použitie ramienka umožňuje, aby sa oligonukleotid naviazal vo zvolenej vzdialenosti na nosič, čo zlepšuje podmienky interakcie s DNA. Ramienko výhodne pozostává z lineárneho uhlíkového reťazca, obsahujúceho 1 až 18, a výhodne 6 alebo 12 skupín (CH2) a amínovú skupinu, ktorá umožňuje väzbu na kolónu (nosič). Ramienko je naviazané na fosfát oligonukleotidu alebo „spacera, ktorý je zložený z báz, ktoré neinterferuj ú s hybridizáciou. Teda „spacer” môže obsahovať purínové bázy. Ako príklad možno uviesť „spacer” obsahujúci sekvenciu GAGG. Ramienko výhodne pozostáva z lineárneho reťazca obsahujúceho 6 alebo 12 atómov uhlíka.

Na realizáciu predkladaného vynálezu sa môžu použiť rôzne typy nosičov. Môžu to byť funkcionalizované chromatografické nosiče, voľné alebo naplnené v kolóne, funkcionalizované povrchy plastov alebo funkcionalizované latexové perličky, magnetické alebo iné. Výhodne sa použijú chromatografické nosiče. Napríklad ako chromatografické nosiče sa môžu využiť agaróza, akrylamid alebo dextrán, ako aj ich deriváty (ako je Sephadex, Sepharose, Superose atď.), polyméry ako je napríklad poly(styrén/divinylbenzén) alebo napríklad štepená alebo neštepená silika. Chromatografická kolóna môže potom pracovať difúznym alebo perfúznym spôsobom.

Na dosiahnutie lepšieho výťažku purifikácie je špeciálne výhodné použitie sekvencii na plazmide, ktoré obsahujú niekolko pozícii hybridizujúcich s oligonukleotidom. Prítomnosť niekoľkých hybridizujúcich pozícií má za následok stimuláciu interakcie medzi danou sekvenciou a oligonukleotidom, čo spôsobuje zlepšenie' výťažku purifikácie. Teda pre oligonukleotid, ktorý obsahuje n opakovaní (repetícií) motívov (CCT), (CT) alebo (CTT), je výhodné použitie DNA sekvencie, ktorá obsahuje aspoň n komplementárnych motívov, a výhodne n + 1 komplementárnych motívov. Sekveneia nesúca n+1 komplementárnych motívov umožňuje dve pozície hybridizácie s oligonukleotidom. Výhodne DNA sekveneia obsahuje až 11 hybridizačných pozícií, teda n+10 komplementárnych motívov.

Spôsob podlá predkladaného vynálezu sa môže použiť na purifikáciu akéhokoľvek typu dvoj vláknovéj DNA. Napríklad kruhovej DNA, ako je napríklad plazmid, ktorý všeobecne nesie jeden alebo viac génov, ktoré majú terapeutický význam. Plazmid môže tiež niesť počiatok replikácie, markerový gén a pod. Spôsob podlá vynálezu sa môže aplikovať priamo na bunkový lyzát. V tomto uskutočnení sa plazmid, amplifikovaný transformáciou a následnou kultiváciou buniek, purifikuje priamo po lýze buniek. Spôsob podlá vynálezu sa môže tiež aplikovať na číre lyzáty, teda na supernatant získaný po neutralizácii a centrifugácii bunkového lyzátu. Môže sa tiež samozrejme aplikovať na roztok prepurifikovaný niektorou zo známych metód. Spôsob podlá predkladaného vynálezu tiež umožňuje, aby sa lineárna alebo kruhová DNA, ktorá nesie požadované sekvencie purifikovala zo zmesi, ktorá obsahuje rôzne DNA s odlišnými sekvenciami. Spôsob podľa vynálezu sa môže tiež použiť na purifikáciu dvojvláknovej DNA.

Bunkovým lyzátom môže byť lyzát z prokaryotických alebo eukaryotických buniek.

Ako príklady vhodných prokaryotických buniek je možné uviesť baktérie E. coli, B. subtilis, S. typhimurium alebo Strepomyces. Pokial ide o eukaryotické bunky, ako príklady je možné uviesť živočíšne bunky, kvasinky, huby a pod., obzvlášť kvasinky Kluyveromyces alebo Saccharomyces alebo bunky COS, CHO, C127, NIH3T3, a pod.

Spôsob podľa vynálezu je obzvlášť výhodný, lebo umožňuje získať velmi rýchlo a velmi jednoducho plazmidovú DNA vo vysokej čistote. Konkrétne, tak ako to je ilustrované v príkladoch, spôsob podľa vynálezu umožňuje účinne oddeliť požadovanú plazmidovú DNA od kontaminujúcich zložiek, ako sú napríklad fragmenty chromozomálnej DNA, endotoxíny, proteíny, nukleázy a pod. Spôsob podľa vynálezu obzvlášť umožňuje prípravu dvojvláknovej DNA, konkrétne DNA plazmidového pôvodu, ktorá má obsah chromozomálnej DNA nižší alebo rovný 0,5%. Ešte výhodnejšie DNA preparáty získané spôsobom podľa vynálezu obsahovali najviac 0,2% chromozomálnej DNA.

Teda predkladaný vynález opisuje kompozície obsahujúce plazmidovú DNA, ktorá sa môže použiť farmaceutický, konkrétne v génovej alebo bunkovej terapii. V tejto súvislosti predmetom vynálezu je aj farmaceutická kompozícia obsahujúca dvojvláknovú DNA, lineárnu alebo plazmidového pôvodu, pripravenú opísaným spôsobom.

Predkladaný vynález sa teda tiež týka preparátu plazmidovej DNA, ktorý má obsah chromozomálnej DNA menší alebo rovný 0,5%, výhodne menší alebo rovný 0,2% a ešte výhodnejšie menší alebo rovný 0,1% a najvýhodnejšie menší alebo rovný 0,01%. Tak ako je to podrobnejšie uvedené ďalej v príkladoch, krok trojzávitnicovej afinitnej interakcie sa zaviedol do purifikačného procesu založeného na klasických chromatografických krokoch. Tento afinitný krok významne zlepšuje čistotu takto získaných plazmidových preparátov, bez ohľadu na ich počiatočnú čistotu. Vytvorenie trojzávitnicovej štruktúry medzi oligonukleotidom (kovalentne naviazaným na chromatografickom nosiči) a požadovaným plazmidom, ktorý má byť purifikovaný, je založené na prítomnosti takej sekvencie v plazmide, ktorá môže vytvárať trojzávitnicovú štruktúru s oligonukleotidom. Táto trojzávitnicová štruktúra je stabilná iba v .kyslom pH, kde sú cytozínové oligonukleotidy protonizované. Potom sa plazmidová DNA eluuje z kolóny jednoducho zvýšením pH na neutrálnu hodnotu.

Kompozície môžu obsahovať plazmidovú DNA, ktorá je bez akéhokoľvek nosiča, je tzv. holá, alebo je spojená s transportným nosičom, ako sú napríklad lipozómy, nanočastice, katiónové lipidy, polyméry, rekombinantné vírusy alebo proteíny a pod.

V jednom uskutočnení vynálezu sa spôsob podľa vynálezu použil na purifikáciu jedného typu dvoj vláknovéj DNA zo zmesi, ktorá obsahuje dva alebo viacero odlišných typov dvoj vláknovéj DNA s odlišnými sekvenciami. Takýto spôsob sa môže aplikovať priamo na bunkový lyzát, kde sa dvojvláknové DNA, amplifikované prostredníctvom bunkovej kultúry, purifikujú po lýze kultivovaných buniek. Spôsob podľa vynálezu sa môže taktiež aplikovať na číre lyzáty, teda na supernatant získaný po neutralizácii a centrifugácii bunkového lyzátu. Spôsob podľa vynálezu sa môže samozrejme použiť aj na roztok, ktorý bol prepurifikovaný.

Presnejšie povedané, spôsob purifikácie prvej dvoj vláknovéj DNA z roztoku, ktorý obsahuje prvú a druhú dvoj vláknovú DNA, zahŕňa (i) prechod roztoku cez prvý nosič obsahujúci kovalentne naviazaný oligonukleotid, ktorý je schopný vytvoriť trojzávitnicu s druhou dvoj vláknovou DNA hybridizáciou so špecifickou sekvenciou v tejto DNA, (ii) získanie roztoku, ktorý prešiel cez prvý nosič, a ktorý je obohatený o nenaviazanú prvú dvojvláknovú DNA, a (iii) prechod získaného roztoku cez druhý nosič, ktorý obsahuje kovalentne naviazaný oligonukleotid, ktorý je schopný vytvárať trojzávitnicu hybridizáciou so špecifickou sekvenciou v prvej dvoj vláknovéj DNA. Po voliteľnom kroku premytia je prvá dvojreťazcová DNA eluovaná z druhého nosiča. Využitím tohoto spôsobu dvojitej purifikácie sa môže získať prvá dvoj vláknová DNA z druhého nosiča bez akejkoľvek detegovatelnej hladiny druhej dvoj vláknovéj DNA.

V špecifickom uskutočnení predkladaného vynálezu je prvou dvoj vláknovou molekulou DNA plazmid pCOR, ktorý má špecifickú sekvenciu:

5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (sekvencia SEQ ID NO: 29), ktorá tvorí stabilnú trojzávitnicovú. štruktúru s oligonukleotidom, ktorý má sekvenciu:

5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 30).

Druhou dvoj vláknovou DNA molekulou je plazmid odvodený z plazmidu ColEl obsahujúci špecifickú sekvenciu:

5 ' -AGAAAAAAA.GGA-3 '	(sekvencia	SEQ	ID NO:	27) ,
ktorá tvorí trojzávitnicovú	štruktúru	1 s oligonukleotidom,
ktorý má sekvenciu:
5¹-TCTTTTTTTCCT-3'	(sekvencia	SEQ	ID NO:	28) .

Teda použitím spôsobu dvojitej purifikácie podľa predkladaného vynálezu je plazmid pCOR výhodne purifikovaný z roztoku, ktorý obsahuje ďalšie plazmidy, ako sú napríklad plazmidy odvodené od plazmidu ColEl.

Predkladaný vynález je ešte podrobnejšie opísaný v nasledujúcej časti prihlášky, obsahujúcej príklady, ktoré je potrebné považovať za ilustratívne a neobraezujúce.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Všeobecné metódy klonovania a molekulárnej biológie použité v príkladoch

Tradičné metódy molekulárnej biológie, ako je napríklad štiepenie reštrikčnými enzýmami, gélová elektroforéza, transformácia E. coli, precipitácia nukleových kyselín a pod., sú opísané v odbornej literatúre (pozri napr. Maniatis et al., T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989. Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Ausubel F.M., R. Brent, R.E. Kinston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and

K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 19871988. John Willey and Sons, New York.). Nukleotidové sekvencie sa stanovili metódou terminácie predlžovania reťazca podľa publikovaného protokolu (Ausubel et al., 1987).

Reštrikčné enzýmy boli zakúpené od firmy New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).

Na uskutočnenie ligácie sa fragmenty DNA inkubovali v pufri, ktorý obsahoval 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM ATP, v prítomnosti DNA ligázy z fága T4 (Biolabs).

Oligonukleotidy sa syntetizovali chemickou syntézou použitím fosforamiditov, keď fosforamidity bolí chránené v β polohe kyanoetylovou skupinou (Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus and H. Kdster, 1984. Polymér support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxy-nucleosides for the synthesis of DNA frag17 ments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J.W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.). Na syntézu sa použil automatický syntetizátor DNA Biosearch 8600 podlá návodu od výrobcu'.

Ligované DNA alebo DNA, u ktorých sa má testovať účinnosť transformácie, sa použili na transformáciu nasledujúceho kmeňa kompetentných buniek:

E. coli DH5a [F/endAl, hsdR17, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, d (lacZYA-arqF) U169, deoR, QQOdlac lacZAM15}} (pre akýkolvek plazmid ColEl), alebo

E. coli XAC-pir (pre akýkolvek plazmid odvodený z plazmidu pCor) .

Minipreparácia plazmidovej DNA sa robila podľa prerokolu Kleina et al., 1980.

Na kultiváciu kmeňov E. coli sa použilo LB médium (Maniatis et al., 1982). Kmene sa inkubovali pri 37°C. Baktérie sa naniesli na misky s LB médiom s prídavkom vhodného antibiotika.

Príklad 1

1.1. Príprava kolóny

Použila sa 1 ml HiTrap kolóna aktivovaná NHS (N-hydroxysukcínimidom, Pharmacia) pripojená k peristaltickej pumpe výstup < 1 ml/min.). Použitý špecifický oligonukleotid obsahoval NH₂skupinu na 5’ konci, a mal nasledujúcu sekvenciu:

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 1)

V tomto príklade sa použili nasledujúce pufre:

Kondenzačný (väzbový) pufor: 0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3.

Pufor A: 0,5 M etanolamín, 0,5 M NaCl, pH 8,3.

Pufor B: 0,1 M acetát, 0,5 M NaCl, pH 4.

Postup

Kolóna sa premyla so 6 ml 1 mM HCI a oligonukleotid zriedený kondenzačným pufrom (50 nmol v 1 ml) sa potom naniesol na kolónu a ponechal počas 30 minút pri teplote miestnosti. Kolóna sa potom trikrát za sebou premyla so 6 ml pufru A a potom 6 ml pufru B. Oligonukleotid bol takto kovalentne naviazaný na kolónu prostredníctvom CONH väzby. Kolóna sa uložila pri 4°C v PBS, 0,1% NaN₃ a môže sa použiť aspoň štyrikrát.

1.2. Konštrukcia plazmidov

Nasledujúce dva oligonukleotidy sa syntetizovali.

Oligonukleotid 4817 (sekvencia SEQ ID NO: 9):

' -GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3'

Oligonukleotid 4818 (sekvencia SEQ ID NO: 10):

5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3'

Tieto oligonukleotidy vnášajú homopurín-homopyrimidínovú sekvenciu (GAA)₁₇ (sekvencia SEQ ID NO: 33) do zodpovedajúceho plazmidu, keď sú hybridizované a klonované do plazmidu, tak ako je tu už opísané.

Sekvencie zodpovedajúce týmto dvom hybridizovaným oligonukleotidom, sa klonovali do viacnásobného klonovacieho miesta plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) , ktorý nesie gén rezistencie proti ampicilínu. Na tento účel sa oligonukleotidy hybridizovali nasledujúcim spôsobom: jeden pg každého oligonukleotidu sa vniesol do 40 pl pufru, ktorý obsaho19 val 50 mM Tris-HCl·, pH 7,4, 10 mM MgCl₂. Táto 2mes sa zahriala na 95°C a potom sa umiestnila pri teplote miestnosti, kde teplota zmesi pomaly klesala. Desať ng zmesi hybridizovaných oligonukleotidov sa ligovalo s 200 ng plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) , ktorý bol štiepený BamHI a BcoRI v 30 ul objeme. Po ligácii sa alikvotný podiel reakčnej zmesi transformoval do DH5oí. Transformačná zmes sa naniesla na misky s L médiom s prídavkom ampicilínu (50 mg/1) a X-gal (20 mg/1). Rekombinantné klony by sa mali prejaviť absenciou modrého sfarbenia na tomto médiu, na rozdiel od rodičovského plazmidu (pBKS-i-) , ktorý umožňuje α-komplementáciu ω fragmentu β-galaktozidázy z E. coli. Po minipreparácii plazmidovej DNA zo 6 klonov, všetky vykazovali stratu PstI miesta lokalizovaného medzi BcoRI a BamHI miestami pBKS+ a zvýšenie molekulovej hmotnosti 448 bp PvuII pásu obsahujúceho viacpočetné klonovacie miesto. Jeden kloň sa vybral a zodpovedajúci plazmid sa nazval pXL2563. Klonovaná sekvencia sa verifikovala sekvenovaním s použitím priméra -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 11)) (Viera J. a J. Messing. 1982. pUC plasmids, M13mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19, 259-268) pre plazmid pBKS+ (Stratagene Cloning Systeme, La Jolla CA) . Plazmid pXL2563 sa purifikoval pomocou súpravy Wizard Megaprep Kit (Promega Corp. Madison, WI) podlá protokolu výrobcu. Tento preparát plazmidovej DNA sa potom použil v nasledujúcich príkladoch.

1.3. Purifikácia plazmidu

Vybavenie

Plazmid pXL2563 (opísaný v časti 1.2) sa purifikoval na HiTrap kolóne s naviazaným oligonukleotidom, tak ako je opísané v časti 1.1., z roztoku, ktorý tiež obsahoval plazmid pBKS+. Pri tejto purifikácii sa použili nasledujúce pufre:

Pufor F: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5 až 5.

Pufor E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Postup

Kolóna sa premyla so 6 ml pufru E a plazmidy (20 pg pXL2563 a 20 pg pBKS+ v 400 pl pufru F) sa naniesli na kolónu a inkubovali 2 hodiny pri teplote miestnosti. Kolóna sa potom premyla 10 ml pufru E a elúcia sa potom uskutočnila pomocou pufra E. Plazmidy sa detegovali po elektroforéze v 1% agarózovom géli po vyfarbení etídiumbromidom. Podiel plazmidov v roztoku sa stanovil pomocou merania ich transformačnej aktivity u E. coli.

Výsledky

Z východiskovej zmesi obsahujúcej 30% pXL2S63 a 70% pBKS+ sa na výstupe z kolóny získal roztok obsahujúci 100% pXL2563.

Čistota stanovená pomocou pomeru OD pri 260 a 280 nm stúpla z hodnoty 1,9 na 2,5, čo ukazuje, že kontaminujúce proteíny boli týmto spôsobom odstránené.

Príklad 2

2.1. Opis purifikácie plazmidovej DNA

Kondenzácia oligonukleotidu (sekveneia SEQ ID NO: 1: 5'-GAGGCTTCTFCTTCTTCTTCTTCTT-3')) na kolónu sa uskutočnila tak, ako je opísané v príklade 1., Na kondenzáciu sa oligonukleotid modifikoval na 5' konci aminoskupinou naviazanou na fosfátový spacer pomocou ramienka, ktoré obsahovalo 6 atómov uhlíka (Modified Oligonucleotides Eurogentec SA, Belgium). Plazmid pXL2S63 sa purifikoval pomocou súpravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) podía protokolu výrobcu. V tomto príklade boli použité nasledujúce pufre:

Pufor F: 0 až 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5 až 5.

Pufor E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Kolóna sa premyla so 6 ml pufru F a 100 μΐ plazmidu pXL2563 zriedeného v 400 pi pufru F sa nanieslo na kolónu a inkubovalo 1 hodinu pri teplote miestnosti. Kolóna sa potom premyla s 10 ml pufru F a elúcia sa potom uskutočnila pufrom E. Meral sa obsah genómovej alebo chromozomálnej DNA E. coli prítomnej vo vzorkách plazmidu pred a po prechode kolónou s oligonukleotidom. Plazmid sa kvantifikoval meraním optickej denzity pri 260 nm.

V tomto príklade sa naviazanie uskutočnilo v pufri, ktorého molarita NaCi sa menila od 0 do 2 M (pufor F) . Výťažok purifikácie sa znižoval, keď sa znižovala molarita NaCi. pH väzbového pufra sa môže meniť v rozmedzí 4,5 až 5, pričom výťažok purifikácie je lepší pri 4,5. Je tiež možné použiť iný elučný pufor s bázickým pH: elúcia sa teda uskutočnila s pufrom, ktorý obsahoval 50 mM borát, pH 9 a 0,5 mM EDTA.

2.2. Kondenzácia oligonukleotidu

Kondenzácia oligonukleotidu (sekveneia SEQ ID NO: 1: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3') na kolónu sa uskutočnila tak, ako je opísané v príklade 1. Plazmid pXL2S63 sa purifikoval pomocou súpravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) podía protokolu výrobcu. V tomto príklade sa použili nasledujúce pufre:

Pufor F: 0,1 M NaCi, 0,2 M acetát, pH 5.

Pufor E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Kolóna sa premyla 6 ml pufru F a 100 μΐ plazmidu pXL2563 zriedeného v 400 μΐ pufru F sa nanieslo na kolónu a inkubovalo 2 hodiny pri teplote miestnosti. Kolóna sa potom premyla 10 ml pufru F a elúcia sa potom uskutočnila pufrom E. Meral sa obsah genómovej alebo chromozomálnej DNA E. coli prítomnej vo vzorkách plazmidu pred a po prechode kolónou s oligonukleotidom. Genómová

DNA sa kvantifikovala pomocou PCR s použitím primérov na gén galK z E. coli podľa nasledujúceho protokolu:

Sekveneie primérov sú opísané v Debouck et al. (Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841-1853):

5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC 24) , a	AGT	TTC-3'	(sekvencia SEQ ID	NO:
5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC	GGG	TGT-3'	(sekvencia SEQ ID	NO:
25) .
Reakčné médium obsahovalo	v 25	μΐ PCR	pufru (Promega Fran-
cúzsko, Charbonniéres): 1,5 mM	MgCl₂	, 0,2 mM dXTP (Pharmacia,	Or-

say) , 0,5 μΜ priméry, 20 U/ml Taq polymerázy (Promega) . Reakcia bežala v nasledujúcich krokoch:

minút pri 95°C cyklov: 10 sekúnd pri 95°C, 30 sekúnd pri 60°C, 1 minúta pri 78°C minút pri 78°C.

Amplifi kovaný fragment DNA s velkosťou 124 bázových párov sa separoval elektroforézou v 3% agarózovom géli za prítomnosti SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA) a potom kvantifikoval prostredníctvom vztiahnutia k referenčnej čistej genómovej DNA E. coli kmeňa B (Ultrapure Genomic DNA, Sigma, katalóg. Č. D4889) .

Vo vzorke nanášanej na kolónu bol obsah chromozomálnej DNA 1%, kým vo vzorke po purifikácii na oligonukleotidovej kolóne bol obsah chromozomálnej DNA 0,2%.

Príklad 3

Purifikácia z číreho lyzátu

Tento príklad opisuje purifikáciu plazmidovej DNA z číreho lyzátu bakteriálnej kultúry, a to v tzv. minipreparatívnom meradle: 1,5 ml nočnej kultúry kmeňa DH5a obsahujúceho plazmid pXL2563 sa centrifugovalo a pelet sa rozsuspendoval v 100 μΐ pufru: 50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Pridalo sa 200 μΐ 0,2 M NaOH, 1% SDS, obsah skúmaviek sa potom premiešal otočením a potom sa pridalo 150 μΐ 3 M octanu draselného, pH 5, a obsah skúmaviek sa opäť premiešal otočením. Po centrifugácii sa odobral supernatant a naniesol na kolónu s oligonukleotidom pripravenú tak, ako je opísané v príklade 1. Naviazanie, premývanie a elúcia sú zhodné ako v príklade 1. Približne 1 pg plazmidu sa získal z 1,5 ml kultúry. Získaný plazmid sa analyzoval elektroforézou v agarózovom géli a farbením etídiumbromidom, pričom výsledkom bol jediný pás superzávitnicovej kruhovej DNA. Žiadne stopy vysokomolekulovej (chromozomálnej) DNA alebo RNA neboli detegovateľné v piazmide, ktorý sa purifikoval týmto spôsobom. Pomer optických denzít v 260 a 280 nm bol vyšší ako 2.

Príklad 4

4.1.

Tento príklad opisuje purifikáciu plazmidovej DNA uskutočňovanú za tých istých podmienok, ako v príklade 3, pričom východiskovým materiálom je 20 ml bakteriálnej kultúry kmeňa DH5a obsahujúceho plazmid pXL2563. Bunkový pelet sa odobral do 1,5 ml pufru: 50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Lýza sa uskutočnila v 2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS a následná neutralizácia v

1,5 ml 3 M octanu draselného, pH 5. DNA sa potom precipitovala 3 ml 2-propanolu a pelet sa potom rozpustil v 0,5 ml pufru: 0,2 M octan sodný, pH 5, 0,1 M NaCl a naniesol na kolónu s oligonukleotidom pripravenú tak, ako je to opísané v príklade 1. Naviazanie, premytie kolóny a elúcia sa uskutočňovali ako v príklade 1, s výnimkou toho, že premývací pufor mal molaritu

NaCl 0,1 M. Získalo sa približne 16 pg plazmidovej DNA. Získaný plazmid sa analyzoval elektroforézou v agarózovom géli a farbením etídiumbromidom, pričom výsledkom bol jediný pás superzávitnicovej kruhovej DNA. Žiadne stopy vysokomolekulovej (chromozomálnej) DNA alebo RNA neboli detegovatelné v plazmide, ktorý sa purifikoval týmto spôsobom. Štiepenie plazmidu reštrikčnými enzýmami poskytlo jediný pás zodpovedajúci očakávanej veľkosti 3 kilobázy. Koncentrácia proteínov vo vzorkách sa znížila zo 125 pg/ml v prípade číreho lyzátu na menej ako 1 pg/ml v purifikovanom plazmide (Micro-BCA test, Pierce). Koncentrácia endotoxínu, stanovená pomocou testu LAL (Biosepra) bola až 10 x nižšia v purifikovanom plazmide v porovnaní s čírym lyzátom.

4.2.

Použitý plazmid obsahuje kazetu cytomegalovírusového promótora, gén kódujúci luciferázu a homopurín-homopyrimidínovú sekvenciu (GAA) 17 (sekvencia SEQ ID NO: 33) pocházajúcu z plazmidu pXL2563. Kmeň DH1 (Maniatis et al., 1989) obsahujúci tento plazmid sa kultivoval v 7 litrovom fermentore. Číry lyzát sa pripravil z 200 gramov buniek: bunkový pelet sa resuspendoval v 2 litroch pufru: 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM glukóza, 10 mM EDTA, ku ktorému sa potom pridali 2 litre pufru: 0,2 M NaOH, 1% SDS. Lyzát sa neutralizoval pridaním 1 litru 3 M octanu draselného. Po diafiltrácii sa 4 ml zahusteného lyzátu naniesli na 5 ml HiTrap-NHS kolónu s naviazaným oligonukleotidom, ktorý má sekvenciu: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 1) , a to spôsobom opísaným v príklade 1.1. Premývanie a elúcia sa uskutočnili ako v príklade 1. Získalo sa približne 400 pg plazmidu. Koncentrácia genómovej DNA v tejto vzorke, meraná technikou opísanou v príklade 2.2, bola 0,1%.

Príklad 5

Použitie modifikovaného oligonukleotidu

Tento príklad opisuje použitie oligonukleotidu, ktorý nesie metylované cytozíny. Sekvencia použitého oligonukleotidu bola nasleduj úca:

'-GAGG^HeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCCT^MeCTT^MeCTT-3 ' (sekvencia SEQ ID NO: 12)

Tento oligonukleotid má NH2 skupinu na 5' konci, ^MeC = 5-metylcytozín. Tento oligonukleotid umožňuje, že plazmid pXL2563 sa purifikuje v podmienkach príkladu 1 s väzbovým pufrom pH 5 (riziko degradácie plazmidu sa tým zníži).

Príklad 6

Oligonukleotid použitý v uvedených príkladoch je modifikovaný na 5' konci aminoskupinou pripojenou na fosfát prostredníctvom ramienka, ktoré obsahuje 6 atómov uhlíka: NH₂-(CH₂)6· V tomto príklade je aminoskupina pripojená na fosfát 5'-koncovej časti prostredníctvom ramienka, ktoré obsahuje 12 atómov uhlíka: NH₂-(CH₂) i2.

Kondenzácia oligonukleotidu a prechod kolónou sa uskutočnili tak, ako je opísané v príklade 2 s pufrom F: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5. Tento oligonukleotid umožňuje dosiahnutie vyšších výťažkov purifikácie: dosiahne sa 53% výťažok, kým s oligonukleotidom obsahujúcim 6 atómov uhlíka je tento výťažok 45% za tých istých podmienok.

Príklad 7

Použitím klonovacej stratégie opísanej v príklade 1.2, boli skonštruované ďalšie dva plazmidy nesúce homopurín-homopyrimidínové sekvencie: plazmid pXL2725, ktorý obsahuje sekvenciu (GGA) 16, (sekvencia SEQ ID NO: 34) a plazmid pXL2726, ktorý obsahuje sekvenciu (GA) 25 (sekvencia SEQ ID NO: 35) .

Príklad 7.1

Konštrukcia plazmidov

Plazmidy pXL2725 a pXL2726, analogické plazmidu pXL2563, sa konštruovali podľa klonovacej stratégie opísanej v príklade 1.2, s použitím nasledujúcich párov oligonukleotidov:

5986:	5 '	-GATCC (GA) 25GGG-3 '	(sekvencia	SEQ	ID	NO:	13)
5987:	5 '	-AATTCCC (TC) 25G-3'	(sekvencia	SEQ	ID	NO:	14)
5981:	5'	-GATCC (GGA) _nGG-3 '	(sekvencia	SEQ	ID	NO:	15)
5982:	5 '	-AATT (CCT) ₁₇CCG-3 '	(sekvencia	SEQ	ID	NO:	16)

Pár oligonukleotidov 5986 a 5987 sa použil na konštrukciu plazmidu pXL2726 kioncvaním oligonukleotidov do miest BamHI a BcoRI z pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), kým oligonukleotidy 5981 a 5982 sa použili na konštrukciu plazmidu pXL2725. Použili sa tie isté experimentálne podmienky ako na konštrukciu plazmidu pXL2563 a zmenili sa iba páry oligonukleotidov. Podobne sa klonovali sekvencie overené sekvenovaním plazmidov. To umožnilo zistiť, že plazmid pXL2725 má modifikáciu vzhladom na očakávanú sekvenciu: namiesto 17-krát opakovanej sekvencie GGA je tu GGAGA(GGA)is (sekvencia SEQ ID NO: 17).

Príklad 7.2

Príprava kolón a purifikácia

Oligonukleotidy tvoriace trojzávitnice s týmito homopurínovými sekvenciami boli naviazané ku kolónam HiTrap podľa techniky opísanej v príklade 1,1. Oligonukleotid so sekvenciou 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 18) sa použil na purifikáciu plazmidu pXL2725 a oligonukleotid so se27 kvenciou 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 19) sa použil na purifikáciu plazmidu pXL2726.

Dve takto získané kolóny umožnili, že zodpovedajúce plazmidy boli purifikované podľa techniky opísanej v príklade 2 s nasledujúcimi puframi:

Pufor F: 2 M NaCI, 0,2 M acetát, pH 4,5.

Pufor E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Dosiahnuté výťažky boli 23% a 31% pri pXL2725 a pXL2726, v danom poradí.

Príklad 8

Tento príklad ilustruje vplyv dĺžky špecifickej sekvencie, ktorá je prítomná v plazmide, na výťažok purifikácie.

Príklad 8.1

Konštrukcia plazmidov

Reportérový gén použitý v týchto experimentoch na demonštráciu aktivity kompozícií podľa vynálezu je gén kódujúci luciferázu (Luc).

Plazmid pXL2621 obsahuje kazetu cytomegalovírusového (CMV) promótora s veľkosťou 661 bp, extrahovanú z pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) štiepením reštrikčnými enzýmami Mlul a HindlII, ktorá je klonovaná v protismere od génu kódujúceho luciferázu, do miest Mlul a HindlII, základného vektora pGL (Promega Corp., Madison, WI). Tento plazmid sa konštruoval použitím štandardných techník molekulárnej biológie.

Plazmidy pXL2727-l a pXL2727-2 boli skonštruované nasledujúcim spôsobom:

Dva mikrogramy plazmidu pXL2621 sa linearizovali s BamHI a enzým sa potom inaktivoval 10 minútovou inkubáciou pri telopte 65°C, súčasne sa oligonukleotidy 6006 a 6008 hybridizovali tak, ako je to opísané v prípade konštrukcie plazmidu pXL2563.

6006: 5'-GATCT(GAA) i₇CTGCAGATCT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 20)

6008: 5'-GATCAGATCTGCAG(TTC) ₁₇A-3' (sekvencia SEQ ID NO:

21) .

Táto hybridizačná zmes sa klonovala na BamHI konce linearizovaného plazmidu pXL2621 a rekombinantné klony sa identifikovali, po transformácii do DH5a, PstI enzymatickou reštrikčnou analýzou, pretože oligonukleotidy vniesli do konštruktu PstI miesto. Vybrali sa dva klony a overila sa nukleotidová sekvencia klonovaného fragmentu použitím priméru (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 22)) ako priméru na sekvenovanie (Viera J. A J. Messing, 1982. The pUC plasmids an Ml3mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19: 259-268).

Prvý kloň (pXL2727-l) obsahuje sekvenciu GAA opakovanú 10-krát. Druhý kloň (pXL2727-2) obsahuje sekvenciu 5'-GAAGAAGAG (GAA) ₇GGAAGAGAA-3' (sekvencia SEQ ID NO: 23).

Príklad 8.2

Príprava kolón a purifikácia

Použila sa taká kolóna, ako je opísané v príklade 1 a kondenzoval sa oligonukleotid 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3 ' (sekvencia SEQ ID NO: 1) .

Plazmid pXL2727-l nesie 14 repetícií sekvencie GAA. Opísaný oligonukleotid, ktorý obsahuje iba 7 repetícií zodpovedajúcich hybridizačnej sekvencii CTT, teda môže hybridizovať s plazmidom v 8 odlišných polohách. Plazmid pXL2727-2 má na rozdiel od neho hybridizujúcu sekvenciu (GAA)₇ (sekvencia SEQ ID NO: 36) tej istej dĺžky, ako je dĺžka oligonukleotidu viazaného ku kolóne. Tento oligonukleotid teda môže hybridizovať iba v jednej pozícii na pXL2727-2.

Experiment je zhodný s pokusom opísaným v príklade 2, s nasledujúcimi puframi:

Pufor E: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5.

Pufor E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Výťažok purifikácie je 29% s plazmidom pXL2727-l a 19% s pXL2727-2.

Príklad 8.3

In vitro transfekcia cicavčích buniek

Použitými bunkami boli NIH 3T3 bunky, ktoré sa inokulovali deň pred experimentom na 24-jamkovej kultivačnej doštičke v počte 50000 buniek/jamka. Plazmid je zriedený v 150 mM NaCl a zmiešaný s lipofektantom RPR115335. Použil sa pomer pozitívnych nábojov lipofektantu/negatívnych nábojov DNA rovnajúci sa 6. Zmes sa vortexovala, inkubovala desať minút pri teplote miestnosti, zriedila v médiu bez fetálneho teľacieho séra a potom sa pridala k bunkám v pomere 1 pg DNA na kultivačnú jamku. Po dvoch hodinách pri 37°C sa pridalo 10% (objem/objem) fetálne teľacie sérum a bunky sa inkubovali 48 hodín pri 37°C v prítomnosti 5% C0₂. Bunky sa dvakrát premyli PBS a luciferázová aktivita sa merala podľa opísaného protokolu (Promega kit, Promega Corp. Madison, WI) na luminometri Lumat LB9501 (EG a G Berthold, Evry). Plazmid pXL2727-l purifikovaný tak, ako je opísané v príklade 8.2, poskytol výťažky transfekcie dvakrát väčšie, ako boli výťažky získané s tým istým plazmidom purifikovaným s použitím súpravy Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI).

Príklad 9

Purifikácia plazmidov odvodených z pCOR

Nasledujúci príklad ukazuje purifikáciu plazmidov odvodených z pCOR použitím trojzávitnicovej afinitnej chromatografie. Ukázalo sa, že táto technológia odstraňuje látky kontaminujúce nukleové kyseliny (konkrétne hostiteľskú genómovú DNA a RNA) do takej miery, ktorá sa nedosiahla konvenčnými chromatografickými metódami.

Trojzávitnicový afinitný gél sa syntetizoval použitím Sephacryl 5-1000 SF (Amersham-Pharmacia Biotech) ako chromatografického nosiča (matrice). Sephacryl 5-1000 sa najprv aktivoval jodistanom sodným (3 mM, teplota miestnosti, 1 hodina) v 0,2 M acetátu sodnom (pH 4,7). Potom sa oligonukleotid kondenzoval cez svoju 5'-NH₂ koncovú skupinu k aldehydovým skupinám aktivovaného nosiča redukčnou amináciou v prítomnosti kyseliny askorbovej (5 mM) tak, ako je to už opísané pri kondenzácii proteínov (Hornsey et al., J. Immunol. Methods, 1986, 93, S3-88). Homopyrimidínový oligonukleotid použitý pri týchto experimentoch (od firmy Eurogentec, purifikovaný HPLC) mal sekvenciu, ktorá bola komplementárna ku krátkej sekvencii 14-méru homopurínu (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (sekvencia SEQ ID NO: 29) prítomnej v počiatku replikácie (oriy) plazmidu pCOR (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482-1488). Tak ako sa už diskutovalo, sekvencia homopyrimidínového oligonukleotidu bola 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3¹(sekvencia SEQ ID NO: 30).

Nasledujúce plazmidy boli podrobené chromatografii: pXL3296 (pCOR bez transgénu, 2,0 kbp), pXL3179 (pCOR-EGE, 2,4 kbp), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2,5 kbp), pXL3678 (pCOR-AFP, 3,7 kbp), pXL3227 (pCOR-lacZ, 5,4 kbp) a pXL3397 (pCOR-Β delece FVIII, 6,6 kbp). Všetky tieto plazmidy boli purifikované dvomi krokmi ionomeničovej (aniónovej) chromatografie z čírych lyzátov získaných tak, ako je to opísané v príklade 4. Plazmid pBKS+ (pBluescript II KS + od firmy Stratagene), odvodený z ColEl, purifikovaný ultracentrifugáciou v CsCl, sa takisto študoval. Všetky použité plazmidy boli v topologickom stave superzávitnice („supercoil) (> 95%) .

V každom experimente purifikácie plazmidovej DNA sa 300 μς plazmidovej DNA v 6 ml 2 M NaCl, 0,2 M octane draselnom (pH 5,0) nanieslo na afinitnú kolónu obsahujúcu uvedený oligonukleotid 5¹-TTCTTTTTTTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 30) pri prietokovej rýchlosti 30 cm/h. Po premytí kolóny 5 objemami toho istého pufru sa viazaný plazmid eluoval 1 M Tris/HCl, 0,5 mM EDTA (pH 9,0) a kvantifikoval s UV (260 nm) a ionomeničovou chromatografiou s kolónou Millipore Gen-Pak (Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26-37). Výťažky plazmidov v zbieraných frakciách boli 207 μρ pre pXL3296, 196 μς pre pXL3179, 192 μς pre pXL3579, 139 μσ pre pXL3678, 97 μς pre pXL 3227 a 79 μς pre pXL 3397.

Nedetegovala sa žiadna väzba plazmidu (< 3 μg) , keď bol pBKS podrobený chromatografii na tejto kolóne. To ukazuje, že oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 30) vytvára stabilné trojzávitnicové štruktúry s komplementárnou 14-mérnou sekvenciou 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (sekvencia SEQ ID NO: 29) prítomnou v pCOR (oriy), ale nie s blízko príbuznou sekvenciou 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (sekvencia SEQ ID NO: 27) prítomnou v pBKS. To dokazuje, že zavedenie jednej nesúhlasnej triády (T*GC v tomto prípade) má za následok kompletnú destabilizáciu trojzávitnicovej štruktúry.

Čo sa týka kontroly, nebola pozorovaná žiadna väzba plazmidu (< 1 pg) , keď bol pXL3179 podrobený chromatograf ii. na prázdnej kolóne syntetizovanej v úplne podobných podmienkach, ale bez oligonukleotidu.

Využívaním tejto metódy s afinitnou purifikačnou kolónou v uvedených podmienkach bol stupeň kontaminácie hostiteľskou genómovou DNA zredukovaný z 2,6% na 0,07% pri príprave pXL3296. Podobne pri príprave pXL3179, keď bola vzorka podrobená chromatografii na tej istej afinitnej kolóne, sa zredukoval stupeň kontaminácie hostiteiskou DNA z 0,5% na 0,008%. Okrem toho, stupeň kontaminácie RNA bol značne redukovaný z 43% RNA na 0,2% RNA pri príprave pXL3179 s použitím tejto afinitnej purifikačnej kolóny.

Okrem toho, výťažok plazmidu PXL3579 bol menši ako 8%, keď bol oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 30) nahradený oligonukleotidom 5'-TTTTTTTTCTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 31) na afinitnej kolóne. Kým bol oligonukleotid tak, ako je uvedený v sekvencii SEQ ID NO: 31, komplementárny k časti VEGEB sekvencie v pXL3579 (t. j. nukleotidy 379 až 389 relatívne k ATG), nenastala významná trojzávitnicová afinita. To dokazuje, že táto afinitná purifikácia si vyžaduje nenáhodnú homopurín-homopyrimidínovú DNA sekvenciu.

Príklad 10

Purifikácia plazmidu odvodeného z ColEl

Nasledujúci príklad ukazuje purifikáciu plazmidov odvodených z ColEl použitím trojzávinicovej afinitnej chromatografie. Bolo ukázané, že táto technológia odstraňuje látky znečisťujúce nukleové kyseliny (konkrétne hostiteľskú genómovú DNA a RNA) na stupeň, ktorý nie je možné dosiahnúť obvyklými chromatografickými metódami.

Trojzávitnicový afinitný gél sa syntetizoval kondenzáciou oligonukleotidu, ktorý mal sekvenciu (sekvencia SEQ ID NO: 28): 5'-TCTTTTTTTCCT-3' na Sephacryl 5-1000 SF oxidovaný jodistanom tak, ako je to opísané v príklade 9.

Plazmidy pXL3296 (pCOR bez transgénu) a pBKS, plazmid odvodený z ColEl, bolí podrobené chromatografii na 1 ml kolóne obsahujúcej oligonukleotid 5'-TCTTTTTTTCCT-3¹ (sekveneia SEQ ID NO: 28) v podmienkach opísaných v príklade 9. Výťažok plazmidov v zobranej frakcii bol 175 pg pre pBKS a < 1 pg pre pXL3296. To dokazuje, že oligonukleotid 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (sekveneia SEQ ID NO: 28) vytvára stabilné trojzávitnicové štruktúry komplementárne s 12-mérnou sekvenciou (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (sekveneia SEQ ID NO: 27) prítomnou v pBKS, ale nie s velmi blízko príbuznou 12mérnou sekvenciou (5'-AGAAAAAAAAGA-3' ) (sekveneia SEQ ID NO: 32) prítomnou v pCOR. To dokazuje, že zavedenie jednej nesúhlasnej triády (C*AT v tomto prípade) môže mať za následok kompletnú destabilizáciu trojzávitnicovéj štruktúry.

Príklad 11

Metóda dvojitej purifikácie

Nasledujúci príklad ukazuje purifikáciu molekuly superzávitnicovej dvoj vláknovéj DNA, ako je napríklad pXL3296, v zmesi, ktorá obsahuje ďalšiu superzávitnicovú dvojvláknovú molekulu, ako je napríklad pBSK, použitím trojzávitnicovéj afinitnej chromatografie. Obe dvoj vláknové molekuly DNA môžu mať podobnú veľkosť, ale každá molekula DNA obsahuje unikátnu sekvenciu, ktorá je schopná vytvárať trojzávitnice s odlišnou delovou sekvenciou. Ako sa už diskutovalo, molekuly ako napríklad pXL3296 obsahujú sekvenciu 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEKVENCIA ID. Č. 29), ale neobsahujú sekvenciu 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (sekveneia SEQ ID NO: 27) . Na rozdiel od toho, molekuly, ako je napríklad pBSK, obsahujú sekvenciu SEQ ID NO: 27, ale neobsahujú sekvenciu SEQ ID NO: 29.

V prvom kroku naniesla na prvú 5 ' -TCTTTTTTTCCTT-3 ' sa zmes, ktorá obsahovala pXL3296 a pBSK, afinitnú kolónu obsahujúcu oligonukleotid (sekveneia SEQ ID NO: 28), ako je napríklad kolóna opísaná v príklade 10. Roztok sa filtroval cez prvú kolónu, ktorá zadržala neviazané molekuly DNA. V druhom kroku sa neviazané molekuly DNA z prvého kroku naniesli na druhú afinitnú kolónu obsahujúcu oligonukleotid (sekvencia SEQ ID NO: 30): 5' -TTCTTTTTTTTCTT-3', ako je napríklad kolóna opísaná v príklade

9. Druhá kolóna sa potom premyla a naviazané molekuly sa eluovali tak, ako je to opísané v príklade 9. Z druhej kolóny sa eluovali iba pXL3296 molekuly. V eluáte (tj. roztoku, ktorý bol eluovaný z kolóny) neboli z druhej kolóny detegované žiadne molekuly pBSK.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob purifikácie dvoj vláknovéj DNA z roztoku, ktorý obsahuje dvojvláknovú DNA zmiešanú s ďalšími zložkami, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok, keď roztok prechádza cez nosič obsahujúci kovalentne naviazaný oligonukleotid, ktorý je schopný vytvoriť trojzávitnicu s dvojvláknovou DNA hybridizáciou so špecifickou ·sekvenciou prítomnou v dvoj vláknovéj DNA, pričom kovalentne naviazaný oligonukleotid obsahuje sekvenciu TCTTTTTTTCCT (sekvencia SEQ ID NO: 28) alebo TTCTTTTTTTTCTT (sekvencia SEQ ID NO: 30).
2. Spôsob purifikácie dvoj vláknovéj DNA z roztoku, ktorý obsahuje dvojvláknovú DNA zmiešanú s ďalšími zložkami, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok, keď roztok prechádza cez nosič obsahujúci kovalentne naviazaný oligonukleotid, ktorý je schopný vytvoriť trojzávitnicu s dvoj vláknovou DNA hybridizáciou so špecifickou sekvenciou prítomnou . v dvoj vláknovéj DNA, pričom špecifická sekvencia prítomná v dvoj vláknovéj DNA obsahuje sekvenciu AGAAAAAAAGGA (sekvencia SEQ ID NO: 27) alebo AAGAAAAAAAAGAA (sekvencia SEQ ID NO: 29) .
3. Spôsob purifikácie prvej dvoj vláknovéj DNA z roztoku, ktorý obsahuje prvú dvojvláknovú DNA a druhú dvojvláknovú DNA, v yznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky, keď (i) roztok prechádza cez prvý nosič, ktorý obsahuje kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu s druhou dvojvláknovou DNA hybridizáciou so špecifickou sekvenciou v tejto druhej DNA, (ii) získa sa roztok, ktorý prešiel cez prvý nosič, a (iii) získaný roztok prechádza cez druhý nosič, ktorý obsahuje kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu s prvou dvoj vláknovou DNA hybridizáciou so špecifickou sekvenciou v tejto prvej DNA, pričom špecifická sekvencia prítomná v prvej dvojvláknovéj DNA obsahuje sekvenciu

AAGAAAAAAAAGAA (sekvencia SEQ ID NO: 29) a špecifická sekvencia prítomná v druhej dvoj vláknovéj DNA obsahuje sekvenciu AGAAAAAAAGGA (sekvencia SEQ ID NO: 27) .
4. Spôsob purifikácie prvej dvoj vláknovéj DNA z roztoku, ktorý obsahuje prvú dvojvláknovú DNA a druhú dvojvláknovú DNA, v yznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky, keď (i) roztok prechádza cez prvý nosič, ktorý obsahuje kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu s druhou dvoj vláknovou DNA hybridizáciou so špecifickou sekvenciou v tejto druhej DNA, (ii) získa sa roztok, ktorý prešiel cez prvý nosič, a (iii) získaný roztok prechádza cez druhý nosič obsahujúci kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu s prvou dvoj vláknovou DNA hybridizáciou so špecifickou sekvenciou v tejto prvej DNA, pričom oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu s prvou dvoj vláknovou DNA obsahuje sekvenciu TTCTTTTTTTTCTT (sekvencia SEQ ID NO: 30) a oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu s druhou dvoj vláknovou DNA obsahuje sekvenciu TCTTTTTTTCCT (sekvencia SEQ ID NO: 28).
5. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m, že roztok je bunkový lyzát.
6. Spôsob podľa nároku 5vyznačujúci sa tým, že bunkový lyzát je číry lyzát.
7. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m, že dvoj vláknová DNA je prepurifikovaná.
8. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa ť ý m, že špecifická sekvencia sa umelo vloží do dvojvláknovej DNA.
9. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia je prirodzene prítomná v dvojvláknovéj DNA.
10. Spôsob podía nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci

I sa t ý m, že oligonukleotid je naviazaný na nosič prostredníctvom disulfidovej, tioéterovej, esterovej, amidovej alebo amínovej väzby.
11. Spôsob podľa nároku 10 vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid je naviazaný na kolónu prostredníctvom ramienka obsahujúceho uhlíkový reťazec (CH₂)_n, kde n je celé číslo 1 až 18 vrátane, pričom ramienko je naviazané na oligonukleotid prostredníctvom fosfátu a na kolónu prostredníctvom amidovej väzby.
12. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid obsahuje aspoň jednu chemickú modifikáciu, ktorá mu poskytuje rezistenciu proti nukleázam alebo ho chráni voči nukleázam alebo zvyšuje jeho afinitu ku špecifickej sekvencii.
13. Spôsob podľa nároku 12 vyznačujúci sa tým, že aspoň jeden z cytozínov v oligonukleotide je metylovaný..
14. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m, že dvojvláknová DNA je kruhová DNA.
15. Spôsob podľa nároku 14 vyznačujúci sa tým, že kruhovou DNA je plazmid.
16. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3 nebo 4, vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia prítomná v dvoj vláknovéj

DNA obsahuje niekolko pozícii na hybridizáciu s oligonukleotidom.
17. Spôsob podlá nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že nosičom je funkcionalizovaný chromatografický nosič, funkcionalizovaný plastový povrch alebo sú to funkcionalizované latexové perličky.
18. Spôsob podlá nároku 17 vyznačujúci sa nosičom je funkcionalizovaný chromatografický nosič.

tým, že
19. Spôsob podlá nároku 18 vyznačujúci sa tým, že purifikovaná dvojvláknová DNA má obsah chromozomálnej DNA menší alebo rovnajúci sa 0,5%.
20. Spôsob podlá nároku 19 vyznačujúci sa tým, že purifikovaná dvojvláknová DNA má obsah chromozomálnej DNA menší alebo rovnajúci sa 0,01%.
21. Spôsob purifikácie dvoj vláknovéj RNA z roztoku, ktorý obsahuje dvojvláknová RNA zmiešanú s ďalšími zložkami vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok, keď roztok prechádza cez nosič obsahujúci kovalentne naviazaný oligonukleotid, ktorý je schopný vytvoriť trojzávitnicu s dvoj vláknovou RNA hybridizáciou so špecifickou sekvenciou prítomnou v dvoj vláknovej RNA, pričom oligonukleotid obsahuje sekvenciu TCTTTTTTTCCT {sekvencia SEQ ID NO: 28) alebo sekvenciu TTCTTTTTTTTCTT (sekvencia SEQ ID NO: 30) .
22. Spôsob podlá nároku 1 alebo 3 vyznačujúci sa tým, že kovalentne naviazaný oligonukleotid obsahuje sekvenciu TCTTTTTTTCCT (sekvencia SEQ ID NO: 28).
23. Spôsob podlá nároku 1 alebo 3 vyznačujúci sa t ý m, že kovalentne naviazaný oligonukleotid obsahuje sekvenciu TTCTTTTTTTTCTT (sekvencia SEQ ID NO: 30).
24. Spôsob podľa nároku 2 alebo 4 vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia prítomná v dvoj vláknovéj DNA obsahuje sekvenciu AGAAAAAAAGGA (sekvencia SEQ ID NO: 27).
25. Spôsob podľa nároku 2 alebo 4 vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia prítomná v dvoj vláknovéj DNA obsahuje sekvenciu AAGAAAAAAAAGAA (sekvencia SEQ ID NO: 29).