KR100853040B1 - 고정된 올리고뉴클레오타이드로 삼중나선 형성의 정제방법 - Google Patents
고정된 올리고뉴클레오타이드로 삼중나선 형성의 정제방법 Download PDFInfo
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Abstract
타 성분과의 혼합물에 DNA를 함유하는 용액을 DNA상에 존재하는 특이적 서열과 하이브리드화하여 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드에 공유 커플링되는 지지체 상에서 통과시키는 이중가닥 DNA의 정제방법.
DNA 정제, 올리고뉴클레오타이드, 삼중나선
Description
관련 출원에 대한 전후참조
본 출원은 내용이 참조로 의지되고 인용되는, 1995년 11월 8일자로 출원된 PCT FR95/01468의 U.S. 국내 단계 출원인 1997년 6월 9일자로 출원된 U.S. 출원 S.N. 08/860,038의 부분 연속출원인 2000년 5월 26일자로 출원된 U.S. 출원 S.N. 09/580,923의 우선권을 주장한다.
본 출원은 새로운 DNA 정제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 약리학적으로 이용할 수 있는 이중가닥 DNA를 신속하게 정제할 수 있게 한다. 좀더 구체적으로 말해서, 본 발명에 따른 정제방법은 DNA와 올리고뉴클레오타이드의 서열간의 특이적 하이브리드화를 수반한다.
유전자 및 세포 요법 기술은 현재 괄목할만한 발전상에 있다. 그러나, 이들 기술은 제약학적 순도의 DNA의 대량 생산 가능성을 필요로 한다. 사실, 이러한 신요법에서, 의약품은 종종 DNA 자체로 이루어지며, 이를 적당량으로 제조하고, 분리하여 인간에서의 치료 용도에 맞는 방식으로 정제할 수 있게 하는 것이 필수이다.
근년에 와서, DNA 발현 벡터가 다양한 세포형에 의해 취해질 수 있고 이들 플라스미드에 의해 암호화된 유전자가 후속 발현될 수 있음을 입증하는 다수의 보고에 의해 유전자 요법 또는 백신접종을 위한 플라스미드 DNA의 주입 가능성이 증명되었다(Ledley, 1995 Hum. Gene Ther. 6, 1129).
유전자 요법 또는 백신접종 적용을 위한 당해 유전자로는 예를 들면, 종양 억제 유전자, 자살 유전자, 또는 안티-센스 서열이 포함될 수 있다. 이들은 또한 알파-페토프로틴 AFP(Morinaga, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4604), 효소, 호르몬, 사이토카인, FGF 같은 성장인자(Jouanneau et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2893) 또는 VEGFB(Olofsson B al., 1996, Proceedings 93, 576), B-결실 인자 VIII(Truett et al., 1985, DNA 4, 333) 같은 응고인자, 아포리포프로틴, 신경전달물질, 뉴로트로픽 인자, 천연 또는 키메릭 면역글로불린 같은 단백질을 암호화할 수 있다. 이.콜라이 β-갈락토시다제를 암호화하는 lacZ 같은 리포터 유전자도 사용된다.
인간에서 유전자 전달 벡터로서 플라스미드 DNA를 사용하기 위한 주된 챌린지는 i)이러한 약품의 제조 및 ii) 순도이다. 이.콜라이 숙주에서 플라스미드 벡터를 높은 카피 수로 생산하기 위한 기술이 최근에 개발되었다. 일반적으로 사용되는 플라스미드는 pBR322, pUC 또는 pBluescript(Lahijani et al., 1996, Hum. Gene Ther., 7, 1971)와 같은 ColE1-유래 플라스미드 또는 pCOR 플라스미드(Soubrier et al., 1999, Gene Therapy, 6, 1482)이다.
유전자 요법 벡터로서 플라스미드 DNA의 사용에 의해 제기된 두 번째 관심사는 플라스미드 벡터 자체의 순도이다. CsCl 구배에서의 초원심분리 또는 크로마토 그래피와 같은 현행 정제방법은 숙주 게놈 DNA와 RNA 또는 단백질 같은 오염물 제거에는 불충분할 수 있다. 특히, 화학적 구조가 플라스미드 DNA의 것과 매우 유사한 숙주 게놈 DNA는 전통적인 크로마토그래피를 이용하여 제거하기란 지극히 곤란하다. 전통적인 크로마토그래피로 수득한 플라스미드 제제에서는 0.5 내지 1%까지의 숙주 게놈 DNA의 전형적인 농도가 발견된다. 따라서, 인간 유전자 요법을 위한 안전한 벡터로서 플라스미드 DNA를 개발하기 위해서는, 숙주 게놈 DNA의 함량을 훨씬 더 낮은 수준으로, 전형적으로 0.1% 또는 심지어는 0.01% 또는 그 이하로 낮추게 할 정제기술이 필요하다.
본 발명은 DNA 정제를 위한 간단하고 특히 효과적인 새로운 방법을 기술한다. 이러한 방법은 특히 고수율 고순도로 수득할 수 있게 한다. 본 발명에 따른 방법은 본질적으로, 정제될 DNA 중으로 삽입된 서열과 천연 또는 변형 염기로 구성된 올리고뉴클레오타이드 간의 특이적 상호작용에 기초한다.
최근에는, 일부 올리고뉴클레오타이드가 DNA 이중나선의 넓은 홈에서 특이적으로 상호작용하여 국소적으로 삼중나선을 형성할 수 있고, 이로 해서 표적 유전자의 전사 억제가 초래됨이 발견되었다(Helene et Toulme, Biochim. Biophys. Acta 1049(1990) 99). 이러한 올리고뉴클레오타이드는 올리고퓨린-올리고피리미딘 서열에서, 즉 하나의 가닥에는 올리고퓨린 서열 및 상보 가닥에는 올리고피리미딘을 보유하는 영역에서 DNA 이중나선을 선택적으로 인식하고, 거기서 국소적으로 삼중나선을 형성한다. 세 번째 가닥(올리고뉴클레오타이드)의 염기는 왓슨-크릭 염기쌍의 퓨린과 수소 결합(Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 결합)을 형성한다.
플라스미드를 분리하기 위한 상호작용의 이러한 유형의 사용이 선행기술에 기재되었다. 따라서, Ito 등(PNAS 89 (1992) 495)은 플라스미드의 특정 서열을 인식하고 그와 삼중나선을 형성할 수 있는 바이오티닐화 올리고뉴클레오타이드의 사용을 기술하고 있다. 이렇게 형성되는 복합체를 이어서 스트렙타비딘-코팅 마그네틱 비드와 접촉시킨다. 이어서 바이오틴과 스트렙타비딘 간의 상호작용은 플라스미드가 비드의 마그네틱 분리에 이은 용출에 의해 분리될 수 있게 한다. 그러나, 이 방법은 약간의 결점이 있다. 특히, 첫 번째로 올리고뉴클레오타이드와 플라스미드간 및 두 번째로 바이오티닐화 복합체와 스트렙타비딘 비드간의 두 연속적인 특이적 상호작용이 필요하다. 더욱이, 최종 용액이 바이오티닐화 올리고뉴클레오타이드로 오염될 수 있으며, 이렇게 되면 약학 조성물에 사용될 수 없다.
발명의 요약
본 발명은 이러한 유형의 상호작용 사용을 가능케 하는 새롭고 개선된 DNA 정제방법을 기술한다. 좀더 구체적으로는, 본 발명의 방법은 지지체에 공유 커플링된 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 이러한 방법은 특히 신속하며, 특히 높은 수율과 순도를 이끈다. 또한, 이 방법은 특히, 다른 핵산, 단백질, (리포폴리사카라이드 같은) 내독소, 뉴클레아제 등을 포함하는 복합 혼합물로부터 DNA를 정제할 수 있게 한다. 사용되는 지지체는 또한 용이하게 재활용될 수 있으며, 수득된 DNA는 제약학적 안전성의 향상된 특성을 보인다. 끝으로, 이 방법은 종래기술과는 상반되게 단지 1단계만을 수반한다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 주제는 이중가닥 DNA의 정제방법에 있으며, 이에 따라 타 성분과 혼합된 DNA를 함유하는 용액은 DNA에 존재하는 특이적 서열과의 하이브리드화에 의해 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드가 공유 커플링되는 지지체를 통해 통과된다. 특이적 서열은 이중가닥 DNA에 자연적으로 존재하는 서열, 또는 후자에 인위적으로 도입된 합성 서열일 수 있다.
본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥 DNA와 직접 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 하기 염기를 함유할 수 있다:
- 이중가닥 DNA의 A.T 더블릿과 트리플릿을 형성할 수 있는 티미딘(T)(Rajagopal et al., Biochem 28(1989) 7859);
- 이중가닥 DNA의 A.T 더블릿과 트리플릿을 형성할 수 있는 아데닌(A);
- 이중가닥 DNA의 G.C 더블릿과 트리플릿을 형성할 수 있는 구아닌(G);
- 이중가닥 DNA의 G.C 더블릿과 트리플릿을 형성할 수 있는 양성자화 사이토신(C+)(Rajagopal et al., loc. cit);
- A.U 또는 A.T 염기쌍과 트리플릿을 형성할 수 있는 우라실(U).
바람직하게는, 사용된 올리고뉴클레오타이드는 사이토신-풍부 호모피리미딘 서열을 포함하고 DNA에 존재하는 특이적 서열은 호모퓨린-호모피리미딘 서열이다. 사이토신의 존재는 사이토신이 양성자화되는 산 pH에서 안정하고 사이토신이 중화되는 알칼리 pH에서 불안정화되는 삼중나선을 갖게 만들 수 있다.
하이브리드화에 의한 삼중나선의 형성을 허용하기 위해서는, 올리고뉴클레오타이드와 DNA에 존재하는 특이적 서열이 상보적이 되는 것이 중요하다. 이와 관련 하여, 최상의 수율과 최상의 선택성을 달성하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 및 완전히 상보적인 특이적 서열이 본 발명의 방법에 사용된다. 이들은 특히, 올리고뉴클레오타이드 poly(CTT) 및 특이적 서열 poly(GAA)일 수 있다. 일례로서, 서열 5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(GAGG(CTT)7; 서열번호 1)의 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있으며, 여기에서 염기 GAGG는 삼중나선을 형성하지 않지만 올리고뉴클레오타이드가 커플링 아암으로부터 떨어져 위치할 수 있게 하며; 서열 (CTT)7(서열번호 26)도 언급될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 상보 단위(GAA)를 함유하는 특이적 서열과 삼중나선을 형성할 수 있다. 당해 서열은 특히, 실시예에 기술된 바와 같이, 7, 14 또는 17 GAA 단위를 함유하는 영역일 수 있다.
특이적 용도의 또다른 서열은 서열: 5′-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3′(서열번호 5)이다. 이 서열은 올리고뉴클레오타이드 5′-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3′(서열번호 6) 또는 5′-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3′(서열번호 7)과 삼중나선을 형성한다.
이 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 폴리퓨린 가닥에 역평행 배향으로 결합한다. 이들 삼중나선은 Mg2+의 존재하에서만 안정하다(Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal and Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
전술한 바와 같이, 특이적 서열은 이중가닥 DNA에 자연적으로 존재하는 서열, 또는 후자에 인위적으로 도입된 합성 서열일 수 있다. 이중가닥 DNA에, 예를 들면 플라스미드의 복제 기원에 또는 마커 유전자에 자연적으로 존재하는 서열과 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 특히 유리하다. 이와 관련하여, 본 출원인은 플라스미드 서열 분석을 수행하였으며, 특히 복제 기원내 이들 DNA의 일부 영역이 호모퓨린-호모피리미딘 영역을 보유할 수 있음을 보여줄 수 있었다. 이들 천연의 호모퓨린-호모피리미딘 영역과 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 합성은 유리하게도 본 발명의 방법이, 비변형 플라스미드, 특히 pUC, pBR322, pSV형 등의 시판 플라스미드에 적용될 수 있게 한다. 이중가닥 DNA에 자연적으로 존재하는 호모퓨린-호모피리미딘 서열로는, 이.콜라이 플라스미드 ColE1의 복제 기원에 존재하는 서열 5′-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3′(서열번호 2)의 전부 또는 일부를 포함하는 서열이 언급될 수 있다. 이 경우에, 삼중나선을 형성하는 올리고뉴클레오타이드는 서열: 5′-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3′(서열번호 3)를 보유하고, Beal 및 Dervan(J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) 및 Jayasena 및 Johnston(Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288)에 의해 기술된 바와 같이 이중나선의 두 가닥에 번갈아 결합한다. 플라스미드 pBR322 β-락타마제 유전자(Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508)의 서열 5′-GAAAAAGGAAGAG-3′(서열번호 4)도 언급될 수 있다.
특정 올리고뉴클레오타이드와 트리플렉스 구조를 형성할 수 있는 두 부가적인 표적 서열이 ColE1에서 및 pCOR의 복제 기원에서 동정되었다. ColE1-유래 플라스미드는 플라스미드 복제에 관여된 RNA-II 전사체의 업스트림에 매핑된 12량체 호모퓨린 서열(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(서열번호 27)을 함유한다(Lacatena et al., 1981, Nature, 294, 623). 이러한 서열은 12량체 상보 5′-TCTTTTTTTCCT-3′(서열 번호 28) 올리고뉴클레오타이드와 안정한 트리플렉스 구조를 형성한다. pCOR 백본은 pCOR의 γ기원 레플리콘의 A+T-풍부 세그먼트에 위치된 14개의 비-반복성 염기(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(서열번호 29)의 호모퓨린 스트레치를 함유한다(Levehenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). 이 서열은 14량체 상보 올리고뉴클레오타이드 5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(서열번호 30)과 안정한 트리플렉스 구조를 형성한다. 상응하는 올리고뉴클레오타이드 5′-TCTTTTTTTCCT-3′(서열번호 28) 및 5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(서열번호 30)은 ColE1 ori 또는 pCOR(oriγ)의 복제 기원내에 위치한 이들의 각 상보 서열을 효율적으로 및 특이적으로 표적화한다. 사실, 단일 비-정규 트라이애드(T*GC 또는 C*AT)는 트리플렉스 구조의 완전한 불안정화를 초래할 수 있다.
복제 기원 또는 마커 유전자에 존재하는 서열과 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 사용이 특히 유리한데, 이유는 동일한 올리고뉴클레오타이드로, 복제 기원 또는 마커 유전자를 함유하는 임의 DNA를 정제할 수 있게 하기 때문이다. 따라서, 그 안에 인공의 특정 서열을 혼입시키기 위해서 플라스미드 또는 이중가닥 DNA를 반드시 변형시켜야 하는 것은 아니다.
비록 완전 상보 서열이 바람직하지만, 올리고뉴클레오타이드의 서열과 DNA에 존재하는 서열간에 약간의 미스매치는 용인될 수 있는 것으로 이해되며, 단 이들은 친화성의 지나치게 큰 손실을 초래하지 않는다. 이.콜라이 β-락타마제 유전자에 존재하는 서열 5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(서열번호 8)이 언급될 수 있다. 이 경우에, 폴리퓨린 서열을 중단시키는 티민이 세 번째 가닥의 구아닌에 의해 인식될 수 있고, 이에 따라 두 T*AT 트리플릿에 의해 플랭킹될 때 안정한 G*TA 트리플릿이 형성된다(Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
특정 양태에 따라, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 서열 (CCT)n, 서열 (CT)n 또는 서열 (CTT)n을 포함하고, n은 1 내지 15의 정수이다. 유형 (CT)n 또는 (CTT)n의 서열을 사용하는 것이 특히 유리하다. 출원인은 실제로, 정제 수율이 올리고뉴클레오타이드내 C의 양에 의해 영향받았음을 보여주었다. 특히, 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드가 좀더 적은 수의 사이토신을 함유할 때 정제 수율은 증가한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 또한 (CCT), (CT) 또는 (CTT) 단위를 조합할 수 있는 것으로 이해된다.
사용되는 올리고뉴클레오타이드는 천연 상태이거나(비변형된 천연 염기로 구성) 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 특히, 올리고뉴클레오타이드는 유리하게는, 뉴클레아제에 대한 이의 내성 또는 이로부터의 보호, 또는 특이적 서열에 대한 이의 친화성이 증가될 수 있게 하는 특정의 화학적 변형을 보유한다.
본 발명에 따라, 올리고뉴클레오타이드는 또한, 뉴클레아제에 더욱 내성을 띠도록 하는 목적으로 골격의 변형을 겪은 뉴클레오사이드의 연결된 연속체를 의미하는 것으로 이해된다. 가능한 변형으로는, DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 포스포로티오에이트(Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), 및 포름아세탈 또는 메틸포스포네이트 골격을 보유하는 올리고뉴클레오타이드(Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768)가 언급될 수 있다. 또한 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드의 α 아노머 로 합성된 올리고뉴클레오타이드도 사용할 수 있다(Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). 골격의 또다른 변형은 포스포라미데이트 결합이다. 예를 들면, DNA와 특별히 안정한 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 부여하는, Gryaznov 및 Chen에 의해 기술된 N3′-P5′뉴클레오타이드간 포스포라미데이트 결합(J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144)이 언급될 수 있다. 골격의 다른 변형으로는, 2′-O-메틸리보스, 포스포디에스테르 등의 리보뉴클레오타이드의 사용(Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144)도 언급될 수 있다. 마지막으로, 또한 삼중나선을 형성할 수 있는, PNA(펩타이드 핵산)에서와 같은 폴리아미드 골격에 의해(Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481), 또는 DNG(데옥시리보뉴클레익 구아니딘, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101)에서와 같이 구아니딘-기본 골격에 의해, 또는 또한 삼중나선을 형성하는 DNA의 폴리 양이온성 동족체에 의해 대치될 수 있다.
세 번째 가닥의 티민 또한 DNA에 대한 올리고뉴클레오타이드의 친화성을 증가시키는 5-브로모우라실에 의해 대치될 수 있다(Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). 세 번째 가닥은 또한 비천연 염기를 함유할 수 있으며, 이러한 염기로는 7-데아자-2′-데옥시크산토신(Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-메틸-5-아미노-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(Koh and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-옥소아데닌, 2-아미노퓨린, 2′-O-메틸슈도이소시티딘, 또는 당업자에 공지된 여타 변형(검토를 위해 Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356)이 언급될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 변형의 또다른 유형은 좀더 구체적으로는, 올리고뉴클레오타이드와 특이적 서열 간의 상호작용 및/또는 친화성을 향상시키는 데 목적이 있다. 특히, 본 발명에 따른 가장 유리한 변형은 올리고뉴클레오타이드의 사이토신 메틸화에 있다(실시예 5 참조). 이렇게 메틸화된 올리고뉴클레오타이드는 중성에 더 가까운 pH 범위에서(≥5) 특이적 서열과 안정한 삼중나선을 형성하는 주목할 만한 특성을 보인다. 따라서, 이는 종래기술의 올리고뉴클레오타이드보다 더 높은 pH 값에서, 즉 플라스미드 DNA의 분해 위험이 훨씬 적은 pH 값에서 작업할 수 있게 해준다.
본 발명의 방법에 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 길이는 적어도 3 염기, 바람직하게는 5 내지 30 염기이다. 10 염기보다 큰 길이의 올리고뉴클레오타이드가 유리하게 사용된다. 길이는 상호작용의 목적하는 선택성과 안정성에 맞도록 각각의 개별 경우에 대해 당업자에 의해 변용될 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 임의의 공지 기술에 의해 합성될 수 있다. 특히, 이들은 핵산 합성기에 의해 제조될 수 있다. 당업자에 공지된 여타 방법도 매우 자명하게 사용될 수 있다.
지지체와의 공유 커플링을 허용하기 위해, 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 작용화된다. 따라서, 티올, 아민 또는 카복실 말단 그룹에 의해 5′또는 3′위 치에서 변형시킬 수 있다. 특히, 티올, 아민 또는 카복실 그룹의 첨가는 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드를 디설파이드, 말레이미드, 아민, 카복실, 에스테르, 에폭사이드, 시아노겐 브로마이드 또는 알데하이드 작용기를 지닌 지지체에 커플링시킬 수 있게 한다. 이러한 커플링은 올리고뉴클레오타이드와 지지체 간의 디설파이드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 결합에 의해 형성된다. 예를 들먼, 이작용성 커플링 시약 같은 당업자에 공지된 여타의 방법이 이용될 수 있다.
또한, 커플링된 올리고뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 향상시키기 위해서는,올리고뉴클레오타이드가 염기의 "아암" 및 "스페이서" 서열을 함유하는 것이 유리할 수 있다. 아암의 사용은 사실상, 지지체로부터 선택된 거리에 올리고뉴클레오타이드를 결합시킬 수 있게 하여, DNA와의 상호작용 조건을 향상시킬 수 있게 된다. 아암은 유리하게는 1 내지 18, 바람직하게는 6 또는 12 (CH2) 그룹을 포함하는 선형 탄소쇄, 및 칼럼에의 결합을 허용하는 아민으로 이루어진다. 아암은 올리고뉴클레오타이드의 또는 하이브리드화를 방해하지 않는 염기로 구성된 "스페이서"의 포스페이트에 결합된다. 따라서, "스페이서"는 퓨린 염기를 포함할 수 있다. 일례로서, "스페이서"는 서열 GAGG를 포함할 수 있다. 아암은 유리하게는 6 또는 12개의 탄소 원자를 포함하는 선형 탄소쇄로 이루어진다.
본 발명의 이행을 위해, 상이한 유형의 지지체가 사용될 수 있다. 이들은 칼럼에 미리 패킹되거나 또는 그 상태로 작용화된 크로마토그래피 지지체, 작용화된 플라스틱 표면 또는 작용화된 라텍스 비드, 마그네틱 또는 그 반대일 수 있다. 크 로마토그래피 지지체가 바람직하게 사용된다. 일례로, 사용될 수 있는 크로마토그래피 지지체는 예를 들면, 아가로스, 아크릴아미드 또는 덱스트란 및 이들의 유도체(예를 들면, 세파덱스, 세파로스, 수퍼로스 등), 폴리(스티렌/디비닐벤젠) 같은 중합체, 또는 그래프트 또는 비-그래프트 실리카이다. 크로마토그래피 칼럼은 확산 또는 관류 모드로 작동될 수 있다.
좀더 양호한 정제 수율을 달성하기 위하여, 플라스미드 상에, 올리고뉴클레오타이드와의 여러 하이브리드화 위치를 함유하는 서열을 사용하는 것이 특히 유리하다. 여러 하이브리드화 위치의 존재는 사실상, 서열과 올리고뉴클레오타이드간의 상호작용을 촉진하여, 정제 수율의 향상을 이끌게 된다. 따라서, (CCT), (CT) 또는 (CTT) 모티프의 n개 반복체를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 적어도 n개의 상보 모티프, 바람직하게는 n+1개의 상보 모티프를 함유하는 DNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 n+1개의 상보 모티프를 운반하는 서열은 올리고뉴클레오타이드와의 두 하이브리드화 위치를 제공한다. 유리하게는, DNA 서열은 11개까지의 하이브리드화 위치, 즉 n+10개의 상보 모티프를 함유한다.
본 발명에 따른 방법은 임의 유형의 이중가닥 DNA 정제에 사용될 수 있다. 후자의 예는 일반적으로 치료적으로 중요한 하나 이상의 유전자를 운반하는, 플라스미드와 같은 환상 DNA이다. 이 플라스미드는 또한 복제 기원, 마커 유전자 등을 운반할 수 있다. 본 발명의 방법은 세포 용해물에 직접 적용될 수 있다. 이러한 양태에서, 형질전환에 의해 증폭되고 이어서 세포 배양된 플라스미드를 세포 용해 후 직접 정제한다. 본 발명의 방법은 또한, 투명한 용해물에, 즉 세포 용해물의 중화 및 원심분리 후에 수득된 상등액에도 적용될 수 있다. 매우 분명하게 공지의 방법으로 예비 정제된 용액에도 적용될 수 있다. 이 방법은 또한 상이한 서열의 DNA를 포함하는 혼합물로부터 중요한 서열을 운반하는 선형 또는 환상 DNA의 정제를 가능하게 한다. 본 발명에 따른 방법은 또한 이중가닥 DNA의 정제에도 이용될 수 있다.
세포 용해물은 원핵생물 또는 진핵생물 세포의 용해물일 수 있다.
원핵생물 세포로는 박테리아 이.콜라이, B.서브틸리스, S.티피무리움 또는 스트렙토마이시즈가 예로 언급될 수 있다. 진핵생물 세포로는, 동물세포, 효모, 진균 등이 언급될 수 있고, 좀더 구체적으로는 클루이베로마이시즈 또는 사카로마이시즈 효모 또는 COS, CHO, C127, N1H3T3 등의 세포를 들 수 있다.
본 발명의 방법은 매우 높은 순도의 플라스미드 DNA를 신속하고 간단하게 수득될 수 있도록 해주기 때문에 특히 유리하다. 특히, 실시예에 예시되는 바와 같이, 이러한 방법은 당해 플라스미드 DNA를 단편상태의 염색체 DNA, 내독소, 단백질, 뉴클레아제 등과 같은 오염 성분으로부터 효과적으로 분리될 수 있게 해준다. 좀더 구체적으로는, 본 발명의 방법은 염색체 DNA 함량이 0.5% 이하인, 특히 플라스미드 기원의 이중가닥 DNA의 제조가 달성될 수 있게 해준다. 좀더 바람직하게는, 수득된 DNA 제제는 염색체 DNA 함량이 0.2% 이하이다. 본 발명은 따라서, 특히 유전자 또는 세포 요법에 약학적으로 사용될 수 있는 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물을 설명한다. 이와 관련하여, 본 발명의 주제는 또한, 전술한 방법에 따라 제조된, 선형의 또는 플라스미드 기원의 이중가닥 DNA를 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명은 또한 0.5% 이하, 바람직하게는 0.2% 이하, 좀더 바람직하게는 0.1% 이하, 한층 더 바람직하게는 0.01% 이하의 염색체 DNA 함량을 갖는 플라스미드 DNA 제제에 관한 것이다. 후술되는 바와 같이, 트리플렉스 친화성 상호작용 단계가 정제 과정 중 전통적인 크로마토그래피 단계의 다운스트림에 혼입된다. 이러한 친화성 단계는 초기 순도가 어찌되든 간에 플라스미드 제제의 순도를 상당히 향상시킨다. 올리고뉴클레오타이드(크로마토그래피 지지체에 공유 결합)와 정제될 당해 플라스미드 간의 트리플렉스 구조의 형성은 올리고뉴클레오타이드와 트리플렉스 구조를 형성할 수 있는 서열의 플라스미드상에의 존재에 의존한다. 이러한 트리플렉스 구조는 산성 pH에서만 안정하며, 올리고뉴클레오타이드의 사이토신은 양성자화된다. 이어서, 플라스미드 DNA는 단순히 pH를 중성으로 상승시킴으로써 칼럼에서 용출된다.
조성물은 "네이키드"이거나 또는 리포솜, 나노입자, 양이온 지질, 중합체, 재조합 바이러스 또는 단백질 등과 같은 수송 캐리어와 조합되는 플라스미드 DNA를 함유할 수 있다.
일 양태로서, 본 발명에 따른 방법은 상이한 유형과 서열의 둘 이상의 이중가닥 DNA를 포함하는 혼합물로부터 이중가닥 DNA의 한 유형을 정제하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 세포 용해물에 직접 적용될 수 있으며, 여기에서 세포 배양을 통해 증폭된 이중가닥 DNA는 배양 세포를 용해시킨 후 정제된다. 이 방법은 또한, 투명한 용해물, 즉 세포 용해물의 중화 및 원심분리 후 수득된 상등액에도 적용될 수 있다. 방법은 또한 예비 정제된 용액에도 적용될 수 있다.
좀더 정확하게는, 제 1 및 제 2 이중가닥 DNA를 함유하는 용액으로부터 제 1 이중가닥 DNA를 정제하는 방법은 (i)용액을 특이적 서열과의 하이브리드화에 의해 제 2 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 공유 커플링된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 지지체에 통과시키고, (ii)결합되지 않은 제 1 이중가닥 DNA로 풍부해지게 될 제 1 지지체를 통과하는 용액을 회수한 다음, (iii)회수된 용액을 제 1 이중가닥 DNA의 특이적 서열과의 하이브리드화에 의해 삼중나선을 형성할 수 있는 공유 결합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 지지체에 통과시키는 단계를 포함한다. 임의 세척 단계 뒤에, 제 1 이중가닥 DNA가 제 2 지지체로부터 용출될 수 있다. 이러한 이중 정제법을 이용하여, 제 1 이중가닥 DNA는 제 2 이중가닥 DNA의 검출 가능한 수준 없이 제 2 지지체로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 제 1 이중가닥 DNA 분자는 서열 5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(서열번호 30)를 갖는 올리고뉴클레오타이드와 안정한 트리플렉스 구조를 형성하는, 특이적 서열 5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′(서열번호 29)를 갖는 pCOR 플라스미드이다. 제 2 이중가닥 DNA 분자는 서열 5′-TCTTTTTTTCCT-3′(서열번호 28)를 갖는 올리고뉴클레오타이드와 트리플렉스를 형성하는, 특이적 서열 5′-AGAAAAAAAGGA-3′(서열번호 27)을 갖는 ColE1-유래 플라스미드이다. 따라서, pCOR 플라스미드는 본 발명에 따른 이중 정제법을 사용함으로써 ColE1-유래 플라스미드와 같은 다른 플라스미드를 함유하는 용액으로부터 유리하게 정제된다.
또한, 본원발명은 디올-잔기를 함유하는 수지를 포함하는 이중가닥 DNA 정제용 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 상기 수지의 디올 잔기를 나트륨 m-페리오데이트로 산화시킴에 의해 활성화시키고, 및 (b) 아스코브산의 존재하에 환원성 아민화에 의하여 올리고뉴클레오타이드를 지지체의 잔기에 커플링시키는 것으로 이루어진 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 28 및 서열번호 30의 서열로부터 선택되는 피리미딘-풍부 서열을 포함하고, 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥 DNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과의 하이브리드화에 의해 비-정규 트라이애드(non-canonical triad)의 형성없이 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있다.
나아가, 본원발명은 지지체에 올리고뉴클레오타이드를 공유결합시키는 단계를 포함하는 이중가닥 DNA 정제용 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드를 지지체와 공유결합시켜 지지체의 잔기를 활성화시키는 단계, 및 활성화된 잔기를 올리고뉴클레오타이드와 접촉시켜 올리고뉴클레오타이드와 지지체의 잔기간에 공유 결합을 수득하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드가 서열 TCTTTTTTTCCT(서열번호 28) 또는 TTCTTTTTTTTCTT(서열번호 30)으로 부터 선택된 피리미딘-풍부 서열을 포함하고, 이중가닥 DNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과의 하이브리드화에 의해 비-정규 트라이애드(non-canonical triad)의 형성없이 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있다. 또한, 상기 지지체는 히드록실 잔기를 포함하는 수지를 포함하며, 히드록실 잔기는 N-하이드록시석신이미드와의 에스테르화에 의해 활성화되고, 활성화된 잔기와 올리고뉴클레오타이드와의 접촉에 의해 올리고뉴클레오타이드와 지지체의 잔기와의 공유결합 아미드 커플링이 생성될 수 있다.
또한, 본원발명은 디올-잔기를 함유하는 수지를 포함하는 이중가닥 DNA 정제용 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 상기 수지의 디올 잔기를 나트륨 m-페리오데이트로 산화시킴에 의해 활성화시키고, 및 (b) 아스코브산의 존재하에 환원성 아민화에 의하여 올리고뉴클레오타이드를 지지체의 잔기에 커플링시키는 것으로 이루어진 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 28 및 서열번호 30의 서열로부터 선택되는 피리미딘-풍부 서열을 포함하고, 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥 DNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과의 하이브리드화에 의해 비-정규 트라이애드(non-canonical triad)의 형성없이 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있다.
나아가, 본원발명은 지지체에 올리고뉴클레오타이드를 공유결합시키는 단계를 포함하는 이중가닥 DNA 정제용 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드를 지지체와 공유결합시켜 지지체의 잔기를 활성화시키는 단계, 및 활성화된 잔기를 올리고뉴클레오타이드와 접촉시켜 올리고뉴클레오타이드와 지지체의 잔기간에 공유 결합을 수득하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드가 서열 TCTTTTTTTCCT(서열번호 28) 또는 TTCTTTTTTTTCTT(서열번호 30)으로 부터 선택된 피리미딘-풍부 서열을 포함하고, 이중가닥 DNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과의 하이브리드화에 의해 비-정규 트라이애드(non-canonical triad)의 형성없이 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있다. 또한, 상기 지지체는 히드록실 잔기를 포함하는 수지를 포함하며, 히드록실 잔기는 N-하이드록시석신이미드와의 에스테르화에 의해 활성화되고, 활성화된 잔기와 올리고뉴클레오타이드와의 접촉에 의해 올리고뉴클레오타이드와 지지체의 잔기와의 공유결합 아미드 커플링이 생성될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로 좀더 상세하게 설명되겠지만, 예시에 불과하며 이로써 제한되지는 않는다.
클로닝 및 분자 생물학의 일반 기술
제한효소에 의한 분해, 겔 전기영동, 이.콜라이에서의 형질전환, 핵산의 침전 등과 같은 분자 생물학의 전통적인 방법이 문헌(Maniatis et al., T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F.M., R. Brent. R.E. Kinston, D.D. Moore. J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York)에 기술되어 있다. 뉴클레오타이드 서열은 이미 반포된 프로토콜(Ausubel et al., 1987)에 따른 쇄 종결법에 의해 측정된다.
제한효소는 New England Biolabs, Beverly, MA(Biolabs)에 의해 공급된다.
연결을 수행하기 위해, DNA 단편을 파지 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP를 포함하는 완충제에서 배양시킨다.
올리고뉴클레오타이드는 제조업자의 권장에 따라 Biosearch 8600 자동 DNA 합성기로 시아노에틸 그룹에 의해 β위치에서 보호된 포스포라미다이트(Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus and H. Koster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII; Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N- morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J.W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.)로 포스포라미다이트 화학작용을 이용하여 합성된다.
연결된 DNA 또는 형질전환 효능에 대해 시험될 DNA를 사용하여 컴피턴트하게 만든 하기 균주를 형질전환시킨다:
이.콜라이 DH5α[F/endA1, hsdR17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, Δ(lacZYA-arqF)U169, deoR, Φ80dlac(lacZΔM15)](임의의 Col E1 플라스미드에 대해); 또는 이.콜라이 XAC-pir(임의 pCor-유래 플라스미드에 대해).
플라스미드 DNA의 미니 제조물을 Klein 등(1980)의 프로토콜에 따라 만든다.
이.콜라이 균주의 증식에 LB 배양 배지를 사용한다(Maniatis et al., 1982). 균주를 37℃에서 배양한다. 박테리아를 적당한 항생물질로 보충한 LB 배지의 디쉬에 플레이팅한다.
실시예 1
1.1. 칼럼의 제조
장비
사용되는 칼럼은 연동펌프(출력＜1 ml/분)에 연결된 NHS(N-하이드록시석신이미드, Pharmacia)로 활성화된 1 ml HiTrap 칼럼이다. 사용되는 특이적 올리고뉴클 레오타이드는 5′말단에 NH2 그룹을 보유하며, 이의 서열은 다음과 같다:
5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(서열번호 1)
본 실시예에서 사용된 완충제는 다음과 같다:
커플링 완충제: 0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
완충제 A: 0.5 M 에탄올아민, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
완충제 B: 0.1 M 아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 4.
방법:
칼럼을 6 ml의 1 mM HCl로 세척한 다음, 커플링 완충제에 희석된 올리고뉴클레오타이드(1 ml중 50 nmol)를 칼럼에 적용하고 30분간 실온에서 방치한다. 칼럼을 6 ml의 완충제 A 및 이어서 6 ml의 완충제 B로 연속해서 3회 세척한다. 이에 따라 올리고뉴클레오타이드가 CONH 결합을 통해 칼럼에 공유 결합된다. 칼럼은 PBS, 0.1% NaN3 중 4℃에서 보관되며 적어도 4회 사용될 수 있다.
1.2. 플라스미드의 작제
하기 두 올리고뉴클레오타이드를 합성한다.
올리고뉴클레오타이드 4817:
5′-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3′(서열번호 9)
올리고뉴클레오타이드 4818:
5′-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG(서열번호 10)
전술한 바와 같이, 이들 올리고뉴클레오타이드는 하이브리드화되어 플라스미드에 클로닝되었을 때, 호모퓨린-호모피리미딘 서열(GAA)17(서열번호 33)을 상응하는 플라스미드 중으로 도입한다.
이들 두 하이브리드화 올리고뉴클레오타이드에 상응하는 서열을, 앰피실린-내성 유전자를 운반하는 플라스미드 pBKS+(Stratagene Cloning System, La Jolla CA)의 다른 클로닝 부위에 클로닝시킨다. 이것 때문에, 올리고뉴클레오타이드를 하기 방법으로 하이브리드화시킨다: 이들 두 올리고뉴클레오타이드 1 ㎍을 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2를 포함하는 최종 완충제 40 ml에 넣는다. 이 혼합물을 95℃로 가열하고 이어서 온도가 서서히 떨어지도록 실온에 둔다. 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드의 혼합물 10 ng을 최종 30 ㎕로 BamHI 및 EcoRI로 분해시킨 플라스미드 pBKS+(Stratagene Cloning System, La Jolla CA) 200 ng으로 연결시킨다. 연결 후, 1 분취량을 DH5a에 형질전환시킨다. 형질전환 혼합물을 앰피실린(50 mg/l) 및 X-gal(20 mg/l)로 보충한 L 배지에 플레이팅한다. 재조합 클론은 이.콜라이 β-갈락토시다제의 단편 ω의 α-상보화를 허용하는 모 플라스미드(pBKS+)와는 상반되게, 이 배지상에서 청색의 부재를 보여야 한다. 6개의 클론으로부터 플라스미드 DNA의 미니 제조 후, 이들 모두는 pBKS+의 EcoRI 부위와 BamHI 부위 사이에 위치한 PstI 부위의 소멸, 및 다중 클로닝 부위를 함유하는 448-bp PvuII 밴드의 분자량 증가를 보였다. 1개의 클론을 선택하여 상응하는 플라 스미드를 pXL2563으로 지칭한다. 클로닝된 서열은 플라스미드 pBKS+(Stratagene Cloning System, La Jolla CA)에 대해 프라이머-20(5′-TGACCGGCAGCAAAATG-3′(서열번호 11))(Viera J. and J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268)를 사용하여 서열분석함으로써 증명된다. 플라스미드 pXL2563를 공급업자의 권장에 따라 Wizard Megaprep kit(Promega Corp. Madison, WI)에 의거하여 정제한다. 이 플라스미드 DNA 제제를 후술되는 실시예에 사용한다.
1.3. 플라스미드 정제
장비
플라스미드 pXL2563(1.2에서 설명)를 또한 플라스미드 pBKS+를 함유하는 용액으로부터, 1.1에 기술된, 올리고뉴클레오타이드에 커플링된 HiTrap 칼럼상에서 정제한다. 이러한 정제과정에 사용된 완충제는 다음과 같다:
완충제 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5 내지 5.
완충제 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
방법:
칼럼을 6 ml의 완충제 F로 세척하고, 플라스미드(400 ㎕의 완충제 F중의 20 ㎍ pXL2563 및 20 ㎍ pBKS+)를 칼럼에 적용한 다음 2시간 동안 실온에서 배양한다. 칼럼을 10 ml의 완충제 F로 세척한 다음 완충제 E로 용출시킨다. 1% 아가로스 겔상에서의 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색 후에 플라스미드가 검출되었다. 용액 중의 플라스미드의 비율은 이.콜라이 상에서 이의 형질전환 활성을 측정함으로써 평가된다.
결과:
pXL2563 30% 및 pBKS+ 70%를 함유하는 혼합물을 출발물질로 하여, pXL2563 100%를 함유하는 용액을 칼럼 배출구에서 회수한다. 260 및 280 nm에서 OD비에 의해 평가된 순도는 1.9에서 2.5로 상승하며, 이는 오염 단백질이 상기 방법에 의해 제거됨을 나타낸다.
실시예 2
2.1. - 본 실시예는 플라스미드 DNA 정제 실험을 설명한다. 칼럼에 올리고뉴클레오타이드(5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(서열번호 1)의 커플링은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행된다. 커플링을 위해, 올리고뉴클레오타이드를 6개의 탄소 원자를 함유하는 아암에 의해 스페이서의 포스페이트에 결합된 아민 그룹으로 5′ 말단에서 변형시킨다(Modified oligonucleotide Eurogentec SA, 벨기에). 플라스미드 pXL2563를 공급업자의 권장에 따라 Wizard Megaprep 키트(Promega Corp., Madison, WI)를 사용하여 정제한다. 본 실시예에 사용된 완충제는 다음과 같다:
완충제 F: 0-2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5 내지 5.
완충제 E: 1 M 트리스-HCl pH 9, 0.5 mM EDTA.
칼럼을 6 ml의 완충제 F로 세척한 다음, 400 ㎕의 완충제 F에 희석된 100 ㎍의 플라스미드 pXL2563를 칼럼에 적용하고 2시간 동안 실온에서 배양시킨다. 칼럼을 10 ml의 완충제 F로 세척하고 이어서 완충제 E로 용출시킨다. 플라스미드를 260 nm에서의 광학밀도를 측정함으로써 정량한다.
본 실시예에서, 결합은 NaCl에 대한 몰농도가 0 내지 2 M로 변하는 완충제(완충제 F)에서 수행된다. NaCl의 몰농도가 떨어질 때 정제 수율은 감소한다. 결합 완충제의 pH는 4.5 내지 5로 다양할 수 있으며, 정제 수율은 4.5에서 더 양호하다. 또한, 염기성 pH의 또다른 용출 완충제를 사용할 수도 있으며: 용출은 따라서 50 mM 보레이트, pH 9, 0.5 mM EDTA를 포함하는 완충제로 수행된다.
2.2. - 칼럼에 올리고뉴클레오타이드(5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(서열번호 1)의 클로닝을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 플라스미드 pXL2563을 공급업자의 권장에 따라 Wizard Megaprep 키트(Promega Corp., Madison, WI)를 사용하여 정제한다. 본 실시예에 사용된 완충제는 다음과 같다:
완충제 F: 0.1 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 5.
완충제 E: 1 M 트리스-HCl pH 9, 0.5 mM EDTA.
칼럼을 6 ml의 완충제 F로 세척하고, 400 ㎕ 완충제 F에 용해된 100 ㎍의 플라스미드 pXL2563을 칼럼에 적용한 다음 1시간 동안 실온에서 배양시킨다. 칼럼을 10 ml의 완충제 F로 세척하고 이어서 완충제 E로 용출시킨다. 올리고뉴클레오타이드 칼럼 통과 전 및 통과 후 플라스미드 샘플에 존재하는 게놈 또는 염색체 이.콜라이 DNA의 함량을 측정한다. 이러한 게놈 DNA를 이.콜라이 galK 유전자 중의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 정량한다. 하기 프로토콜에 따라: 이들 프라이머의 서열이 Debouck 등(Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841-1853)에 의해 기술된다:
5′-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3′(서열번호 24) 및 5′-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3′(서열번호 25).
반응 매질은 25 ㎕의 PCR 완충제(Promega France, Charbonnieres)에: 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dXTP(Pharmacia, Orsay); 0.5 μM 프라이머; 20 U/ml Taq 폴리머라제(Promega)를 포함한다. 반응은 하기 순서에 따라 실행된다:
- 95℃에서 5분
- 95℃에서 10초
60℃에서 30초
78℃에서 1분간의 30 사이클
- 78℃에서 10분
길이가 124 염기쌍인 증폭된 DNA 단편을 SybrGreen I(Molecular Probes, Eugene, USA)의 존재하에 3% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분리한 다음, 이.콜라이 균주 B(Sigma, ref D4889)로부터 Ultrapur 게놈 DNA 시리즈를 참조로 하여 정량한다.
칼럼에 적용된 샘플에 염색체 DNA 1% 및 올리고뉴클레오타이드 칼럼상에서 정제된 샘플에 0.2% 존재한다.
실시예 3: 투명한 용해물에 대한 실험
본 실시예는 소위 말하는 "miniprep" 스케일에서, 박테리아 배양액의 투명한 용해물로부터 플라스미드 DNA 정제를 설명한다: 플라스미드 pXL2563을 함유하는 DH5α균주의 철야 배양액 1.5 ml를 원심분리하고, 펠릿을 100 ㎕의 50 mM 글루코 스, 25 mM 트리스-HCl, pH 8, 10 mM EDTA에 재현탁시킨다. 200 ㎕의 0.2 M NaOH, 1% SDS를 가하고, 튜브를 뒤집어 혼합한 다음, 150 ㎕의 3 M 칼륨 아세테이트, pH 5를 가하고 튜브를 뒤집어 혼합한다. 원심분리 후에 상등액을 회수하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득한 올리고뉴클레오타이드 칼럼에 로딩한다. 결합, 세척 및 용출은 실시예 1에서 기술한 것들과 동일하다. 대략 1 ㎍의 플라스미드를 1.5 ml의 배양액으로부터 회수한다. 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색으로 분석한 수득된 플라스미드는 "수퍼코일된" 환상 DNA의 단일 밴드 형태를 취한다. 이러한 방법으로 정제된 플라스미드에서는 고분자량(염색체) DNA 또는 RNA의 어떠한 흔적도 검출 불가였다. 260 및 280 nm에서 광학밀도의 비는 2보다 크다.
실시예 4
4.1: 본 실시예는 플라스미드 pXL2563을 함유하는 DH5α균주의 20 ml 박테리아 배양액을 출발물질로 하여, 실시예 3에서와 동일한 조건하에서 수행한 플라스미드 DNA 정제 실험을 설명한다. 세포 펠릿을 1.5 ml의 50 mM 글루코스, 25 mM 트리스-HCl, pH 8, 10 mM EDTA에 취한다. 2 ml의 0.2 M NaOH, 1% SDS로 용해시키고, 1.5 ml의 3 M 칼륨 아세테이트, pH 5로 중화시킨다. 이어서, DNA를 3 ml의 2-프로판올로 침전시키고, 펠릿을 0.5 ml의 0.2 M 나트륨 아세테이트, pH 5, 0.1 M NaCl에 취한 다음 실시예 1에서 기술한 바와 같이 수득한 올리고뉴클레오타이드 칼럼에 로딩한다. 결합, 칼럼의 세척 및 용출은 세척 완충제의 경우 NaCl에 대해 이의 몰농도가 0.1 M인 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행된다. 대략 16㎍의 플라스미드 DNA가 수득된다. 수득되고 아가로스 겔 전기영동과 에티듐 브로마 이드 염색에 의해 분석된 플라스미드는 "수퍼코일된" 환상 DNA의 단일 밴드 형태를 취한다. 정제된 플라스미드에서 고분자량(염색체) DNA 또는 RNA의 어떠한 흔적도 검출 불가이다. 플라스미드를 제한효소로 분해하면 3 킬로베이스의 예상된 분자량에서 단일 밴드를 부여한다. 샘플내 단백질 농도는 투명한 용해물내 125 ㎍/ml에서 정제 플라스미드내 1 ㎍/ml로 떨어진다(Micro-BCA 분석, Pierce). LAL 분석(Biosepra)에 의해 평가된 내독소 농도를 출발물질인 투명한 용해물에 대해, 정제된 플라스미드에서 10보다 큰 계수로 나눈다.
4.2: 사용된 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터를 함유하는 카세트, 루시퍼라제 암호화 유전자 및 플라스미드 pXL2563으로부터 기원하는 호모퓨린-호모피리미딘 서열(GAA)17(서열번호 33)을 함유한다. 이러한 플라스미드를 함유하는 균주 DH1(Maniatis et al., 1989)을 7 리터들이 발효조에서 배양한다. 투명한 용해물이 200 그램의 세포로부터 제조되며; 세포 펠릿을 2 리터의 25 mM 트리스, pH 6.8, 50 mM 글루코스, 10 mM EDTA에 취하며, 여기에 2 리터의 0.2 M NaOH, 1% SDS를 가한다. 1 리터의 3 M 칼륨 아세테이트를 첨가하여 용해물을 중화시킨다. 투석여과 후, 이 용해물 4 ml를 실시예 1.1에 기술된 방법에 따라, 서열 5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(서열번호 1)의 올리고뉴클레오타이드에 커플링된 5 ml HiTrap-NHS 칼럼에 적용한다. 세척 및 용출을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 대략 400 ㎍의 플라스미드가 회수된다. 실시예 2.2에 기재된 기술로 측정한, 이 샘플내 게놈 DNA의 수준은 0.1%이다.
실시예 5: 변형 올리고뉴클레오타이드의 사용
본 실시예는 메틸화 사이토신을 지닌 올리고뉴클레오타이드의 사용을 설명한다. 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같다: 5′-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCCTMeCTT
MeCTT-3′(서열번호 12).
이 올리고뉴클레오타이드는 5′말단에 NH2 그룹을 보유한다. MeC = 5-메틸사이토신. 이 올리고뉴클레오타이드는 pH 5의 결합 완충제로 실시예 1의 조건하에서 플라스미드 pXL2563이 정제될 수 있게 한다(이에 따라 플라스미드의 분해 위험이 감소된다).
실시예 6
상기 실시예에서, 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 6개의 탄소 원자를 함유하는 아암: NH2-(CH2)6을 통해 포스페이트에 결합된 아민 그룹으로 5′말단에서 변형된다. 본 실시예에서, 아민 그룹은 12개의 탄소 원자를 함유하는 아암: NH2-(CH2)12을 통해 5′말단의 포스페이트에 결합된다.
올리고뉴클레오타이드의 커플링 및 칼럼에의 통과는 완충제 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5로 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 더 양호한 정제 수율을 구축할 수 있게 한다: 53% 수율이 수득되며, 반면에 6개의 탄소 원자를 함유하는 올리고뉴클레오타이드로는, 이 수율은 동일한 조건하에서의 45% 정도이다.
실시예 7
실시예 1.2에 기술된 클로닝 전략에 따라, 호모퓨린-호모피리미딘 서열을 운반하는 또다른 두 플라스미드를 작제한다: 서열 (GGA)16(서열번호 34)를 함유하는 플라스미드 pXL2725 및 서열 (GA)25(서열번호 35)를 함유하는 플라스미드 pXL2726.
실시예 7.1: 플라스미드의 작제
플라스미드 pXL2563과 유사한, 플라스미드 pXL2725 및 pXL2726을 하기의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 실시예 1.2에 기술된 클로닝 전략에 따라 작제한다:
5986: 5′-GATCC(GA)25GGG-3′(서열번호 13)
5987: 5′-AATTCCC(TC)25G-3′(서열번호 14)
5981: 5′-GATCC(GGA)17GG-3′(서열번호 15)
5982: 5′-AATT(CCT)17CCG-3′(서열번호 16)
pBKS+(Stratagene Cloning System, La Jolla CA)의 BamHI 및 EcoRI 부위에 올리고뉴클레오타이드를 클로닝함으로써 플라스미드 pXL2726를 작제하는 데 올리고뉴클레오타이드쌍 5986 및 5987를 사용하고, 반면에 플라스미드 pXL2725의 작제에는 올리고뉴클레오타이드 5981 및 5982를 사용한다. 플라스미드 pXL2563의 작제에서와 동일한 실험 조건이 사용되며, 단지 올리고뉴클레오타이드쌍만이 변경되었다. 마찬가지로, 클로닝된 서열을 플라스미드상에서의 서열분석에 의해 증명한다. 이는 플라스미드 pXL2725가 예상된 서열에 대해 변형을 보유함을 알 수 있게 해주었다: 17회 반복된 서열 GGA 대신에, GGAGA(GGA)15(서열번호 17)이 존재한다.
실시예 7.2: 칼럼의 제조 및 정제
이들 호모퓨린 서열과 삼중나선을 형성하는 올리고뉴클레오타이드를 실시예 1.1에 설명된 기술에 따라 HiTrap 칼럼에 커플링시킨다. 서열 5′-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3′(서열번호 18)의 올리고뉴클레오타이드를 플라스미드 pXL2725의 정제에 사용하고 서열 5′-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(서열번호 19)의 올리고뉴클레오타이드는 플라스미드 pXL2726의 정제에 사용한다.
이렇게 수득된 두 칼럼은 상응하는 플라스미드를 하기 완충제로, 실시예 2에 설명된 기술에 따라 정제될 수 있게 해준다:
완충제 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.
완충제 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
수득된 수율은 각각 pXL2725 및 pXL2726에 대해 23% 및 31%이다.
실시예 8
본 실시예는 플라스미드에 존재하는 특정 서열의 길이가 정제 수율에 미치는 영향을 설명한다.
실시예 8.1: 플라스미드의 작제
본 발명 조성물의 활성을 증명하기 위해 이들 실험에 사용된 리포터 유전자는 루시퍼라제 암호화 유전자(Luc)이다.
플라스미드 pXL2621은 제한효소 MluI 및 HindIII로의 절단에 의해 pcDNA3(Invitrogen Corp., San Diego, CA)로부터 추출되고, 벡터 pGL 기본 벡터(Promega Corp., Madison, WI) 중으로, MluI 및 HindIII 부위에, 루시퍼라제 암호화 유전자의 업스트림에 클로닝된, 661-bp 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 함유하는 카세트를 함유한다. 이 플라스미드는 분자 생물학의 표준기술을 이용하여 작제된다.
플라스미드 pXL2727-1 및 pXL2727-2를 하기 방식으로 작제한다;
플라스미드 pXL2621 2 ㎍를 BamHI으로 선형화한다; 효소는 10분간 65℃에서 처리하여 불활성화시키고; 동시에, 올리고뉴클레오타이드 6006 및 6008을 플라스미드 pXL2563의 작제에 대해 설명한 바와 같이 하이브리드화한다.
6006: 5′-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3′(서열번호 20)
6008: 5′-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3′(서열번호 21).
이 하이브리드화 혼합물을 플라스미드 pXL2621의 BamHI 말단에 클로닝하고, DH5α중으로 형질전환시킨 후, 올리고뉴클레오타이드가 PstI 부위를 도입하므로 재조합 클론을 PstI 효소 제한 분석에 의해 확인한다. 두 클론을 선발하고, 클로닝된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 서열분석 반응 프라이머로서 프라이머(6282, 5′-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3′(서열번호 22)를 사용하여 증명하였다(Viera J. and J. Messing, 1982. The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers, Gene 19:259- 268).
제 1 클론(pXL2727-1)은 10회 반복되는 서열 GAA를 함유한다. 두 번째(pXL2727-2)는 서열 5′-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3′(서열번호 23)를 함유한다.
실시예 8.2: 칼럼의 제조 및 정제
실시예 1에 기술되고, 올리고뉴클레오타이드 5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(서열번호 1)에 커플링되는 것과 같은 칼럼이 사용된다.
플라스미드 pXL2727-1은 서열 GAA의 14 반복체를 운반한다. 상응하는 하이브리드화 서열 CTT의 7 반복체만을 함유하는 전술한 올리고뉴클레오타이드는 따라서 8개의 상이한 위치에서 플라스미드와 하이브리드화될 수 있다. 이와 반대로, 플라스미드 pXL2727-2는 칼럼에 결합된 올리고뉴클레오타이드의 것과 동일한 길이의 하이브리드화 서열(GAA)7(서열번호 36)을 보유한다. 이 올리고뉴클레오타이드는 따라서 pXL2727-2상의 오직 1 위치에서만 하이브리드화될 수 있다.
실험은 하기 완충제를 사용하여, 실시예 2에 기술된 것과 동일하다:
완충제 F: 2M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.
완충제 E: 1M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
정제 수율은 플라스미드 pXL2727-1로는 29%, pXL2727-2로는 19%이다.
실시예 8.3: 포유동물 세포의 시험관내 형질감염
사용되는 세포는 실험 전날에 웰당 50,000 세포로 24-웰 배양 플레이트에 접종한 NIH 3T3 세포이다. 플라스미드를 150 mM NaCl에 희석시키고 리포펙턴트 RPR115335와 혼합한다. 6에 해당하는 리포펙턴트 양전하/DNA 음전하비가 사용된다. 혼합물을 와동시키고, 실온에서 10분간 방치한 다음 태 송아지 혈청 없이 배지에 희석시킨 다음 세포에 배양 웰당 DNA 1 ㎍의 비율로 가한다. 37℃에서 두 시간 후, 10% 부피/부피의 태 송아지 혈청을 가하고 세포를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 48시간 동안 배양한다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 루시퍼라제 활성을 기술된 프로토콜(Promega kit, Promega Corp. Madison, WI)에 따라 Lumat LB9501 루미노미터(EG and G Berthold, Evry) 상에서 측정한다. 실시예 8.2에 기술된 바와 같이 정제한 플라스미드 pXL2727-1은 Wizard Megaprep 키트(Promega Corp. Madison, WI)를 사용하여 정제한 동일한 플라스미드로 수득된 것들의 두 배만큼 큰 형질감염 수율을 제공한다.
실시예 9: pCOR-유래 플라스미드의 정제
하기 실시예는 삼중나선 친화성 크로마토그래피를 사용하는 pCOR-유래 플라스미드의 정제방법을 설명한다. 이 기술은 핵산 오염물(특히 숙주 게놈 DNA 및 RNA)을 통상적인 크로마토그래피법으로는 달성되지 않는 수준으로 낮게 제거하는 것으로 나타났다.
트리플렉스 친화성 겔은 크로마토그래피 매트릭스로서 세파크릴 S-1000 SF(Amersham-Pharmacia Biotech)를 사용하여 합성된다. 세파크릴 S-1000을 먼저 0.2 M 나트륨 아세테이트(pH 4.7) 중의 나트륨 m-페리오데이트(3 mM, 실온, 1h)로 활성화시킨다. 이어서, 단백질의 커플링에 대해 전술한 바와 같이 아스코브산(5 mM)의 존재하에 환원성 아민화에 의하여 올리고뉴클레오타이드를 이의 5′-NH2 말단 잔기를 통해 활성화 매트릭스의 알데하이드 그룹에 커플링시킨다(Hornsey et al., J. Immunol. Methods, 1986, 93, 83-88). 이들 실험에 사용된 호모피리미딘 올리고뉴클레오타이드(Eurogentec로부터, HPLC-정제)는 pCOR 플라스미드(Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482-1488)의 복제 기원(oriγ)에 존재하는 짧은 14량체 호모퓨린 서열(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(서열번호 29)에 상보적인 서열을 지닌다. 전술한 바와 같이, 호모피리미딘 올리고뉴클레오타이드의 서열은 5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(서열번호 30)이다.
하기 플라스미드를 크로마토그래피한다: pXL3296(트랜스진이 없는 pCOR, 2.0 kbp), pXL3179(pCOR-FGF, 2.4 kbp), pXL3579(pCOR-VEGFB, 2.5 kbp), pXL3678(pCOR-AFP, 3.7 kbp), pXL3227(pCOR-lacZ 5.4 kbp) 및 pXL3397(pCOR-B 결실 FVIII, 6.6 kbp). 모든 이들 플라스미드는 실시예 4에 기술된 바와 같이 수득된 투명한 용해물로부터 두 음이온-교환 크로마토그래피 단계에 의해 정제되었다. CsCl에서 초원심분리에 의해 정제된, 플라스미드 pBKS+(pBluescript II KS+, Stratagene), ColE1-유래 플라스미드도 또한 검토되었다. 사용된 모든 플라스미드는 이들의 수퍼코일된(＞95%) 위상 상태에 있었다.
각각의 플라스미드 DNA 정제 실험에서, 6 ml의 2 M NaCl, 0.2 M 칼륨 아세테이트(pH 5.0) 중의 플라스미드 DNA 300 ㎍을 전술한 올리고뉴클레오타이드 5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(서열번호 30)를 함유하는 친화성 칼럼상에 30 cm/h의 유량으로 로딩한다. 5 부피의 동일한 완충제로 칼럼을 세척한 후, 결합된 플라스미드를 1 M 트리스/HCl, 0.5 mM EDTA(pH 9.0)으로 용출시킨 다음 UV(260 nm) 및 Millipore Gen-Pak 칼럼(Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26-37)을 사용하는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정량한다. 수집된 분획내 플라스미드 회수량은 pXL3296에 대해 207 ㎍, pXL3179에 대해 196 ㎍, pXL3579에 대해 192 ㎍, pXL3678에 대해 139 ㎍, pXL 3227에 대해 97 ㎍, 및 pXL 3397에 대해 79 ㎍이었다.
pBKS를 상기 칼럼에서 크로마토그래피하였을 때 플라스미드 결합이 검출되지 않았다(＜3 ㎍). 이러한 결과는 올리고뉴클레오타이드 5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(서열번호 30)이 pCOR(oriγ)에 존재하는 상보적인 14량체 서열 5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′(서열번호 29)와는 안정한 트리플렉스 구조를 만들지만, pBKS에 존재하는 밀접하게 관련된 서열 5′-AGAAAAAAAGGA-3′(서열번호 27)과는 그러하지 않음을 시사한다. 이러한 점은 단일 비-정규 트라이애드(이 경우에는 T*GC)의 도입이 트리플렉스 구조의 완전한 불안정화를 초래함을 시사한다.
대조로서, 엄격하게 유사한 조건하에서, 그러나 올리고뉴클레오타이드 없이 합성된 블랭크 칼럼상에서 pXL3179를 크로마토그래피하였을 때 플라스미드 결합이 관찰되지 않았다(＜1 ㎍).
여기에 보고된 조건에서 이러한 친화성 정제 칼럼을 작동시킴으로써, 숙주 게놈 DNA에 의한 오염 수준이 pXL3296의 제조에 대해 2.6%에서 0.07%로 감소하였다. 마찬가지로, 숙주 DNA에 의한 오염 수준도 샘플을 동일한 친화성 칼럼을 통해 크로마토그래피하였을 때 pXL3179의 제조에 대해 0.5%에서 0.008%로 감소하였다. 또한, RNA에 의한 오염 수준도 이러한 친화성 정제 칼럼을 사용함으로써 pXL3179의 제조시 43% RNA에서 0.2% RNA로 대폭 감소하였다.
또한, 플라스미드 pXL3579 회수율은 친화성 칼럼상에서 올리고뉴클레오타이드 5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(서열번호 30)이 올리고뉴클레오타이드 5′-TTTTTTTTCTT-3′(서열번호 31)로 대치될 때 8% 미만이었다. 서열번호 31로 기재된 올리고뉴클레오타이드가 pXL3579내 VEGFB 서열의 일부(즉, ATG에 대해 뉴클레오타이드 379-389)와 상보적이지만, 유의미한 트리플렉스 친화성은 일어나지 않는다. 이러한 사실은 이 친화성 정제가 비-랜덤 호모퓨린-호모피리미딘 DNA 서열을 요함을 시사한다.
실시예 10: ColE1-유래 플라스미드의 정제
하기 실시예는 삼중나선 친화성 크로마토그래피를 사용하는 ColE1-유래 플라스미드의 정제를 설명한다. 이러한 기술은 핵산 오염물(특히 숙주 게놈 DNA 및 RNA)을 통상적인 크로마토그래피법으로는 달성되지 않는 수준으로 감소시키는 것으로 나타났다.
트리플렉스 친화성 겔은 실시예 9에 기술된 바와 같이 페리오데이트-산화 세파크릴 S-1000 SF 상에 서열 5′-TCTTTTTTTCCT-3′(서열번호 28)를 지닌 올리고뉴클레오타이드를 커플링함으로써 합성된다.
실시예 9에 기재한 조건에서 올리고뉴클레오타이드 5′-TCTTTTTTTCCT-3′(서열번호 28)을 함유하는 1-ml 칼럼상에서 플라스미드 pXL3296(트랜스진이 없는 pCOR) 및 pBKS, ColE1-유래 플라스미드를 크로마토그래피한다. 수집된 분획내 플라스미드 회수량은 pBKS에 대해서는 175 ㎍, pXL3296에 대해서는 ＜1 ㎍이었다. 이러한 사실은 올리고뉴클레오타이드 5′-TCTTTTTTTCCT-3′(서열번호 28)가 pBKS에 존재하는 상보적인 12량체 서열 (5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(서열번호 27)과는 안정한 트리플렉스 구조를 만들지만, pCOR에 존재하는 매우 밀접하게 관련된 12량체 서열(5 ′-AGAAAAAAAAGA-3′)(서열번호 32)과는 그러하지 않음을 시사한다. 이는 단일 비-정규 트라이애드(이 경우에는 C*AT)의 도입이 트리플렉스 구조의 완전한 불안정화를 초래할 수도 있음을 시사한다.
실시예 11: 이중-정제법
하기 실시예는 삼중나선 친화성 크로마토그래피를 이용하여, pBSK와 같은 또다른 수퍼코일된 이중가닥 분자를 함유하는 혼합물에서, pXL3296 같은 수퍼코일된 이중가닥 DNA 분자의 정제를 설명한다. 두 이중가닥 DNA 분자 모두 유사한 크기를 지닐 수 있지만, 각각의 DNA 분자는 상이한 표적 서열과 삼중나선을 형성할 수 있는 고유한 서열을 함유한다. 앞서 논의된 바와 같이, pXL3296 같은 분자는 서열 5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′(서열번호 29)는 함유하지만, 서열 5′-AGAAAAAAAGGA-3′(서열번호 27)은 함유하지 않는다. 이와 반대로, pBSK 같은 분자는 서열번호 27은 함유하지만, 서열번호 29는 함유하지 않는다.
제 1 단계에서, pXL3296과 pBSK를 함유하는 혼합물을 실시예 10에 기술된 칼 럼과 같이, 올리고뉴클레오타이드 5′-TCTTTTTTTCCTT-3′(서열번호 28)을 함유하는 제 1 친화성 칼럼 상에 로딩한다. 용액을 비-결합 DNA 분자를 함유한 제 1 칼럼에 통과시킨다. 제 2 단계에서, 제 1 단계로부터의 비-결합 DNA 분자를 실시예 9에 기술된 칼럼 같이, 올리고뉴클레오타이드 5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(서열번호 30)을 함유하는 제 2 친화성 칼럼 상에 로딩한다. 이어서, 실시예 9에 기술된 바와 같이, 제 2 칼럼을 세척하고 결합된 분자를 용출시킨다. 제 2 칼럼으로부터 pXL3296 분자만이 용출된다. 제 2 칼럼으로부터의 용출액(즉, 칼럼으로부터 용출되는 용액)에서는 pBSK 분자가 검출되지 않았다.
<110> AVENTIS RHARMA S.A.
CROUZET, Joel
SCHERMAN, Daniel
WILS, Pierre
CAMERON, Beatrice
BLANCHE, Francis
<120> PURIFICATION OF A TRIPLE HELIX FORMATION WITH AN IMMOBILIZED
OLIGONUCLEOTIDE
<130> 3804.1381304
<150> 09/580,923
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<212> DNA
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<223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide
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gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaagggcttc cctctttcc 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide
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aagggaggga ggagaggaa 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cytosines (C) in the sequence are methylated
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- 제 1 이중가닥 DNA 및 제 2 이중가닥 DNA를 함유하는 용액으로부터 제 1 이중가닥 DNA의 정제방법으로서,(i) 특이적 서열과의 하이브리드화에 의해 비-정규 트라이애드(non-canonical triad)의 형성없이 제 2 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 공유 커플링된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 지지체에 상기 용액을 통과시키는 단계,(ii) 제 1 지지체를 통과한 용액을 회수하는 단계, 및(iii) 회수된 용액을 특이적 서열과의 하이브리드화에 의해 비-정규 트라이애드(non-canonical triad)의 형성없이 제 1 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 공유 결합 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 지지체에 통과시키는 단계를 포함하며,제 1 이중가닥 DNA에 존재하는 특이적 서열이 서열 AAGAAAAAAAAGAA(서열번호 29)를 포함하고 제 2 이중가닥 DNA에 존재하는 특이적 서열이 서열 AGAAAAAAAGGA(서열번호 27)를 포함하는 정제방법.
- 제 1 이중가닥 DNA 및 제 2 이중가닥 DNA를 함유하는 용액으로부터 제 1 이중가닥 DNA의 정제방법으로서,(i) 특이적 서열과의 하이브리드화에 의해 제 2 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 공유 커플링된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 지지체에 상기 용액을 통과시키는 단계,(ii) 제 1 지지체를 통과한 용액을 회수하는 단계, 및(iii) 회수된 용액을 특이적 서열과의 하이브리드화에 의해 제 1 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 공유 결합 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 지지체에 통과시키는 단계를 포함하며,제 1 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드가 서열 TTCTTTTTTTTCTT(서열번호 30)을 포함하고 제 2 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드가 서열 TCTTTTTTTCCT(서열번호 28)을 포함하는 정제방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 세포 용해물인 정제방법.
- 제 30 항에 있어서, 세포 용해물이 투명한 용해물인 정제방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중가닥 DNA가 예비 정제되는 정제방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 서열이 이중가닥 DNA에 인위적으로 도입되거나, 또는 특이적 서열이 이중가닥 DNA에 자연적으로 존재하는 정제방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 디설파이드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 결합을 통해 지지체에 커플링되는 정제방법.
- 제 34 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 탄소쇄 (CH2)n(여기에서, n은 1 내지 18의 정수이다)를 포함하는 아암을 통해 칼럼에 결합되고, 아암은 포스페이트를 통해 올리고뉴클레오타이드에 결합되며 아미드 결합을 통해 칼럼에 결합되는 정제방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 자신을 뉴클레아제에 대해 내성이 되도록 만들거나 뉴클레아제로부터 보호되도록 만드는 화학적 변형, 또는 특이적 서열에 대한 자신의 친화성을 증가시키는 화학적 변형을 적어도 하나 이상 보유하는 정제방법.
- 제 36 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 사이토신 중 적어도 하나가 메틸화되는 정제방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중가닥 DNA가 환상 DNA인 정제방법.
- 제 38 항에 있어서, 환상 DNA가 플라스미드인 정제방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중가닥 DNA에 존재하는 특이적 서열이 올리고뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 위한 수개의 위치를 포함하는 정제방법.
- 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 작용화된 크로마토그래피 지지체, 작용화된 플라스틱 표면 또는 작용화된 라텍스 비드인 정제방법.
- 제 41 항에 있어서, 지지체가 작용화된 크로마토그래피 지지체인 정제방법.
- 제 42 항에 있어서, 정제된 이중가닥 DNA가 0.5% 이하의 염색체 DNA 함량을 갖는 정제방법.
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- 디올-잔기를 함유하는 수지를 포함하는 이중가닥 DNA 정제용 지지체의 제조방법으로서,(a) 상기 수지의 디올 잔기를 나트륨 m-페리오데이트로 산화시킴에 의해 활성화시키고, 및(b) 아스코브산의 존재하에 환원성 아민화에 의하여 올리고뉴클레오타이드를 지지체의 잔기에 커플링시키는 것으로 이루어진 단계를 포함하고,상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 28 및 서열번호 30의 서열로부터 선택되는 피리미딘-풍부 서열을 포함하고,상기 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥 DNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과의 하이브리드화에 의해 비-정규 트라이애드(non-canonical triad)의 형성없이 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는이중가닥 DNA 정제용 지지체의 제조방법.
- 지지체에 올리고뉴클레오타이드를 공유결합시키는 단계를 포함하는 이중가닥 DNA 정제용 지지체의 제조방법으로서,상기 올리고뉴클레오타이드가 서열 TCTTTTTTTCCT(서열번호 28) 또는 TTCTTTTTTTTCTT(서열번호 30)으로 부터 선택된 피리미딘-풍부 서열을 포함하고,이중가닥 DNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과의 하이브리드화에 의해 비-정규 트라이애드(non-canonical triad)의 형성없이 이중가닥 DNA와 삼중나선을 형성할 수 있는 이중가닥 DNA 정제용 지지체의 제조방법.
- 제 46 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드를 지지체와 공유결합시켜 지지체의 잔기를 활성화시키는 단계, 및 활성화된 잔기를 올리고뉴클레오타이드와 접촉시켜 올리고뉴클레오타이드와 지지체의 잔기간에 공유 결합을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법.
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- 제 45 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 수지가 아가로스, 덱스트란, 세파덱스 또는 그래프트 실리카인 제조방법.
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