[go: up one dir, main page]

SK14822002A3 - Konjugáty na báze polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu a spôsoby ich prípravy - Google Patents

Konjugáty na báze polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu a spôsoby ich prípravy Download PDF

Info

Publication number
SK14822002A3
SK14822002A3 SK1482-2002A SK14822002A SK14822002A3 SK 14822002 A3 SK14822002 A3 SK 14822002A3 SK 14822002 A SK14822002 A SK 14822002A SK 14822002 A3 SK14822002 A3 SK 14822002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
camptothecin
polyglutamic acid
composition
conjugate
cpt
Prior art date
Application number
SK1482-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Rama Bhatt
Vries Peter De
J. Peter Klein
Robert A. Lewis
Jack W. Singer
John Tulinsky
Original Assignee
Cell Therapeutics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cell Therapeutics, Inc. filed Critical Cell Therapeutics, Inc.
Publication of SK14822002A3 publication Critical patent/SK14822002A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polyamides (AREA)

Description

Predložený vynález sa týka kompozícií (prípravkov) obsahujúcich polyméry na báze polyglutámovej kyseliny, ktoré sú kovalentne konjugované s kamptotecínom, resp. s jeho biologicky aktívnymi analógmi kamptotecínu. Predložený vynález sa ďalej týka prípravy a farmaceutického použitia takých prípravkov.
Doterajší stav techniky
Kamptotecín je vo vode nerozpustný, opticky aktívny alkaloid získaný zo stromu Camptotheca acuminata. 20(S)-kamptotecín a 20(S)-kamptotecínový analóg sú cytotoxické agens, a predpokladá sa, že stabilizujú jednoreťazcové zlomy indukované topoizomerázou I vo fosfodiesterovom hlavnom reťazci DNA, a tým zabraňujú religácii. Tento mechanizmus vedie k produkcii zlomu v dvojreťazovej DNA počas replikácie, a pokiaľ nie je DNA opravená, má za následok apoptózu. 20(S)-Kamptotecín a 20(S)-kamptotecínový analóg sú vo vode nerozpustné. Veľký počet týchto liečiv má vynikajúcu protinádorovú aktivitu proti ľudským rakovinovým bunkovým líniám a in vivo zvieracím xenoimplantátom. Napriek tomu vďaka ich nerozpustnosti vo vode, je podanie týchto liečiv veľmi namáhavé. Farmakologicky dôležitý laktónový kruh 20(S)kamptotecínu a jeho analóg je v prítomnosti ľudského plazmového albumínu nestabilný, čo vedie ku konverzii aktívneho liečiva na inaktívnu karboxylátovú formu, ktorá sa viaže na albumín. Jeden prístup riešenia týchto farmaceutických a farmakokinetických problémov 20(S)-kamptotecínu a 20(S)kamptotecínových analógov spočíva v ich kovalentnej väzbe na neutrálne polyméry, napr. polyetylénglykol (viď napr. odkaz 1 a 2 nižšie). Použitím tohto prístupu môže byť rozpustnosť vo vode najaktívnejších kamptotecínov zlepšená takým spôsobom, že konjugované polyméry môžu byť parenterálne podávané vo vodnom médiu.
Je tu stála potreba nových polymérnych konjugátov, ktoré sú schopné solubilizovať väčšie množstvo 20(S)-kamptotecínu a 20(S)-kamptotecínových analógov na polymérovom reťazci, a tým znížiť celkovú hmotnosť polyméru potrebného na podanie príslušnej dávky aktívneho liečiva. Navyše je tu tiež stála potreba nových polymérnych konjugátov, ktoré môžu mať výnimočné vlastnosti ako protinádorové agens, kde tieto vlastnosti nemôžu byť zistené u nekonjugovaných vo vode rozpustných proliečiv a analógov 20(S)kamptotecínu.
Literatúra patriaca ku stavu techniky:
1. US Patent No. 5,646,159
2. Greenwald et al., Bioorg. Med. Chem. 6: 551 - 552 (1998)
3. US Patent No. 5,545,880
4. Conover et al. Cancer Chemother. Pharmacol. 42: 407 - 414 (1998)
5. PCT Application WO99/17804
6. Hesswijk et al. J. Cont. Re. 1: 312 (1985)
7. UŠ Patent No. 5,880,131
8. US Patent No. 5,892,043
9. US Patent No. 5,837,673
10. US Patent No. 5,854,006
11. US Patent No. 5,340,817
12. US Patent No. 4,943,579
13. Singer et al., Ann. NY Acad. Sci. 922:136 - 150 (2000)
Podstata vynálezu
Termín „polyglutámová kyselina“ alebo „polymér na báze polyglutámovej kyseliny“, ako je používaný v predloženom vynáleze, zahrnuje poly (1-glutámovú kyselinu), poly (d-glutámovú kyselinu), poly (dl-glutámovú kyselinu), poly (1-gamma glutámovú kyselinu), poly (d-gamma glutámovú kyselinu) a poly (dl-gamma glutámovú kyselinu). Výhodne zahrnuje polymér na báze polyglutámovej kyseliny aspoň 50 % ich aminokyselinových zvyškov ako glutámovú kyselinu, výhodnejšie 100 %. Polymér na báze polyglutámovej kyseliny môže byť substituovaný až 50 % prirodzene sa vyskytujúcimi alebo chemicky modifikovanými aminokyselinami, výhodne hydrofilné aminokyseliny, za predpokladu, že pokiaľ sú konjugované s terapeutickým agens, má substituovaný polymér na báze polyglutámovej kyseliny zlepšenú rozpustnosť vo vode a/nebo zlepšenú účinnosť v porovnaní s nekonjugovaným terapeutickým agens a je výhodne neimunogénny.
Molekulová hmotnosť polyméru na báze polyglutámovej kyseliny používaného pri príprave konjugátu spôsobmi popísanými v predloženom vynáleze je typicky väčšia než 5000 daltonov, výhodne od 20 kD do 80 kD, výhodnejšie od 25 kD do 60 kD (ako je stanovené podľa viskozity). Odborná verejnosť si iste uvedomí, že molekulové hmotnosti sa môžu v závislosti na zvolenej metóde líšiť. Tieto iné metódy zahrnujú napr. gélovú filtráciu, spektroskopickopické metódy (meranie s malým uhlom rozptylu a uhol rozptylu lasera), index lomu a ich kombinácie.
Termín „PG“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na polymér na báze polyglutámovej kyseliny.
Termín „kamptotecín“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na 20(S)-kamptotecín a biologicky aktívny 20(S)-kamptotecínový analóg.
Termín „CPT“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na
20(S)-kamptotecín majúci štruktúru uvedenú nižšie:
kde R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = H.
Termín „20(S)-kamptotecínový analóg“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na biologicky aktívny 20(S)-kamptotecínový analóg, kde jeden alebo viac substituentov R na kamptotecínovej štruktúre uvedenej vyššie je iných než H. Viď napr. Wang et al., Med. Res. Rev. 17: 367 - 425 (1997); Labergne and Bigg Bull. Cancer (Paris) 1: 51 - 8 (1998); a tabuľka 2 tu uvedená.
Termín „konjugát na báze polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu“ alebo „PG-kamptotecín“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na polymér na báze polyglutámovej kyseliny, ktorý je kovalentne viazaný na 20(S)-kamptotecín alebo biologicky aktívny 20(S)-kamptotecínový analóg priamou väzbou medzi skupinou karboxylovej kyseliny polyglutámovej kyseliny a funkčnou kyselinou terapeutického agens alebo nepriamou väzbou cez skupinu bifunkčného spacera. Výhodné spacerové skupiny sú také, ktoré sú relatívne stabilné voči hydrolýze pri cirkulácii, sú biologicky odbúrateľné a sú netoxické pri odštiepení od konjugátu. Je samozrejmé, že vhodné spacery nebudú interferovať s protinádorovými účinkami konjugátov. Príklady spacerov zahrnujú aminokyseliny (napr. glycín, alanín, β-alanín, glutámová kyselina, leucín, izoleucín), -[NH-(CHR')p-CO]n-, kde substituent R' je bočný reťazec prirodzene vyskytujúcej sa aminokyseliny, n je celé číslo medzi 1 a 10, najvýhodnejšie medzi 1 a 3; a p je celé číslo medzi 1 a 10, najvýhodnejšie medzi 1 a 3; hydroxykyseliny všeobecného vzorca -[O-(CHR')p-CO]n-, kde substituent R' je bočný reťazec prirodzene vyskytujúcej sa aminokyseliny, n je celé číslo medzi 1 a 10, najvýhodnejšie medzi 1 a 3; a p je celé číslo medzi 1 a 10, najvýhodnejšie medzi 1 a 3 (napr. 2-hydroxyoctová kyselina, 4hydroxybutyrová kyselina); dioly, aminotioly, hydroxytioly, aminoalkoholy a ich kombinácie. Výhodné spacery sú aminokyseliny, výhodne prirodzene vyskytujúce sa aminokyseliny, výhodnejšie glycín. Terapeutický agens môže byť pripojený k polyméru alebo spaceru akýmkoľvek spôsobom spojenia, ktorý vedie k fyziologicky štiepiteľnej väzbe (tzn. väzba, ktorá je štiepiteľná enzymatickým alebo neenzymatickým mechanizmom, ktorý sa týka podmienok v živých zvieracích organizmoch). Príklady výhodných väzieb zahrnujú ester, amid, karbamát, karbonát, acyloxyalkyléter, acyloxyalkyltioéter, acyloxyalkylester, acyloxyalkylamín, acyloxyalkyl sulfónamid, alkoxykarbonyloxyalkyl, najvýhodnejšia amidová a esterová väzba.
Spôsoby prípravy týchto väzieb sú dobre známe v obore organickej syntézy a môžu byť nájdené v štandardnej literatúre, napr. March, Advanced Organic Chemistry, Wiley Interscience (1992).
Miera naviazania kamptotecínu na PG môže byť vyjadrená ako množstvo molekúl na polymérový reťazec na báze polyglutámovej kyseliny alebo výhodne ako % z celkovej hmotnosti konjugátu („ % naviazania“). Optimálna miera naviazania pre príslušný konjugát a príslušné použitie je stanovená empiricky na základe požadovaných vlastností konjugátu (napr. rozpustnosť vo vode, terapeutická účinnosť, farmakokinetické vlastnosti, toxicita a dávkovacie podmienky).
Percento naviazaného konjugátu PG-kamptotecínu môže byť merané podľa spôsobu uvedeného nižšie v odseku o spôsobe prípravy.
Kamptotecín a kamptotecínový analóg musí byť schopný sa pripojiť na polymér pomocou funkčných skupín, ktoré sú už v natívnej molekule prítomné alebo môžu byť inak zavediteľné štandardnými postupmi v organickej syntéze bez zmeny aktivity agens. V príkladoch uvedených tu a ako je uvedené acyloxyalkylamíd, acyloxyalkoxykarbonyl, acyloxyalkyl amid, acyloxyalkylkarbamát, ketal, acetál, disulfid, tioester, jV-acylamid, močovinu a //-sulfonylimidát. V súčasnej dobe je v tabuľke 3 je kamptotecín relatívne vo vode nerozpustný v nekonjugovanej forme a vykazuje výrazne zlepšenú rozpustnosť po konjugácii. Napriek tomu sa predpokladá, že i vo vode rozpustné analógy a proliečivá (napr. estery aminokyselín) majú výhody po svojej konjugácii na polyglutámovú kyselinu (napr. zlepšenú farmakokinetiku a retenciu v mieste účinku v porovnaní s nekonjugovaným agens, zvýšenú účinnosť).
Reakciami uskutočňovanými pri „štandardných kopulačných podmienkach“ je mienené uskutočnenie v inertnom rozpúšťadle (napr. dimetylformamidu, dimetylsulfoxidu, V-metylpyrrolidónu) pri teplote od -20°C do 150°C, výhodne od 0°C do 70°C, výhodnejšie od 0°C do 30°C, v prítomnosti kopulačného činidla a katalyzátora. Je samozrejmé, že použitá teplota bude závisieť na príslušných faktoroch, napr. stabilite terapeutického agens a reaktivite atakujúcej skupiny. Vhodné kopulačné činidlá sú dobre známe v organickej syntéze a zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, karbodiimidy, alkylchloroformiát a trietylamín, pyridíniové soli-tributylamínu, fenyldichlórofosfát, 2-chloro-l ,3,5-trinitrobenzén a pyridín, di-2pyridylkarbonát, polystyryldifenylfosfín, (trimetylsilyl)etoxyacetylén, 1,1'karbonylbis(3-metylimidazolium)triflát, dietylazodikarboxylát a trifenylfosfín, N,V'-karbonyldiimidazol, metánsulfonylchlorid, pivaloylchlorid, atď. Vhodné katalyzátory pre alkoholovú kopuláciu zahrnujú, napr. 4-N,Ndimetylaminopyridín a 4-pyrollidinopyridín. Termín „inertné rozpúšťadlo“, ako je používaný v predloženom vynáleze, znamená rozpúšťadlo, ktoré je inertné za podmienok reakcie popísanej vyššie [vrátane napr. benzénu, toluénu, acetonitrilu, tetrahydrofuránu („THF“), dimetylformamidu („DMF“), chloroformu („CHCI3“), metylénchloridu (nebo dichlórmetánu alebo „CH2CI2“), dietyléteru, etylacetátu, acetónu, metyletylketónu, dioxánu, pyridínu, dimetoxyetánu, /-butylmetyléteru, atď. Pokiaľ nie je uvedené inak, sú rozpúšťadlá používané v reakciách podľa predloženého vynálezu inertné rozpúšťadlá.
Pokiaľ sa na kamptotecín nachádzajú rôzne funkčné skupiny, bude selektívne pripojenie jednotlivých funkčných skupín na polymér na báze polyglutámovej kyseliny typicky vyžadovať použitie vhodnej chrániacej skupiny. Termín „chrániaca skupina“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na akúkoľvek skupinu, ktorá, pokiaľ je pripojená k jednému alebo viac hydroxylov, tiolov, aminoskupín a karboxylov zlúčenín, zabraňuje reakciám na týchto skupinách a táto chrániaca skupina môže byť odstránená štandardnými chemickými alebo enzymatickými postupmi na obnovenie hydroxylovej, tiolovej, amino alebo karboxylovej funkcie. Všeobecne viď Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 1999 (John Wiley and Sons, N.Y.).
Konkrétna použiteľná odstrániteľná chrániaca skupina nie je kritickým prvkom systému a výhodné odstrániteľné hydroxyl chrániace skupiny zahrnujú štandardné substituenty, napr. allyl, benzyl, acetyl, chloroacetyl, tiobenzyl, benzylidín, fenacyl, r-butyl-difenylsi lyl ,r-butyldi metyl si 1 yl, trietylsilyl, MOM (metoxymetyl), MEM (2-metoxyetoxymetyl) a akékoľvek ďalšie iné skupiny, ktoré môžu byť zavedené chemicky na hydroxylovú funkciu a potom odstránené buď chemickými alebo enzymatickými metódami pri miernych podmienkach zlúčiteľných s charakterom produktu.
Výhodné odstrániteľné amino chrániace skupiny zahrnujú štandardné substituenty, napr. /-butoxykarbonyl (r-BOC), benzyloxykarbonyl (CBz), fluorenylmetoxykarbonyl (FMOC), allyloxykarbonyl (ALOC), trichlóroetoxykarbonyl (TROC), atď., ktoré môžu byť odstránené pri štandardných podmienkach, ktoré sú zlučiteľné s charakterom produktu. Výhodné karboxyl chrániace skupiny zahrnujú estery, napr. metyl, etyl, propyl, r-butyl, atď., ktoré môžu byť odstránené pri miernej hydrolýze zlučiteľnej s charakterom produktu.
Názvoslovie
Konjugáty PG-kamptotecínu podľa predloženého vynálezu sú označené spôsobom, ktorý je uvedený pre názorné konjugáty v tabuľke 1. Názvoslovie používané v tabuľke 1 môže byť tiež pochopené v súvislosti s obrázkom 1.
Tabuľka 1
zlúčenina P G konjugát
1 PG-CPT (20-konjugovaný)
2 i PG-(lO-OAc-CPT) (20-konjugovaný)
3 PG-(IO-OH-CPT) (20-konjugovaný)
4 PG-gly-CPT (20-viazaný)
5 PG-gly-gly-CPT (20-viazaný)
6 PG-gly-gly-gly-CPT (20-viazaný)
7 PG-ala-CPT (20-viazaný)
8 PG-( -ala)-CPT (20-viazaný)
9 PG-(4-NH-butyryl)-CPT (20-viazaný)
10 PG-(2-O-acetyl-CPT (20-viazaný)
11 PG-(4-O-butyryl)-CPT (20-viazaný)
12 PG-( -glu)-CPT (20-viazaný)
13 , PG-(10-O-CPT) (10-konjugovaný)
14 PG-gly-(lO-O-CPT) (10-viazaný)
15 PG-(9-NH-CPT) (9-konjugovaný)
16 PG-gly-(9-NH-CPT) (9-,viazaný)
17 PG-gly-( 10-OH-CPT) (20-viazaný)
18 PG-gly-(7-Et-10-OH-CPT) (20-viazaný)
19 PG-gly-(7-t-BuMe2Si-10-OAc-CPT) (20-viazaný)
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázku 1 sú zobrazené štruktúry konjugátov PG-kamptotecínu (PGCPT) uvedené v tabuľke 1.
Detailný popis výhodných uskutočnení
A. Konjugáty
Predložený vynález zahrnuje farmaceutický aktívne konjugáty polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu, ktoré sú charakterizované všeobecným vzorcom (1):
I (Kamptothecin—X-)—PG m v ktorom
PG je polymér na báze polyglutámovej kyseliny;
X je jednoduchá väzba, aminoacylový linker -[-OC-(CHR')p-NH]n- alebo hydroxyacylový linker
-[OC-(CHR')p-O]n-, kde substituent R' je bočný reťazec prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny;
kamptotecín je 20(S)-kamptotecín alebo biologicky aktívny 20(S)kamptotecínový analóg;
m je kladné celé číslo od 5 do 65;
kamptotecín-X je kovalentne viazaný na karboxylovú skupinu uvedeného polyméru cez esterovú alebo amidovú väzbu;
in je celé číslo medzi 1 a 10, najvýhodnejšie medzi 1 a 3; a p je celé číslo medzi 1 a 10, najvýhodnejšie medzi 1 a 3;
a špecifické vzorce (II) - (VII)
ll;
kde substituenty R1, R2, R3 a R4 sú každý H; alebo substituent R1 je -NH2 a substituenty R2, R3 a R4 sú každý H; alebo substituent R1 je -NO2 a substituenty R2, R3 a R4 sú každý H; alebo substituenty R1, R3 a R4 sú každý H a substituent R2 je -OH; alebo substituenty R1, R3 a R4 sú každý H a substituent R2 je -O-C(O)-CH3; alebo substituenty R1 a R3 sú každý H, substituent R4 je -SiMe2-f-Bu a substituent R2 je -OH.
Ul;
IV;
kde Y je N alebo O;
V;
VI;
kde
Y je N alebo O;
substituent R’ je bočný reťazec prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny;
substituent R1 je -NH2 alebo H; substituent R2 je -H, -OH alebo -O-C(O)-CH3; substituent R3 je -H alebo alkylová skupina; a substituent R4 je -H, alkylová skupina alebo trialkylsilylová skupina.
Termín „alkylová skupina“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na alifatickú uhľovodíkovú skupinu. Alkylová skupina má 1 až 20 atómov uhlíka (kdekoľvek je tu citovaná, číselné rozmedzie napr. „1 až 20“ znamená akékoľvek číslo v danom rozmedzí; napr. „1 až 20 atómov uhlíka“ znamená, že alkylová skupina môže pozostávať z 1 atómu uhlíka, z 2 atómov uhlíka, z 3 atómov uhlíka, atd’., až a vrátane 20 atómov uhlíka, aj keď tu uvedená definícia tiež zahrnuje výskyt termínu „alkylová skupina“, kde nie je uvedené číselné rozmedzie). Výhodnejšie je alkylová skupina so „strednou“ veľkosťou majúca 1 až 10 atómov uhlíka. Najvýhodnejšia je „nižšia“ alkylová skupina majúca 1 až 4 atómy uhlíka, napr. metyl, etyl, propyl, izopropyl, nbutyl, Zerc-butyl, /zo-butyl. Alkylová skupina môže byť substituovaná alebo nesubstituovaná. Pokiaľ je substituovaná, substituent(y) je(sú) výhodne jedna alebo viac skupín jednotlivo a nezávisle vybrané z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, merkaptoskupiny, alkyltioskupiny, halogénu, karbonylu, nitroskupiny a aminoskupiny.
Termín „trialkylsilylová skupina“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na skupinu -Si(alkyl)3, kde termín „alkylová skupina“ je definovaný vyššie.
Výhodné uskutočnenie tohto vynálezu zahrnujú konjugáty PGkamptotecínu, ktoré vykazujú výraznú protinádorovú aktivitu, zvýšenú rozpustnosť vo vode, zníženú toxicitu a zvýšené maximálne tolerované dávky (MTD) v porovnaní s nekonjugovaným kamptotecínom alebo kamptotecínovým analógom. Predpokladá sa, že tieto konjugáty tiež vykazujú unikátne farmakokinetické vlastnosti (napr. zvýšenú permeabilitu a retenciu v nádorovom tkanive, postupné uvoľňovanie aktívneho agens, dlhý biologický polčas) v porovnaní s nekonjugovaným agens a stabilizáciu laktónového kruhu proliečiva, o ktorom je známe, že je rozhodujúci pre ich aktivitu, ďalej sa predpokladá, že schopnosť solubilizovať vysoko nerozpustného kamptotecínového analóga konjugáciou na mnohopočetné dostupné konjugačné miesta na PG bude rozširovať rozmedzie klinického použitia kamptotecínových analógov, ktoré môžu byť vysoko aktívne, ale ktoré nemôžu byť používané v dôsledku svojich problémov s rozpúšťaním. S odkazom na vyššie uvedené vzorce sú konjugáty PG-kamptotecínu reprezentované všeobecným vzorcom (II) a vzorcom (VI) najvýhodnejšie, kde substituenty R , R1, R2, R3 a R4 sú každý H;
substituenty R1, R3 a R4 sú každý H a substituent R2 je -OH alebo -O-C(O)CH3;
substituent R1 je -NH2 a substituent R2, R3 a R4 sú každý H;
a konjugát reprezentovaný všeobecným vzorcom (IV).
Polymér na báze polyglutámovej kyseliny používaný v konjugáte by mal byť vo vode rozpustný, biologicky degradovateľný a výrazne neimunogénny. Polyméry na báze polyglutámovej kyseliny, ktoré spadajú do rozsahu predloženého vynálezu sú popísané vyššie (viď oddiel podstaty vynálezu). Molekulová hmotnosť polyméru na báze polyglutámovej kyseliny je typicky väčšia než 5000 daltonov, výhodne od 20 kD do 80 kD, výhodnejšie od 25 kD do 60 kD (ako je stanovené podľa viskozity). Najvýhodnejšie sú polyméry na báze poly-(L-glutámovej kyseliny) majúce molekulovú hmotnosť medzi 30 kD a 50 kD. Odborná verejnosť si je vedomá, že molekulové hmotnosti sa môžu v závislosti na zvolenej metóde líšiť. Tieto iné metódy zahrnujú napr. gélovú filtráciu, spektroskopickopické metódy (meranie s malým uhlom rozptylu a uhol rozptylu laseru), index lomu a ich kombinácie.
Pre priame konjugáty podľa predloženého vynálezu sa % naviazanie pohybuje výhodne v rozmedzí od asi 7 % do asi 20 %, výhodnejšie od asi 10 % do asi 17 % a ešte výhodnejšie od asi 12 % do asi 15 %. Pre konjugáty viazané nepriamo na PG cez aminokyselinový linker sa % naviazania pohybuje výhodne v rozmedzí od asi 7 % do asi 50 %, výhodnejšie od asi 15 % do asi 38 % a najvýhodnejšie od asi 20 % do asi 38 %.
B. Spôsoby prípravy
Konjugáty polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu podľa predloženého vynálezu sú pripravené priamym alebo nepriamym naviazaním biologicky aktívneho kamptotecínu na polymér na báze polyglutámovej kyseliny. Môže sa používať akýkoľvek kamptotecín za predpokladu, že obsahuje alebo môže byť funkcionalizovaný skupinou, ktorá môže byť viazaná na gamma-karboxylátovú skupinu PG, výhodne cez esterovú alebo amidovú väzbu. Viď napr. Wang, et al. Med. Res. Rev. 17: 367 - 425 (1997). Labergne and Bigg, Bull. Cancer. (Paris) 7: 51 - 8 (1998) a tabuľka 2 nižšie. Teda 20(S)-kamptotecín a biologicky aktívny 20(S)-kamptotecínový analóg môžu byť viazané na PG cez 20(S)-hydroxylovú skupinu kamptotecínového jadra alebo cez ďalšiu dostupnú funkčnú skupinu analóga.
Všeobecne sú priamo viazané konjugáty polyglutámovej kyselinykamptotecínu pripravené rozpustením kamptotecínu a polyglutámovej kyseliny v dimetylformamide alebo inom inertnom rozpúšťadle, ochladením roztoku a pridaním do ochladenej zmesi kopulačného činidla a prebytku amínovej bázy, napr. dimetylaminopyridínu. S prekvapením bolo až teraz zistené, že použitie chloridu bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfínovej kyseliny (ΒΟΡ-Cl) alebo 2chlórmetylpýridínium-jodidu ako kopulačných činidiel umožňuje prípravu konjugátov s výrazne zvýšeným obsahom 20(S)-kamptotecínu alebo 20(S)kamptotecínových analógov (tzn. % naviazania v rozmedzí asi 10 % - 20 %) v porovnaní s tým, čo bolo doteraz známe. Toto zistenie je veľmi dôležité, pretože poskytuje prípravky s vysoko zvýšeným molárnym pomerom aktívneho liečiva na PG polymér, a tým zníženie celkovej hmotnosti polyméru potrebného na podanie príslušnej dávky liečiva pacientovi. Ďalšie výhody a nové charakteristiky týchto konjugátov sú diskutované v tejto prihláške. Reakčná zmes sa nechá ohriať a mieša sa dostatočne dlhú dobu na prebehnutie reakcie z asi 70 %. Výsledný konjugát môže byť izolovaný precipitáciou z roztoku pridaním prebytku vodného roztoku soli (napr. NaCl, KC1, NH4C1), výhodne
10-15 % roztok soli, pri chladení reakčnej zmesi v rozmedzí 0 °C až 10 °C a spojením konjugátu ako pevnej látky vo svojej protónovanej forme.
Bolo zistené, že na dosiahnutie vysokého stupňa účinnosti prípravku podľa predloženého vynálezu s minimálnou toxicitou je nevyhnutné odstránenie nezreagovaného kamptotecínu z konjugátu. Nezreagovaný kamptotecín a ďalšie nečistoty môžu byť extrahované premytím pevného konjugátu organickým rozpúšťadlom, v ktorom nezreagovaný kamptotecín a ďalší nečistoty (nie konjugát) sú rozpustné, napr. 1 až 3 % metanol-dichlórmetán, 1 až 3 % metanol-chloroform, chloroform, dichlóretán a ďalšie. Všeobecne prítomnosť nezreagovaného kamptotecínu v konjugátovom produkte môže byť detegovaná sonikáciou konjugátu počas 3 hodín v 2 % metanole-dichlórmetáne a analýzou kamptotecínu v organickom extrakte pomocou TLC. ’H NMR spektrum konjugátu umožní potvrdiť, že kamptotecín je kovalentne viazaný na PG (viď tabuľka 3 NMR analýz vybraných názorných príkladov konjugátov).
Na stanovenie množstva naviazaného liečiva na polymér je časť priamo konjugovaného PG-kamptotecínu podrobená hydrolýze bázou na uvoľnenie konjugovaného kamptotecínu, ktorý tiež otvára laktónový kruh na soľ voľnej karboxylovej kyseliny. Po okyslení na opätovné zavretie karboxylátu na laktón sa uvoľnený kamptotecín extrahuje. Týmto spôsobom získaný kamptotecín sa porovnáva so vzorkou pravého kamptotecínu na TLC a *H NMR. Percentuálne naviazanie sa vypočíta z množstva kamptotecínu, ktoré je izolované v extrakte a hmotnosti konjguvaného produktu. Percentuálne naviazanie môže byť tiež stanovené meraním UV absorbancie PG-kamptotecínu a vypočítaním obsahu kamptotecínu z kalibračnej krivky kamptotecínu. Typicky je toto stanovenie uskutočňované pri vlnovej dĺžke 364 nm. Napriek tomu odborná verejnosť vie, že určiť optimálnu vlnovú dĺžku pre toto stanovenie možno len rutinným experimentom. Pokiaľ sú rozmanité funkčné skupiny dostupné na pripojenie, môže selektívne pripojenie konkrétnej skupiny liečiva na polymér na báze polyglutámovej kyseliny vyžadovať použitie vhodnej chrániacej skupiny v závislosti na rozdielnych reaktivitách skupín. Nijako nelimitujúcim príkladom vhodnej chrániacej skupiny je acetylová skupina. Ďalšie vhodné chrániace skupiny známe odbornej verejnosti sú popísané napr. v knihe autorov Greena a Wutse, ktorá je tu citovaná.
Reakcia 20(S)-10-hydroxykamptotecínu s aktívnym acylovým donórom, napr. anhydrid kyseliny octovej v prítomnosti pyridínu ako bázy, prebieha výhradne len v polohe 1O-hydroxylu. 10-Acetoxyderivát sa potom pripojí na PG cez 20(S)-hydroxyl. Acetát bol vybraný ako chrániaca skupina, pretože sa predpokladá, že bude hydrolyzovaný in vivo a je farmaceutický prijateľný. Alternatívne môže byť 10-hydroxyl chránený odstrániteľnou chrániacou skupinou (napr. BOC) pred konjugáciou na PG, potom odstránením chrániacej skupiny trifluóroctovo-u kyselinou (viď príklad 3 nižšie). Pri absencii chrániacej skupiny poskytne reakcia 20(S)-10-hydroxykamptotecínu s PG pomocou chlorometylpyridínium-jodidu/4-dimetylaminopyridínu/PG-H v dimetylformamide PG-(IO-O-CPT) ako výhradný produkt.
Kopulácia 20(S)-9-aminokamptotecínu s PG za podmienok priamej konjugácie (chlorometylpyridínium-jodid a 4-dimetylaminopyridín) prebieha na heteroatómovom substituente aromatického A-kruhu a v tomto prípade vzniká PG-9-NH-CPT ako výhradný produkt. Tento záver bol odvodený na základe výsledkov z analogickej kopulácie 20(S)-9-aminokamptotecínu s a-tercbutylesterom Boc-L-glutámovej kyseliny, ktorá poskytla produkt, ktorého lH NMR spektrum vykazovalo charakteristické posuny signálov v dôsledku 20(S)9-aminokamptotecínových aromatických protónov, zatiaľ čo signály v dôsledku protónov etylov laktónu neboli posunuté.
Konjugáty PG-kamptotecínu spadajúce do predloženého vynálezu môžu byť tiež pripravené inzerciou bifunkčného linkera medzi 20(S)-kamptotecín alebo analóg 20(S)-kamptotecínu a alfa alebo gamma karboxyskupinu PG polyméru. Výhodné linkery sú prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny, βaminokyseliny, gamma aminokyseliny alebo hydroxykyseliny, výhodnejšie glycínové linkery. Použitie linkerov poskytuje účinné konjugáty s ešte väčším % naviazaní 20(S)-kamptotecínu a jeho analógov než u priamych konjugátov. Nepriame konjugáty sú všeobecne získané pripravením esteru aminokyseliny alebo hydroxyesteru 20(S)-kamptotecínu alebo požadovaného analóga 20(S)kamptotecínu podľa známeho spôsobu (viď napr. US Patent No. 5,646,159 a
Greenwald et al., Bioorg. Med. Chem. 6: 551 - 562 (1998)) na alfa alebo gamma karboxyskupinu PG cez aminoskupinu aminokyseliny alebo hydroxyskupinu hydroxykyseliny pri štandardných kopulačných podmienkach za vzniku amidovej, resp. esterovej väzby.
Konjugácia 20(S)-10-hydroxykamptotecínu s PG cez glycínový linker pripojený k 20(S)-hydroxylu sa uskutoční reakciou 20(S)-lO-hydroxykamptotecínu s diZerc-butyldikarbonátom a pyridínom za vzniku jediného zodpovedajúceho 10O-Boc-derivátu, ktorý sa potom 20-O-acyluje Boc-glycínom pomocou karbodiimidového kopulačného činidla (napr. diizopropylkarbodiimid, l-etyl-3(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid) a 4-dimetylaminopyridín. Odstránením Boe chrániacich skupín trifluóroctovou kyselinou a následne konjugáciou s PG sa získa PG-gly-(l O-OH-CPT). PG-gly-(7-Et-10-OH-CPT) a PG-gly-(7-ZBuMe2Si-10-OAc-CPT) sa pripravia týmto spôsobom.
Konjugácia 20(S)-1 O-hydroxykamptotecínu na PG cez glycínový linker pripojený k 10-hydroxylu sa uskutoční nasledujúcim spôsobom. Reakciou 20(S)-10-hydroxykamptotecínu so symetrickým anhydridom Boc-glycínu a pyridínom sa získa len zodpovedajúci ester 10-(A-Boc)-glycinátu, ktorého reakciou s trifluóroctovou kyselinou sa dosiahne odštiepenie A-Boc chrániacej skupiny. Výsledný ester 10-glycinátu 20(S)-hydroxykamptotecínu sa konjuguje s PG pomocou 1,3-diizopropylkarbodiimidu a 4-dimetylaminopyridínu za vzniku PG-gly-(lO-O-CPT)).
Výhradná kopulácia s α-aminoskupinou glycínu bola odvodená na základe analogickej kopulácie esteru 10-glycinátu 20(S)-10hydroxykamptotecínu s α-Zerc-butylesterom A-Boc-L-gluťámovej kyseliny pri rovnakých reakčných podmienkach. *H NMR spektrum tohto reakčného produktu vykazovalo charakteristické posuny signálov v dôsledku 20(S)-10hydroxykamptotecínových aromatických protónov, zatiaľ čo signály v dôsledku protónov etylov laktónu neboli posunuté.
Prvé dva kroky konjugácie 20(S)-9-aminokamptotecínu na PG cez glycínový linker pripojený k 9-aminoskupine môžu byť uskutočnené podľa spôsobu popísaného v Wall et al., J.Med. Chem. 36: 2689 - 2700 (1993). Konjugácia trifluóroctovej soli 20(S)-9-(glycylamino)kamptotecínu s PG sa uskutoční v prítomnosti diizopropylkarbodiimidu a dimetylaminopyridínu za vzniku PGgly-(9NH-CPT). Konjugácia PG s 20(S)-kamptotecínom pomocou glycylglycínového (gly-gly; di-gly) linkeru sa uskutoční najskôr reakciou trifluóroctovej soli 20-O-(glycyl)kamptotécínu s N-(tercbutoxykarbonyl)glycínom v prítomnosti karbodiimidového kopulačného činidla za vzniku 20-O-((7V-(/erc-butoxykarbonyl)glycyl)glycyl)kamptotecínu, ktorý sa potom nechá reagovať s trifluóroctovou kyselinou za vzniku trifluóroctovej soli 20-O-(glycyl-glycyl)kamptotecínu, ktorá sa potom ďalej nechá reagovať s polyL-glutámovou kyselinou v prítomnosti N,//-dimetylaminopyridínu a 1,3diizopropylkarbodiimidu za vzniku PG-gly-gly-CPT.
Konjugácia PG s 20(S)-kamptotecínu pomocou glycyl-glycyl-glycínového (gly-gly-gly; tri-gly) linkeru sa uskutočňuje najskôr reakciou ((N-(tercbutoxykarbonyl)glycyl)glycyl)-glycínu s 20(S)-kamptotecínom v prítomnosti A/N-dimetylaminopyridínu a 1,3-diizopropylkarbodiimidu za vzniku 20-O-(((jV(íerc-butoxykarbonyl)glycyl)glycyl)glycyl)kamptotecínu, ktorý sa potom nechá reagovať s trifluóroctovou kyselinou za vzniku trifluóroctovej soli 20-0(glycyl-glycyl-glycyl)kamptotecínu, ktorá sa potom ďalej nechá reagovať s poly-(L-glutámovou kyselinou) (956 mg) v prítomnosti N,Ndimetylaminopyridínu a 1,3-diizopropylkarbodiimidu za vzniku PG-gly-glygly-CPT.
Konjugáty PG-kamptotecínu podľa predloženého vynálezu vykazujú protinádorovú aktivitu proti rôznym nádorom, vrátane ľudskej pľúcnej rakoviny, ľudskej nemalobunkovej pľúcnej rakoviny, rakoviny prsníka, ovariálnej rakoviny a melanómu (viď príklad 20). Predpokladá sa, že tieto konjugáty budú aktívne proti širokému spektru cicavčích (vrátane ľudských) rakovin, vrátane pevných nádorov (napr. pľúcna rakovina, ovariálna rakovina, rakovina prsníka, rakovina gastrointestinálneho traktu, rakovina hrubého čreva, rakovina slinivky, močového mechúra, pečene, prostaty a mozgu) a rôznych hematopoéznych rakovin (napr. Hodgkinova choroba, nehodginov lymfóm, leukémie). Predpokladá sa, že tieto konjugáty môžu byť tiež použiteľné pri ošetrení rakovin rezistentných voči liečivám.
Farmaceutické prípravky obsahujúce konjugáty PG-kamptotecínu podľa predloženého vynálezu spadajú rovnako do rozsahu vynálezu. Tieto farmaceutické prípravky môžu obsahovať akékoľvek množstvo konjugátu, ktoré je účinné z hľadiska protinádorovej aktivity in vivo. Odbornej verejnosti je zrejmé, že dávka, ktorá je podávaná pacientovi, bude závisieť na veku, váhe a fyzickom stave pacienta, spôsobe podania, konkrétnej rakovine, ktorá je ošetrovaná, štádiu nádora, atď. Pre akýkoľvek konkrétny subjekt by špecifické dávkovacie režimy (dávka i frekvencia podania) mali byť upravené podľa príslušného pacienta lékarom. Rozsah dávky, ktorý by mal byť účinný (výhodne parenterálne alebo intravenózne podanie), sa pohybuje 0,1 - 100 mg kamptotecínu alebo kamptotecínového analóga na kg telesnej váhy denne, výhodne 1 - 60 mg kamptotecínu alebo kamptotecínového analóga na kg telesnej váhy denne. Farmaceutické prípravky obsahujú farmaceutický účinné množstvo konjugátu PG-kamptotecínu vo farmaceutický prijateľnom nosiči alebo riediacom roztoku. Stanovenie účinného množstva farmaceutického prípravku spadá do kompetencií odbornej verejnosti. Prijateľné nosiče alebo riediace roztoky na terapeutické použitie sú tiež dobre známe vo farmaceutickom odbore a sú popísané napr. v Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Konzervačné prostriedky, stabilizátory, farbivá a ďalšie prostriedky môžu byť tiež vo farmaceutickom prípravku. Do rozsahu predloženého vynálezu rovnako spadá podanie konjugátov PG-kamptotecínu v kombinačnej terapii s ďalšími liečivami, vrátane, ale nie je to nijako limitované, ďalších protinádorových liečiv, a rádioterapií.
V závislosti na špecifických podmienkach, pri ktorých prebieha ošetrenie, môžu byť tieto farmaceutické prípravky pripravené a podávané systematicky alebo lokálne. Techniky formulácie a podania môžu byť nájdené v Remington's Pharmaceutical Sciences vyššie. Vhodné spôsoby môžu zahrňovať perorálne, rektálne, transdermálne, vaginálne, transmukózne alebo intestinálne podanie; parenterálne podanie, vrátane intramuskulárneho, subkutánneho intramedulárne injekcie, ako i intratekálne, priame intraventrikulárne, intravenózne, intraperitoneálne, intranazálne alebo intraokulárne injekcie.
Na injekciu môžu byť farmaceutické prípravky podľa predloženého vynálezu pripravené vo vodných roztokoch, výhodne vo fyziologicky zlúčiteľných pufroch, napr. fyziologický pufor. Použitie farmaceutický prijateľných nosičov na prípravu farmaceutických prípravkov uvedených v predloženom vynáleze na uskutočnenie podľa vynálezu v jednotkových dávkach vhodných na systémové podanie spadá rovnako do rozsahu vynálezu.
Predložený vynález je ďalej ilustrovaný na nasledujúcich príkladoch, ktoré nemajú akýmkoľvek spôsobom limitovať rozsah predloženého vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
V nasledujúcich príkladoch sú molekulové hmotnosti používanej polyglutámovej kyseliny na prípravu konjugátov stanovené dodávateľom (Sigma) na základe meraní viskozít. Ďalej číslo príkladu zodpovedá číslu zlúčeniny na obrázku 1.
Príklad 1
PG-CPT (spôsob 1)
Do zmesi 20(S)-kamptotecínu (132 mg, 0,38 mmol) a poly-(L-glutámovej kyseliny) (33 kD, 530 mg), predom sušenej za vákua počas 4 hodín, sa pridá bezvodý dimetylformamid (20 ml). Roztok sa ochladí v ľadovom kúpeli a pridá sa chlorid bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfínovej kyseliny (174 mg, 0,68 mmol), M/V-dimetylaminopyridín (167 mg, 1,37 mmol) a diizopropyletylamín (74 mg, 0,57 mmol). Reakčná zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 2 dennom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a pridáva sa 10 % vodný roztok chloridu sodného (45 ml) počas 25 minút. Táto zmes sa okyslí na pH 2,5 pridaním 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej (3,5 ml) a mieša sa pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Precipitát sa filtruje, premyje vodou (4 x 50 ml) a suší za vákua počas 12 hodín. Pevný podiel sa rozotrie na prášok a suspenduje v 2 % metanol-dichlórmetánu (10 ml). Po 3 hodinovom miešaní sa pevný podiel separuje centrifugáciou a supernatant sa dekantuje. Tento premývací proces sa opakuje štyrikrát kvôli úplnému odstráneniu nezreagovaného kamptotecínu. Pevný podiel sa suší za vákua počas 2 dní, čím sa získa PG-CPT (521 mg, 87 % látková bilancia vypočítaná z hmotnosti izolovaného 20(S)-kamptotecínu (64, 5 mg)).
’H NMR (300 MHz v DMSO-d6): δ 12,10 (s,-COOH), 6,90-8,80 (m), 5,15-5,8 (m), 3,10-4,35 (m), 1,42-2,62 (m,), 0,90 (br s, 19-CH3).
Hmotnostné percento naviazaného 20(S)-kamptotecínu v tejto vzorke PGCPT sa stanoví nasledujúcim spôsobom. Do suspenzie PG-CPT (100 mg) v metanol-vode (1:1,4 ml) sa pridá 1 M vodný roztok hydroxidu sodného (2 ml). Žltý roztok sa mieša počas 16 hodín, okyslí na pH 5 pridaním IM kyseliny chlorovodíkovej a extrahuje dichlórmetánom (4 x 20 ml). Spojené organické extrakty sa sušia nad síranom horečnatým a koncentrujú pri zníženom tlaku, čím sa získa 20(S)-kamptotecín (13 mg). ’H NMR a TLC tejto vzorky je zhodné s pravým 20(S)-kamptotecínom. Na základe týchto výsledkov je hmotnostné percento naviazaní 20(S)-kamptotecínu v tejto vzorke PG-CPT 13 %.
PG-CPT (spôsob 2)
Do zmesi 20(S)-kamptotecínu (64 mg, 0,18 mmol) a poly-(L-glutámovej kyseliny) (50 kD, 256 mg), sušenej za vákua počas 6 hodín, sa pridá bezvodý dimetylformamid (15 ml). Po ochladení roztoku na -5 °C v kúpeli z ľadu a soli sa pridá 2-chlórmetylpyridínium-jodid (85 mg, 0,33 mmol) a N,Ndimetylaminopyridín (81 mg, 0,66 mmol) pod atmosférou argónu. Reakčná zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 4 dennom miešaní sa zmes ochladí na teplotu 0 °C a pridáva sa 10 % vodný roztok chloridu sodného (35 ml) počas 25 minút. Zmes sa okyslí na pH 2,5 pridaním 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej (3,5 ml) a mieša pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Precipitát sa filtruje, premyje vodou (4 x 30 ml) a suší za vákua. Pevný podiel sa rozotrie na prášok a suspenduje v 2 % metanol-dichlórmetáne (10 ml). Po miešaní počas 3 hodín sa pevný podiel separuje centrifugáciou a supernatant dekantuje. Tento premývací proces sa opakuje štyrikrát kvôli úplnému odstráneniu nezreagovaného kamptotecínu. Pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PGCPT (295 mg, 97 % látková bilancia vypočítaná z hmotnosti izolovaného 20(S)23 kamptotecínu (13 mg)). *H NMR (300 MHz v DMSO-d6): δ 12,10 (s, -COOH), 6,90-8,80 (m), 5,15-5,8 (m), 3,10-4,35 (m), 1,42-2,62 (m), 0,90 (br s, 19 -CH3). Percentuálna hmotnosť naviazaného 20(S)-kamptotecínu v tejto vzorke PG-CPT je 16 % podľa spôsobu popísaného vyššie pri syntéze PG-CPT spôsobom 1.
Príklad 2
PG-(10-OAc-CPT)
20(S)-l0-acetoxykamptotecín sa pripraví podľa spôsobu popísaného v patente US 4,545,880 (Miyasaka et al), ktorý je ako celok tu uvedený vo forme odkazu.
Suspenzia poly-(L-glutámovej kyseliny) (50 kD, 235 mg) a 10acetoxykamptotecínu (53 mg, 0,13 mmol) v dimetylformamide (8 ml) sa rozpustí pri miernom ohrievaní. Po ochladení výsledného roztoku na izbovú teplotu sa postupne pridá roztok chlórmetylpyridínium-jodidu (75 mg, 0,29 mmol) v dimetylformamide (2 ml) a roztok 4-dimetylaminopyridínu (73 mg, 0,60 mmol) v dimetylformamide (2 ml). Po 18 hodinovom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli pri intenzívnom miešaní počas 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (30 ml). Po okyslení na pH 1-2 pomalým pridaním 0,5M kyseliny chlorovodíkovej sa zmes nechá ohriať na izbovú teplotu a mieša počas ďalších 30 minút. Pevný podiel sa spojí centrifugáciou a supernatant dekantuje. Pevný podiel sa suspenduje vo vode (200 ml) a znovu izoluje po centrifugácii. Tento premývací proces sa opakuje 2 x a pevný podiel sa suší za vákua. Suspenzia pevného podielu v 2 % metanol-chloroforme (25 ml) sa podrobí ultrazvuku (90 minút) a filtruje. Tento premývací proces sa opakuje a pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PG -(10-OAc-CPT) (174 mg, 61 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. ’H NMR (300 MHz, dôDMSO) δ 7,2-8,5 (mnohopočetné široké signály, Ar-H), 5,45, 5,20 (br s, C-17, C-5 CH2), 0,85 (br triplet, C-18 CH3),
Príklad 3
PG-(IO-OH-CPT)
Do roztoku 20(S)-lO-hydroxykamptotecínu (317 mg, 0,87 mmol) v dimetylformamide (8 ml) a pyridínu (1,5 ml) sa pridá roztok di-/erc-butyldikarbonátu (328 mg, 1,5 mmol) v dimetylformamide (2 ml). Po 3 hodinovom miešaní pri izbovej teplote sa zmes rozdelí medzi chloroform (100 ml) a vodu (100 ml). Chloroformová fáza sa premyje IM kyselinou chlorovodíkovou (2 x 100 ml), suší nad síranom sodným, filtruje a koncentruje za vákua. Pevný podiel sa rekryštalizuje (chloroform-hexán), čím sa získa 20(S)-lQ-tercbutoxykarbonyloxykamptotecín (358 mg, 91 % výťažok) vo forme žltého prášku. lH NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,34 (s, 1 H), 8,23 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,75 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7,67 (s, 1 H), 7,66 (dd, J = 8, 2 Hz, 1 H), 5,75 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,31 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,27 (s, 2 H), 1,91 (sep„ J = 6 Hz, 2 H), 1,62 (s, 9 H), 1,06 (t, J = 6 Hz, 3 H). Suspenzia poly-(L-glutámovej kyseliny) (507 mg, 3,9 mmol voľného karboxylátu) a 20(S)-10-/ercbutoxykarbonyloxykamptotecínu (103 mg, 0,23 mmol) v dimetylformamide (20 ml) sa rozpustí pri miernom ohrievaní po ochladení výsledného roztoku na izbovú teplotu a postupne sa pridá roztok chlórmetylpyridínium-jodidu (129 mg, 0,5 mmol) v dimetylformamide (2,5 ml) a roztok 4-dimetylaminopyridínu (131 mg, 1,1 mmol) v dimetylformamide (2,5 ml). Po 80 hodinovom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a pri intenzívnom miešaní sa počas 30 minút pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (65 ml). Po okyslení na pH 1-2 pomalým pridaním 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej sa zmes nechá ohriať na izbovú teplotu a mieša počas ďalších 30 minút. Pevný podiel sa spojí centrifugáciou a supernatant dekantuje. Pevný podiel sa suspenduje vo vode (200 ml) a znovu izoluje po centrifugácii. Tento premývací proces sa opakuje dvakrát a pevný podiel sa suší za vákua. Suspenzia pevného podielu v 2 % metanol-chloroforme (25 ml) sa podrobí ultrazvuku (90 minút) a filtruje. Tento premývací proces sa opakuje a pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PG(10-Zerc-butoxykarbonyloxykamptotecín) (20-konjugovaný) (471 mg, 78 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. Percentuálne naviazanie je 10 %, vypočítané z hmotnosti 20(S)-10-/erc-butoxykarbonyloxykamptotecínu (53 mg) izolovaného z metanol-chloroformových premývacích roztokov. ‘H NMR (300 MHz, d^-DMSO) δ 7,2-8,5 (mnohopočetné široké signály, Ar-H), 5,45, 5,20 (br, s, C-17, C-5 CH2), 1,55 (s, 10-O-Boc), 0,85 (brs, C-18 CH3).
PG-(10-/erc-butoxykarbonyloxykamptotecín) (20-konjugovaný) (288 mg) sa pridáva v štyroch podieloch do trifluóroctovej kyseliny (50 ml) počas 30 minút. Po 24 hodinovom miešaní sa zmes koncentruje za vákua, čím sa získa PG-(IO-OH-CPT) (251 mg, 87 % látková bilancia). Podľa *H NMR je hmotnostné percento naviazaní 5 %. *H NMR (300 MHz, TFA-J) δ 9,15 (br, s, Ar-H); 7,2-8,5 (mnohopočetné široké signály,’ Ar-H); 5,6-6,0 (mnohopočetné signály, C-17, C-5 CH2); 1,05 (br, triplet, C-18 CH3).
Príklad 4
PG-gly-CPT
Do zmesi 20(S)-kamptotecínu (17,0 g, 48,8 mmol), N-(tercbutoxykarbonyl)-glycínu (12,82 g, 73,2 mmol) a bezvodého dimetyformamidu (170 ml), ochladeného v ľadovom kúpeli (4-6°C) sa po častiach počas 15 minút pridáva 4-dimetylaminopyridín (7,75 g, 63,5 mmol), potom l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)karbodiimid (14,03 g, 73,2 mmol) po častiach počas 20 minút. Po 3,5 hodinovom miešaní pri teplote 5 - 10°C (vodný kúpeľ z ľadu a vody) sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli (4°C) a pri intenzívnom miešaní sa pridáva počas 30 minút voda (275 ml). Po ďalšom 15 minútovom miešaní sa pevný podiel filtruje, premyje vodou (2 x 150 ml), ľadovo studenou 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou (300 ml) a vodou (3x 100 ml). Po 20 hodinovej lyofilizácii sa pevný podiel rekryštalizuje z etylacetát-metanolu (1:4, 500 ml). Po filtrácii sa pevný podiel premyje ľadovo studeným metanolom (2 x 100 ml) a suší, čím sa získa 2O-0-(jV-(/erc-butoxykarbonyl)glycyl)kamptotecín (22,5 g, 91 % výťažok). Protónovým NMR sa potvrdí, že ide o látku zhodnú s originálnou vzorkou. Do suspenzie 20-<9-(7'/-(/ercbutoxykarbonyl)glycyl)kamptotecínu (48,6 g, 93,6 mmol) v bezvodom etylacetáte (125 ml), chladenej v ľadovom kúpeli, sa počas 30 minút pridáva trifluóroctová kyselina (250 ml). Po 3,5 hodinách sa rozpúšťadlá odparujú za zníženého tlaku. Rekryštalizáciou z hexán-metanol-etylacetátu (1:2:20, 575 ml) sa získa pevný podiel, ktorý sa filtruje, premyje etylacetátom (150 ml), suší za vákua, čím sa získa trifluóroctová soľ 2O-0-(glycyl)kamptotecínu (46, 4 g, 93 % výťažok) vo forme žltého prášku. *H NMR (TFA-í/): δ 9,35 (s, 1H), 8,258,45 (m, 3H), 8,05 (t, J=7,3 Hz, 1H), 7,82 (s, 1H), 5,80 (d, J=18,1 Hz, 1H),
5,70 (s, 2H), 5,55 (d, J=18,1 Hz, 1H), 4,42 (d, J=17,6 Hz, 1H), 4,30 (d, J=17,6 Hz, 1H), 2,10-2,30 (m, 2H), 1,00 (t, J= 7,4 Hz, 3H). Do roztoku poly-(Lglutámovej kyseliny) (1,24 g) v bezvodom dimetylformamide (31 ml) sa pridá trifluóroctová soľ 2O-0-(glycyl)kamptotecínu (1,0 g, 1,9 mmol). Po ochladení na teplotu 0°C sa po častiach pridáva dimetylaminopyridín (707 mg, 5,79 mmol), potom roztok 1,3-diizopropylkarbodiimidu (292 mg, 2,32 mmol) v dimetylformamide (1 ml), ktorý sa pridáva počas 20 minút. Zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po miešaní počas 2 dní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a počas 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (75 ml). Zmes sa okyslí na pH 2,5 pridaním IM kyseliny chlorovodíkovej. Po 1 hodinovom miešaní pri izbovej teplote, sa pevný podiel filtruje, premyje vodou (4 x 100 ml) a suší za vákua. Pevný podiel sa suspenduje v 2 % metanoldichlórmetáne (75 ml), mieša počas 1 hodiny a filtruje. Tento premývací proces sa opakuje trikrát s 2 % metanol-dichlórmetánom, raz acetonitrilom (100 ml) a raz vodou (100 ml). Pevný podiel sa suší za vákua počas 2 dní, čím sa získa PG-gly-CPT (1,88 g, 93 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. *H NMR (300 MHz v TFA-í/) δ 9,45 (s, C-7H), 8,30-8,52 (m, aromatické protóny), 8,27 (t, J = 6,6 Hz, aromatické protóny), 7,95 (s, aromatický protón), 5,92 (d, J =
18,3 Hz, protón laktónu), 5,72 (s, 5-Hz) 5,60 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 4,80 (br s), 4,30-4, 70 (m, protóny glycínového metylénu), 2,00-2,70 (m), 1,10 (br s).
Príklad 5
PG-gly-gly-CPT
Po miešaní zmesi trifluóroctovej soli 20-O-(glycyl)kamptotecínu (2,60 g, 5,0 mmol) a A-(/erc-butoxykarbonyl)glycínu (2,63 g, 15,0 mmol) v bezvodom dimetylformamide (50 ml) počas 30 minút) sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a pridá sa 4-dimetylaminopyridín (1,83 g, 15,0 mmol). Počas 30 minút sa pridáva diizopropylkarbodiimid (1,89 g, 15,0 mmol) ä reakčná zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 16 hodinovom miešaní sa zmes nechá reagovať s vodou (100 ml) a extrahuje dichlórmetánom (3x 100 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú vodou (100 ml), 0,lM kyselinou chlorovodíkovou (100 ml), vodou (100 ml) a sušia nad bezvodým síranom sodným. Po koncentrácii za zníženého tlaku sa zvyšok čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 4 % metanol-dichlórmetánu, čím sa získa 20-O-((7V(/ercbutoxykarbonyl)glycyl)glycyl)kamptotecín (1,30 g, 45 % výťažok) vo forme žltého prášku. *H NMR (CDCh): δ 8,35 (s, 1H), 8,22 (d, J = 8,38 Hz, 1 H), 7,91 (d, J = 8,07, 1 H), 7,76-7,85 (m, 1 H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,10 (s, 1H), 5,70 (d, J = 17,25 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1H),
5,25 (s, 2H), 5,10 (brs, 1H), 3,70-4,45 (m, 4H), 2,05-2,30m (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 0,95 (t, J = 7,47 Hz, 3H).
Roztok 20-O-((7V-(/erc-butoxykarbonyl)glycyl)glycyl)kamptotecínu (1,20 g, 2,10 mmol) v trifluóroctovej kyseline-dichlórmetánu (1:1, 4 ml) sa mieša počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Po odparení rozpúšťadiel za zníženého tlaku sa zvyšok trituruje etylacetátom (50 ml). Pevný podiel sa filtruje, premyje dichlórmetánom (40 ml) a suší za vákua, čím sa získa trifluóroctová soľ 20-0(glycyl-glycyl)kamptotecínu (1,0 g, 82 % výťažok) vo forme žltého prášku. *H NMR (TFA-í/): δ 9,45 (s, 1H), 8,10-8,50 (m, 3H), 7,95 (s, 1 H), 5,90 (d, J =
18,3 Hz, 1 H), 5,80 (s), 5,65 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 4,10-4,60 (m, 4H), 2,20-2,50 (m, 2H), 1,10 (t, J= 7,4 Hz, 3H).
Do zmesi trifluóroctovej soli 2O-0-(glycyl-glycyl)kamptotecínu (220 mg, 0,38 mmol) a poly-L-glutámovej kyseliny (532 mg) v bezvodom dimetylformamide (14,5 ml), chladenej v ľadovom kúpeli, sa pridá N,Ndimetylaminopyridín (140 mg, 1,15 mmol). Roztok 1,3diizopropylkarbodiimidu (58 mg, 0,46 mmol) v dimetyformamide (0,5 ml) sa pridáva počas 20 minút a zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 35 hodinovom miešaní pod atmosférou argónu sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a počas 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (35 ml). Po 1 hodinovom miešaní sa zmes okyslí na pH 2,5 pridaním IM kyseliny chlorovodíkovej. Pevný podiel sa filtruje, premyje vodou (3 x 75 ml), suší za vákua, premyje 2 % metanol-dichlórmetánom (4 x 50 ml), suší za vákua, premyje acetonitrilom (100 ml), premyje vodou (100 ml), suší za vákua, čím sa získa PG-gly-gly-CPT (625 mg, 88 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. ’H NMR (300 MHz v TFA-d): δ 9,45 (s, C-7H), 7,85-8,6 (aromatické protóny), 5,92 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 5,70 (s) 5,62 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 4,20-5,10 (m), 32,10-2,90 (m), 1,00 (s).
Príklad 6
PG-gly-gly-gly-CPT
Do roztoku ((W-(/erc-butoxykarbonyl)gIycyl)glycyl)glycínu (1,99, 6,88 mmol) a 20(S)-kamptotecínu (1,20 g, 3,44 mmol) v bezvodom dimetylformamide (20 ml), chladenom na teplotu 0 °C, sa pridá N,Ndimetylaminopyridín (630 mg, 5,16 mmol), potom pomaly 1,3diizopropylkarbodiimid (0, 96 g, 7,6 mmol) a reakčná zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 16 hodinovom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli, nechá reagovať s vodou (55 ml) a extrahuje dichlórmetánom (3 x 50 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú postupne 0,lM kyselinou chlorovodíkovou (2 x 50 ml) a vodou (2 x 50 ml) a sušia nad síranom sodným. Po odparení rozpúšťadla za níženého tlaku sa zvyšok čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 4 % metanoldichlórmetánu, čím sa získa 20-O-(((W-(/erc-butoxykarbonyl)glycyl)glycyl)glycyl)kamptotecín (1, 52 g, 71 % výťažok) vo forme svetlo žltého prášku. 'H NMR (CDCI3): δ 8,40 (s, 1 H), 8,25 (d, J = 8,38 Hz, 1 H), 7,91 (d, J = 8,07, 1 H), 7,76-7,85 (m, 1 H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 7,26 (s, 1 H), 7,05 (br s, 1 H), 5,65 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2H), 5,15 (br s, 1 H), 3,70-4,45 (m, 6H), 2,15-2,35 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 0,95 (t, J = 7,47 Hz, 3H).
Roztok 20-O-(((jV-(/erc-butoxykarbonyl)glycyl)glycyl)glycyl)kamptotecínu (1,50 g, 2,42 mmol) v trifluóroctovej kyseline-dichlórmetánu (1:
1,5 ml) sa mieša počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Po odparení rozpúšťadiel za zníženého tlaku sa zvyšok trituruje etylacetátom (30 ml). Pevný podiel sa filtruje, premyje dichlórmetánom (50 ml) a suší za vákua, čím sa získa trifluóroctová soľ 2O-0-(glycyl-glycyl-glycyl)kamptotecínu (1,3 g, 85 % výťažok) vo forme žltého prášku. *H NMR (DMSO-dô): δ 8,78 (s, 1H), 7,708,65 (m, 4H), 7,10 (s, 1H), 5,55 (s, 2H), 3,95-4,30 (m, 2H), 3,85 (s, 2H), 3,51 (s, 2H), 2,10-2,25 (m, 2H), 0,95 (t, J= 7,4 Hz, 3H).
Do zmesi trifluóroctovej soli 20-O-(glycyl-glycyl-glycyl)kamptotecínu (940 mg, 1,49 mmol) a poly-(L-glutámovej kyseliny) (956 mg) v bezvodom dimetylformamide (29,5 ml), chladenej v ľadovom kúpeli, sa pridá N,Ndimetylaminopyridín (545 mg, 4,47 mmol). Počas 20 minút sa pridáva roztok 1,3-diizopropylkarbodiimidu (275 mg, 1,78 mmol) v dimetyformamide (0,5 ml). Po 3 dennom miešaní pod atmosférou argónu sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a počas 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (69 ml). Po 1 hodinovom miešaní sa zmes okyslí na pH 2,5 pridaním IM kyseliny chlorovodíkovej. Pevný podiel sa filtruje, premyje vodou (3 x 75 ml), suší za vákua, premyje 2 % metanol-dichlórmetánom (3 x 50 ml), suší za vákua, premyje acetonitrilom (100 ml), premyje vodou (100 ml) a suší za vákua, čím sa získa PG-gly-gly-gly-CPT (1,50 g, 87 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. 'H NMR (300 MHz v TFA-d): δ 9,45 (s, C-7H), 7,85-8,50 (aromatické protóny), 5,92 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 5,70 (s) 5, 62 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 4,10-5,00 (m), 2,05-2,75 (m), 1,05 (s).
Príklad 7
PG-ala-CPT
Do roztoku A-(/erc-butoxykarbonyloxy)alanínu (568 mg, 3,0 mmol) v bezvodom dimetylformamide (8 ml), chladenom na teplotu 0 °C, sa pridá 20(S)kamptotecín (348 mg, 1,0 mmol) a dimetylaminopyridín (244 mg, 2,0 mmol).
1,3-Diizopropylkarbodiimid (379 mg, 3,0 mmol) sa pomaly pridá a reakčná zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 16 hodinovom miešaní sa zmes nechá reagovať s vodou (50 ml) a extrahuje dichlórmetánom (4 x 40 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú postupne 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 50 ml), vodou (2 x 50 ml), 0,1 M vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2 x 25 ml) a vodou (2 x 50 ml). Po sušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odparuje za zníženého tlaku a zvyšok čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 2 % metanoldichlórmetánu, čím sa získa 2O-0-(Ar-(/erc-butoxykarbonyloxy)alanyl)kamptotecín (420 mg, 81 % výťažok) vo forme žltého prášku. *H NMR (CDC13): δ 8,35 (s, 1 H), 8,22 (d, J = 8,38 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 8,07, 1H), 7,76-7,85 (m, 1H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 7,26 (s, 1 H), 5,70 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2H), 4,95 (br s, 1 H), 4,45 (br t, 1 H), 2,05-2,30m (m, 2H), 1,55 (d, 3H), 1,45 (s, 9H), 0,95 (t, J = 7,47 Hz, 3H).
Roztok 20-<9-(Ar-(ferc-butoxykarbonyloxy)alanyl)kamptotecínu (300 mg, 0,57 mmol) v trifluóroctovej kyseline-dichlormetánu (1:1, 2 ml) sa mieša počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Po odparení rozpúšťadiel za zníženého tlaku sa zvyšok trituruje 10 % metanol-chloroformom (12 ml). Filtráciou sa získa trifluóroctová soľ 20-<9-(alanyl)kamptotecínu (318 mg, 87 % výťažok) vo forme žltého prášku, ktorý sa ihneď používa v nasledujúcej reakcii.
Do miešanej suspenzie trifluóroctovej soli 20-<?-(alanyl)kamptotecínu (114 mg, 0,21 mmol), poly-(L-glutámovej kyseliny) (280 mg) a N,Ndimetylaminopyridínu (77 mg, 0,63 mmol) v bezvodom dimetylformamidu (8,5 ml) sa počas 20 minút pridáva roztok 1,3-diizopropylkarbodiimidu (34,5 mg, 0,273 mmol) v dimetylformamide (0,5 ml). Zmes sa mieša pod atmosférou argónu počas 2 dní. Po ochladení v ľadovom kúpeli sa počas 30 minút pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (21 ml). Po 1 hodinovom miešaní sa zmes upraví na pH 2,5 pridaním IN kyseliny chlorovodíkovej. Pevný podiel sa filtruje, premyje vodou (5 x 25 ml) a suší za vákua. Pevný podiel sa premyje 2 % metanol-dichlórmetánom (4 x 50 ml) a suší za vákua, čím sa získa PG-alaCPT (330 mg, 81 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. ’H NMR (300
MHz v TFA-í/): δ 9,45 (s, C-7H), 7,85-8,6 (aromatické protóny), 5,92 (d, J =
18,3 Hz, protón laktónu), 5,70 (s) 5,62 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 4,806,05 (m), 3,80-4,50 (m), 1,20-2,80 (m), 1,70 (br s), 1,00 (s).
Príklad 8
PG-(P-ala)-CPT
Do roztoku N-Zerc-butoxykarbonyl-p-alanínu (568 mg, 3,0 mmol) v bezvodom dimetylformamide (8 ml), chladenom na teplotu 0°C, sa pridá 20(S)kamptotecín (348 mg, 1,0 mmol) a dimetylaminopyridín (244 mg, 2,0 mmol). Pomaly sa pridáva 1,3-diizopropylkarbodiimid (379 mg, 3,0 mmol) a reakčná zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 16 hodinovom miešaní sa zmes zriedi vodou (50 ml) a extrahuje dichlórmetánom (4 x 40 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú postupne 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 50 ml), vodou (2 x 50 ml), 0,1 M vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2 x 25 ml) a vodou (2 x 50 ml). Po sušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odparuje za zníženého tlaku. Zvyšok sa čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu mobilnou fázou 2 % metanoldichlórmetánu, čím sa získa 20-<9-(N-/erc-butoxykarbonyl-Palanyl)kamptotecín (431 mg, 83 % výťažok) vo forme svetlo žltého prášku. *H NMR (CDCh): δ 8, 35 (s, 1H), 8,22 (d, J = 8,38 Hz, 1 H), 7,91 (d, J = 8,07, 1 H), 7,76-7,85 (m, 1 H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,26 (s, 1 H), 5,70 (d, J =
17,25 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2H), 5,15 (br s, 1 H), 3,30-3,50 (m, 2H), 2,55-2,80m (m, 2H), 2,15-2,25 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 0,95 (t, J = 7,47 Hz, 3H).
Roztok 20-O-(7ť-terc-butoxykarbonyl-P-alanyl)kamptotecínu (250 mg, 0,48 mmol) v zmesi trifluóroctovej kyseliny a dichlórmetánu (1:1, 2 ml) sa mieša pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Po odparení rozpúšťadla za zníženého tlaku sa zvyšok trituruje zmesou metanolu, hexánov a dichlórmetánu (1:2:7). Filtráciou sa získa trifluóroctová soľ 20-O-(P-alanyl)kamptotecínu (241 mg, 94 % výťažok) vo forme žltého prášku. *H NMR (DMSO-dé): δ 8,78 (s, 1 H), 8,058,50 (m, 2H), 7,60-7,94 (m, 2H), 7,15 (s, 1H), 5,55 (s, 2H), 5,30 (s, 2H), 2,8032
3,60 (m, 4H), 2,15-2,25 (m, 2H), 1,00 (t, J= 7,4 Hz, 3H). Do miešanej zmesi trifluóroctovej soli 20-O-(P-alanyl)kamptotecínu (241 mg, 0,45 mmol), poly-Lglutámovej kyseliny (326 mg) a A.ľV-dimetylaminopyridínu (165 mg, 1,35 mmol) v bezvodom dimetylformamide (12,5 ml) sa počas 20 minút pridáva roztok 1,3-diizopropylkarbodiimidu (74 mg, 0,59 mmol) v dimetyformamide (0,5 ml). Po 2 dennom miešaní pod atmosférou argónu sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a počas 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (30 ml). Po 1 hodinovom miešaní sa zmes okyslí na pH 2,5 pridaním IM kyseliny chlorovodíkovej. Pevný podiel sa filtruje, premyje vodou (5 x 25 ml) a suší za vákua. Pevný podiel sa premyje zmesou 2 % metanolu a dichlórmetáne (4 x 50 ml) a suší za vákua, čím sa získa PG-(P-ala)-CPT (485 mg, 94 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. *H NMR (300 MHz v TFAdy. δ 9,45 (s, C-7H), 7,85-8,6 (aromatické protóny), 5,92 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 5,70 (s) 5,62 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 4,70-5,10 (m), 3,65-3,90 (m), 2,00-3,10 (m), 1,00 (s).
Príklad 9
PG-(4-NH-butyryl)-CPT
Do roztoku 4-(/erc-butoxykarbonylamino)butyrovej kyseliny (203 mg, 3,0 mmol) v bezvodom dimetylformamide (8 ml), chladenom na teplotu 0 °C, sa pridá 20(S)-kamptotecín (348 mg, 1,0 mmol), jV,2V-dimetylaminopyridín (244 mg, 2,0 mmol), potom 1,3-diizopropylkarbodiimid (379 mg, 3,0 mmol), ktorý sa pridáva pomaly. Reakčná zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 16 hodinovom miešaní sa zmes nechá reagovať s vodou (50 ml) a extrahuje dichlórmetánom (4 x 40 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú s 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 50 ml), vodou (2 x 50 ml), 0,1 M vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2 x 25 ml) a vody (2 x 50 ml). Po sušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odparuje za zníženého tlaku a zvyšok čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 2 % metanolu v dichlórmetáne, čím sa získa 20- O-(4 -(tercbutoxykarbonylamino)butyryl)-kamptotecín (432 mg, 81 % výťažok) vo forme žltého prášku. ‘H NMR (CDC13): δ 8,35 (s, 1 H), 8,22 (d, J = 8,38 Hz, 1 H),
7,91 (d, J = 8,07, 1 H), 7,76-7,85 (m, 1 H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 7,26 (s, 1
H), 5,70 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2H), 4,85 (brs, 1 H), 3,05-3,30 (m, 2H), 2,40-2,60 (m, 2H), 2,05-2,30 m (m, 2H), 1,751,90 (m, 2H), 1,40 (s, 9H), 0,95 (t, J = 7,47 Hz, 3H).
Roztok 20-č)-(4-(Zerc-butoxykarbonylamino)butyryl)kamptotecínu (400 mg, 0,75 mmol) v zmesi trifluóroctovej kyseliny a dichlórmetánu (1:1, 2 ml) sa mieša počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Po odparení rozpúšťadiel za zníženého tlaku sa zvyšok trituruje 10 % metanolom v dichlórmetáne (12 ml). Filtráciou sa získa trifluóroctová soľ 20-(9-(4-aminobutyryl)kamptotecínu (331
I mg, 83 % výťažok) vo forme žltého pevného podielu. ’H NMR (DMSO-dô): δ 8,78 (s, 1 H), 8,05-8,45 (m, 2H), 7,65-7,94 (m, 2H), 7,05 (s, 1 H), 5,55 (s, 2H), 5,30 (s, 2H), 2,60-2,85 (m, 4H), 2,00-2,25 (m, 2H), 1,70-1,90 (m, 2H), 1,00 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
Do suspenzie trifluóroctovej soli 20-č>-(4-aminobutyryl)kamptotecínu (250 mg, 0,46 mmol), poly-(L-glutámovej kyseliny) (414 mg) a N,Ndimetylaminopyridínu (168 mg, 1,38 mmol) v bezvodom dimetylformamide (13,5 ml) sa počas 20 minút pridáva roztok 1,3-diizopropylkarbodiimidu (75 mg, 0,6 mmol) v dimetyformamide (0, 5 ml). Po 2 dennom miešaní pod atmosférou argónu sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a počas 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (35 ml). Po ďalšom 1 hodinovom miešaní sa zmes okyslí na pH 2,5 pridaním IM kyseliny chlorovodíkovej a filtruje. Pevný podiel sa premyje vodou (5 x 25 ml), suší za vákua, premyje zmesou 2 % metanolu v dichlórmetáne (4 x 50 ml) a suší za vákua, čím sa získa PG-(4-NH-butyryl)-CPT (574 mg, 94 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. *H NMR (300 MHz v TFA-ď) δ 9,45 (s, C-7H), 8,30-8,52 (m, aromatické protóny), 8,27 (t, J = 6,6 Hz, aromatické protóny), 7,95 (s, aromatický protón), 7,20 (s, aromatický protón), 5,92 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 5,70 (s), 5,62 (d, J — 18,3 Hz, protón laktónu), 4,70-5,05 (m), 3,453,70 (m), 2,02-3,00 (m), 1,05 (br s),
Príklad 10
PG-(2-<9-acetyl)-CPT
20-O-(2-hydroxyacetyl)kamptotecín sa pripraví podľa spôsobu popísaného v Greenwald et al, Bioorg. Med. Chem. 6\ 551-562 (1998). Do roztoku 2O-0-(2-hydroxyacetyl)kamptotecínu (80 mg, 0,20 mmol) a poly-(Lglutámovej kyseliny) (411 mg) v dimetylformamide (20 ml) sa postupne pridá chlórmetylpyridínium-jodid (163 mg, 0,64 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (89 mg, 0,73 mmol). Po 18 hodinovom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a v priebehu 1 hodiny sa pridá 10 % vodný roztok chloridu sodného (50 ml). Hodnota pH výslednej zmesi sa zníži na 2 pomalým pridaním 0,1 M kyseliny chlorovodíkovej. Precipitát sa spojí po centrifugácii a suspenduje vo vode (25 ml) a znovu spojí po centrifugácii. Tento postup sa opakuje ešte dvakrát a pevný podiel sa suší za vákua. Pevný podiel sa následne suspenduje v zmesi chloroformu a metanolu (95:5, 10 ml) a počas 90 minút podrobí ultrazvuku. Zmes sa filtruje a pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PG-(2-G-acetyl)CPT (404 mg, 86 % látková bilancia) vo forme svetlo žltého pevného podielu. 15 % Hmotnostné naviazanie sa potvrdí na základe hmotnosti izolovaného 20G-(2-hydroxyacetyl)kamptotecínu. *H NMR (300 MHz, dô-DMSO) δ 7,6-8,7 (mnohopočetné široké signály CPT Ar-H), 7,15 (s, CPT Ar-H), 4,8-5, 6 (široké signály, CPT laktón, C5-CH2-), 3,7-4,3 (široký signál, PG α-CH), 3,1-3,4
(široký singlet, PG), 1,7-2,4 (široké CH2CH3). signály, PG), 1,0 (br signál, CPT-
Príklad 11
PG-(4-O-butyryl)-CPT
Do zmesi 20(S)-kamptotecínu (300 mg, 0,86 mmol) a 4-
benzyloxybutyrovej kyseliny (501 mg, 2,58 mmol) v bezvodom
dimetylformamide (12 ml) chladenom na teplotu 0°C sa pridá N,N-
dimetylaminopyridín (210 mg, 1,72 mmol). Pomaly sa pridá 1,3diizopropylkarbodiimid (326 mg, 2,58 mmol) a reakčná zmes sa potom nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 15 hodinovom miešaní sa zmes nechá reagovať s vodou (50 ml) a extrahuje dichlórmetánom (4 x 40 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 50 ml), vodou (2 x 50 ml) a sušia nad síranom sodným. Po odparení rozpúšťadla za zníženého tlaku sa zvyšok čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 2 % metanolu v dichlórmetáne, čím sa získa 20-0-(4benzyloxybutyryl)kamptotecín (432 mg, 81 % výťažok) vo forme žltého prášku. ’H NMR (CDC13): δ 8,35 (s, 1 H), 8,22 (d, J = 8,38 Hz 1 H), 7,91 (d, J = 8,07, 1 H), 7,76-7,85 (m, 1H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 7,20-7,40 (m, 6H),
5,70 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2H), 4,52 (brs, 2H), 3,45-3,60 (m, 2H), 2,60-2,75 (m, 2H), 1,90-2,35 (m, 4H), 0,95 (t, J = 7,47 Hz, 3H).
Do zmesi 2O-0-(4-benzyloxybutyryl)kamptotecínu (1,0 g, 1,90 mmol) a 10 % palladia na aktívnom uhlí (50 % vody, 200 mg) suspendovaného v etanol1,4-dioxáne (4:1, 20 ml) sa pridá cyklohexén (0,78 g, 9,5 mmol). Po 15 hodinovom zahrievaní pri miernom refluxe sa zmes ochladí a katalyzátor sa odstráni filtráciou. Po koncentrácii za zníženého tlaku sa pevný zvyšok kryštalizuje metanolom (8,0 ml), čím sa získa 20-0-(4hydroxybutyryl)kamptotecín (679 mg, 82 % výťažok) vo forme svetlo žltého prášku. ’H NMR (CD3OD): δ 8,40 (s, 1 H), 8,05 (d, J = 8,38 Hz 1 H), 7,91 (d, J = 8,07, 1 H), 7,76-7,85 (m, 1 H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 7,30 (s, 1 H), 5,70 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2H), 3,50 (t, 3H), 2,50 (t, 2H), 1,70-2,30 (m, 4H), 0,95 (t, J ť 7,47 Hz, 3H).
Do zmesi 2O-0-(4-hydroxybutyryl)kamptotecínu (114 mg, 0,26 mmol) a poly-(L-glutámovej kyseliny) (265 mg, 1,8 mmol) v bezvodom dimetylformamide (7,5 ml) sa pridá dimetylaminopyridín (6 mg, 0,052 mmol), potom sa pomaly pridá 1,3-diizopropylkarbodimid (43 mg, 0,34 mmol) a reakčná zmes sa mieša pod argónom počas 5 hodín. Po ochladení v ľadovom kúpeli sa po kvapkách pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (18 ml). Hodnota pH sa upraví na 2,5 pridaním IN kyseliny chlorovodíkovej. Po 1 hodinovom miešaní pri izbovej teplote sa zmes filtruje, pevný podiel premyje vodou (3 x 30 ml) a suší za vákua. Prášok sa premyje zmesou 2 % metanolu v dichlórmetáne (4 x 30 ml) a suší za vákua, čím sa získa PG-(4-D-butyryl)-CPT (360 mg, 95 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. lH NMR (300 MHz v TFA-í/): δ 9,45 (s, C-7H), 8,30-8,52 (m, aromatické protóny), 8,27 (t, J = 6,6 Hz, aromatický protón), 7,95 (s, aromatický protón), 5,92 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 5,70 (s,) 5,62 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 4,90 (br s), 4,40 (s), 2,00-2,90 (m), 1,10 (br s).
Príklad 12
PG-(y-glu)-CPT
Do roztoku //-(/erc-butoxykarbonyljglutamyl-y-ŕerc-butylesteru (910 mg, 3,0 mmol) v bezvodom dimetylformamide (8 ml), chladenom na teplotu 0 °C, sa pridá 20(S)-kamptotecín (348 mg, 1,0 mmol) a jV,7V-dimetylaminopyridín (244 mg, 2,0 mmol), potom sa pomaly pridáva 1,3-diizopropylkarbodiimid (379 mg, 3,0 mol) a reakčná zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 16 hodinovom miešaní sa zmes nechá reagovať s vodou (50 ml) a extrahuje dichlórmetánom (4 x 40 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú postupne 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 50 ml), vodou (2 x 50 ml), 0,1 M vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2 x 25 ml) a vodou (2 x 50 ml). Po sušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odparuje za zníženého tlaku. Zvyšok sa čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 2 % metanolu v dichlórmetáne, čím sa získa a-/erc-butylester 20-č>-(N-(/ercbutoxykarbonyl)-y-glutamyl)kamptotecínu (432 mg, 81 % výťažok) vo forme žltého prášku. 'H NMR (CDCis): δ 8,40 (s, 1 H), 8,22 (d, J = 8,38 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 8,07, 1H), 7,65-7,85 (m, 2H), 7,26 (s, 1H), 5,70 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2H), 5,05 (br d, 1 H), 4,10 (brs, 1H), 1,85-2,70 (m, 6H), 1,45 (s, 18H), 0,95 (t, J = 7,47 Hz, 3H).
Roztok Zerc-butylesteru 20-O-(N-(tercbutoxykarbonyl)glutamyl)kamptotecínu (300 mg, 0,47 mmol) v zmesi dichlórmetánu a trifluóroctovej kyseliny (1:1, 1 ml) sa mieša pri izbovej teplote počas 20 minút. Po odparení rozpúšťadiel za zníženého tlaku sa zvyšok trituruje zmesou metanolu, dichlorometánu a hexánov (1:2:2, 10 ml). Filtráciou sa získa trifluóroctová soľ α-Zerc-butylesteru 20-0-(y-glutamyl)kamptotecínu (239 mg, 79 % výťažok) vo forme žltého pevného podielu. ’H NMR (DMSOd6): δ 8,78 (s, 1 H), 7,70-8,20 (m, 3H), 7,05 (s, 1 H), 5,55 (s, 2H), 5,30 (s, 2H), (brs, 1H), 1,90-2,85 (m, 6H) 1,50 (s, 9H), 1,00 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
Do zmesi trifluóroctovej soli α-Zerc-butylesteru 20-Ο-(γglutamyl)kamptotecínu (239 mg, 0,37 mmol), poly-(L-glutámovej kyseliny) (395 mg, 2,69 mmol) a MTV-dimetylaminopyridínu (135,6 mg, 1,11 mmol) v bezvodom dimetylformamide (12,5 ml) sa pridá roztok 1,3diizopropylkarbodiimidu (61 mg, 0,48 mmol) v dimetyformamide (0,5 ml) počas 20 minút. Po 2 dennom miešaní pod atmosférou argónu sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a počas 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (30 ml). Po 1 hodinovom miešaní sa zmes okyslí na pH 2,5 pridaním 1 M kyseliny chlorovodíkovej. Pevný podiel sa filtruje, premyje vodou (4 x 30 ml) a suší za vákua, premyje zmesou 2 % metanolu v dichlórmetáne (4 x 50 ml) a suší za vákua, čím sa získa α-Zerc-butylester PG-(y-glu)-CPT (556 mg, 94 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. ’H NMR (300 MHz v TFA-d): δ 9,45 (s, C-7H), 7,90-8,60 (m, aromatické protóny), 7,25 (s, aromatický protón), 5,92 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 5,70 (s), 5,62 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 4,60-5,0 (m), 2,05-3,00 (m), 1,55 (s), 1,10 (br s).
Roztok α-Zerc-butylesteru PG-(y-glu)-CPT (550 mg) v trifluóroctovej kyseline (5 ml) sa mieša pri izbovej teplote počas 16 hodín. Po koncentrácii za zníženého tlaku sa zvyšok premyje vodou (100 ml) a suší za vákua, čím sa získa PG-(y-glu)-CPT (460 mg) vo forme žltého prášku. *H NMR (300 MHz v TFA-z/): δ 9,45 (s, C-7H), 7,90-8,60 (m, aromatické protóny), 5,92 (d, J - 18,3 Hz, protón laktónu), 5,70 (s), 5,62 (d, J = 18,3 Hz, protón laktónu), 4,60-5,0 (m), 2,05-3,00 (ri), 1,05 (br s).
Príklad 13
PG-(IO-O-CPT)
Suspenzia sodnej soli poly-(L-glutámovej kyseliny) (50 kD, 740 mg) v dimetylformamide (30 ml) sa ochladí v ľadovom kúpeli, potom sa pridá metánsulfónová kyselina (0,3 ml, 4,6 mmol) a zmes sa mieša počas 30 minút. Následne sa postupne pridá 10-hydroxykamptotecín (166 mg, 0,45 mmol), chlórmetylpyridínium-jodid (190 mg, 0,74 mmol) a 4-dimetylaminopyridín (168 mg, 1,4 mmol). Zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu a mieša intenzívne počas 20 hodín, ochladí v ľadovom kúpeli a za intenzívneho miešania sa počas 45 minút pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (100 ml). Po okyslení na pH 1-2 pomalým pridaním 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej sa zmes nechá ohriať na izbovú teplotu a mieša počas ďalších 30 minút. Pevný podiel sa spojí centrifugáciou a supernatant dekantuje. Pevný podiel sa suspenduje vo vode (200 ml) a znovu izoluje po centrifugácii. Tento premývací proces sa opakuje dvakrát a pevný podiel sa suší za vákua. Suspenzia pevného podielu v 2 % metanole v chloroforme (25 ml) sa podrobí ultrazvuku (90 minút) a filtruje. Tento premývací proces sa opakuje a pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PG-( 10-O-CPT) (674 mg, 93 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. *H NMR (300 MHz, dé-DMSO) δ 7,2-8,6 (mnohopočetné široké signály, Ar-H), 5,45, 5,20 (br s, C-17, C-5 CH2), 0,85 (br triplet, C-18 CH3). Percentuálne naviazanie je 13 %, vypočítané z hmotnosti 20(S)-lO-hydroxykamptotecínu izolovaného zo zmesi metanolu v chloroforme premývacích roztokov.
Alternatívne sa PG-(10-O-CPT) pripraví podľa spôsobu popísaného vyššie, ale použije sa poly-(L-glutámová kyselina) miesto sodnej soli poly-(Lglutámovej kyseliny) a metánsulfónovej kyseliny.
Príklad 14
PG-gly-(l 0-O-CPT)
Roztok /ť-ŕerc-butoxykarbonylglycínu (603 mg, 3,4 mmol) v dimetylformamide (10 ml) sa nechá reagovať s diizopropylkarbodiimidom (0,27 ml, 1,7 mmol). Po 15 minútovom miešaní sa tento roztok pridá do roztoku 20(S)-10-hydroxykamptotecínu (406 mg, 1,11 mmol) a pyridínu (0,9 ml) v dimetylformamide (10 ml). Po 4 hodinovom miešaní sa zmes naleje do vody (300 ml) a extrahuje s chloroformom (4 x 75 ml). Spojené chloroformové extrakty sa premyjú 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 100 ml), potom nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2 x 100 ml), sušia nad síranom sodným, filtrujú a koncentrujú za vákua. Zvyšok sa čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 2 % metanolu v chloroforme, čím sa získa 20(S)-1 Q-(N-tercbutoxykarbonylglycyloxy)kamptotecín (247 mg, 43 %) vo forme svetlo žltého prášku. ’H NMR (300 MHz, CDC13) δ 8, 32 (s, 1 H), 8,21 (d, J = 8 Hz, 1 H),
7,70 (d, J = 3 Hz, 1 H), 7,64 (s, 1 H), 7,56 (dd, J = 8,3 Hz, 1 H), 5,73 (d, J = 15
Hz, 1 H), 5,28 (d, J = 15 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2 H),' 5,17 (m, 1 H), 4,26 (d, J = 7
Hz, 2 H), 1,88 (sep., J = 6 Hz, 2 H), 1,49 (s, 9 H), 1,04 (t, J = 6 Hz, 3 H),
Roztok 20(S)-l 0-(W-/erc-butoxykarbonylglycyloxy)kamptotecinu (206 mg, 0,39 mmol) v dichlórmetáne (10 ml) a trifluóroctovej kyseliny (5 ml) sa mieša počas 90 minút. Po koncentrácii za vákua sa zvyšok rozpustí v chloroforme (50 ml) a koncentruje za vákua. Zvyšok sa rozpustí v toluéne (50 ml) a koncentruje za vákua, čím sa získa 20(S)-10-(glycyloxy)kamptotecín.
Roztok 20(S)-10-(glycyloxy)kamptotecínu v dimetylformamide (10 ml) sa pridá do roztoku poly-(L-glutámovej kyseliny) (50 kD, 641 mg) v dimetylformamide (20 ml), potom sa pridá 4-dimetylaminopyridín (151 mg, 1,2 mmol) a diizopropylkarbodiimid (0,08 ml, 0,5 mmol). Po intenzívnom 60 hodinovom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a za intenzívneho miešania sa počas 1 hodiny pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (75 ml). Po okyslení na pH 1-2 pomalým pridaním 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej sa zmes nechá ohriať na izbovú teplotu a mieša počas 30 minút. Pevný podiel sa spojí centrifugáciou a supernatant dekantuje. Pevný podiel sa suspenduje vo vode (200 ml) a znovu izoluje po centrifugácii. Tento premývací proces sa opakuje dvakrát a pevný podiel sa suší za vákua. Suspenzia pevného podielu v % metanole v chloroforme (25 ml) sa podrobí ultrazvuku (90 minút) a filtruje. Tento premývací proces s 2 % metanolom v chloroforme sa opakuje. Pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PG-gly-(l O-O-CPT) (560 mg, 70 %) vo forme žltého prášku. 'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ 7,2-8,8 (mnohopočetné široké signály, Ar-H), 5,45, 5,20 (br s, C-17, C-5 CH2), 0,9 (br s, C-I8CH3).
Príklad 15
PG-(9-NH-CPT)
Do zmesi 20(S)-9-aminokamptotecínu (157 mg, 0,43 mmol) a poly-(Lglutámovej kyseliny) (38 kD, 628 mg), sušenej za vákua počas 4 hodín, sa pridá bezvodý dimetylformamid (35 ml). Po ochladení v ľadovom kúpeli sa pridá 2-chlórmetylpyridínium-jodid (199 mg, 0,78 mmol) a N,Ndimetylaminopyridín (200 mg, 1,64 mmol) a zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu. Po 2 dennom miešaní sa zmes ochladí na teplotu 0 °C a počas 25 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (82 ml). Zmes sa okyslí na pH
2,5 pridaním IM kyseliny chlorovodíkovej (3,5 ml) a mieša pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Precipitát sa filtruje, premyje vodou (4 x 50 ml) a suší za vákua. Pevný podiel sa rozotrie na prášok a suspenduje v 2 % metanole v dichlórmetáne (10 ml). Po 3 hodinovom miešaní sa pevný podiel separuje centrifugáciou a supernatant dekantuje. Tento premývací proces sa opakuje štyrikrát kvôli úplnému odstráneniu nezreagovaného 20(S)-9aminokamptotecínu. Pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PG-(9-NHCPT) (592 mg, 80 % látková bilancia vypočítaná z hmotnosti izolovaného 20(S)-9-aminokamptotecínu (45 mg)). *H NMR (300 MHz v DMSO-dó): δ 12, 10 (s, -COOH), 8,80 (s), 6,50-8,5 (m), 5,15-5,8 (m), 3,10-4,35 (m), 1,42-2,62 (m,), 0,90 (br s, I9-CH3). Percentuálna hmotnosť naviazaného 20(S)-9aminokamptotecínu v tejto vzorke PG-(9-NH-CPT) je 14 %, vypočítané z hmotnosti spotrebovaného 20(S)-9-aminokamptotecínu (115 mg) počas kopulačnej reakcie.
Príklad 1 6
PG-gly-(9-NH-CPT)
20(S)-9-(7^-Zerc-butoxycabonylglycylamino)kamptotecín sa pripraví modifikáciou spôsobu popísaného Wall et al, J. Med. Chem. 1993, 36, 26892700. Do roztoku 7V-/erc-butoxykarbonylglycínu (526 mg, 3,0 mmol) v bezvodom dimetylformamide (10 ml) sa počas 30 minút pridáva 20(S)-9aminokamptotecín (363 mg, 1,0 mmol), potom 1,3-diizopropylkarbodiimid (379 mg, 3,0 mmol). Po 12 hodinovom miešaní pod atmosférou argónu sa zmes nechá reagovať s vodou (50 ml) a extrahuje dichlórmetánom (3 x 100 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú vodou (50 ml), 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 50 ml), 0,1 M nasýteným vodný roztokom hydrogénuhličitanu sodného a vodou (50 ml). Roztok sa suší nad síranom sodným a koncentruje za zníženého tlaku, zvyšok sa kryštalizuje (metanolchloroform (1:9)), čím sa získa 20(S)-9-(jV-ŕerc-butoxycabonylglycylamino)kamptotecín (354 mg, 68 % výťažok) vo forme žltého prášku. ’H NMR (DMSOd6): δ 10,10 (s, 1H), 8,79 (s, 1H), 8,03 (d, J = 7 Hz, 1 H), 7,85 (t, J = 7 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,37 (s, 1H), 7,19 (t, J = 6 Hz, 1H), 6,53 (s, 1 H), 5,44 (s, 2H), 5,29 (s, 2H), 3,92 (m, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 0,89 (t, J = 7Hz, 3H).
Roztok 20(S)-9-(jV-/erc-butoxycabonylglycylamino)kamptotecínu (80 mg, 0,15 mmol) v zmesi trifluóroctovej kyseliny dichlórmetánu (1:1, 4 ml) sa mieša počas 1 hodiny pri izbovej teplote, rozpúšťadlá sa odparujú za zníženého tlaku a pevný podiel rekryštalizuje (dichlórmetán-dietyléter (3:7, 50 ml), čím sa získa trifluóroctová soľ 20(S)-9-(glycylamino)-kamptotecínu (78 mg, 82 % výťažok) vo forme hnedastého žltého prášku.
Do miešanej suspenzie trifluóroctovej soli 20(S)-9-(glycylamino)kamptotecínu (78 mg, 0,15 mmol), poly-(L-glutámovej kyseliny) (38 kD, 222 mg) a N,?/-dimetylaminopyrÍdínu (46 mg, 0,37 mmol) v bezvodom dimetylformamide (5,5 ml) sa počas 20 minút pridáva roztok 1,3diizopropylkarbodiimidu (17 mg, 0,14 mmol) v dimetyformamide (0,5 ml). Po 2 dňovom miešaní pod atmosférou argónu sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a počas 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (15 ml). Po ďalšom 1 hodinovom miešaní sa zmes okyslí na pH 2,5 pridaním 1 M kyseliny chlorovodíkovej (1,5 ml) a filtruje. Pevný podiel sa premyje vodou (5 x 25 ml), suší za vákua, premyje 2 % metanoldichlórmetánom (3 x 50 ml) a suší za vákua, čím sa získa PG-gly-(9-NH-CPT) (255 mg, 92 % látková bilancia) vo forme hnedastého žltého prášku. Hmotnostné percento naviazaného 20(S)-9aminokamptotecínu v tejto vzorke PG-gly-(9-NH-CPT) je 20 %, vypočítané z hmotnosti spotrebovaného 20(S)-9-aminokamptotecínu pri kopulačnej reakcii.
Príklad 17
PG-gly-(l O-OH-CPT)
Do roztoku 20(S)-l0-/erc-butoxykarbonyloxykamptotecínu (350 mg, 0,77 mmol), A-zerc-butoxykarbonylglycínu (403 mg, 2,3 mmol) a 4dimetylaminopyridínu (283 mg, 2,3 mmol) v dichlórmetáne (20 ml) sa pridá diizopropylkarbodiimid (0, 36 ml, 2,3 mmol). Po 20 hodinovom miešaní sa zmes zriedi chloroformom (150 ml) a premyje 1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 100 ml), potom nasýteným vodný roztokom hydrogénuhličitanu sodného a vodou (1:1, 2 x 50 ml). Organická fáza sa suší nad síranom sodným, filtruje a koncentruje za vákua, zvyšok čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 1 % metanolu v chloroforme, čím sa získa 20-D-(AZerc-butoxykarbonylglycyl)-l 0-(/erc-butoxykarbonyloxy)-kamptotecínu (250 mg, 52 % výťažok) vo forme žltého prášku. ’H NMR (300 MHz, CDC13) 8,34 (s, 1 H), 8,23 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,74 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7,67 (dd, J = 8,2 Hz, 1 H), 5,70 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,41 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,27 (s, 2 H), 4,96 (m, 1 H), 4,29-4,03 (m, 2 H), 2,23 (d, sex, J = 31,6 Hz, 2 H), 1,63 (s, 9 H), 1,43 (s, 9 H), 1,00 (t, J = 6 Hz, 3 H).
Roztok 20-G-(A-/erc-butoxykarbonylglycyl)-1 Q-(tercbutoxykarbonyloxy) -kamptotecínu (250 mg, 0,4 mmol) v dichlórmetáne (40 ml) a trifluóroctovej kyseline (10 ml) sa mieša počas 60 minút. Po koncentrácii za vákua sa zvyšok rozpustí v metanole (10 ml), potom sa pridá toluén (50 ml) a roztok koncentruje za vákua. Tento proces sa opakuje dvakrát, čím sa získa 20-G-glycyl-l O-hydroxy-kamptotecín. 20-O-glycyl-10-hydroxykamptotecín, pripravený v predošlom kroku, sa rozpustí v dimetylformamide (5 ml) a nechá reagovať s N,?'/-diizopropyletylamínom (0,2 ml, 1,1 mmol). Tento roztok sa pridá do roztoku poly-(L-glutámovej kyseliny) (37,7 kD, 640 mg) a diizopropylkarbodiimidu (0,1 M, 0,64 mmol) v dimetylformamide (23 ml). Po 18 hodinovom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a za intenzívneho miešania sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (75 ml). Po okyslení na pH 1-2 pomalým pridaním 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej sa zmes nechá ohriať na izbovú teplotu a mieša počas 1 hodiny. Pevný podiel sa spojí centrifugáciou a supernatant dekantuje. Pevný podiel sa suspenduje vo vode (200 ml) a znovu izoluje po centrifugácii. Tento prémývací proces sa opakuje dvakrát a pevný podiel sa suší za vákua. Suspenzia pevného podielu v 2 % metanolu v chloroforme (25 ml) sa podrobí ultrazvuku (90 minút) a filtruje. Tento prémývací proces sa opakuje, pevný podiel sa potom suší za vákua, čím sa získa PG-gly-( 1 0-OH-CPT) (663 mg, 83 % látková bilancia) vo forme žltého prášku: ’H NMR (300 MHz, dô-DMSO) δ 7,1-8,5 (mnohopočetné široké signály, Ar-H), 5,45, 5,20 (br s, C-17, C-5 CH2), 0,9 (br s, C-18 CH3).
Príklad 18
PG-gly-(7-Et-10-OH-CPT)
20(S)-7-Etyl-l0-hydroxykamptotecín (SN 38) (333 mg, 0,85 mmol) sa rozpustí v zmesi dimetylformamidu (6 ml) a pyridínu (2 ml). Pridá sa roztok di-Zerc-butyl-dikarbonátu (294 mg, 1,35 mmol) v dimetylformamide (2 ml) a zmes sa mieša pri izbovej teplote počas 19 hodín, koncentruje za vákua a zvyšok sa čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze chloroform-metanol (99:1), čím sa získa 20(S)-l 0-Zerc-butoxykarbonyloxy-7etylkamptotecín (337 mg, 80 % výťažok) vo forme žltého prášku. *H NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,24 (d, J = 12 Hz, 1 H), 7,88 (d, J = 4 Hz, 1 H), 7,63-7,70 (m, 2 H), 5,75 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,31 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,27 (s, 2 H), 3,28 (q, J = 7 Hz, 2 H), 1,90 (sep, J = 8 Hz, 2 H), 1,61 (s, 9 H), 1,43 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,08 (t, J = 8 Hz, 3 H).
Hydrochlorid 1 -(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (192 mg, 1,0 mmol) sa pridá do roztoku 1O-íerc-butoxykarbonyloxy-7-etylkamptotecinu (150 mg, 0,30 mmol), V-(terc-butoxykarbonyl)gíycínu (178 mg, 1,0 mmol) a 4dimetylaminopyridínu (137 mg, 1,1 mmol) v dichlórmetáne (15 ml). Po 24 hodinovom miešaní sa zmes zriedi chloroformom (75 ml) a premyje 1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 50 ml) a nasýteným vodným roztokom uhličitanu sodného a vodou (1:1, 2 x 50 ml). Organická fáza sa suší nad síranom sodným, filtruje a koncentruje za vákua, zvyšok sa čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze chloroform-metanol (99:1), čím sa získa 20-<?-(jV-(/erc-butoxykarbonyl)glycyl)-1 Q-tercbutoxykarbonyloxy-7-etylkamptotecín (41 mg, 20 % výťažok) vo forme žltého prášku. ‘H NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,27 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,90· (d, J = 3 Hz, 1 H), 7,68 (dd, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,72 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,42 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,25 (s, 2 H), 4,96 (m, 1 H), 4,29-4,03 (m, 2 H), 3,17 (q, J = 7 Hz, 2 H), 2,23 (d, sex, J = 31,6 Hz, 2 H), 1,63 (s, 9 H), 1,48-1,38 (m, 12 H), 1,00 (t, J = 6 Hz, 3 H).
20-6>-(V-(/erc-butoxykarbonyl)glycyl)-10-rerc-butoxykarbonyloxy-7etylkamptotecín (40 mg, 0,06 mmol) sa rozpustí v dichlórmetáne (25 ml) a pridá sa trifluóroctová kyselina (15 ml). Po 1 hodinovom miešaní sa zmes koncentruje za vákua, zvyšok sa rozpustí v metanole (20 ml) a pridá sa toluén (20 m). Roztok sa koncentruje za vákua. Tato procedúra sa opakuje ešte dvakrát. Výsledný pevný podiel sa rozpustí v dimetylformamide (3 ml) a nechá reagovať s M/V-diizopropyletylamínom (0,03 ml, 0,17 mmol). Tento roztok sa pridá do roztoku poly-(L-glutámovej kyseliny) (168 mg) a diizopropylkarbodiimidu (0,02 ml, 0,13 mmol) v dimetylformamide (6 ml). Po 21 hodinovom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a za intenzívneho miešania počas 60 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (30 ml). Hodnota pH zmesi sa potom zníži na 1-2 pomalým pridaním 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa nechá ohriať na izbovú teplotu a mieša ďalších 60 minút, centrifuguje a supernatant sa dekantuje. Pevný podiel sa suspenduje vo vode (75 ml) a znovu separuje centrifugáciou. Tento postup sa opakuje ešte dvakrát a pevný podiel sa suší za vákua počas 24 hodín. Pevný podiel sa suspenduje v chloroform-metanole (92:2, 25 ml) a výsledná kašovitá zmes sa podrobí ultrazvuku (90 minút). Zmes sa filtruje a postup opakuje. Pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PG-gly-(7-Et-10-OH-CPT) (112 mg, 54 % látková bilancia) vo forme žltého prášku. Podľa *H NMR spektra činí hmotnostné naviazanie 12 %. *H NMR (300 MHz, d-TFA) δ 8, 5-7,7 (mnohopočetné široké signály, Ar-H), 6,0-5,6 (br, signály, C-17, C-5 CH2), 4,6 (m, gly CH2), 3,5 (m, 7-etyl CH2), 1,6 (br, t, 7-etyl CH3), 0,9 (br t, C-18 CH3).
Príklad 19
PG-gly-(7-t-BuMe2Si-10-OAc-CPT)
Do roztoku 20(S)-7-(/erc-butyldimetylsilyl)-10-hydroxykamptotecínu (DB 67; Bom et al, J. Med. Chem. 43: 3970-80 (2000)) (38 mg, 0,08 mmol) v zmesi dichlórmetánu (0,5 ml) a pyridínu (0,1 ml, 1,2 mmol) sa pridá anhydrid octovej kyseliny (0,04 ml, 0,42 mmol). Po 20 hodinovom miešaní sa reakčná zmes koncentruje za vákua, zvyšok čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu mobilnou fázou chloroform-metanol (99:1), čím sa získa 10-acetoxy7-(/erc-butyldimetylsilyl)kamptotecín (29 mg, 70 %) vo forme žltého prášku. *H NMR (300 MHz, CDC13) δ 8, 23 (d, 1 H, J = 10 Hz), 8,08 (d, 1 H, J = 2 Hz), 7,67 (s, 1 H), 7,53 (dd, 1 H, J = 10,2 Hz), 5,75 (d, 1 H, J = 15 Hz), 5,34 (s, 2 H), 5,30 (d, 1 H, J = 15 Hz), 2,39 (s, 3 H), 1,88 (hep, 2 H, J = 9 Hz), 1,06 (t, 3 H, J = 9 H), 0,98 (s, 9 H), 0,69 (s, 6 H).
Hydrochlorid 1 -(3-(dimetylamino)propyl)-3-etylkarbodiimidu (35 mg, 0,18 mmol) sa pridá do roztoku 10-acetoxy-7-(tercbutyldimetylsilyl)kamptotecínu (30 mg, 0,058 mmol), N-(tercbutoxykarbonyl)glycínu (33 mg, 0,19 mmol) a 4-dimetylaminopyridínu (16 mg, 0,13 mmol) v dichlórmetáne. Po 20 hodinovom miešaní sa zmes zriedi dichlórmetánom (25 ml) a výsledný roztok sa premyje 1 M kyselinou chlorovodíkovou (2 x 20 ml). Organická fáza sa suší nad síranom sodným, filtruje a koncentruje za vákua, zvyšok čistí zrýchlenou chromatografiou na stĺpci silikagélu v mobilnej fáze 1 % metanol-chloroformu, čím sa získa 10acetoxy-20-O-(7V-(ferc-butoxykarbonyl)glycyl)-7-(fercbutyldimetylsilyl)kamptotecín (24 mg, 61 % výťažok) vo forme žltého prášku. *H NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,23 (d, 1 H, J = 10 Hz), 8,11 (d, 1 H, J = 2 Hz), 7,56 (dd, 1 H, J = 10,2 Hz), 7,22 (s, 1 H), 5,68 (d, 1 H, J = 15 Hz), 5,40 (d, 1 H, J = 15 Hz), 5,29 (s, 2 H), 4,95 (br s, 1 H), 4,27-4,00 (m, 2 H), 2,40 (s, 3 H), 2,36-2,13 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H), 1,01-0,95 (m, 12 H), 0,70 (s, 6 H).
Do roztoku 10-acetoxy-20-0-(N-(/erc-butoxykarbonyl)glycyl)-7-(/ercbutyldimetylsilyl)kamptotecínu (21 mg, 0,031 mmol) v dichlórmetáne (5 ml) sa pridá trifluóroctová kyselina (2,5 ml). Po 90 minútovom miešaní sa zmes koncentruje za vákua, zvyšok rozpustí v metanol-toluéne (1:1, 4 ml). Roztok sa koncentruje za vákua. Táto procedúra sa opakuje ešte dvakrát, čím sa získa trifluóroctová soľ 10-acetoxy-7-(/erc-butyldimetylsilyl)-20-0(glycyl)kamptotecínu, ktorá sa použije v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia. *H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8, 21-8,11 (m, 2 H), 7,68-7,63 (m, 1 H), 7,42 (s, 1 H), 5,69-5,38 (m, 4 H), 4,22 (q, 2 H, J = 18 Hz), 2,39 (s, 3 H), 2,33-2,20 (m, 2 H), 1,07 (t, 3 H, J = 8 Hz), 1,00 (s, 9 H), 0,75 (s, 6 H).
4-Dimetylaminopyridín (12 mg, 0,098 mmol) a diizopropylkarbodiimid (0,37 ml z 0,1 M roztoku v dimetylformamidu) sa pridá postupne do roztoku trifluóroctovej soli 10-acetoxy-7-(/erc-butyldimetylsilyl)-20-0(glycyl)kamptotecínu (0,03 mmol) a poly-(L-glutámovej kyseliny) (64 mg) v dimetylformamide (5 ml). Po 20 hodinovom miešaní sa zmes ochladí v ľadovom kúpeli a v priebehu 30 minút sa pridáva 10 % vodný roztok chloridu sodného (20 ml). Hodnota pH zmesi sa zníži na 2 pomalým pridaním 0,1 M kyseliny chlorovodíkovej. Precipitát sa spojí centrifugáciou. Pevný podiel sa suspenduje vo vode (10 ml) a po centrifugácii znovu izoluje. Táto sekvencia sa opakuje ešte dvakrát a pevný podiel sa suší za vákua. Pevný podiel sa potom suspenduje v 5 % metanol-chloroforme (10 ml) a podrobí ultrazvuku (90 minút). Zmes sa filtruje a spojený pevný podiel sa suší za vákua, čím sa získa PG-gly-(7-/-BuMe2Si-10-OAc-CPT) (69 mg, 84 % látková bilancia) vo forme svetlo žltého pevného podielu. Podľa ’H NMR činí hmotnostné naviazanie 15
%. *H NMR (300 MHz, CF3CO2D) δ 8,71 (br s CPT Ar-H), 8,17 (s, CPT Ar-H),
7,99-7,91 (m, CPT Ar-H), 6,00-5,58 (m, CPT laktón, C5-CH2-), 5,00-4,77 (m,
PG a-CH), 3,84 (s, Gly CH2), 2,78-2,59 (m, PG-CH2-), 2,38-2,05 (m, PG-CH2), 1,30 (br s, CPT -CH2CH3), 1,12 (br s, CPT (CH3)3CSi(CH3)2), 0,88 (br s,
CPT (CH3)3CSi(CH3)2).
' t
Príklad 20 ln vivo biologické aktivity
A. Kamptotecínové konjugáty
Maximálna tolerovaná dávka (MTD) a relatívna účinnosť PG-CPT konjugátov bola najskôr testovaná pomocou jednotlivých IP injekcií na C57BL/6 myšiach majúcich subkutánne B16 melanómy. Aj keď B16 melanóm je len nepatrne citlivý na 20(S)-kamptotecín, je tento model používaný na screening rôznych zlúčenín na predbežné stanovenie účinnosti vďaka reprodukovateľnosti a schopnosti stanoviť zlúčeninu v krátkej dobe. Nádory boli vytvorené v svale pravej interskapulárnej oblasti subkutánnou injekciou 1,0 x 10s buniek myšieho melanómu (B-16-F0; ATTC CRL-6322) v objeme 0,2 ml PBS suplementovanom 2 % FBS. Testované zlúčeniny a kontrola boli podávané (0,5 ml na 20 g telesnej hmotnosti) 7 alebo 8 dní po implantácii nádorových buniek, keď nádory dorástli do objemu 5 ± 1 mm3. Konjugáty kamptotecínu boli rozpustené v 0,1 M roztoku Na2HPO4 sonikáciou pri teplote 45°C počas 45 - 60 minút. Natívne kamptotecíny boli rozpustené v zmesi 8,3 % Cremophor EL/8,3 % etanolu v 0,75 % fyziologickom roztoku. Všetky injekcie boli podávané intraperitoneálne (IP). Každá ošetrovaná skupina sa skladala z 10 myší náhodne rozdelených do skupín. Objem nádoru bol vypočítaný podľa vzorca (dĺžka x šírka x výška)/2. Myši, ktorých nádory dosahovali alebo boli väčšie než 2000 mm3, boli eutanázované cervikálnou dislokáciou. Účinnosť testovaných zlúčenín proti nádoru bola stanovená vypočítaním oneskorenia rastu nádora (TGD): priemerná doba nádorov v dňoch u ošetrovanej skupiny potrebná na dosiahnutie fixného objemu mínus priemerná doba nádorov v dňoch u kontrolnej skupiny potrebná na dosiahnutie rovnakého objemu. Na stanovenie štatistických rozdielov bol uskutočnený nepárový študentov test. Na stanovenie MTD zlúčenín boli zlúčeniny testované v rôznych koncentráciách. MTD je maximálna tolerovaná ekvivalentná dávka kamptotecínu. Bolo zistené, že MTD pre konjugáty PG-20(S)-kamptotecínu je približne dvakrát väčšie než pre voľný 20(S)-kamptotecín, teda umožňuje podanie vyšších dávok kamptotecínu majúcich za následok zvýšenú protinádorovú účinnosť. Pre priamo kopulovaný 20(S)-kamptotecín, PG-CPT, bolo maximálne naviazanie približne 14 % (hmotnosť 20(S)-kamptotecínu/celková hmotnosť konjugátu). Glycínový linker (PG-gly-CPT) umožňoval až 39 % naviazanie a zvýšenú rozpustnosť vo vode.
B. Účinok rôznych konjugátov PG-kamptotecínu na rast nádoru u zvieracích modelov
Všeobecne bolo zistené, že PG-glycínové konjugáty 20(S)-kamptotecínu boli lepšie než konjugáty PG-CPT pripravené s ďalšími linkermi (biologicky, tj. účinnosť a toxicita a/alebo vzhľadom na rozpustnosť vo vodnom médiu a jednoduchosti syntézy a množstvo kamptotecínu, ktorý by mohol byť naviazaný na hlavný reťazec PG) a lepšie než porovnateľné PG-gly-konjugáty pozostávajúce z 20(S)-9-aminokamptotecínu, 20(S)-lO-hydroxykamptotecínu, 20(S)-7-etyl-10-hydroxykamptotecínu (SN 38) a 20(S)-10-acetoxy-7-(ŕercbutyldimetylsilyl)kamptotecínu (10-O-acetyl DB 67). Dáta podporujúce tento nárok sú zhrnuté nižšie. V niektorých experimentoch boli PG konjugáty porovnávané s nekonjugovaným 20(S)-kamptotecínom alebo komerčne a klinicky dostupným topotecanom. Vo všetkých prípadoch vykazovali PGkonjugáty lepšiu protinádorovú účinnosť než voľné liečivá. Navyše štúdie účinnosti jednotlivej dávky na dvoch ďalších modeloch nádorov (MCA-4 rakoviny prsníka a OSA-1 ovariálnej rakoviny) demonštrovali, že PG-CPT buď priamo kopulovaný alebo pomocou glycínového linkera mal rovnako zvýšenú účinnosť v porovnaní s natívnym 20(S)-kamptotecínom a jeho MTD, a že MTD konjugátov PG bola približne dvojnásobne vyššia než MTD pre naivný CPT. Okrem vyššie uvedených modelov bol používaný ešte jeden ďalší syngénny model viď. LL/2 Lewisove pľúca (ATTC CR.L-1642) a 2 xenogénne modely viď. ľudské NC1-H460 pľúcne karcinómy (ATTC HTB-177) a HT-29 ľudské karcinómy hrubého čreva (ATTC HTB-38). Na týchto xenogénnych modeloch boli miesto imunokompetentných C57BL/6 myší používané imunokompromitované atymické ncr nu/nu myši. S výnimkou množstva nádorových buniek implantovaných na vytvorenie nádorov boli experimentálne protokoly a postupy rovnaké ako u B-16/F0 modelu.
Na vytvorenie PG konjugátov 20(S)-kamptotecínu bolo používané celkovo 6 iných linkerov než glycín. Vo všetkých konjugátoch bol PG z rovnakej šarže a mal priemernú molekulovú hmotnosť 50 kD. Boli testované rôzne konjugáty a porovnávané s PG-gly-CPT v mnohých experimentoch u B16 modelu. Ako prvé bolo demonštrované, že glycínové konjugáty sú účinnejšie než konjugáty 2-hydroxyoctovej kyseliny (glykolová kyselina) pri všetkých troch testovaných koncentráciách 20(S)-kamptotecínu. Po druhé bolo demonštrované, že glycínové konjugáty boli výrazne účinnejšie u B-16 modelu než konjugáty pripravené s: glutámovou kyselinou (glu), alanínom (ala), βalanínom (β-ala) a 4-aminobutyrovou kyselinou.
Naviazanie týchto konjugátov bolo rôzne a pohybovalo sa od 22 % pre βala pripojený 20(S)-kamptotecín až 37 % pre gly-pripojený 20(S)-kamptotecín. Ďalší testovaný linker a porovnávaný s gly bol 4-hydroxybutyrová kyselina. Dva konjugáty malí rovnaké množstvo naviazaní 20(S)-kamptotecínu (35 %) a boli porovnávané v mnohých testoch na B-16/F0, LL/2 a HT-29 modeloch. Bolo demonštrované, že glycínové konjugáty boli rovnako alebo viac účinné než konjugáty 4-hydroxybutyrovej kyseliny. Navyše konjugáty 4-hydroxybutyrovej kyseliny je namáhavejšie pripraviť, sú menej rozpustné vo vodných roztokoch než glycínové konjugáty a môžu mať nežiaduce účinky.
V mnohých experimentoch sa na HT-29 a NC1-H460 modeloch študoval účinok dĺžky linkeru. Bola porovnávaná účinnosť konjugátov pozostávajúcich z gly (napr. PG-gly-CPT), gly-gly (dimér) (napr. PG-gly-gly-CPT) alebo glygly-gly (trimér) (napr. PG-gly-gly-gly-CPT) ako linker s odpovedajúcim naviazaním 20(S)-kamptotecínu. Princíp, teoreticky, spočíval v tom, že dlhší linker môže viesť k stabilnejšej forme PG-CPT konjugátu. Zistilo sa, že konjugáty obsahujúce triméry boli účinnejšie než konjugáty obsahujúce monomér a dimér (ktoré mali rovnakú účinnosť) pri rovnakom percentuálnom naviazaní 20(S)-kamptotecínu a ekvivalentných koncentráciách 20(S)kamptotecínu. Napriek tomu konjugáty obsahujúce trimér sú toxickejšie než mono-gly konjugáty pri rovnakých ekvivalentných koncentráciách 20(S)kamptotécínu. Navyše syntéza konjugátov obsahujúcich dimér a trimér je ďaleko časovo náročnejšia než u glycínových konjugátov a rozpustnosť konjugátov obsahujúcich trimér vo vode je výrazne nižšia než u mono-gly konjugátov. Dôležitými parametrami, ktoré by mohli determinovať účinnosť a toxicitu konjugátov sú okrem iného molekulová hmotnosť PG a percentuálne naviazanie 20(S)-kamptotecínu. Bolo demonštrované na B-16 a HT-29 modeloch, že konjugáty PG-gly-CPT pripravené s PG o 50 kD sú účinnejšie než konjugáty pripravené s PG o 74 alebo 33 kD. Bolo rozhodnuté, že hlavná pozornosť bude smerovať len na 50 kD PG-gly-konjugáty a stanovenie protinádorového účinku rôznych naviazaných 20(S)-kamptotecínov. Pri prvotnom experimente s HT-29 karcinómami hrubého čreva bolo zistené, že 35 % naviazaní bolo zreteľne účinnejších než 25 %, 20 % alebo 15 % naviazaní konjugátov, pričom myši dostali rovnaké množstvo 20(S)-kamptotecínových ekvivalentov. Zvyšovaním naviazaní z 35 % na 37 % a 39 % sa ďalej tiež zvyšovala účinnosť u HT-29 a tiež NC1-H460 modelu. Zvyšovanie naviazaní na 47 % viedlo k lepšej účinnosti, v skutočnosti bola účinnosť menšia než látka s 35 % naviazaním. Rozpustnosť konjugátov vo vode sa začala znižovať od 35 % až 39 %, pričom látky s vyšším percentuálnym naviazaním boli čím ďalej, tým viac nerozpustnejšie.
V jednom experimente na HT-29 modeli bolo preukázané, že účinnosť jednorazovej intraperitoneálnej (ip) dávky 50 kD PG-gly-CPT by mohla byť zvýšená štvornásobným podávaním s týždňovým intervalom pre celkovú akumulačnú dávku kamptotecínu (3 x) pri jednorazovej dávke. Myši tento dávkovací režim veľmi dobre znášali. Ideálny konjugát PG-gly-CPT sa skladá z PG s priemernou molekulovou hmotnosťou 50 kD (podľa merania viskozity), (mono)glycínu ako linkera a 35 - 37 % 20(S)-kamptotecínu. MTD u samčích ncr nu/nu myší je 40 mg/kg 20(S)-kamptotecínových ekvivalentov a je približne dvakrát vyšší než MTD pre voľný 20(S)-kamptotecín.
v
C. Ďalšie modely ľudského nádora
Bola študovaná protinádorová aktivita PG-gly-CPT (33 kD, 37 % naviazaní) na NC1-H322 (ATTC CRL-5806) ľudskej pľúcnej rakovine inokulovanej s.c. do samičích nahých myší. Liečivo bolo podané i.v. v 9, 13, 17 a 21 deň pri ekvivalentnej dávke 20(S)-kamptotecínu 40 mg/kg, pričom nádory dosiahli v priemere 7-8 mm. TGD trvalo 40 dní. Samičie nahé myši sa subkutánnym xenoimplantátom NC1-H460 ľudskej nemalobunkovej pľúcnej rakoviny boli ošetrované PG-gly-CPT v 1, 5, 9 a 13 deň dávkou 40 mg/kg 20(S)-kamptotecínu na injekciu. Testovaná dávka 40 mg ekviv. 20(S)kamptotecínu/kg každý štvrtý deň x 4 mierne prekročila MTD. Aj keď nebolo pozorované žiadne úmrtie, pohybovali sa váhové úbytky približne okolo 20 % východzej hmotnosti. Absolútne oneskorenie rastu nádora (definované ako denný rozdiel rastu nádorov od 8 mm do 12 mm medzi ošetrovanými a kontrolnými skupinami) bolo u myší ošetrovaných PG-glyCPT 43 dní.
V druhom experimente bol pri rovnakom režime testovaný priamo konjugovaný PG-CPT i.p., ktorý tiež preukázal výrazné oneskorenie rastu bez pozorovateľnej toxicity.
Na nahých myšiach inokulovaných s.c. 1,5 x 106buniek/myší NC1-H1299 (ATTC CRL-5803) ľudskými bunkami rakoviny pľúc bol tiež testovaný PG-glyCPT. Vďaka nadmernému úbytku hmotnosti pri 40 mg ekviv. 20(S)kamptotecínu/kg v predošlom experimente na nahých myšiach, bola dávka znížená na 30 mg ekviv. 20(S)-kamptotecínu/kg každý štvrtý deň x 4. Táto dávka bola dobre tolerovaná a pozorovalo sa 32 denné TGD.
D. 10-Hydroxykamptotecínové konjugáty
PG-konjugáty 20(S)-l 0-hydroxykamptotecínu boli podrobené predbežným štúdiám na B16 modeli. Najaktívnejší konjugát v týchto štúdiách je látka priamo konjugovaná alebo viazaná s glycínom cez 20-hydroxyl.
V počiatočných experimentoch sa priamo kopulovaná látka PG-(lO-OAc-CPT) prejavovala ako aktívnejšia pri 50 mg ekviv. 20(S)-10-hydroxykamptotecínu/kg než PG-gly-(l0-O-CPT). Napriek tomu tato dávka bola pod MTD u oboch zlúčenín a PG-(10-OAc-CPT) roztok bol veľmi viskózny a zlúčenina vyprecipitovala z roztoku po približne 30 minútach, a teda sa stala nepraktickou na použitie.
Pri 50 mg ekviv. 20(S)-lO-hydroxykamptotecínu/kg vykazovala PG-(10OAc-CPT) TGD 5,3 dní (p < 0,01 v porovnaní s kontrolou). Je veľmi zaujímavé, že MTD u PG-(IO-OH-CPT) sa pohybuje medzi 10 a 50 mg ekviv. 20(S)-10-hydroxykamptotecínu/kg. Napriek tomu i pri toxickej dávke 50 mg/kg nebol tak účinný ako PG-(10-OAc-CPT) alebo PG-gly-(lO-OH-CPT).
Malo by sa poznamenať, že v priamom porovnaní na B-16/FO modeli bol 50 kD PG-gly-(lO-OH-CPT) konjugát približne dvakrát účinnejší než PG-gly(7-Et-lO-OH-CPT); pri rovnakom percentuálnom naviazaní a koncentrácii SN 38. Rovnaké výsledky boli zistené pri porovnaní PG-gly-CPT s PG-gly-(7-tBuMe2Si-10-OAc-CPT) na HT-29 modeli. Všeobecne bolo zistené, že PG 20(5)-10-hydroxykamptotecínové konjugáty a PG konjugáty 10hydroxykamptotecínových derivátov alebo (7-t-BuMe2Si-10-OAc-CPT) neboli tak účinné, dobre tolerované alebo ľahko rozpustiteľné vo vodných roztokoch ako PG-gly-20(S)-kamptotecínové konjugáty; aj keď boli priamo viazané alebo viazané glycínom alebo viazané v rôznych polohách.
E. 9-aminokamptotecínové konjugáty
Štúdie ukazujú, že PG-9-NH-CPT je aktívny a má MTD väčší než 25 mg ekviv. 20(S)-9-aminokamptotecínu/kg. Napriek tomu bolo tiež zistené, že 20(S)-9-aminokamptotecínové konjugáty nie sú také účinné, dobre tolerované alebo ľahko rozpustiteľné vo vodných roztokoch ako PG-gly-20(S)kamptotecínové konjugáty; aj keď boli priamo viazané alebo viazané glycínom alebo viazané v rôznych polohách.
F. Súhrn porovnávacie dáta
V priamych porovnaniach s PG-gly-20(S)-CPT konjugátov ani PG konjugáty pripravené s 20(S)-9-aminokamptotecínom ani tie pripravené s
20(S)-10-hydroxykamptotecínom neboli tak účinné, dobre tolerované alebo ľahko rozpustiteľné vo vodných roztokoch ako PG-gly-CPT konjugáty; aj keď boli priamo viazané alebo viazané glycínom alebo viazané cez esterovú väzbu alebo amidovú väzbu (v prípade 20(S)-9-aminokamptotecínu) alebo viazané v rôznych polohách.
Zatiaľ čo predložený vynález bol popísaný s odkazmi na jeho špecifické uskutočnenia, malo by byť zrozumiteľné odbornej verejnosti, že môžu byť uskutočnené rôzne zmeny a ekvivalenty môžu byť nahradené bez vzdialenia sa od zmyslu a rozsahu predloženého vynálezu. Navyše môžu byť uskutočnené mnohé modifikácie v konkrétnych situáciách, zloženia látok, v spôsoboch, krokoch. Všetky tieto modifikácie spadajú rovnako do rozsahu patentových nárokov. Všetky patenty, prihlášky vynálezov a publikácie citované v predloženom texte sú tu uvedené ako odkaz.
Tabuľka 2
kde substituent R4 = H
zlúčenina R5 R1 R2 R3
20(S)-kamptotecín H H H H
topotecan H CH2N(CH3)2 OH H
2 0(S)-9-amino-kamptotecín H nh2 H H
20(S)-9-nitro-kamptotecín H no2 H H
10-hydrox y-kamptotecín H H OH H
SN-38 CH2CH3 H OH H
2O(S)-1O,11 - metyléndioxykamptotecín H H -CH2-O-CH2-
lurtotecan (GI 14721 1) -CH2-(N-me- tylpiperazín) H -o-ch2-ch2-o-
irinotecan (CPT-11) CH2CH3 H OCO-[1,4'- bipiperidinyl H
DX-8951F -CH2-CH2-CH(NH2)- ch3 F
DB67 -SiMe2t-Bu H -OH H
Tabuľka 3
PG konjugát % CPT v konjugát u (w/w) rozpustno sť vo vode signály u 300 MHz *H NMR spektra (DMSOd6) 1 myšia jedn. dávka MTD (IP mg. ekviv. CPT/kg
PG-CPT (20- konjugovaný ) 14 11 mg/ml δ 12,1 (široký singlet, PG γ-COOH), 7,4 - 8,5 (mnohopočetné široké signály, Ar - H), 5,6 (široký singlet, laktón -CH2-), 0,9 (široký signál, CPT CH2CH3) 60 - 80 mg ekviv. CPT/kg
PG-gly-CPT (20- konjugovaný ) 37 25 mg/ml δ 12,1 (široký singlet, PG γ-COOH), 7,4 - 8,5 (mnohopočetné široké signály, Ar - H), 5,6 (široký singlet, laktón -CH2-), 0,9 (široký signál, CPT CH2CH3) 60 - 80 mg ekviv. CPT/kg
PG-(10- OAc-CPT (20- konjugovaný ) 13 10 mg/ml δ 12,1 (široký singlet, PG γ-COOH), 7,2 - 8,6 (mnohopočetné široké signály, Ar - H), 5,4 (singlet, laktón -CH2-), 5,2 (singlet, C5-H2), 0,9 (široký triplet, CPT CH2CH3) 10 - 20 mg ekviv. CPT/kg
PG-(10-O- CPT) (10konjugovaný ) 13 10 mg/ml 1 δ 12,1 (široký singlet, PG γ-COOH), 7,2 - 8,6 (mnohopočetné široké signály, Ar - H), 5,4 (singlet, laktón -CH2-), 5,2 (singlet, C5-H2), 0,9 (široký triplet, CPT CH2CH3) 50 mg ekviv. CPT/kg
PG-gly-(10O-CPT) (10viazaný) 20 > 10 mg/ml δ 12,1 (široký singlet, PG γ-COOH), 7,2 - 8,8 (mnohopočetné široké signály, Ar - H), 5,4 (singlet, laktón -CH2-), 5,2 (singlet, C5-H2), 0,9 (široký signál, CPT CH2CH3) > 10 < 50 mg ekviv. CPT/kg
PG-(10-OH- CPT) (20viazaný) 19 > 10 mg/ml δ 12,1 (široký singlet, PG γ-COOH), 7,0 - 8,5 (mnohopočetné široké signály, Ar - H), 5,4 (singlet, laktón -CH2-), 5,2 (singlet, C5-H2), 0,9 (široký signál, CPT CH2CH3) > 50 mg ekviv. CPT/kg
PG-(9-NH- CPT) (9- konjugovaný ) 14 7 mg/ml δ 12,1 (široký singlet, PG γ-COOH), 8,8 (široký singlet, C7-H), 7,2 - 8,0 (mnohopočetné široké signály, Ar - H), 5,4 (singlet, laktón -CH2-), 0,9 (široký signál, CPT CH2CH3) > 25 mg ekviv. CPT/kg

Claims (34)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje konjugát polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu majúci všeobecný vzorec (Kamptothecin—X-)—PG 1 m
    v ktorom
    PG je polymér na báze polyglutámovej kyseliny;
    X je jednoduchá väzba, aminoacylový linker -[-OC-(CHR')p-NH]n- alebo hydroxyacylový linker -[OC-(CHR')P-O]n-, kde substituent R' je bočný reťazec prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny;
    kamptotecín je 20(S)-kamptotecín alebo biologicky aktívny 20(S)kamptotecínový analóg;
    m je kladné celé číslo od 5 do 65;
    I kamptotecín-X je kovalentne viazaný na karboxylovú skupinu uvedeného polyméru cez esterovú alebo amidovú väzbu;
    n je celé číslo medzi 1 a 10; a p je celé číslo medzi 1 a 10.
  2. 2. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že X je jednoduchá väzba.
  3. 3. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že
    X je aminoacylový linker -[-OC-(CHR')p-NH]q- alebo hydroxyacylový linker -[OC-(CHR')p-O]q-, kde substituent R' je bočný reťazec prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny; , · · n je celé číslo medzi 1 a 10; a p je celé číslo medzi 1 a 10.
  4. 4. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 5000 do asi 100000.
  5. 5. Kompozícia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 20000 do asi 80000.
  6. 6. Kompozícia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 25000 do asi 60000.
  7. 7. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že uvedený kamptotecínový analóg je vybraný zo skupiny skladajúcej sa z 20(S)kamptotecínu, 20(S)-topotecanu; 20(S)-9-aminokamptotecínu; 20(S)-9nitrokamptotecínu; 20(S)-10-hydroxykamptotecínu; SN-38; 20(S)-10,l 1metyléndioxykamptotecínu; lurtotecanu; irinotecanu; DX-8951 F alebo DB 67.
  8. 8. Kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že uvedený kamptotecínový analóg je vybraný z 20(S)-kamptotecínu, 20(S)-9aminokamptotecínu, 20(S)-9-nitrokamptotecínu, 20 (S)-7-etyl-10hydroxykamptotecínu, 20(S)-l O-hydroxykamptotecínu a 20(S)-10acetoxykamptotecínu.
    I
  9. 9. Kompozícia podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený konjugát polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu má všeobecný vzorec li;
    a uvedený kamptotecín je vybraný z (a) 20(S)-kamptotecínu, kde substituenty R1, R2, R3 a R4 sú každý H;
    (b) 20(S)-9-aminokamptotecínu, kde substituent R1 je -NH2 a substituenty R2, R3 a R4 sú každý H;
    (c) 20(S)-9-nitrokamptotecínu, kde substituent R1 je -NO2 a substituenty R2, R3 a R4 sú každý H;
    (d) 20(S)-1 O-hydroxykamptotecínu, kde substituenty R1, R3 a R4 sú každý H a substituent R2 je -OH; alebo (e) 20(S)-10-acetoxykamptotecínu, kde substituenty R1, R3 a R4 sú každý H a substituent R2 je -O-C(O)-CH3.
  10. 10. Kompozícia podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 25000 do asi 60000.
  11. 11. Kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že uvedený kamptotecín je 20(S)-kamptotecín a uvedený 20(S)-kamptotecín zahrnuje od asi 10 % do asi 16 % hmotn. konjugátu.
  12. 12. Kompozícia podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že uvedený konjugát polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu je vybraný zo zlúčeniny všeobecného vzorca III, všeobecného vzorca IV alebo všeobecného vzorca V:
    Hl;
    IV;
    V;
    kde Y je N alebo O.
  13. 13. Kompozícia podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 30000 do asi 60000.
  14. 14. Kompozícia podľa nároku 13, vyznačujúca sa tým, že uvedený kamptotecín zahrnuje od asi 10 % do asi 16 % hmotn. konjugátu.
  15. 15. Kompozícia podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že uvedený konjugát polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu je vybraný zo zlúčeniny všeobecného vzorca VI alebo všeobecného vzorca VII:
    VI;
    VII kde
    Y je N alebo O ;
    substituent R' je bočný reťazec prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny;
    f substituent R1 je -NH2 alebo H;
    substituent R2 je -H, -OH alebo rO-C(O)-CH3;
    substituent R3 je -H alebo alkylová skupina; a substituent R4 je -H, alkylová skupina alebo trialkylsilylová skupina.
  16. 16. Kompozícia podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že substituent R'je H.
  17. 17. Kompozícia podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 30000 do asi 60000.
  18. 18. Kompozícia podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že uvedený 20(S)kamptotecín zahrnuje do asi 10 % do asi 50 % hmotn. konjugátu.
    I 1 · '
  19. 19. Kompozícia podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že uvedený 20(S)kamptotecín zahrnuje od asi 15 % do asi 38 % hmotn. konjugátu.
  20. 20. Kompozícia obsahujúca PG-gly-CPT, PG-gly-( 10-OH-CPT) alebo PGgly-(9-NH-CPT), vyznačujúca sa tým, že uvedený PG má molekulovú hmotnosť od asi 25000 do asi 60000 a uvedený 20(S)-kamptotecín zahrnuje od asi 10 % do asi 50 % hmotn. konjugátu.
  21. 21. Spôsob prípravy kompozície obsahujúcej konjugát polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu majúci všeobecný vzorec (Kamptothecin—X-)—PG m v ktorom
    PG je polymér na báze polyglutámovej kyseliny;
    X je jednoduchá väzba, aminoacylový linker -[-OC-(CHR')p-NH]n- alebo hydroxyacylový linker -[OC-(CHR')p-O]n-, kde substituent R' je bočný reťazec prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny;
    kamptotecín je 20(S)-kamptotecín alebo biologicky aktívny 20(S)kamptotecínový analóg;
    m je kladné celé číslo od 5 do 65;
    kamptotecín-X je kovalentne viazaný na karboxylovú skupinu uvedeného polyméru cez esterovú alebo amidovú väzbu;
    n je celé číslo medzi 1 a 10; a *
    p je celé číslo medzi 1 a 10;
    pričom uvedený spôsob zahrnuje:
    (a) prípravu polyméru na báze polyglutámovej kyseliny majúceho molekulovú hmotnosť od asi 25000 do asi 60000 daltonov stanovenú podľa viskozity a 20(S)-kamptotecínu na jeho konjugáciu s polymérom; a (b) kovalentne viazaný uvedený 20(S)-kamptotecín na uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny za podmienok, ktoré sú dostačujúce na pripojenie aspoň 5 molov 20(S)-kamptotecínu na mól polyméru, a tým vytvorenie uvedeného konjugátu polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu.
  22. 22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedený 20(S)kamptotecín je vybraný z 20(S)-9-aminokamptotecínu, 20(S)-10hydroxykamptotecínu alebo 20(S)-kamptotecínu.
  23. 23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že 20(S)-kamptotecín zahrnuje od asi 10 % do asi 16 % hmotn. konjugátu.
  24. 24. Spôsob prípravy prípravku obsahujúceho konjugát polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (a) prípravu protónovanej formy polyméru na báze polyglutámovej kyseliny a 20(S)-kamptotecínu alebo biologicky aktívneho 20(S)kamptotecínového analóga na jeho konjugáciu s polymérom;
    (b) reakciu uvedeného polyméru na báze polyglutámovej kyseliny a uvedeného 20(S)-kamptotecínu v inertnom organickom rozpúšťadle v prítomnosti bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfínovej kyseliny za podmienok, ktoré sú dostatočné na vytvorenie konjugátu polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu; a (c) precipitáciu uvedeného konjugátu polyglutámovej kyselinykamptotecínu z roztoku pridaním prebytku objemu vodného roztoku soli.
  25. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:
    (d) premytie uvedeného precipitátu na odstránenie nezreagovaného 20(S)-kamptotecínu.
  26. 26. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že chlórometylpyridíniumjodid je nahradený za bis(20-oxo-3-oxazolidinyl)fosfínovú kyselinu v kroku (b).
  27. 27. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 25000 do asi 60000 daltonov podľa meraní viskozity.
  28. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že uvedený 20(S)kamptotecín zahrnuje od asi 10 % do asi 16 % hmotn. konjugátu.
  29. 29. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje protinádorové a/nebo antileukemické účinné množstvo konjugátu polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1, 11 alebo 14 alebo jeho farmaceutický prijateľné soli a farmaceutický prijateľný nosič a/alebo riediaci roztok.
  30. 30. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje protinádorové a/alebo antileukemické účinné množstvo konjugátu polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu podľa nároku 20 alebo jeho farmaceutický prijateľné soli a farmaceutický prijateľný nosič a/alebo riediaci roztok.
  31. 31. Spôsob ošetrenia leukémie alebo pevného nádora, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje podanie, pri potrebe takého ošetrenia, farmaceutického prípravku podľa nároku 30 pacientovi, a tým dochádza k ovplyvneniu liečby ošetrenia príslušnej leukémie a pevného nádora.
  32. 32. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje konjugát polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu pripravený podľa spôsobu uvedeného v jednom z nárokov 21 - 28.
  33. 33. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje konjugát polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu majúci všeobecný vzorec III, IV alebo V:
    IV;
    V;
    kde
    PG je polymér na báze polyglutámovej kyseliny;
    Y je N alebo O.
    substituent R' je bočný reťazec prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny;
    n je celé číslo medzi 1 a 10; a p je celé číslo medzi 1 a 10; a kde uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 30000 do asi 60000.
  34. 34. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje konjugát polyglutámovej kyseliny-kamptotecínu majúci všeobecný vzorec VI alebo VII:
    VI;
    PG kde
    Y je N alebo O ;
    substituent R je bočný reťazec prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny;
    substituent R1 je -NH2 alebo H;
    substituent R2 je -H,-OH alebo -O-C(O)-CH3;
    substituent R3 je -H alebo alkylová skupina; a substituent R4 je -H, alkylová skupina alebo trialkylsilylová skupina; a kde uvedený polymér na báze polyglutámovej kyseliny má molekulovú hmotnosť od asi 30000 do asi 60000.
SK1482-2002A 2000-03-17 2001-03-19 Konjugáty na báze polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu a spôsoby ich prípravy SK14822002A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19042900P 2000-03-17 2000-03-17
PCT/US2001/008553 WO2001070275A2 (en) 2000-03-17 2001-03-19 Polyglutamic acid-camptothecin conjugates and methods of preparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK14822002A3 true SK14822002A3 (sk) 2003-05-02

Family

ID=22701317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1482-2002A SK14822002A3 (sk) 2000-03-17 2001-03-19 Konjugáty na báze polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu a spôsoby ich prípravy

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20020016285A1 (sk)
EP (1) EP1267939A2 (sk)
JP (1) JP2003527443A (sk)
KR (1) KR20020082888A (sk)
CN (1) CN1429121A (sk)
AU (1) AU2001247513A1 (sk)
BR (1) BR0109272A (sk)
CA (1) CA2402643A1 (sk)
CZ (1) CZ20023330A3 (sk)
HU (1) HUP0204562A2 (sk)
IL (1) IL151685A0 (sk)
MX (1) MXPA02009082A (sk)
NO (1) NO20024421L (sk)
PL (1) PL358335A1 (sk)
RU (1) RU2002128610A (sk)
SI (1) SI21172A (sk)
SK (1) SK14822002A3 (sk)
TR (1) TR200202194T2 (sk)
WO (1) WO2001070275A2 (sk)
ZA (1) ZA200207423B (sk)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6441025B2 (en) * 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives
NZ529789A (en) 1999-10-12 2005-04-29 Cell Therapeutics Inc Manufacture of polyglutamate-20(S)-camptothecin conjugates
US20030054977A1 (en) * 1999-10-12 2003-03-20 Cell Therapeutics, Inc. Manufacture of polyglutamate-therapeutic agent conjugates
US20020077290A1 (en) 2000-03-17 2002-06-20 Rama Bhatt Polyglutamic acid-camptothecin conjugates and methods of preparation
US6629995B1 (en) * 2000-03-31 2003-10-07 Super Gen, Inc. Camptothecin conjugates
WO2003097052A2 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Celgene Corporation Methods and compositions using immunomodulatory compounds for treatment and management of cancers and other diseases
USRE48890E1 (en) 2002-05-17 2022-01-11 Celgene Corporation Methods for treating multiple myeloma with 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione after stem cell transplantation
US7393862B2 (en) 2002-05-17 2008-07-01 Celgene Corporation Method using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for treatment of certain leukemias
US7968569B2 (en) 2002-05-17 2011-06-28 Celgene Corporation Methods for treatment of multiple myeloma using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
US7323479B2 (en) 2002-05-17 2008-01-29 Celgene Corporation Methods for treatment and management of brain cancer using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-methylisoindoline
US11116782B2 (en) 2002-10-15 2021-09-14 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine
CN1309763C (zh) * 2002-10-31 2007-04-11 日本化药株式会社 喜树碱的高分子衍生物
US7354948B2 (en) 2002-11-06 2008-04-08 Celgene Corporation Methods for treatment of chronic uveitis using cyclopropyl-n-{2-[(1S)-1-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-(methylsulfonyl)ethyl]-3-oxoisoindoline-4-yl}carboxamide
US8017762B2 (en) * 2003-04-17 2011-09-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
CA2522637C (en) * 2003-04-17 2014-01-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified irna agents
US7851615B2 (en) * 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
US8796436B2 (en) 2003-04-17 2014-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
UA83504C2 (en) 2003-09-04 2008-07-25 Селджин Корпорейшн Polymorphic forms of 3-(4-amino-1-oxo-1,3 dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
WO2005113018A2 (en) 2004-04-27 2005-12-01 Wellstat Biologics Corporation Cancer treatment using viruses and camptothecins
WO2006020719A2 (en) 2004-08-11 2006-02-23 Arqule, Inc. Aminoacid conjugates of beta - lapachone for tumor targeting
US8614228B2 (en) 2004-08-11 2013-12-24 Arqule, Inc. Quinone prodrug compositions and methods of use
EP1792927B1 (en) * 2004-09-22 2013-03-06 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Novel block copolymer, micelle preparation, and anticancer agent containing the same as active ingredient
ATE540698T1 (de) 2005-07-14 2012-01-15 Wellstat Biologics Corp Krebsbehandlung mit viren, fluoropyrimidinen und camptothecinen
ITPD20050242A1 (it) * 2005-08-03 2007-02-04 Fidia Farmaceutici Bioconiugati antitumorali dell'acido ialuronico o dei suoi derivati, ottenibili per coniugazione chimica diretta o indiretta, e loro impiego in campo farmaceutico
KR20080074207A (ko) * 2005-12-05 2008-08-12 닛토덴코 가부시키가이샤 폴리글루타메이트-아미노산 콘쥬게이트 및 이의 제조 방법
US7671067B2 (en) * 2006-02-09 2010-03-02 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Treatment of non-hodgkin's lymphomas with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamtothecin
US7462627B2 (en) * 2006-02-09 2008-12-09 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin for treatment of breast, colorectal, pancreatic, ovarian and lung cancers
KR20080106254A (ko) 2006-03-28 2008-12-04 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 탁산류의 고분자 결합체
CA2658015A1 (en) 2006-03-30 2007-10-11 Diatos S.A. Camptothecin-peptide conjugates and pharmaceutical compositions containing the same
US8940332B2 (en) 2006-05-18 2015-01-27 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha High-molecular weight conjugate of podophyllotoxins
CL2007002218A1 (es) 2006-08-03 2008-03-14 Celgene Corp Soc Organizada Ba Uso de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina 2,6-diona para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de linfoma de celula de capa.
JP5548364B2 (ja) * 2006-10-03 2014-07-16 日本化薬株式会社 レゾルシノール誘導体の高分子結合体
WO2008056596A1 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymeric derivative of nucleic acid metabolic antagonist
WO2008056654A1 (en) * 2006-11-08 2008-05-15 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymeric derivative of nucleic acid metabolic antagonist
US20080181852A1 (en) * 2007-01-29 2008-07-31 Nitto Denko Corporation Multi-functional Drug Carriers
JP2010518120A (ja) * 2007-02-09 2010-05-27 エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド ７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンのマルチアームポリマー複合体を用いた抵抗性または難治性の癌の治療方法
EP2144631A2 (en) * 2007-04-10 2010-01-20 Nitto Denko Corporation Multi-functional polyglutamate drug carriers
AU2008246067B2 (en) 2007-04-30 2011-10-20 Arqule, Inc. Hydroxy sulfonate of quinone compounds and their uses
US8197828B2 (en) * 2007-05-09 2012-06-12 Nitto Denko Corporation Compositions that include a hydrophobic compound and a polyamino acid conjugate
EP2155254B1 (en) * 2007-05-09 2012-11-28 Nitto Denko Corporation Polymers conjugated with platinum drugs
EP2155253A2 (en) * 2007-05-09 2010-02-24 Nitto Denko Corporation Polyglutamate conjugates and polyglutamate-amino acid conjugates having a plurality of drugs
USRE46190E1 (en) 2007-09-28 2016-11-01 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha High-molecular weight conjugate of steroids
WO2009111271A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-11 Nitto Denko Corporation Polymer paclitaxel conjugates and methods for treating cancer
WO2009116509A1 (ja) * 2008-03-18 2009-09-24 日本化薬株式会社 生理活性物質の高分子結合体
US9149540B2 (en) 2008-05-08 2015-10-06 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymer conjugate of folic acid or folic acid derivative
JP2011162569A (ja) 2008-05-23 2011-08-25 Nano Career Kk カンプトテシン高分子誘導体及びその用途
US20100056555A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Method of treating ras associated cancer
JP2012505906A (ja) * 2008-10-15 2012-03-08 日東電工株式会社 ポリグルタメートコンジュゲートの調製方法
CA2738807A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Treatment of neuroblastoma with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin
US8808749B2 (en) 2009-05-15 2014-08-19 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymer conjugate of bioactive substance having hydroxy group
JP2013514443A (ja) * 2009-12-16 2013-04-25 日東電工株式会社 ポリグルタミン酸の制御された合成
US20110224148A1 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 Nitto Denko Corporation Carbohydrate-polyamino acid-drug conjugates
EP3372617B1 (en) 2010-04-02 2024-07-24 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
CA2816997A1 (en) 2010-11-17 2012-05-24 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Novel polymer derivative of cytidine metabolic antagonist
CN102649810A (zh) * 2011-05-19 2012-08-29 东北林业大学 喜树碱衍生物、其制备方法和用途
PT2754682T (pt) 2011-09-11 2017-08-29 Nippon Kayaku Kk Método para o fabrico de copolímero de bloco
US9180203B2 (en) * 2012-10-23 2015-11-10 The Johns Hopkins University Self-assembling drug amphiphiles and methods for synthesis and use
BR112017003620A2 (pt) 2014-08-22 2017-12-05 Celgene Corp métodos de tratamento de mieloma múltiplo com compostos imunomoduladores em combinação com anticorpos
JP2018527302A (ja) 2015-06-26 2018-09-20 セルジーン コーポレイション 免疫調節化合物を用いたカポジ肉腫またはｋｓｈｖ誘発性リンパ腫の治療方法、及びバイオマーカーの使用
CN106267227A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 北京蓝贝望生物医药科技股份有限公司 抗肿瘤药物
US20200030452A1 (en) * 2016-09-30 2020-01-30 IF7Cure, Inc. Process for the Manufacture of a Tumor-Vasculature Targeting Antitumor Agent
CN106831853B (zh) * 2017-02-15 2019-02-22 浙江海正药业股份有限公司 7-乙基-10-o-叔丁基二苯基硅基喜树碱-20-o-甘氨酸盐酸盐的制备工艺
CN108727581A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 华东师范大学 以苯硼酸酯为连接单元的两亲性喜树碱高分子前药及其制备方法和应用
JP2021095424A (ja) * 2018-03-28 2021-06-24 持田製薬株式会社 抗癌剤結合アルギン酸誘導体
AU2020397848A1 (en) 2019-12-04 2022-06-16 Dantari, Inc. Methods and compositions for synthesis of therapeutic nanoparticles

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356166A (en) * 1978-12-08 1982-10-26 University Of Utah Time-release chemical delivery system
PL189698B1 (pl) * 1996-03-12 2005-09-30 Pg Txl Co Kompozycja farmaceutyczna zawierająca lek przeciwnowotworowy i jej zastosowania
US6441025B2 (en) * 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
TR200202194T2 (tr) 2003-01-21
KR20020082888A (ko) 2002-10-31
US20020016285A1 (en) 2002-02-07
IL151685A0 (en) 2003-04-10
WO2001070275A3 (en) 2002-01-03
NO20024421D0 (no) 2002-09-16
WO2001070275A2 (en) 2001-09-27
NO20024421L (no) 2002-11-15
CN1429121A (zh) 2003-07-09
RU2002128610A (ru) 2004-03-27
CA2402643A1 (en) 2001-09-27
JP2003527443A (ja) 2003-09-16
AU2001247513A1 (en) 2001-10-03
SI21172A (sl) 2003-10-31
PL358335A1 (en) 2004-08-09
ZA200207423B (en) 2003-12-17
CZ20023330A3 (cs) 2003-02-12
EP1267939A2 (en) 2003-01-02
HUP0204562A2 (hu) 2003-04-28
MXPA02009082A (es) 2003-12-11
BR0109272A (pt) 2004-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK14822002A3 (sk) Konjugáty na báze polyglutámovej kyseliny a kamptotecínu a spôsoby ich prípravy
US6328953B1 (en) Polymeric derivatives of camptothecins
US4943579A (en) Water soluble prodrugs of camptothecin
ES2198421T3 (es) Derivados de la camptotecina unidos a polimeros.
US7173041B2 (en) Polyglutamic acid-camptothecin conjugates and methods of preparation
US20040053976A1 (en) Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
BRPI0014652B1 (pt) fabricação de conjugados de agente terapêutico-poliglutamato
JPH10506375A (ja) カンプトセシン化合物の水溶性エステル
WO2016025752A1 (en) Reagents for thiol conjugation and conjugates formed therefrom
CA2979527A1 (en) Conjugates of pyrrolobenzodiazepine (pbd) prodrugs for treating disease
KR100762556B1 (ko) 토포이소머라제 Ⅰ 억제작용이 있는 캄프토테신 β-알라닌에스테르
CA3193485A1 (en) Peptidic conjugates of sn38 useful in the treatment of cancer
US20020183243A1 (en) Polyglutamic acid-camptothecin conjugates and methods of preparation
WO2017086392A1 (ja) 新規なグルタミン酸誘導体とブロック共重合体を含有する組成物及びその用途
MXPA00003031A (en) Polymeric derivatives of camptothecins