SK11242002A3 - Zlúčenina, spôsob prípravy zlúčeniny, farmaceutický prostriedok a spôsob liečenia rakoviny - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka kahalalidovej zlúčeniny, spôsobu jej prípravy, farmaceutického prostriedku, ktorý ju obsahuje a jej použitia.

Doterajší stav techniky

Kahalalid F je biologicky aktívny cyklický depsipeptid izolovaný z mäkkýša s mäsitou nohou Elysia rufescens a jeho stravy, zelenej riasy Bryopsis sp. Kahalalid F bol po prvýkrát izolovaný Hamannom a Scheuerom, pozri Hamann, M. T., Scheuer, P. J., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 5825-5826. V tejto publikácii nebola určená absolútna stereochémia jednotlivých valinov (3 D-Val a 2 L-Val) a treonínov (L-Thr a D-allo-Thr). V neskoršej publikácii Scheuer a kol. (Goetz, G., Yoshida, VV. Y., Scheuer, P. J., Tetrahedron 1999, 55, 7739-7746) stanovili v molekule pozíciu 5 Val a 2 Thr.

Teda štruktúra kahalalidu F podľa práce Scheuera a kol. bola:

Medzitým jednotlivé pozície 5-Val a 2-Thr stanovil tiež prof Reinhan (K. L.

Reinhart, osobné zdelenie). Zatiaľčo jeho stanovenie pre 2 Thr a 3 Val súhlasí so stanovením

Λ prof. Scheuera, pre posledné 2 Val tu existuje rozpor. Teda, v Reinhartovom stanovení sú dva po sebe nasledujúce Val v postrannom reťazci orientované opačne a štruktúra je vyjadrená všeobecným vzorcom í:

(l)

Teraz je prijímané a v tomto texte je opäť demonštrované, že správny vzorec pre kahalalid F je všeobecný vzorec I.

Jedná sa o zložitú štruktúru, ktorá obsahuje 6 aminokyselín v cyklickej časti a okrem toho cyklickú časť reťazec siedmich aminokyselín zakončený acylovou skupinou. Kahalalid F (všeobecný vzorec I) je výnimočne účinné a vzácne protinádorové činidlo morského pôvodu, avšak nedostatok zodpovedajúceho množstva brzdí plány klinických pokusov.

Sú známe iné kahalalidové zlúčeniny, napríklad odkazujeme na prácu Hamann, M. T. a kol., J. Org. Chem., 1996, „Kahalalidy: Biologicky aktívne peptidy z morského mäkkýša Elysia rufescens a z jeho stravy - riasy Bryopsis sp., zv. 61, str. 6594-6660. Rovnako ako pre kahalalid F, tento článok uvádza tiež štruktúru kahalalidu A a E. Kahalalid K bol popísaný v Nat. Prod. 1999, 62, 1192 a kahalalid O bol popísaný v Nat. Prod. 2000, 63, 152.

Štruktúra týchto ďalších kahalalidových zlúčenín je uvedená v nasledujúcich všeobecných vzorcoch 1 až 11:

oR· _ ,, _ L-Thr *^ν° t-Ser H0^*[ ⁰ ** í^l

ΗΗψΟ «***·

TrC

UDr \

Mm

Kahalalid A (1)

UTy

VRo

Kahalalid B (2)

Kahalalid D (4)

Kahalalid E (5)

Kahalalid F (6)

V*5

Kahalalid G (7)

m»

Kahalalid K (10)

Kahalalid O (11)

Cyklické kahalalidy obsahujú aminokyselinový kruh a postranný reťazec, ktorý je zakončený acylovou skupinou.

Kahalalidy majú rad biologických · aktivít, z ktorých významná je protinádorová a protituberkulózna aktivita.

Podstata vynálezu

Predložený vynález poskytuje napodobeniny prirodzených kahalalidov. Zlúčeniny sa môžu odlišovať v jednej alebo viacerých aminokyselinách a v jednej alebo viacerých zložkách postranného acylového reťazca.

Vhodné napodobeniny, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, majú aspoň jeden z nasledujúcich rysov, ktorými sa odlišujú od pôvodného prírodného kahalalidu:

až 7, prípadne 1 až 3, prípadne 1 alebo 2, prípadne 1 aminokyselina, ktoré sa líšia od aminokyselín pôvodného kahalalidu;

až 10, prípadne 1 až 6, prípadne 1 až 3, pripadne 1 alebo 2 ďalšie metylénové skupiny v acylovej skupine postranného reťazca pôvodnej zlúčeniny;

až 10, pripadne 1 až 6, prípadne 1 až 3, prípadne 1 alebo 2 vynechané metylénové skupiny v acylovej skupine postranného reťazca pôvodnej zlúčeniny;

až 6, prípadne 1 alebo 3 substituenty pridané alebo vynechané z acylovej skupiny postranného reťazca pôvodnej zlúčeniny.

U cyklických kahalalidov sa môže pridanie alebo vynechanie aminokyseliny uskutočniť v kruhovom cykle alebo postrannom reťazci.

Príklady predloženého vynálezu sú zlúčeniny podobné kahalalidu F, ktoré majú všeobecný vzorec Π:

ô

Aaa-7

(II) kde Aaa¹, Aaa^x, Aaa³, Aaa⁴, Aaa⁶a Aaa⁷ sú, pokiaľ vyhovujú, nezávisle na sebe aaminokyseliny L a D konfigurácie, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ sú nezávisle na sebe H alebo organická kyselina vybraná zo skupiny zahrňujúcej alkylovú skupinu, arylovú skupinu, arylalkylovú skupinu a ich deriváty substituované hydroxylovou skupinou, merkaptoskupinou, aminoskupinou, quanidínovou skupinou, halogénovou skupinou; X¹ je nezávisle O, S alebo N; R² je, pokiaľ vyhovuje, nezávisle H alebo organická kyselina vybraná zo skupiny zahrňujúcej alkylovú skupinu a arylalkylovú skupinu; Aaa⁵ je, pokiaľ vyhovuje, nezávisle aminoskupina L alebo D konfigurácie; kde X² je nezávisle organická skupina vybraná zo skupiny zahrňujúcej alkenyl, alkylovú skupinu, arylovú skupinu, arylalkylovú skupinu a ich deriváty substituované hydroxylovou skupinou, merkaptoskupinou, nezávisle H alebo organická skupina vybraná zo skupiny zahrňujúcej alkylovú skupinu, arylovú skupinu, arylalkylovú skupinu a ich deriváty substituované hydroxylovou skupinou, g merkaptoskupinou, aminoskupinou, guanidínovou skupinou, halogénovou skupinou; a R ma nezávisle nasledujúce všeobecné vzorce ΙΠ, IV alebo V:

(Hl)

R

n (IV)

R¹⁰ (V) kde R⁹, R¹⁰ a R¹¹ sú nezávisle na sebe H alebo organická skupina vybraná zo skupiny zahrňujúcej alkylovú skupinu, arylovú skupinu, arylalkylovú skupinu a ich deriváty substituované hydroxylovou skupinou, merkaptoskupinou, aminoskupinou, guanidínovou skupinou, karboxylovou skupinou, karboxyamidovou skupinou, halogénovou skupinou; R⁹ a R¹⁰ môžu tvoriť časť toho istého cyklu; R⁹ môže zaujímať S alebo R konfiguráciu vzhľadom k uhlíku, ku ktorému je pripojený a n je 0 až 6. Definície aminokyselín sa tiež môžu meniť a je možné použiť prolín a analogické aminokyseliny vrátane hydroxyprolínu. Všeobecné vzorce ΠΙ, IV a V môžu byť vzájomne premiešané a môžu znázorňovať postranné reťazce vytvorené z opakujúcich sa jednotiek, uvedených vo viacej než jednom z týchto všeobecných vzorcov.

V modifikácii je jedna alebo viacej aminokyselín Aaa-6 a Aaa-5 zo šesťčlenného aminokyselinového kruhu vynechaných alebo je pridaná aminokyselina Aaa-7 medzi Aaa-6 aAaa-1, aby sa dosiahlo kruhov, ktoré sú zložené zo štyroch, piatich alebo siedmich aminokyselín. Výhodné je, keď je kruh zložený zo šiestich aminokyselín.

Predložený vynález je ďalej zameraný na syntetický postup prípravy kahalalidu F a podobných zlúčenín.

Výhodné uskutočnenia

Výhodné zlúčeniny sú podobné kahalalidu F (všeobecný vzorec I), kde vo všeobecnom vzorci Π Aaa-1 je D-allo-Thr (X¹ = O, R¹ = CH3), Aaa-2 je D-allo-Ile (R³ = 1metylpropyl), Aaa-3 je D-Val (R⁴ = izopropyl), Aaa-4 je Phe (R⁵ = benzyl), Aaa-5 je Z-Dhb (X² = C=CHCH3 v Z konfigurácii), Aaa-6 je L-Val (R⁶ = izopropyl), Aaa-7 je D-allo-Ile (R⁷ =

1-metylpropyl) a R⁸ obsahuje hexapeptidový derivát nasledujúceho všeobecného vzorca VI:

Ďalšie výhodné zlúčeniny sú analogicky podobné ostatným kahalalidom a majú aminokyseliny a postranné reťazce s týmito zlúčeninami spoločné. Odvolávame sa na známe štruktúry kahalalidov. Výhodná je taká zlúčenina tohto vynálezu, ktorá napodobňuje prirodzený kahalalid, pričom je na jednom alebo na viacerých miestach molekuly modifikovaná, je do nej niečo vložené alebo niečo odstránené.

Zvlášť výhodné sú zlúčeniny, ktoré majú aminokyseliny, aké sú v prírodnej cyklickej kahalalidovej zlúčenine, ale líšia sa postranným reťazcom, najmä v acylovej časti. Takéto odchýlky môžu zahrňovať viacej alebo menej metylénových skupín, v typickom prípade najviac zmenu v dvoch metylénových skupinách a viacej alebo menej substituentov, menovite pridanie halogénov, ako sú fluórové substituenty.

Tu používaný termín „organická skupina“ označuje uhľovodíkovú skupinu, ktorá je klasifikovaná ako alifatická skupina, cyklická skupina alebo kombinácia alifatickej a cyklickej skupiny (napr. arylalkylová skupina). V kontexte predloženého vynálezu termín „alifatická skupina“ označuje nasýtený alebo nenasýtený, lineárny alebo rozvetvený uhľovodík. Tento termín zahrňuje napríklad alkylové, alkenylové a alkinylové skupiny.

Termín „alkylová skupina“ označuje nasýtenú lineárnu alebo rozvetvenú uhľovodíkovú skupinu, ktorá zahrňuje napríklad metyl, etyl, izopropyl, izobutyl, t-butyl, heptyl, dodecyl, oktadecyl, amyl, 2-etylhexyl, 2-metylbutyl, 5-metylhexyl, 9-metyl-3-decyl a podobne, zvlášť alkylové skupiny, ktoré majú jednu postrannú metylovú skupinu. Vhodná alkylová skupina je dlhá a má 1 až 20 uhlíkových atómov, výhodnejšie 1 až 15 alebo 1 až 10 uhlíkových atómov, alebo môže byť krátka a má 1 až 6 alebo 1 až 3 uhlíkové atómy. Je vhodné, keď skupina R¹¹ má dlhý uhlíkový reťazec a všeobecne všetky ostatné alkylové skupiny sú s výhodou krátke.

Termín „alkenylová skupina“ označuje nenasýtenú lineárnu alebo rozvetvenú uhľovodíkovú skupinu s jednou alebo viacerými dvojitými väzbami uhlík-uhlík, ako je napríklad vinylová skupina. Vhodná alkenylová skupina má 2 až 8 alebo 2 až 4 uhlíkové atómy.

Termín „alkinylová skupina“ označuje nenasýtenú lineárnu alebo rozvetvenú uhľovodíkovú skupinu s jednou alebo viacerými trojitými väzbami uhlík-uhlík. Vhodná alkinylová skupina má 2 až 8 alebo 2 až 4 uhlíkové atómy.

Termín „cyklická skupina“ označuje uhľovodíkovú skupinu s uzatvoreným cyklom, ktorá je klasifikovaná ako alicyklická skupina, aromatická skupina alebo heterocyklická skupina.

Termín „alicyklická skupina“ označuje cyklickú uhľovodíkovú skupinu, ktorá sa svojimi vlastnosťami podobá alifatickým skupinám a je vhodné, keď má jeden alebo dva cykly so 4 až 10 uhlíkovými atómami.

Termín „aromatická skupina“ alebo „arylová skupina“ označuje aromatickú uhľovodíkovú skupinu s jedným alebo mnohými cyklami a je vhodné, keď má jeden alebo dva cykly s 5 až 10 uhlíkovými atómami.

Termín „heterocyklická skupina“ označuje uzavretý kruhový uhľovodík, v ktorom na mieste jedného alebo viacerých uhlíkových atómov v kruhu je iný prvok než uhlík (napr. 1 až 3 alebo viacej atómov dusíka, kyslíka, síry, atď.) a je vhodné, keď má jeden alebo dva cykly, v ktorých je umiestnených 4 až 10 atómov.

V technickej oblasti sa veľký rozsah substitúcie nielen toleruje, ale často je aj vhodný. U zlúčenín predloženého vynálezu sa substitúcia predpokladá. Pre zjednodušenie diskusie a zavedenie určitej terminológie používanej v tejto prihláške sú termíny „skupina“ a „zložka“ používané na rozlíšenie medzi chemickými druhmi, ktoré umožňujú substitúciu, alebo ktoré môžu byť substituované a tými, ktoré ju neumožňujú, alebo nemôžu byť takto substituované. Teda, keď je pre chemický substituent použitý termín „skupina“, popisovaná chemická látka obsahuje napríklad v reťazci nesubstituovanú skupinu a skupinu s atómami O, N alebo S, rovnako aj karbonylovú skupinu, alebo iné bežné substituenty. Keď je pre popis chemickej zlúčeniny alebo substituentu použitý termín „zložka“, znamená to, že sa počíta len s nesubstituovanými chemickými látkami. Napríklad, výrazom „alkylová skupina“ je označovaný nielen čistý otvorený reťazec nasýtených uhľovodíkových alkylových substituentov, ako sú metyl, etyl, izopropyl, izobutyl, t-butyl a podobne, ale tiež alkylové substituenty nesúce na sebe ďalšie substituenty známe v odbore, ako sú hydroxylová skupina, alkoxylová skupina, aminoskupina, karboxylová skupina, karboxyamidová skupina, halogénové atómy, kyanoskupina, nitroskupina, alkylsulfonylová skupina, atď. Teda, „alkylová skupina“ zahrňuje éterové skupiny, halogenované alkyly, alkoholy, tioly, karboxyly, amíny, hydroxyalkyly, sulfoalkyly, atď. Obyčajne sa dáva prednosť halogenovaným skupinám. Na druhej strane, výraz „alkylová zložka“ je obmedzený len na zabudovanie čistého otvoreného reťazca nasýteného uhľovodíkového alkylového substituenta, ako je metyl, etyl, propyl, izobutyl a podobne.

Vo zvlášť výhodnom vyhotovení tohto vynálezu poskytujeme zlúčeninu všobecného vzorca A:

(A) kde každý z Aa^l až Aa⁶ so susedným -N-, resp. -CO- predstavuje a alebo β aminokyselinu, s výhodou a aminokyselinu, X je väzobná skupina Aa¹, s výhodou vybraná z aminoskupiny, hvdroxylovej skupiny alebo tiolovej skupiny, výhodnejšie je hydroxylová skupina a R je skupina voliteľne zahrňujúca jednu alebo viacej a alebo β aminokyselín, s výhodou a aminokyselín. Vo variante nemusí byť -CO-Aa⁶-N- prítomné, je možné, aby chýbalo tiež -CO-Aa⁵-N- alebo inou možnosťou je, že je medzi Aa⁶ a Aa¹ vložené -CO-Aa⁷-N-.

Aminokyseliny môžu mať L alebo D konfiguráciu. Je výhodné, keď je konfigurácia rovnaká ako u zodpovedajúcej aminokyseliny v kahalalidovej zlúčenine, najmä v kahalalide

F. Jedna alebo viacej Aa¹ až Aa⁶ s výhodou zodpovedá aminokyseline na rovnakej pozícii v prírodnom kahalalide alebo v jeho obdobe. Vo zvlášť výhodnom prevedení je každá aminokyselina rovnaká ako v kahalalide F. Teda výhodné sú ako Aa¹ D-allo-Thr, ako Aa² Dallo-Ile, ako Aa³ D-Val, ako Aa⁴ Phe, ako Aa³ Z-Dhb, ako Aa⁶ L-Val.

Keď sú používané podobné zlúčeniny, potom sú vhodné také, ktoré majú aminokyseliny nahradené a náhrada je uskutočnená s ohľadom na štruktúru príslušných aminokyselín v prírodnom kahalalide takom, ako je kahalalid F. Náhradou za treonín je serin a jeho homológy a taktiež cysteín a jeho homológy. Náhradou za izoleucín sú iné aminokyseliny s nepolámymi skupinami, ako sú alanín, valin, leucín a prolin a taktiež ich analógy a homológy. V tomto ohľade výskyt atómov dusíka -N- vo všeobecnom vzorci A nevylučuje možnosť tvorby kruhu tak, ako k tomu dochádza s prolínom. Náhradou za valin je izoleucín a iné aminokyseliny s nepolámymi skupinami vrátane ich analógov a homológov. Náhradou za fenylalanín sú tryptofan atyrozín. Náhradou za Dhb sú iné aminokyseliny s takým alkenylidénovým substituentom, vrátane aminokyselín s C3 alebo ďalšími postrannými reťazcami a taktiež ich analógy a homológy.

Aa¹ má s výhodou všeobecný vzorec:

O

RAa¹ kde RAa¹ je postranný reťazec obsahujúci väzobnú skupinu X. Príklady postranných reťazcov sú alkyl, aryl a arylalkyl, predovšetkým alkyl, typicky alkyl s 1 až 4, hlavne s 2 uhlíkovými atómami. Výhodný je rozvetvený alkyl. Je vhodné, keď väzobnou skupinou X je kyslík, pričom je výhodné, keď Aa^l je odvodené od treoninu, avšak môžu byť i iné väzobné skupiny, ako je síra alebo aminoskupina (nesubstituovaná alebo substituovaná alkylom, arylom alebo arylalkylom). Je vhodné, keď skupina X je jedinou polárnou skupinou v Aa¹. Aa¹ môže byť racemickou zmesou, L alebo D, aleje výhodné, keď je v D konfigurácii.

Aa² má s výhodou všeobecný vzorec:

O

-----N-----1---RAa² kde RAa² . je postranný reťazec ako je alkyl, aryl a arylalkyl, predovšetkým alkyl, typicky alkyl s 1 až 5, hlavne s 3 uhlíkovými atómami, výhodný je rozvetvený alkyl ako je vizoleucíne. Je vhodné, keď vAa² nie sú poláme substituenty. Aa² môže byť racemickou zmesou, L alebo D, aleje výhodné, keď je v D konfigurácii.

Aa³ má s výhodou všeobecný vzorec:

O

RAa³ kde RAa³ je postranný reťazec ako je alkyl, aryl a arylalkyl, predovšetkým alkyl, typicky alkyl s 1 až 5, hlavne s 3 uhlíkovými atómami. Výhodný je rozvetvený alkyl ako je vo valíne. Je vhodné, keď v Aa³ nie sú polárne substituenty. Aa³ môže byť racemickou zmesou, L alebo D, ale je výhodné, keď je v D konfigurácii.

Aa⁴ má s výhodou všeobecný vzorec:

RAa⁴ kde RAa⁴ je postranný reťazec ako je alkyl, aryl a arylalkvl, predovšetkým arylalkyl, typicky arylalkyl s 7 až 10, hlavne so 7 uhlíkovými atómami. Výhodný je benzyl ako je vo fenylalaníne. Je vhodné, keď v Aa⁴ nie sú polárne substituenty. Aa⁴ môže byť racemickou zmesou, L alebo D, ale je výhodné, keď je v L konfigurácii.

Aa⁵ má s výhodou všeobecný vzorec:

RAa⁵“ RAa^íb kde každý z RAa^5a a RAa^íb je vybraný zo skupiny zahrňujúcej vodík alebo postranný reťazec ako je alkyl, aryl a arylalkyl, predovšetkým alkyl, typicky alkyl s 1 až 4, hlavne s 1 uhlíkovým atómom. S výhodou je RAa^5a vodík vytvárajúci Z konfiguráciu, ako je napríklad vo výhodnej kyseline a,b-didehydro-a-aminomaslovej. Je vhodné, keď v Aa⁵ nie sú polárne substituenty. Aa⁵ môže byť racemickou zmesou, L alebo D, ale je výhodné, keď je v L konfigurácii.

Aa⁶ má s výhodou všeobecný vzorec:

Ο

RAa⁶ kde RAa⁶ je postranný reťazec ako je alkyl, aryl a arylalkyl, predovšetkým alkyl, typicky alkyl s 1 až 5, hlavne s 3 uhlíkovými atómami. Výhodný je rozvetvený alkyl ako je vo valíne. Je vhodné, keď v Aa⁶ nie sú polárne substituenty. Aa⁶ môže byť racemickou zmesou, L alebo D, ale je výhodné, keď je v L konfigurácii.

Aminokyseliny Aa¹ až Aa⁷ môžu byť také, ako sú definované pre skupiny Aaa-1 až Aaa-7 vo všeobecnom vzorci Π.

S výhodou postranný reťazec obsahuje 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-ProL-Om-D-allo-Ile, alebo jeho obdobu, vrátane analógov a homológov. Príklady podobných reťazcov zahrňujú také, ktoré majú všeobecný vzorec (R'jm-Caminokyselinajn-, kde m + n nie sú nula, R¹ predstavuje koncovú skupinu, výhodný je alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl, heteroalkyl, alicyklickú alebo inú koncovú skupinu a -(aminokyselina)npredstavuje voliteľný reťazec aminokyselín.

Je vhodné, keď koncová alkylová skupina má 1 až 12 uhlíkových atómov, výhodnejšie, keď má až 10 uhlíkových atómov, môže byť substituovaná a je výhodné, keď je rozvetvená. Príkladom je butyl, pentyl, hexyl, heptyl, oktvl a ďalšie alkylové skupiny obsahujúce 1 alebo viacej metylov alebo etylov, alebo ďalšie postranné skupiny, ktoré s výhodou obsahujú 1 až 6 uhlíkových atómov, predovšetkým 5-metylhexyl a iné alkylové skupiny, ktoré sú rozvetvené na opačnom konci, ako je ich pripojenie ku zbytku molekuly. Medzi vhodné substituenty patria skupiny ako sú halogénová, hydroxylová, alkoxylová, amínová, karboxylová, karboxyamidová, kyánová, nitroskupina, alkylsulfonylová, alkoxylová, alkoxyalkylová, arylalkylarylová, heterocyklickú, alicyklická, arylová, arylalkylová a ďalšie skupiny, ktoré sa tu spomínajú. Pokiaľ je to vhodné, môžu tieto substituenty niesť ďalšie substituenty, ako napríklad tolylovú skupinu. Halogénové substituenty sú v súčasnej dobe najpreferovanejšie, najmä 1 alebo viaceré, ako napríklad 1 až 3 atómy fluóru. Ďalšie koncové skupiny môžu byť vybrané podľa poučenia v texte a zahrňujú alicyklické, arylalkylové, arylové, heterocyklické alebo iné skupiny s možným 1 alebo viacerými substituentami, predovšetkým s 1 až 3.

Postranný reťazec R-CO-N- môže na dusíku obsahovať vodík alebo substituenta ako je alkylová, arylová alebo arylalkylová skupina.

Vhodné podoby postranných reťazcov používajú substituované aminokyseliny, vybrané v súhlase s vyššie uvedeným princípami, pričom pre aminokyseliny v cyklickej časti molekuly sú vyberané alternatívy izoleucínu, valínu a treonínu a alternatívy omitínu zahrňujú lyzín, histidín, arginín; alternatívy prolínu zahrňujú alanín a iné nepoláme aminokyseliny, ako sú glycín, izoleucín a iné, skôr spomenuté aminokyseliny. V typickom prípade má reťazec R 0 až 10, výhodnejšie 4 až 8, ako napr. 5, 6 alebo 7, najmä 7 aminokyselín. Tam, kde je viacej než 7 aminokyselín, je výhodné, keď tieto dodatočné aminokyseliny sú prirodzené aminokyseliny, najmä tie, ktoré sú tu uvedené.

Aminokyseliny môžu byť použité buď vo forme racemickej zmesi alebo ako forma L alebo D. Keď sa aminokyseliny vyskytujú v postrannom reťazci R, je výhodné, keď sa jedna alebo viacej z nich vyskytuje v rovnakej konfigurácii ako v prirodzenom postrannom reťazci. Počítané od cyklického hexapeptidu, aminokyselinové zbytky sú v konfigurácii DLDDLLD. Je vhodné, keď koncová alkylová skupina má 1 až 12 uhlíkových atómov, výhodnejšie 4 až 10 uhlíkových atómov, môžu byť substituované a je výhodné, keď sú rozvetvené. Medzi vhodné substituenty patria skupiny, ako sú halogén, hydroxylová, alkoxylová, amínová, karboxylová, karboxyamidová, kyánová, nitroskupina, alkylsulfonylová a ďalšie skupiny, ktoré sa tu spomínajú. Halogénové substituenty sú v súčasnej dobe preferované najviac.

Všeobecne môže byť postranný reťazec R-CO-N v zlúčeninách všeobecného vzorca II definovaný ako postranný reťazec R⁸-NH-CHR⁷-CO-NH- vrátane zlúčenín obsahujúcich zmesi aminokyselín, ktoré sú definované vo všeobecných vzorcoch m, IV a V.

Napriek tomu, že výhodné rysy boli popísané v odkaze na kahalalid F, táto prihláška poskytuje iné výhodné zlúčeniny, ktoré sú predmetom tohto vynálezu a sú to podľa rovnakých princípov navrhované napodobeniny iných kahalalidov. Teda môžu byť zmenené aminokyseliny a postranné reťazce s výhodou, ale tak, aby bola zachovaná hydrofilnohydrofóbna rovnováha medzi polárnymi a nepolámymi skupinami.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, majú výhodnú biologickú aktivitu, okrem iného, protinádorovú aktivitu.

Predložený vynález teda poskytuje spôsob liečenia akéhokoľvek cicavca, vrátane človeka, ktorý je postihnutý rakovinou, kedy tento spôsob zahrňuje podávanie postihnutému jedincovi terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny, ktorá je predmetom tohto vynálezu alebo farmaceutického prostriedku, ktorý ju obsahuje.

Predložený vynález sa tiež týka farmaceutických prípravkov, ktoré ako svoju aktívnu zložku obsahujú zlúčeninu alebo zlúčeniny, ktoré sú predmetom tohto vynálezu a taktiež postupy ich prípravy.

Príklady farmaceutických prostriedkov zahrňujú akúkoľvek pevnú látku (tablety, pilulky, tobolky, granuly, atď.) alebo tekutinu (roztoky, suspenzie alebo emulzie), ktorá má vhodné zloženie, alebo orálny, miestny alebo parenterálny spôsob podávania a môžu obsahovať čistú zlúčeninu alebo túto zlúčeninu v kombinácii s akýmkoľvek nosičom alebo farmakologicky aktívnymi zlúčeninami. Pokiaľ sú tieto prostriedky podávané parenterálne, je potrebné, aby boli sterilné.

Podávanie zlúčenín alebo prostriedkov predloženého vynálezu môže byť uskutočnené akýmkoľvek vhodným spôsobom, ako je intravenózna infúzia, orálne prípravky, intraperitoneálne a intravenózne podávanie. Prednosť sa dáva infúznym časom až 24 hodín, výhodnejšie 2 až 12 hodín a najvýhodnejšie 2 až 6 hodín. Zvlášť žiadúce sú krátke infuzne časy, ktoré umožňujú, aby liečenie bolo uskutočnené bez celonočného pobytu v nemocnici. Avšak infúzie môžu trvať, pokiaľ sa to vyžaduje, 12 až 24 hodín alebo ešte dlhšie. Infúzie môžu byť uskutočnené vo vhodných intervaloch, povedzme 2 až 4 týždne. Farmaceutické prostriedky obsahujúce zlúčeniny, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, môžu byť podávané lipozómomi alebo zapúzdrené v štruktúrach nanometrových rozmerov, formami trvalého uvoľňovania alebo inými štandardnými spôsobmi podávania.

Správne dávkovanie zlúčenín bude varírovať v závislosti od určitého prípravku, od spôsobu aplikácie, od polohy, od hostiteľa a od liečeného nádoru. Do úvahy sa budú brať i iné faktory, ako sú vek, telesná hmotnosť, pohlavie, strava, čas podávania, rýchlosť vylučovania, stav hostiteľa, kombinácia liekov, citlivosť reakcie a vážnosť choroby. Podávanie môže byť v rámci maximálne povolenej dávky uskutočňované kontinuálne alebo periodicky.

Zlúčeniny a prostriedky predloženého vynálezu môžu byť použité s inými liekmi a môžu tak poskytnúť kombinovanú terapiu. Iné lieky môžu tvoriť súčasť toho istého prostriedku, alebo môžu byť poskytované ako oddelený prostriedok, podávaný v tej istej dobe alebo v inom čase. Identita iného lieku nie nijako zvlášť obmedzená a medzi vhodných kandidátov patria:

a) lieky s antimitotickými účinkami, špeciálne tie, ktoré sú zamerané na elementy cytoskeletu, vrátane modulátorov mikrotubúl, ako sú taxánové lieky (ako je taxol, paclitaxel, taxoter, dodetaxel), podofylotoxíny alebo alkaloidy zo zimozelene (vincristín, vinblastín);

b) lieky antimetabolity, ako sú 5-fluórouracil, cytarabín, gemcitabín, analógy purínu, ako sú pentostatin, metotrexát;

c) alkylačné činidlá, ako sú dusíkaté horčičné zlúčeniny (ako sú cyklofosfamid alebo ifosfamid)

d) lieky, ktoré cielene pôsobia na DNA, ako sú antracyklínové lieky adriamycín, doxorubicín, farmorubicín alebo epirubicín;

e) lieky, ktoré cielene pôsobia na topoizomerázy, ako je etopozid;

f) hormóny, agonisty a antagonisty hormónov, ako sú estrogény, antiestrogény (tamoxifén a podobné zlúčeniny) a androgény, flutamid, leuprorelín, goserelín, cyprotrón alebo oktreotid;

g) lieky, ktoré cielene pôsobia na prenos signálu v nádorových bunkách, vrátane derivátov antibiotík, ako je herceptín;

h) alkylačné lieky, ako sú lieky obsahujúce platinu (cis-platín, carbonplatín, oxaliplatín, paraplatín) alebo nitrózomočoviny;

i) lieky potencionálne ovplyvňujúce metastázy nádorov, ako sú inhibítory metaloproteináz v cytoplazme;

j) činidlá pre génovú terapiu a antisense terapiu;

k) protilátkové liečivá;

l) iné biologicky aktívne zlúčeniny morského pôvodu, najmä ekteínascidíny, ako je ekteínascidín 743 alebo didemníny, ako je aplidin;

m) analógy steroidov, najmä dexametazón;

n) protizápalové lieky, najmä dexametazón; a

o) lieky proti dáveniu, najmä dexametazón.

Predložený vynález sa tiež týka tých zlúčenín vynálezu, ktoré sa používajú v liečebnej metóde a použitie zlúčenín pri príprave prostriedku na liečenie rakoviny.

Od zlúčenín predloženého vynálezu sa tiež očakáva, že budú mať protituberkulóznu aktivitu.

Tento vynález tiež poskytuje postup na prípravu zlúčenín vynálezu, vrátane kahalalidu F, ktorý obsahuje uzatvorenie kruhu medzi Aa³ a Aa⁴ Bolo zistené, že uzatvorenie kruhu v tejto pozícii umožní vynikajúci postup. Ostatné modifikácie, vrátane vytvorenia alebo rozšírenia postranného reťazca na Aa¹ a/alebo odstránenie chrániacich skupín a/alebo modifikovanie substituentov na aminokyselinách, môžu byť uskutočnené pred a/alebo po uzatvorení kruhu.

Proces teda môže byť znázornený nasledujúcou schémou:

kde R je skupina R-CO-N- alebo jej prekurzor a kde jedna alebo viacej aminokyselín môže obsahovať chrániace skupiny a kde -COOH na Aa³ a/alebo -NH₂ na Aa⁴ môžu byť voliteľne chránené, aktivované alebo derivované. Takéto postupy na používanie prekurzorov alebo chrániacich skupín, pre aktiváciu alebo derivovanie, sú samy o sebe celkom bežné a pre praktické uskutočnenie tohto postupu nie je potrebné uvádzať ďalšie podrobnosti.

Postup, ktorý je predmetom predloženého vynálezu, môže byť uskutočnený zvýchodzích materiálov rýchlym spôsobom za súčasnej kontroly optických izomérov a sférického usporiadania molekuly, pričom sa využíva výhoda metódy syntézy na pevnej fáze, kde je konštruovaná molekula v priebehu všetkých syntetických operácií naviazaná na nerozpustnom podklade. Teda nadbytok reagentov a rozpustných medziproduktov môže byť jednoducho odstránený premývaním komplexu molekula-živica pomocou vhodných rozpúšťadiel. Preto môže byť použitý veľký nadbytok rozpustných reagentov, aby bola počas krátkeho času posunutá reakčná rovnováha v smere produktov, aby bola potlačená racemizácia (pokiaľ o to ide) a iné druhotné reakcie. Táto metóda je tiež prístupná pre automatizáciu.

Výhodné uskutočnenie syntetického postupu, ktorý je predmetom predloženého vynálezu, je najlepšie znázornené v schéme 1, ktorá je zameraná na vytvorenie zlúčenín všeobecného vzorca Π.

Schéma 1

Ako je vyššie uvedené v schéme 1, výhodný postup na syntetickú prípravu kahalalidu

F (všeobecný vzorec I) jeho derivátov a analógov, je založený na syntéze na pevnej fáze (pozri napr. Lloyd-Williams P. a kol., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and

Proteins, CRC Press, Boca Raton (FL), 1997.

Postup znázornený v schéme 1 obsahuje tieto po sebe nasledujúce kroky:

a) pripojenie Fmoc-aminokyseliny (Aaa³) k pevnému podkladu (napr. polystyrén, polyetylén nanesený na polystyréne a podobne), ktorý obsahuje veľmi kyslú nestálu skupinu alebo linker (napr. chlorotrityl, polyalkoxybenzyl a podobne) a vytvorí esterovú väzbu;

b) predlžovanie peptidického reťazca tromi aminokyselinami (Aaa², Aaa¹ a Aaa⁷) pomocou postupu používajúceho Fmoc/tBu. Pre I, X¹ = OH je vnesené bez chrániacich skupín. Pokiaľ X¹ = NH₂ toto je vnesené s chrániacou skupinou Alloc;

c) zabudovanie (Aaa⁶) pomocou postupu používajúceho Fmoc/tBu;

d) predĺženie peptidického reťazca o zostávajúce aminokyseliny a Rⁿ-COOH až Aaa⁷ pomocou postupu používajúceho Fmoc/tBu;

e-1) predĺženie peptidického reťazca o 2 aminokyseliny [Aaa⁵ (OH, H), Aaa⁴] až Aaa⁶ pomocou postupu používajúceho Fmoc/tBu. Skupina OH, pripojená k Aaa⁵ nie je chránená;

e-2) dehydratovanie na pevnej fáze, čím je získaný peptid s Aaa⁵;

alebo e'-l) zabudovanie dipeptidu Alloc-Aaa⁴-Aaa⁵-OH, ktorý bol spojený a dehydratovaný v roztoku;

f) odstránenie skupiny Alloc z zatiaľčo peptid je stále ukotvený na pevnom podklade;

g) uvoľnenie peptidu s chráneným (pokiaľ je chránenie použité) postranným reťazcom z pevného podkladu;

h) cyklizácia peptidu v roztoku;

i) odstránenie skupín chrániacich postranný reťazec, ktoré sú nestále voči TFA.

Je nutné si uvedomiť, že určitý výber chrániacich skupín nie je kritický a že je možný široký výber volieb. Napríklad typ skupín Bzl môže nahradiť tBu/Boc; namiesto Fmoc možno použiť Boe; namiesto Alloc možno použiť Fmoc; namiesto chlorotritylu možno použiť Wangovu živicu.

Podrobný popis výhodných uskutočnení postupu

Výhodný postup predloženého vynálezu je znázornený v schéme 1. Ako je tam znázornené a podrobnejšie diskutované v príkladoch, ktoré ďalej nasledujú, tento postup môže byť uskutočnený nasledujúcim postupom:

Fmoc-Aaa³-OH je s výhodou pripojený k živici chlorotrityl-polystyrén, viď Barlos, K., Gatos, D., Schäfer, W. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 590-593, v prítomnosti DIEA, ktorý udržuje úroveň substitúcie približne na 0,15 až 0,5 mmol/g. Použitie vyššieho plnenia so sebou prináša v konečnom produkte prítomnosť ukončených peptidov, viď Chiva, C., Vilaseca, M., Giralt, E., Albericio, f. J. Pept. Sci. 1999, 5, 131-140.

Odstránenie skupiny Fmoc bolo uskutočnené pomocou piperidínu-DMF (2:8, objem) (1 x 1 minúta, 3x5 minút, 1 x 10 minút). Väzba Fmoc-, Aloc-Aaa-OH a Rⁿ-COOH (5 ekvivalentov) bolo uskutočnená pomocou HATU-DIEA, viď Carpino, L. A., El-Faham, A., Minor, C. A., Albericio, F. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994, 201-203, (5:10) v DMF počas 90 minút. Po spojení bol uskutočnený ninhydrínový test a pokiaľ bol pozitívny, väzba bola za rovnakých podmienok opakovaná, inak sa v postupe pokračovalo. Premývanie medzi deprotekčným, väzobným a opäť medzi deprotekčným krokom bolo uskutočnené pomocou DMF (5 x 0,5 minúty) a CH2CI2 (5 x 0,5 minúty), pričom zakaždým bolo použitých 10 ml roztoku na gram živice.

Pripojenie Alloc-Aaa⁶-OH (7 ekvivalentov), kde X¹ = 0, bolo uskutočnené pomocou ekvimolárneho množtva DIPCDI a 0,7 ekvivalentov DMAP počas 2 hodín. Toto pripojovanie bolo dvakrát opakované.

Odstránenie skupiny Alloc bolo uskutočnené pomocou Pd(PPh₃)₄ (0,1 ekvivalentu) v prítomnosti PhSiH₃ (10 ekvivalentov) v argónovej atmosfére, viď Gómez-Martinez, P., Thieriet, T., Albericio, F., Guibé, F. J. Chem. Soc. Perkin 1 1999, 2871-2874.

Dehydratácia bola uskutočnená na pevnej fáze pomocou EDC (vo vode rozpustný karbodiimid, 100 ekvivalentov) v prítomnosti CuCl (60 ekvivalentov) v CH2CI2-DMF (10:2) počas 6 dní. Fukase, K., Kitazawa, M., Sano, A., Shimbo, K., Horimoto, S., Kubo, A., Wakamiya, T., Shibe, A. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1992, 65, 2227-2240.

Dipeptid Alloc-Aaa⁴-Aaa⁵-OH (5 ekvivalentov), ktorý bol pripravený v roztoku z Alloc-Aaa⁴-OH a H-Aaa^J(OH, H)-OzBu s EDC a potom dehydratovaný a opracovaný TFA, bol spojený s HATU-DEEA (5:10) v priebehu 16 hodín a ešte to bolo opakované ďalšie 3 hodiny.

Použitie iných väzobných reagentov založené na HOBt, ako je HBTU alebo DIPCDI-HOBt, viedlo k neúplným inkorporáciám dipeptidu.

Odštepovanie chráneného peptidu zo živice bolo uskutočnené pomocou TFA-CH2CI2 (1:99) (5 x 30 sekúnd).

Cyklizačný krok bol uskutočnený pomocou DIPCDI-HOBt (3:3 ekviv.) v CH2CI2DMF počas 2 hodín. Taktiež môžu byť použité iné metódy, ako je napríklad PyBOP/DĽEA (3:6 ekviv.) v DMF.

Záverečné odstránenie chrániacich skupín bolo uskutočnené pomocou TFA-H2O (95:5) počas 1 hodiny.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Skratky

Skratky používané pre aminokyseliny a označovanie peptidov zodpovedajú pravidlám IUPAC-IUB komisie pre biochemické názvoslovie, viď J. Biol. Chem. 1972, 247, 977-983. Sú použité nasledujúce ďalšie skratky: 4-AcBut-OH, 4 kyselina acetoxymaslová; AcButBut-OH, kyselina 4-(4-acetoxybutanoyloxy)maslová; ACH, kyselina a-kyano-4-hydroxyškoricová; Alloc, allyloxykarbonyl; Boe, terc-butyloxykarbonyl; t-Bu, terc-butyl; But-OH, kyselina maslová; Cl-TrtCl-živica, 2-chlorotritylchloridová živica; Dap, kyselina 2,3diaminopropiónová; 4-DiMeABut-OH, kyselina N,N-dimetyl-4-aminomaslová; 3-DiMeButOH, kyselina 3,3-dimetylmaslová; DHB, kyselina 2,5-dihydroxybenzoová; Z-Dhb, kyselina a,b-didehydro-a-aminomaslová; DIEA, Ν,Ν-diizopropyletylamín; DMF, N,Ndimetylformamid; EDC, l-etyl-3-(3'-dimetylaminopropyl)karbodiimid hydrochlorid; Etg, etylglycín; ESMS, elektrosprejová hmotnostná spektrometria; FABMS, hmotnostná spektrometria pomocou bombardovania rýchlymi atómami; Fmoc, 9-fluorenylmetoxykarbonyl; HATU, N-[(dimetylamino)-1 H-1,23-triazolo-[4,5]pyridín-1 -yl-metylén]-Nmetylénmetánamínium hexafluorofosforečnan N-oxid; HBTU, N-[(lH-benzotriazol-lyl)](dimetyIamino)metylén]-N-metylmetán-amínium hexafluorofosforečnan N-oxid; 2-HedoOH, kyselina 2,4-hexadiénová; Hep-OH, kyselina heptánová; HOAc, kyselina octová; HOAt, kyselina l-hydroxy-7-azabenzotriazol(3hydroxy-3H-l,2,3-triazol-[4,5-b]pyridín); HOBt, 1hydroxybenzotriazol; IBut-OH, kyselina izomaslová; 3-MeBut-OH, kyselina 3-metylmaslová;

5-MeHex-OH, kyselina 5-metylhexánová; MeOH, metanol; 4-MePen-OH, kyselina 4metylpentánová; NMM, N-metylmorfolín; 4-HOBut, kyselina 4-hydroxymaslová; (bOH)Phe-OH, b-hydroxyfenylalanín; Lit-OH, kyselina litocholová; Pal, kyselina palmitová; Phe-OH, a,b-didehydrofenylalanín; PyAOP, 7-azabenzotriazol-l-yl-N-oxy-tris-(pyrrolidín)24 fosfónium hexafluorofosforečnan; PyBOP, benzotriazol-l-ykN-oxy-tris-ÍpyTrolidín)fosfónium hexafluorofosforečnan; SPS, syntéza na pevnej fáze; TFA, kyselina trifluóroctová; Tico-OH, kyselina tetraikosanová. Pokiaľ nie je stanovené inak, symboly aminokyselín označujú L konfiguráciu.

Všeobecné postupy. Cl-TrtCl-živice, aminokyselinové deriváty chránené Fmoc, HOBt, PyBOP, HATU boli od PerSeptive Biosystems (Framingham, MA), Bachem (Bubendorf, Švajčiarsko), NovaBiochem (Läufenfingen, Švajčiarsko). Alloc-aminokyseliny boli pripravené v podstate tak, ako je popísané Danglesom a kol., viď Dangles, O., Guibé, F., Balavoine, G., Lavielle, S., Marquet, A., J. Org. Chem. 1987, 52, 4984-4993 a 5-MeHex-OH syntézou cez kyselinu malónovú. DIEA, DIPCDI, EDC, piperidín, TFA boli od Aldrich (Milwaukee, WI). DMF a CH2CI2 boli od SDS (Peypin, Francúzsko). Acetonitril (pre HPLC) bol od Scharlau (Barcelona, Španielsko). Všetky komerčné reagenty a rozpúšťadlá boli použité v takom stave, ako boli dodané, s výnimkou DMF a CH2CI2, ktoré boli prevzdušnené dusíkom, aby boli odstránené prchavé kontaminujúce látky (DMF) a uložené nad aktívnym molekulovým sitom 0,4 nm (Merck, Darmstadt, Nemecko) (DMF) alebo CaCh (CH2CI2). Extrakty organických roztokov boli sušené nad bezvodým MgSO₄ a potom nasledovalo odstránenie rozpúšťadla pri zníženom tlaku a teplote <40 °C.

Syntéza na pevnej fáze bola uskutočnená v polypropylénových injekčných striekačkách (20, 10 ml), ukončených poréznym polypropylénovým diskom. Rozpúšťadlá a rozpustné reagenty boli odstránené odsávaním. Odstránenie skupiny Fmoc bolo uskutočnené pomocou piperidínu-DMF (2:8 objem) (lxl minúta, 3x5 minút, 1 x 10 minút). Premývanie medzi odstraňovaním chrániacich skupín, pripojovaním a opakovaním krokov odstraňujúcich chrániace skupiny bolo uskutočnené pomocou DMF (5 x 0,5 minúty) a CH2CI2 (5 x 0,5 minúty), zakaždým bolo použitých 10 ml rozpúšťadla na gram živice. Peptidová syntéza a premývanie boli uskutočnené pri teplote 25 °C. Syntézy uskutočnené na pevnej fáze boli kontrolované pomocou HPLC alikvotu (približne 10 mg) medziproduktov, získaných po odštiepení zmesí TFA-H2O (9:1) počas 60 minút z peptidyl-živice. Kolóny pre HPLC [Kromasil Cjg (podmienky A až F) /C4 (podmienky G, H)], kolóna pre reverznú fázu (4,6 x 250 mm, 10 mm) boli od Akzo Nobel (Bohum, Švédsko). Analytická HPLC bola uskutočnená na prístroji Shimadzu obsahujúcom dve pumpy na podávanie roztokov (model LC-6A), automatický injektor (model SIL-6B), detektor premenlivých vlnových dĺžok (model SPD6A), kontrolnú jednotku systému (model SCL-6B) a súradnicový zapisovač (model C-R6A). Detekcia UV bola robená pri 220 nm a lineárne gradienty od CH3CN (+0,036 % TFA) do

Η₂0 (+ 0,045% TFA) boli uskutočnené pri rýchlosti prietoku 1,0 ml/min. od: (podmienky A)

1:9 až 10:0 počas 30 min; (podmienky B) 3:7 až 10:0 počas 30 min; (podmienky C) 1:19 až

19:1 počas 30 min; (podmienky D) 45:55 až 90:10 počas 30 min; (podmienky E) 45:55 až 6:4 počas 30 min; (podmienky F) izokraticky 1:1; (podmienky G) 3:7 až 1:0 počas 30 min;

(podmienky H) 1:1 až 1:0 počas 30 min.

MALDI-TOF- a ES-MS analýzy peptidových vzoriek boli uskutočnené na prístroji PerSeptive Biosystems Voyager DE RP použitím matríc CHCA alebo DHB a na spektrometri Micromass VG-quattro. Vzorky peptid-živica boli hydrolyzované v 12M vodnom roztoku HCl-kyselina propiónová (1:1) pri teplote 155 °C počas 1 až 3 hodín a vzorky bez peptidu boli hydrolyzované v 6M vodnom roztoku HC1 pri teplote 155 °C počas 3 hodín. Nasledujúce analýzy aminokyselín boli uskutočnené na autoanalyzátore Beclanan Systém 6300. ’H-NMR (500 MHz, 200 MHz) a ¹³C-NMR (50 MHz) spektroskopia boli uskutočnené na zariadení Bruker DMX-500 (11,7 T) a Varian Gemini 200 (4,7 T). Chemické posuny (d) sú vyjadrené ako počet častí z milióna v smere zodpovedajúcom znižovaniu sily poľa TMS. Väzobné konštanty sú vyjadrené v hertzoch.

Kahalalid F (1)

Príklad 1: H-D-Val-O-TrtCl -živica

Cl-TrtCl-živica (1 g, 1,35 mmol/g) bola umiestnená do 20 ml polypropylénových injekčných striekačiek, ukončených poréznym polypropylénovým filtračným diskom. Živica bola potom premytá CH₂C1₂ (5 x 0,5 min.) a bol pridaný roztok Fmoc-D-Val-OH (92 mg, 0,27 mmol, 0,2 ekvivalentu) a DĽEA (471 ml, 2,7 mmol, 2 ekvivalenty) v CH₂C1₂ (2,5 ml) a zmes bola miešaná 1 hodinu. Reakcia bola ukončená pridaním MeOH (800 ml) a miešaním 15 minút. Fmoc-D-Val-O-TrtCl-živica bola ďalej premývaná nasledujúcimi roztokmi - CH₂C1₂ (3 x 0,5 min.), DMF (3 x 0,5 min.), piperidín-CH₂Cl₂-DMF (1:9,5:9,5, 1x10 min.), piperidínDMF (1:4, 1x15 min.), DMF (5 x 0,5 min ), izopropanol (2 x 1 min.), DMF (5 x 0,5 min.), MeOH (2 x 1 min.) a sušená vo vákuu. Účinnosť väzby bola vypočítaná na základe AAA (analýzy aminokyselín) a bola 0,15 mmol/g.

Príklad 2: Fmoc-D-al lo-Ile-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-živica

Fmoc-D-allo-Ile-OH (265 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov), Fmoc-D-allo-Thr-OH (voľná hydroxylová skupina) (256 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov) bolo postupne pridaných k vyššie získanej H-D-Val-O-TrtCl-živici použitím HATU (285 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov) a DIEA (261 ml, 1,5 mmol, 10 ekvivalentov) v DMF (2,5 ml). Vo všetkých prípadoch bol po 90 minútach väzobnej reakcie ninhydrinový test negatívny. Odstránenie skupiny Fmoc a premývanie boli urobené tak, ako je popísané vo všeobecných postupoch. Alloc-Val-OH (211 mg, 1,05 mmol, 7 ekvivalentov) bolo pripojených k DIPCDI (163 mg, 1,05 mmol, 7 ekvivalentov) v prítomnosti DMAP (12,8 mg, 0,105 mmol, 0,7 ekvivalentu). Táto väzobná reakcia bola dvakrát opakovaná za rovnakých podmienok. Na alikvot peptidylživice bolo pôsobené TFA-H₂O (9:1) 60 minút a HPLC (podmienky A, tR 25,9 min.) hrubého produktu získaného po odparení ukázala >98% čistotu. ESMS, vypočítané pre C45H63N5O11,

849,5. Zistené: m/z 850,1 [M+H]⁺.

Príklad 3: 5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Pro-Om(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Alloc)D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-živica

Skupina Fmoc bola odstránená a k vyššie uvedenej peptidyl-živici (príklad 2) boli postupne pridané Fmoc-Om(Boc)-OH (341 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov), Fmoc-D-ProOH (253 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov), Fmoc-D-Val-OH (255 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov), Fmoc-Val-OH (255 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov), Fmoc-Thr(tBu)-OH (298 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov), Fmoc-D-Val-OH (255 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov) a 5MeHex-OH (98 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov) použitím HATU (285 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov) a DIEA (261 mg, 1,5 mmol, 10 ekvivalentov) v DMF (2,5 ml). Vo všetkých prípadoch boli po 90 minútach väzobné reakcie na ninhydrinový alebo chloranílový (po inkorporácii D-Val) test negatívne. Odstránenie skupiny Fmoc a premývanie boli urobené tak, ako je to popísané vo všeobecných postupoch. Na alikvot peptidyl-živice bolo pôsobené TFAH₂O (9:1) 60 minút a HPLC (podmienky A, ír 17,2 min.) hrubého produktu získaného po odparení ukázala > 82% čistotu. ESMS, vypočítané pre Cé6Hii6Ni₂0i7, 1348,9. Zistené: m/z 1350,0 [M+H]*.

Príklad 4: 5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Om(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr-(ValThr-Phe-AUoc)-D-allo-Ue-D-Val-O-TrtCl-živica

Skupina Alloc bola odstránená pomocou Pd(PPh3)4 (17,3 mg, 0,015 mmol, 0,2 ekvivalentu) v prítomnosti PhSffib (185 μΐ, 1,5 mmol, 10 ekvivalentov) v argónovej atmosfére. K vyššie uvedenej peptidyl-živici (príklad 3) boli postupne pridané Fmoc-Thr-OH (voľná hydroxylová skupuna) (256 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov) a Alloc-Phe-OH (187 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov) použitím HATU (285 mg, 0,75 mmol, 5 ekvivalentov) a DIEA (261 mg, 1,5 mmol, 10 ekvivalentov) v DMF (2,5 ml). Vo všetkých prípadoch bol po 90 minútach väzobnej reakcie ninhydrínový test negatívny. Odstránenie skupiny Fmoc a premývanie boli urobené tak, ako je to popísané vo všeobecných postupoch. Na alikvot peptidyl-živice bolo pôsobené TFA-H2O (9:1) 60 minút a HPLC (podmienky A, tR 17,8 min.) hrubého produktu získaného po odparení ukázala >70% čistotu. ESMS, vypočítané pre C79H132N14O20, 1597,0. Zistené: m/z 1598,2 [M+H] λ

Príklad 5: 5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Om(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(ValZ-Dhb-Phe-H)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-živica (prostredníctvom dehydratácie na pevnej fáze)

Na vyššie uvedenú peptidyl-živicu (príklad 4) bolo pôsobené EDC (2,88 g, 15 mmol, 100 ekvivalentov), CuCl ( 891 mg, 9 mmol, 60 ekvivalentov) v CH2CI2-DMF (10:2) (12 ml) 6 dní. Po dôkladnom premytí DMF, CH2CI2 a DMF bola skupina Alloc odstránená pomocou Pd(PPh3)4 (17,3 mg, 0,015 mmol, 0,1 ekvivalentu) v prítomnosti PhSiH3(185 μΐ, 1,5 mmol, 10 ekvivalentov) v argónovej atmosfére. Výsledná účinnosť väzby bola vypočítaná na základe AAA (analýzy aminokyselín) a bola 0,11 mmol/g (92 % celkového výťažku). Na alikvot peptidyl-živice bolo pôsobené TFA-H₂O (9:1) 60 minút a HPLC (podmienky A, ír 17,2 min.) hrubého produktu získaného po odparení ukázala >70% čistotu. ESMS, vypočítané pre C75H126N14O17, 1495,0. Zistené: m/z 1496,0 [M+H]*.

Príklad 6: 5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Om(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(ValZ-Dhb-Phe-H)-D-allo-Ile-D-Val-OH

Chránený peptid bol odštiepený zo živice (0,5 g, 55,9 μτηοΐ) pomocou zmesi TFACH2CI2 (1:99) (5 x 30 s). Spojené filtráty boli odparené dosucha a lyofílizované a bolo získaných 80,2 mg (48,5 gmol, 87% výťažok) zlúčeniny uvedenej v nadpise, ktorý vykazoval čistotu >70%, ako bolo zistené pomocou HPLC (podmienky B, ír 25,7 min.). ESMS, vypočítané pre C84H142N14O19, 1651,1. Zistené: m/z 1652,3 [M+H]⁺.

Príklad 7: Kahalalid F (I)

Chránený peptid bol (príklad 6) (40,0 mg, 24 pmol) rozpustený v DMF (25 ml) a boli pridané pyBOP (37,8 mg, 73 pmol, 3 ekvivalenty) a DIEA (25 ml, 145 pmol, 6 ekvivalentov). Zmes sa nechala miešať 1 hodinu a potom bolo rozpúšťadlo odstránené odparovaním pri zníženom tlaku. Chránený peptid bol rozpustený v TFA-H₂O (19:1, 5 ml) a zmes sa nechala miešať 1 hodinu. Rozpúšťadlo bolo odstránené odparením pri zníženom tlaku a potom bola pridaná H2O (5 ml) a urobená lyofílizácia. Hrubý produkt bol chromatografícky čistený pri strednom tlaku (Vydac C13 15-20 pm, 30 nm, 240 x 24 mm), lineárny gradient od 20 % do 60 % acetonitrilu (+0,05% TFA) vo vode (+0,05% TFA) 5 hodín (každého rozpúšťadla 300 ml), 120 ml/h, detekcia pri 220 nm a bola tak získaná zlúčenina uvedená v nadpise (5,0 mg, 3,4 pmol, 14% výťažok). MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H124NUO16, 1477,9. Zistené: m/z

1478,7 [M+H] , 1500,6 [M+Na] , 1516,5 [M+K]~. Produkt bol eluovaný pri HPLC spoločne [podmienky D (tR 12,5 min.), E (tR 17,4 min.) a F (ír 12,1 min.)] so vzorkou skutočného kahalalidu F. ’H-NMR (500 MHz, d⁶-DMSO) spektrum zlúčeniny bolo identické s prírodným produktom (údaje uvedené v tabuľke 1).

Tabuľka 1

zbytok	N-H	Ha	Ηβ	iný
(Z)-Dhb	9,69 (s)	•	6,34 (q, J = 7,0 Hz)	1,26 (d, J = 7,5 Hz, y-CHj)
D-al.lo-lle 1	8,82 (d, J = 10,0 Hz)	4,31	1,73	1,31,1,02, 0,77 (y-CH,, yCH3, 5-CH3)
L-Phe	8,79 (d, J = 5,5 Hz)	4,42	2,93 (m)	7,20(1 H Ar, m) 7,28 (4H Ar, m)
D-al.lo- Thr	8,56 (d, J = 8,0 Hz)	4,53	4,96 (m)	1,07 (δ, J = 6,5 Hz, y-CH3)

D-Val 3	8,10 (d, J = 8,5 Hz)	4,26	1,94	0,86 (2 y-CH3)
L-Orn	7,95 (d, J = 8,5 Hz)	4,49	1,48 (2H)	1,67 (y-CHz), 2,74 (bs, δCH2), 7,69 (ε-ΝΗ3*)
D-al.lo-lle 2	7,90 (d)	4,37	1,69	1,30, 1,03, 0,77 (y-CH2, y- CH3, ô-CH3)
D-Val 5	7.88 (d)	4,23	1,96	0,84 (2 y-CH3)
L-Thr	7,82 (d, J = 8,0 Hz)	4,26	3,97 (m)	4,88 (d, J = 5,0 Hz, OH), 0.98 (d, J = 6,5 Hz, y-CH3)
D-Val2	7,62 (d, J = 8,5 Hz)	4,46	2,17	0,77 (y-CH3), 0.62 (d, J = 7,0 Hz, y-CH3)
L-Val 4	7,57 (d, J = 8,5 Hz)	4,28	1,98	0,80 (2 y-CH3)
L-Val 1	6,76 (d, J = 9,0 Hz)	3,86	1,39	0.62 (d, J = 7,0 Hz, y-CH3), 0,58 (d. J = 6,0 Hz, y-CH3)
D-Pro		4,36	2,03, 1,87, 1,79 (β-ΟΗ2, y-CH2), 3,76 (1H, m, 5-CH2), 3,53(1 H, m, -CH2)
5-MeHex		2,13 (2H)	1,47 (3-CH2, δ-CH), 1,11 (y-CH2), 0,82 (2 ε- CH3)

Kahalalid F (I)

Príklad 8: Alloc-Phe-Thr-OtBu

Príklad 7bis: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácia počas cyklizačného kroku) v príklade 7. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (ír 17,4 min., podmienky B) aESMS, vypočítané pre C75H124N14O16, 1477,9. Zistené: m.z 1501,3 [Ní+Na]', 1517,3 [Ní+K]'.

H-Thr-OtBu-HCl (3,1 g, 15 mmol, 1,3 ekvivalentu) bolo rozpustených vCH₂C1₂ (30 ml) a bolo pridané DIEA (2,9 ml, 17 mmol, 1,5 ekvivalentu) a zmes sa nechala miešať 30 minút. Potom boli pridané Alloc-Phe-OH (2,8 g, 11 mmol, 1 ekvivalent) a EDC (2,8 g, 15 mmol, 1,3 ekvivalentu) v CH₂CI₂ (35 ml) a reakčná zmes bola miešaná 18 hodín. Organická reakčná zmes bola premytá H₂O (3 x 25 ml), sušená (MgSO4) a vákuovo koncentrovaná. Výsledný olej (4,12 g) bol chromatograficky čistený [CHCE-MeOH-HOAc (9:1:0,2)] a bol získaný produkt uvedený v nadpise (3,25 g, 8 mmol, 71% výťažok), ktorý bol charakterizovaný analytickou HPLC (ír 20,9 min., >98% Čistota; podmienky C); ESMS, vypočítané pre C21H30N2O6, 406,2. Zistené: m/z 408,0 [M+H]; ^lH-NMR (200 MHz, CDCI3):

7.1 až 7,3 (5 H, m, Ar); 6,89 (1 H, d, J = 8,8 Hz, NH); 5,7 až 5,9 (1 H, m, CH allyl); 5,56 (1 H, d, J = 8,0 Hz, OH); 5,2 až 5,3 (2 H, m, CH₂ g-allyl); 4,52 (2 H, d, J = 5,4 Hz, CH₂ a-allyl); 4,45 (1 H, dd, J = 8,4 Hz, 2,8 Hz, a-CH Thr); 4,22 (1 H, dq, J = 6,2 Hz, J = 3,0 Hz, b-CH Thr); 3,0 až 3,2 (2 H, m, b-CH₂ Phe); 1,47 (9 H, s, tBu); 1,15 (3 H, d, J = 6,6 Hz, g-CH₃ Thr); ¹³C-NMR (50 MHz, CDCI3): 172,2 (CO), 169,5 (CO); 156,0 (CO); 136,1 (Cq, Ar); 132,5 (CH, allyl); 129,3 (CH, Ar); 128,5 (CH, Ar); 126,9 (CH, Ar); 117,7 (CH₂, allyl); 82,7 (Cq, tBu); 68,5 (b-CH, Thr); 65,9 (CH₂, allyl); 58,0 (a-CH Thr); 56,2 (a-CH Phe); 38,3 (b-CH₂ Phe); 28,0 (CH₃, tBu); 20,8 (g-CH₃ Thr).

Príklad 9: Alloc-Phe-Z-Dhb-OtBu

Alloc-Phe-Thr-OtBu (3,25 g, 8,0 mmol), EDC (9,90 g, 52 mmol, 6,5 ekvivalentu) a CuCl (2,14 g, 22 mmol, 2,7 ekvivalentu) bolo rozpustených v zmesi CH₂Cl₂-bezvodý DMF (65 ml, 12:1)) v atmosfére N₂ a zmes sa nechala miešať 2 dni v atmosfére N₂. Organické rozpúšťadlo bolo vákuovo odstránené a zbytok sa dal do nasýteného roztoku EDTA (100 ml), ktorý bol extrahovaný EtOAc (3 x 50 ml). Spojený organický roztok bol premývaný solankou (3 x 60 ml), sušený (MgSO₄) a vákuovo koncentrovaný, čim sa získala svetložltá pevná látka (2,8 g), ktorá bola chromatograficky čistená [CHCE-MeOH-HOAc (9:1:0,1)] a bol získaný produkt uvedený v nadpise (2,6 g, 6,7 mmol, 84% výťažok), ktorý bol charakterizovaný pomocou analytickej HPLC (tR 23,1 min., >95% čistota; podmienky C); ESMS, vypočítané pre C2iH₂₈N₂O5, 388,2. Zistené: m/z 389,6 [M+H]⁺; ^!H-NMR (200 MHz, CDCI3): 7,2 až 7,4 (5 H, m, Ar); 6,69 (1 H, q, J = 7,4 Hz, CH Dhb); 5,8 až 6,0 (1 H, m, CH allyl); 5,2 až 5,3 (2 H, m, CH₂ g-allyl); 4,5 až 4,6 (2 H, m, a-CH₂ allyl); 3,1 až 3,3 (2 H, m, b-CH₂ Phe); 1,67 (3 H, d, J = 7,2 Hz, CH₃ Dhb); 1,47 (9 H, s, tBu); ¹³C-NMR (50 MHz, CDCI3): 168,9 (CO);

163.1 (CO); 156,0 (CO); 136,0 (Cq, Ar); 132,6, 132,3 (CH, allyl; b-CH Dhb); 129,3 (CH,

Ar); 128,7 (CH, Ar); 127,0 (CH, Ar); 117,9 (CH₂, allyl); 81,7 (Cq, tBu); 66,0 (CH₂, allyl); 56,3 (a-CH Phe); 38,2 (b-CH₂ Phe); 28,0 (CH₃ tBu); 14,7 (CH₃ Dhb).

Príklad 10: Alloc-Phe-Z-Dhb-OH

Alloc-Phe-Z-Dhb-OtBu (2,6 g, 6,7 mmol) bol rozpustený v TFA-CH₂C1₂-H₂O (90:8:2,

5,5 ml) a zmes sa nechala miešať 3 hodiny. Organická reakcia bola vákuovo koncentrovaná a bol získaný produkt uvedený v nadpise (2,2 g, 6,6 mmol, 99% výťažok), ktorý bol charakterizovaný pomocou analytickej HPLC (ír 17,0 min., >95% čistota; podmienky C); ESMS, vypočítané pre C17H20N2O5, 332,1. Zistené: m/z 333,7 [M+H]⁺; ’H-NMR (200 MHz, CD3OD): 7,2 až 7,3 (5 H, m, Ar); 6,84 (1 H, q, J = 7,2 Hz, CH Dhb); 5,8 až 6,0 (1 H, m, CH allyl); 5,1 až 5,3 (2 H, m, CH2 g-allyl); 4,4 až 4,5 (2 H, m, a-CH2 allyl); 3,2 až 3,3 (1 H, m, bCH2 Phe); 2,8 až 3,0 (1 H, m, b-CH2 Phe); 1,66 (3 H, d, J = 7,4 Hz, CH3 Dhb); ¹³C-NMR (50 MHz, CD3OD): 173,1 (CO); 138,5 (Cq, Ar); 136,7, 134,1 (CH, allyl; b-CHDhb); 130,3 (CH, Ar); 129,4 (CH, Ar); 127,7 (CH, Ar); 117,4 (CH₂, allyl); 66,6 (CH₂, allyl); 57,8 (a-CH Phe);

39,1 (b-CH₂ Phe); 14,1 (CH₃ Dhb).

Príklad 11: 5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Om(Boc)-D-allo-Ile-D-aIlo-Thr (Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-živica

Cl-TrtCl-živica (0,45 g, 1,35 mmol/g) bola umiestnená do 10 ml polypropylénových injekčných striekačiek, ukončených poréznym polypropylénovým filtračným diskom. Peptidyl-živica bola získaná pomocou rovnakého postupu, ktorý je popísaný v príkladoch 1 až 3 s tou výnimkou, že pri pripojovaní prvej aminokyseliny (Fmoc-D-Val-OH) k živici bolo použitých 0,3 ekvivalentu namiesto 0,2 ekvivalentu. Počiatočná náplň, ako bolo vypočítané na základe aminokyselinovej analýzy, bola 0,29 mmol/g. Akonáhle boli aminokyseliny naviazané, na alikvot peptidyl-živice bolo pôsobené TFA-H2O (9:1) 60 minút a HPLC (podmienky B, ír 17,3 min.) hrubého produktu, získaného po odparení vykazovala čistotu >80%. ESMS, vypočítané pre CôóHusN^Oi?, 1348,9. Zistené: m/z 1350,1 [M+H].

Príklad 12: 5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Om(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr (Val-Z-Dhb-Phe-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-živica (pomocou inkorporácie dipeptidu)

Na peptidyl-živicu bolo kvôli odstráneniu skupiny Alloc pôsobené Pd(PPh₃)4 (15,1 mg, 0,013 mmol, 0,1 ekvivalentu) v prítomnosti PhSiH₃ (161 μΐ, 1,3 mmol, 10 ekvivalentov) v atmosfére Ar. Alloc-Phe-Z-Dhb-OH (217 mg, 0,65 mmol, 5 ekvivalentov) aHATU (249 mg, 0,65 mmol, 5 ekvivalentov) boli rozpustené v DMF (1,25 ml) a pridané k peptidyl-živici, potom bol pridaný DIEA (228 μΐ, 1,3 mmol, 10 ekvivalentov) a zmes bola miešaná cez noc. Po premývaniach bolo, pokiaľ ninhydrínový test bol negatívny, pripájanie opakované s rovnakým množstvom chemikálií 3 hodiny. Po premývaniach pomocou DMF a CH2CI2 bolo na alikvot peptidyl-živice pôsobené TFA-H₂O (9:1) 60 minút a po HPLC (podmienky B, T_R 18,3 min.) vykazoval hrubý produkt, získaný po odparení, čistotu >80%. MALDI-TOFMS, vypočítané pre C79H130N14O19, 1579,0. Zistené: m/z 1580,3 [M+H]', 1602,2 [M+Na]⁺,

1618,2 [M+K]⁺.

Príklad 13: 5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Om(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr (Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-allo-Ile-D-Val-OH

Skupina Alloc bola z peptidyl-živice (príklad 12) odstránená pomocou Pd(PPh₃)4 (15,1 mg, 0,013 mmol, 0,1 ekvivalentu) v prítomnosti PhSiH₃ (161 μΐ, 1,3 mmol, 10 ekvivalentov) v atmosfére Ar. Záverečná náplň, ako bolo vypočítané na základe aminokyselinovej analýzy, bola 0,16 mmol/g (79% výťažok). Chránený peptid bol zo živice odštiepený (235 mg, 37,5 mmol) pomocou zmesi TFA-CH₂C1₂ (1:99) (5 x 30 s). Spojené filtráty boli pri zníženom tlaku odparené dosucha a lyofilizované, čim bolo získaných 40,5 mg (24,5 mmol, 65%) zlúčeniny uvedenej v nadpise čistoty >80%, ako bolo zistené pomocou HPLC (podmienky B, ír 24,3 min.). MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C84H142NMO19,

1651,1. Zistené: m/z 1674,8 [M+Na]', 1690,8 [M+K]~.

Príklad 14: Kahalalid F (I)

Chránený peptid (príklad 13) (38,5 mg, 23 pmol) bol rozpustený v DMF (25 ml) a boli pridané pyBOP (36,4 mg, 70 μιηοΐ, 3 ekvivalenty) a DIEA (24 ml, 140 pmol, 6 ekvivalentov). Zmes sa nechala miešať 1 hodinu a potom bolo rozpúšťadlo odstránené vákuovým odparením. Chránený cyklický peptid bol rozpustený VTFA-H2O (19:1, 5 ml) a zmes sa nechala miešať 1 hodinu. Rozpúšťadlo bolo odstránené vákuovým odparením, potom bola pridaná H₂O (5 ml) a bolo to lyofilizované. Hrubý produkt bol čistený tak, ako bolo popísané v príklade 7 a bola získaná zlúčenina uvedená v nadpise (3,6 mg, 2,4 μτηοΐ, 10% výťažok), ktorý bol identický s produktom získaným v príklade 7.

-MeHex-D-V al-Thr-D-V al-V al-D-Pro-Om-D-allo-He-cy klo(D-allo-Thr-D-allo-IleD-Val-Phe-Z-Dhb-Val) (štruktúra určená pre kahalalid F Goetzom, G. a kol., Tetrahedron,

1999, zv. 55, 7739-7746).

> A JJ

Príklad 15: 5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Om-D-allo-IIe-cyklo(D-aIlo-Thr-D-allolle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) (pomocou dehydratácie na pevnej fáze)

Experimentálne postupy boli uskutočnené, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7 len s tou výnimkou, že v príklade 3 Fmoc-Val-OH bol inkorporovaný do D-Pro-peptidyl-živice a potom po odstránení skupiny Fmoc, bol inkorporovaný Fmoc-D-Val-OH. Záverečná náplň, ako bolo vypočítané na základe aminokyselinovej analýzy, bola 0,106 mmol/g (87% celkový výťažok), výťažok štiepenia bol 83% a bolo získaných 4,7 mg zlúčeniny uvedenej v nadpise, čo predstavuje 13% celkový výťažok v troch krokoch - cyklizačnom kroku, kroku odstraňovania chrániacich skupín a purifikačnom kroku. Tento produkt bol eluovaný v HPLC o 0,8 až 1,9 min. neskôr než vzorka pravého kahalalidu F [podmienky D (t_R 13,3 oproti 12,5 min.), E (t_R 18,8 oproti 17,4 min.), a F (t_R 14,0 oproti 12,1 min.)]. MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H124N14O16, 1477,9. Zistené: m z 1478,7 [M+H], 1500,7 [M+Na]”, 1516,6 [M+K]~.

’H-NMR (500 MHz, d⁶-DMSO) spektrum zlúčeniny (tabuľka Π a ĽH) bolo odlišné od spektra, získaného zo vzorky skutočného kahalalidu F. Najväčšia odchýlka bola tá, že získaná syntetická zlúčenina mala dve konformácie, čo bolo spôsobené cis-trans rovnováhou medzi LVal-D-Pro zbytkom, ktorá nebola pozorovaná ani v prírodnom produkte, ani vizomére získanom v príklade 7.

Tabuľka II (hlavný, trans izomér)

zbytok	N-H	Ha	Ηβ	iný
(Z)-Dhb	9,67 (s)	-	6,33 (q)	1,27 (d, J = 7,0 Hz, y-CH3)
D-al.lo-lle 1	8,80 (d)	4,31	1.73	1,32, 0,77 (y-CH2, y-CH3, δ- -CH3)
L-Phe	8,78 (d, J = 5,5 Hz)	4,43	2,93 (m)	7,20 (1 H Ar, m) 7,28 (4H Ar, m)
D-al.lo- -Thr	8,58 (d, J = 9,0 Hz)	4,53	4,95 (m)	1,07 (d, J = 6,5 Hz, y-CH3)
L-Val 3	7,97 (d, J = 8,5 Hz)	4,34	1,94	0,84 (2 y-CH3)

L-Om	7,77 (d, J = 8,5 Hz)	4,47	1,46 (2H)	1,66(y-CH2), 2,72 (bs, δ-CH2), 7,66 (ε-ΝΗ3*)
D-al. lo-lle 2	7,87 (d, H= 8,5 Hz))	4,37	1,68	0,75 (č-CH3 nebo d-CH3 a Y-CH3)
D-Val 5	7,90	4,22	1,95	0,85 (2 y-CH3)
L-Thr	7,90 (d)	4,24	4,02	4.98 (OH), 1,02 (d, J = 6,5 Hz, y-CH3)
D-Val2	7,63 (d, J = 8,5 Hz)	4,45	2,18	0,77 (y-CH3), 0,62 (y-CH3)
D-Val 4	7,56 (d, J = 9,0 Hz)	4,34	2,02	0,84 (y-CH3), 0,79 (y-CH3),
L-Val 1	6,75 (d)	3,86	1,39	0,62 (2 y-CH3)
D-Pro		4,30	2,03, 1,81, 1,73 (β-ΟΗ2, y-CH2), 3,73(1 H, m. č-CH2), 3,52 (1H, m, δ-ΟΗ2)
5-MeHex		2,08 (1H) 2,15 (1H)	1,48 (b-CH2, δ-CH), 1,11 (y-CH2), 0,82 (2 ε- -CH3) i 1 1

Tabuľka ΠΙ (vedľajší, cis izomér)

i zbvtok 1	N-H	Ha	Ηβ	iný
(Z)-Dhb	9,63 (s)	-	6,33 (q)	1,278 (d, J =6,5 Hz, y-CH3)
D-al.lo-lle 1	8,76 (d)	4,30	1,71	1,33, 0,76 (y-CH2, y-CH3, δ- -CH3)
L-Phe	8,78 (d, J = 5,5 Hz)	4,43	2,93 (m)	7,20 (1 H Ar, m) 7,28 (4H Ar, m)
D-al.lo- -Thr	8,58 (d, J = 9,0 Hz)	4,53	4,95 (m)	1,00(y-CH3)
L-Val 3	8,06 (d, J = 8,5 Hz)	4,11	1,81	0,71 (y-CH3), 0,60 (y-CH3)
L-Orn	8,37 (d, J = 9,0 Hz)	4,62	1,52 (2H)	1,64 (y-CH2), 2,78 (bs, δ- -CH2), .7,66 (ε-ΝΗ3*)
D-al.lo-lle	8,09 (d, H= 9,0 Hz))	4,42	1,64	0,77 (δ-ΟΗ3 nebo d-CH3 a

2				Y-CH3)
D-Val 5	7,90	4,22	1,95	0,85 (2 y-CH3)
L-Thr	7.88 (d)	4,23	3,99	4.93 (OH), 1,02 (Y-CH3)
D-Val2	7,63 (d, J = 8,5 Hz)	4,45	2,18	0,77 (y-CH3). 0,62 (y-CH3)
D-Val 4	7,49 (d, J = 9,0 Hz)	4,34	1,94	0,79 (y-CH3), 0,73 (y-CH3),
L-Val 1	6,72 (d)	3,84	1,38	0,62 (2 y-CH3)
D-Pro		4,93	2,06, 1,89, 1,75 (β-ΟΗ2, y-CH2), 3,3 (m, δ- -CH2)
5-MeHex		2,08 (1H) 2.15 (1H)	1,48 (P-CH2, δ-CH), 1,11 (y-CH2), 0,82 (2 ε- -CH3)

Príklad 15bis: 5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-Dallo-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácia počas cyklizačného kroku) v príklade 15. Produkt bol charakterizovaný pomocou analytickej HPLC (ír 17,6 min., podmienky B) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H124N14O16, 1477,9. Zistené: m'z 1479,3 [M+H]', 1501,2 [M+Na]*, 1517,2 [M+K]'.

Príklad 16. 5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) (pomocou inkorporácie dipeptidu)

Experimentálne postupy boli uskutočnené ako bolo popísané v príkladoch 8 až 14, len s tou výnimkou, že v príklade 14, Fmoc-Val-OH bol inkorporovaný do D-Pro-peptidyl-živice a potom po odstránení skupiny Fmoc bol inkorporovaný Fmoc-D-Val-OH. Záverečná náplň, ako bolo vypočítané na základe aminokyselinovej analýzy, bola 0,16 mmol/g (79% celkový výťažok), výťažok štiepenia bol 78% a bolo získaných 3,4 mg zlúčeniny uvedenej v nadpise, čo predstavuje 10% celkový výťažok v troch krokoch - cyklizačnom kroku, kroku odstraňovania chrániacich skupín a purifikačnom kroku. Vyčistený produkt bol identický s produktom získaným v príklade 15.

Hamann a kol, Kahalalid B [5-MeHex-Tyr-cyklo(D-Ser-Phe-D-Leu-Pro-Thr-Gly)]

Príklad 17: H-Thr(ťBu)-O-TrtCl-živica

Cl-TrtCl-živica (0,5 g, 1,35 mmol/g) bola umiestnená do 10 ml polypropylénových injekčných striekačiek, ukončených poréznym polypropylénovým filtračným diskom. Živica bola potom premytá CH2CI2 (5 x 0,5 min.), boli pridané roztoky Fmoc-Thr(tBu)-OH (54 mg, 0,135 mmol, 0,2 ekvivalentu) aDDEA (235 ml, 1,35 mmol, 2 ekvivalenty) VCH2CI2 (1,25 ml) a zmes bola miešaná 1 hodinu. Reakcia bola ukončená pridaním MeOH (400 ml) po pätnásťminútovom miešaní. Fmoc-Thr(tBl:t)-O-TrtCl-živica bola podrobená nasledujúcim premývaniam a opracovávaniam: CH2CI2 (3 x 0,5 min.), DMF (5 x 0,5 min.), piperidinCH2CI2-DMF (1:9,5:9,5, 1 x 10 min.), piperidín-DMF (1:4, 1x15 min.), DMF ( 5 x 0,5 min.), izopropanol (2 x 1 min.), DMF (5 x 0,5 min.), MeOH (2 x 1 min.) a vákuovo sušená. Náplň, ako bolo vypočítané na základe aminokyselinovej analýzy, bola 0,15 mmol/g.

Príklad 18: 5-MeHex-Tyr-D-Ser(Gly-H)-Phe-D-Leu-Pro-Thr-OH

Fmoc-Pro-OH (178 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov), Fmoc-D-Leu-OH (187 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov), Fmoc-Phe-OH (204 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov), Fmoc-D-SerOH (voľná hydroxylová skupina) (173 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov), Fmoc-Tyr(tBu)-OH (243 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov) a 5-MeHex-OH (69 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov) boli postupne pridané k vyššie získanému H-Thr(tBu)-O-TrtCl-živici pomocou DIPCDI (82 μΐ, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov) aHOBt (81 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov) v DMF (1,25 ml). Vo všetkých prípadoch, okrem D-Ser, bol po 90 minútach väzobnej reakcie ninhydrínový test negatívny. Fmoc-D-Ser-OH (173 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov) bol znovu pripájaný sHATU (201 mg, 0,53 mmol, 7 ekvivalentov) v prítomnosti DIEA (184 μΐ, 1,06 mmol, 14 ekvivalentov) v DMF 90 minút. Odstránenie skupiny Fmoc a premývanie boli urobené tak, ako bolo popísané vo všeobecných postupoch. Boc-Gly-OH (119 mg, 0,68 mmol, 9 ekvivalentov) bol pripájaný pomocou DIPCDI (105 μΐ, 0,68 mmol, 9 ekvivalentov) v prítomnosti DMAP (8,3 mg, 68 pmol, 0,9 ekvivalentu) 2,5 hodiny. Pripájanie sa opakovalo s čerstvými reagentami 1,5 hodiny. Výsledná náplň bola 0,10 mmol/g, čo predstavuje 77% výťažok syntézy. Nechránený peptid bol zo živice odštiepený (525 mg, 54 pmol) pôsobením TFA-H2O (92:8) 2 hodiny. Spojené filtráty boli vákuovo odparené dosucha, bola pridaná H2O (5 ml), roztok bol lyofilizovaný a bolo získaných 43,0 mg (48 pmol, 89% výťažok) zlúčeniny uvedenej v nadpise, ktorá vykazovala čistotu >85% a bola kontrolovaná pomocou HPLC (podmienky A, tR 18,5 min.). ESMS, vypočítané pre C45H65N7O12, 895,5. Zistené: m/z 896,6 [M+H].

Príklad 19: KahalalidB [5-MeHex-Tyr-cyklo(D-Ser-Phe-D-Leu-Pro-Thr-Gly)]

Nechránený peptid (príklad 18) (40,5 mg, 45 pmol) bol rozpustený v DMF (48 ml) a boli pridané PyBOP (70 mg, 0,135 mmol, 3 ekvivalenty) aDIEA (47 ml, 0,271 mmol, 6 ekvivalentov). Zmes sa nechala miešať 2 hodiny a potom bolo rozpúšťadlo vákuovo odparené, bola pridaná HjO (5 ml) a roztok bol zlyofilizovaný. Hrubý produkt bol čistený pomocou chromatografíe pri strednom tlaku (Vydac Ci§ 15-20 pm, 30 nm, 240 x 24 mm), lineárny gradient od 20% do 60% acetonitrilu (+0,05% TFA) vo vode (+ 0,05% TFA) 5 hodín (každého rozpúšťadla 300 ml), 120 ml/h, detekcia pri 220 nm a bola tak získaná zlúčenina uvedená v nadpise (8,7 mg, 9,9 pmol, 22% výťažok). Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky A, ír 21,6 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C45H63N7O11, 877,5. Zistené: m/z 878,'7 [M+H]', 900,6 [M+Na]⁺, 916,5 [M+K]. AAA: Gly 1,02 (1), Thr 0,95 (1), Phe 0,99 (1), Ser 1,00 (1), Pro 1,20 (1), Leu 1,00 (1), Tyr 0,87 (1).

Príklad 20: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-Etg-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 4 a 6 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 4 bol Fmoc-Thr-OH vymenený za Fmoc-Etg-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír

16,8 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H126N14O16, 1479,0. Zistené: m/z 1480,2 [M+H], 1502,2 [M+Naf, 1518,0 [M+K]⁺.

Príklad 20b: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-D-Etg-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 4 a 6 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 4 bol Fmoc-Thr-OH vymenený za Fmoc-Etg-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, t_R

17,0 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C₇5Hi26N_I4Oi6, 1479,0. Zistené: m/z 1501,0 [M+Na]⁺, 1517,9 [M+Kf.

Príklad 20c: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-aHo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-D-Thr-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 4 a 6 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 4 bol Fmoc-Thr(tBu)OH vymenený za Fmoc-D-Thr(tBu)-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, t_R 19,9 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H126N14O17, 1494,9. Zistené: m/z 1517,4 [M+Na]^-, 1533,4 [M+K]⁺.

Príklad 20d: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-D-allo-Thr-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 4 a 6 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 4 bol Fmoc-Thr(tBu)OH vymenený za Fmoc-D-allo-Thr-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, t_R 18,0 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H126N14O17, 1494,9. Zistené: m/z 1496,6 [M+H]^-, 1518,6 [M+Na]⁺, 1534,6 [M+K]^-.

Príklad 20e: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-VaI-D-Pro-Om-D-allo-ne-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-D-Phe-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 4 bol Fmoc-Thr-OH vymenený za Fmoc-D/L-(b-OH)Phe-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, t_R 22,2 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre CsoH^ôNhOiô, 1538,95. Zistené: m/z 1540,3 [M+H]\ 1562,4 [M+Na]⁺, 1578,4 [M+K]^-.

Príklad 21: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-Dpa-D-allo-IleD-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tými výnimkami, že v príklade 2 bol Fmoc-D-allo-Thr-OH vymenený za Fmoc-D-Dpa(Alloc)-OH a že pred inkorporáciou Alloc-Val-OH, ktorý bol inkorporovaný ako posledný z chránených aminokyselín, bola Alloc skupina zDpa odstránená, ako je ukázané vyššie. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC a ESMS, vypočítané pre C74H123N15O15, 1461,9. Zistené: m/z 1463,3 [M+H]*.

Príklad 22: But-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo-(D-allo-Thr-D-allo-Ile-DVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za But-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, tR 14,7 min.) aMALDI-TOF-MS, vypočítané pre C72H118N14O16, 1435,9. Zistené: m/z 1459,6 [M+Na]\ 1475,6 [M+K]”.

Príklad 22bis: But-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-IleVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácia počas cyklizačného kroku) v príklade 22. Produkt boí charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, tR 16,0 min.) aMALDI-TOF-MS, vypočítané pre C72H118N14O16, 1435,9. Zistené: m/z 1459,5 [M+Na]⁺, 1475,5 [M+K]⁺.

Príklad 23: 5-MeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za 3-MeBut-OH. Produkt bol· charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 15,9 min.) aMALDI-TOF-MS, vypočítané pre C73H120N14O16, 1449,9. Zistené: m/z 1473,2 [M+Na]*, 1489,9 [M+K]”.

Príklad 23bis: 5-MeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-Dallo-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácia počas cyklizačného kroku) v príklade 23. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, tR 17,0 min.) aESMS, vypočítané pre C73H120N14O16, 1449,9 Zistené: m/z

1473,3 [M+Naf, 1489,4 [M+K]*.

Príklad 24: 3,3-DiMeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-Dallo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za

3,3-DiMeBut-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, tR 16,3 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C74H122N14O16, 1463,9. Zistené: m/z 1487,4 [M+Na]⁺, 1503,6 [M+K]⁺.

Príklad 24bis: 3,3-DiMeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-ThrD-allo-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácia počas cyklizačného kroku) v príklade 24. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, tR 17,6 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C74H122N14O16, 1463,9. Zistené: m/z 1487,3 [M+Na]⁺, 1503,3 [M+K]⁺.

Príklad 25: 4-MePen-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za

4-MePen-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 16,5 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C74H122N14O16, 1463,9. Zistené: m/z 1487,7 [M+Na]⁺, 1503,6 [M+Kf.

Príklad 25bis: 4-MePen-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ue-cyklo(D-allo-Thr-Dallo-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácia počas cyklizačného kroku) v príklade 25. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 17,8 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C74H122N14O16, 1463,9. Zistené: m/z 1487,8 [M+Na]⁺, 1503,6 [M+K]⁺.

Príklad 26: Hep-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-DVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za Hep-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, tR 17,5 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H124N14O16, 1477,9. Zistené: m z 1501,4 [M+Na]*,

1517,5 [M+K]⁺.

Príklad 26bis: Hep-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-IleVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácia počas cyklizačného kroku) v príklade 26. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 18,9 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H124N14O16, 1477,9. Zistené: m/z 1501,6 [M+Na]⁺, 1517,7 [M+K]⁺, 1463,9. Zistené: m/z 1487,8 [M+Na]’, 1503,6 [M+K]⁺.

Príklad 27: Pal-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-DVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex zamenený za Pal-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky G, ír 22,1 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C84H142N14O16, 1603,1. Zistené: m/z 1626,9 [M+Na]’, 1642,9 [M+K]⁺.

Príklad 27bis: Pal-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-IleVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácia počas cyklizačného kroku) v príklade 27. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky G, ír 18,9 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C75H124N14O16, 1603,1. Zistené: m/z 1626,8 [M+Na]⁺, 1642,8 [M+K]⁺.

Príklad 27a: 4-DiMeABut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-Dallo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex zamenený za 4-DiMeBut-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 12,0 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C74H123N15O16, 1477,9. Zistené: m/z 1478,6 [M+H]',

1500.6 [M+Na]', 1516,6 [M+K]'.

Príklad 27b: 2-Hedo-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za

2-Hedo-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 15,8 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C74H118N14O16, 1458,9. Zistené: m/z 1460,0 [M+H]\ 1482,0 [M+Na]', 1497,96 [M+K]'.

Príklad 27c: 4-AcBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za 4-AcBut-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, tR 18,2 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C74H120N14O18, 1492,9. Zistené: m/z 1493,7 [M+H]',

1515,8 [M+Na]', 1531,7 [M+K]'.

Príklad 27d: 4-HOBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za 4-HOBut-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 16,6 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C72H118N14O17, 1450,9. Zistené: m/z 1451,6 [M+H]',

1473.6 [M+Na]', 1489,6 [M+K]'.

Príklad 27e: Ac-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-DVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za HOAc. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, tR 17,0 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C70H114N14O16, 1406,9. Zistené: m/z 1407,8 [M+H]⁺,

1429,8 [M+Na]⁺.

Príklad 27f: TFA-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-ällo-IleD-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (trifluoroacetylácie počas cyklizačného kroku) v príklade 27e. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 14,7 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C70H111F3N14O16, 1460,8. Zistené: m/z 1462,0 [M+H]⁺, 1484,1 [M+Na]⁺, 1500,0 [M+K]⁺.

Príklad 27g: AcButBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-Dallo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za AcButBut-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 14,1 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C78H126N14O20, 1578,9. Zistené: m/z 1581,2 [M+H]’,

1602,2 [M+Na]⁺, 1618,2 [M+K]⁺.

Príklad 27h: IBut-D-allo-Ile-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-ThrD-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za Fmoc-D-allo-Ile-OH, odstránenie skupiny Fmoc a acylácia pomocou Ibut-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 15,3 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C78H129N15O17, 1548,0. Zistené: m/z 1548,8 [M+H]’, 1570,8 [M+Na]’, 1586,8 [M+K]’.

Príklad 27i: Lit-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-DVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za Lit-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky H, tR 13,1 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C92H150N14O17, 1723,1. Zistené: m/z 1724,6 [M+H]*,

1746,6 [M+Na]*, 1761,5 [M+K]*.

Príklad 27j: TFA-Lit-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-alloIle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (trifluoroacetylácie počas cyklizačného kroku) v príklade 27i. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky H, ír 17,1 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C94H159F3N14O18, 1819,1. Zistené: m/z 1820,6 [M+H]*, 1842,6 [M+Na]*, 1858,6 [M+K]^-.

Príklad 27k: Tlco-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-IleD-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 bol 5-MeHex vymenený za Tlco-OH. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky H, ír 16,8 min.) aESMS, vypočítané pre C92H158N14O16, 1715,2. Zistené: m/z 858,2 [M+HJ72, 1171,8 [M+H]“.

Príklad 28: H-D- Val-Thr- Val-D- Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-DVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Vychádzalo sa z 200 mg živice a experimentálne postupy boli vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, len s tou výnimkou, že v príklade 3 nebol inkorporovaný 5MeHex a Fmoc-D-Val bol vymenený za Fmoc-D-Val. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 11,6 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C68H112N14O15, 1364,8. Zistené: m/z 1388,3 [M+Na]*, 1404,3 [M+K]*.

Príklad 28bis: H-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-IleVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácie počas cyklizačného kroku) v príklade 28. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, t_R 12,9 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre CeeHiuNuOu, 1364,8. Zistené: m/z 1388,4 [M+Naf, 1404,4 [M+K]⁺.

Príklad 29: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-DVal-Phe-Z-Dhb-Val)

Experimentálne postupy boli v podstate vyhotovené tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, ale podľa schémy 2.

5Mhex-(Aaa) _n-Dalle--DaThr-Dalle-DVal

O—Vat-ZDhb-Ph®

Vychádzalo sa z 200 mg živice a Fmoc-Orn(Boc)-OH nebol inkorporovaný. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky A, ír 23,9 min.) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C70H114N12O15, 1362,9. Zistené: m/z 1386,4 [M+Na]⁺, 1402,4 [M+K]⁺.

Príklad 29bis: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-VaI-D-Pro-D-allo-IIe-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-IleD-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Bol získaný ako vedľajší produkt v priebehu prípravy (racemizácie počas cyklizačného kroku) v príklade 29. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (podmienky B, ír 12,9 min.) a MALDI-TOF-MS.

Príklad 30: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-ValPhe-Z-Dhb-Val)

Experimentálne postupy boli v podstate vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, ale podľa schémy 2. Vychádzalo sa z 200 mg živice a Fmoc-Om(Boc)-OH a Fmoc-DPro-OH neboli inkorporované. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (ír 20,3 min., podmienky B) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C65H107N11O14, 1265,8. Zistené: m/z

1288,5 [M+Naf, 1304,5 [M+K].

Príklad 31: 5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val)

Experimentálne postupy boli v podstate vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, ale podľa schémy 2. Vychádzalo sa z 200 mg živice a Fmoc-Om(Boc)-OH, Fmoc-DPro-OH a Fmoc-D-Val-OH neboli inkorporované. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (ír 20,0 min., podmienky B) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C60H98N10O13,

1166,7. Zistené: m/z 1190,9 [M+Naf, 1206,9 [M+K]⁺.

Príklad 32: 5-MeHex-D-Val-Thr-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-DhbVal)

Experimentálne postupy boli v podstate vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, ale podľa schémy 2. Vychádzalo sa z 200 mg živice a Fmoc-Om(Boc)-OH, Fmoc-DPro-OH, Fmoc-D-Val-OH a Fmoc-Val-OH neboli inkorporované. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (ír 24,6 min., podmienky A) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C55H89N9O12, 1067,7. Zistené: m/z 1068,7 [M+H]\1090,6 [M+Na]⁺, 1106,5 [M+Kf.

Príklad 33: 5-MeHex-D-Val-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Experimentálne postupy boli v podstate vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, ale podľa schémy 2. Vychádzalo sa z 200 mg živice a Fmoc-Om(Boc)-OH, Fmoc-DPro-OH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-Val-OH a Fmoc-Thr(tBu)-OH neboli inkorporované. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (tR 19,8 min., podmienky B) aMALDI-TOFMS, vypočítané pre CjiH^NgOio, 966,6. Zistené: m/z 990,7 [M+Na]\ 1007,2 [M+K]⁺

Príklad 34: 5-MeHex-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Experimentálne postupy boli v podstate vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, ale podľa schémy 2. Vychádzalo sa z 200 mg živice a Fmoc-Om(Boc)-OH, Fmoc-DPro-OH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH a Fmoc-D-Val-OH neboli inkorporované. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (ír 22,0 min., podmienky B) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C46H73N7O9, 966,6. Zistené: m/z 890,6 [M+Na]⁺, 906,6 [M+K]⁺.

Príklad 35: 5-MeHex-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Experimentálne postupy boli v podstate vykonané tak, ako bolo popísané v príkladoch 1 až 7, ale podľa schémy 2. Vychádzalo sa z 200 mg živice aFmoc-D-allo-Ile-OH, FmocOm(Boc)-OH, Fmoc-D-Pro-OH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH a Fmoc-D-Val-OH neboli inkorporované. Produkt bol charakterizovaný pomocou HPLC (ír

17,1 min., podmienky B) a MALDI-TOF-MS, vypočítané pre C^HóíNôOs, 754,5. Zistené: m/z 755,7 [M+Hf, 777,7 [M+Naf, 793,7 [M+K]'

Biologická aktivita

Biologická aktivita zlúčenín predloženého vynálezu je uvedená vo výsledkoch v nasledujúcich tabuľkách, ktoré boli získané metodológiou podľa Berjeron a kol., Biochem. and Bioph. Res. Comm., 1984, 121, 3, 848-854. Bunkovými líniami sú P388, myšací lymfóm; A549, ľudský pľúcny karcinóm; HT-29, ľudský karcinóm hrubého čreva; MEL-28, ľudský melanóm; DU-145, ľudský karcinóm prostaty.

Tabuľka zlúčenín podobných kahalalidu F

zlúčenina	: cyklus 1	reťazec**	molekulová hmotnosť
27j	i cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- 1 1 -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: TFA-Lit-	1820
i 27i 1	j cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- | -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: litocholoyl (Lit)	1724
27	; cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- i ! -Val-Phe-Z-Dhb-Val) 1	koncová skupina: palmitoyl Palm	1604
. 27bis	• cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle- ; -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: palmitoyl Palm	1604 i
27g	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) •	koncová skupina: 4-(4-acetoxybutanoyloxy)-butyryl (AcButBut-)	1579
27h	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	IBut-D-allo-lle-D-Val-L-Thr- -L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D- -allo-lle-	1548
20e	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-D-Phe-Val)-D-Phe: a, b-didehydrofenylalanin	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val- -D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo- -lle-	1539
20c	cykló(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Thr-Val)	5-MeHex-D-Val-Ľ-Thr-Ľ-Val- -D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo- -lle-	1495
27c	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 4- -acetoxibutyryl (4-AcBut)	1493

20	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-L-Etg-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val- -D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo- -lle-	1479
20b	cyklo(D-allo-Thr-D-aľlo-lle-D- -Val-Phe-D-Etg-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val- -D-Val-D-Pro-L-Om-D-allo- -lle-	1479
27a	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: N,N-dimetyM-aminobutyryl (4-DiMeABut)	1478
(.ako Scheuer) 15	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-D-Val-L-Val-D-Pro-L-Om-D-allo-lle-	1477
15 bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-D-Val-L-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1477 i
26	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: Heptanoyl (Hep)	1477
26 bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: Heptanoyl (Hep)	1477
(Rinehart) 7	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val- -D-Val-D-Pro-L-Om-D-allo- -lle-	1477
7 bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val- -D-Val-D-Pro-L-Om-D-allo- -lle-	1477
24	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 3,3-dimetylbutyryl (3,3-DiMeBut)	1463
24 bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 3,3- -dimetylbutyryl (3,3-	1463

		-DiMeBut)
25	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 3-metylpentanoyl (4-MePen)	1463 i I
j 25 bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 3- -metylpentanoyl (4-MePen)	1463
27f	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: trifluoracetyl (TFA)	1461
27b	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 2,4- -hexadienoyl (Hedo)	1459
27d	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 4- -hydroxybutyryl	1451
•23 í 1	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 3- -metylbutyryl (3-MetBut)	1451
| 23b i 1 1 1	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: 3- -metylbutyryl (3-MetBut)	1451 t
I 22 i 1	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: butyryl (But)	1435
i 22b i 1	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: butyryl	1435
27c 1 1	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: acetyl	1407
28 i	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: nie mastná kyselina	1365
28 bis 1	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	koncová skupina: nie mastná kyselina	1365
29	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-Ľ-Val- -D-Val-D-Pro-D-allo-lle-	1363
29 bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val- -D-Val-D-Pro-D-allo-lle-	1363

31	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val- -D-allo-lle-	1167
32 I	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-D-allo- -lle-	1068
19	L-Phe-D-Leu-L-Pro-_-Thr-Gly- -D-Ser	5-MeHex-L-Tyr-	878
34	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D- -Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-allo-lleL-Tyr-	868
35	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-	754

Zlúčeniny, u ktorých je reťazec označený “koncová skupina’, majú rovnaký reťazec ako v zlúčenine 7, ale s uvedenou substitúciou za 5-MeHex.

Tabuľka cytotoxicity zlúčenín podobných kahalalidu F, hodnoty IC50 (pmol) pre deriváty

zlúčenina	A549M	DU145M	HT29M	MEL28M	p388M
27j	5.49E-05	5.49E-05	5.49E-05	5.49E-05	2.75E-03
27i	5,80E-04	5,80E-04	2.90E-05	1.45E-04	1.45E-04
27	1.56E-04	3.12E-O5	6.23E-05	6.23ΕΌ5	3.12E-05
27bis	>3,12E-03	1.56E-03	6.23E-04	6.23E-04	>3,12E-03
27g	>6,33E-04	>6,33E-O4	1.58E-03	3.17E-03	>3,17E-03
27h	NA	NA	NA	NA	NA
20e	3.25E-03	6.50E-04	NA	NA	NA
20c	NA	NA	NA	NA	NA
27c	NA	NA	6.70E-04	3.35E-03	NA
20	>3,38E-03	>3,38E-03	>3,38E-03	>3,38E-03	>3,38E-O3
20b	>3,38E-03	3.38E-03	3.38E-03	>3,38E-03	>3,38E-03

27a	NA	NA	NA	NA	NA
(ako Scheuer) 15	>3,29E-03	3.29E-03	3.29E-03	>3,29E-03	>3,29E-03
15 bis	>3,39E-O3	>3,39E-03	>3,39E-03	>3,39E-03	>3,39E-03
26	>3,39E-04	>3,39E-05	6.77E-04	1.69E-03	3.39E-03
26 bis	>3,39E-03	>3,39E-03	>3,39E-04	1.69E-03	>3,39E-03
(Rinehart) 7	>3,39E-O4	1.69E-04	>3,39E-05	>3,39E-04	>3,39E-03
7 bis	>3,39E-03	>3,39E-03	>3,39E-03	>3,39E-03	>3,39E-03
24	1.71E-03	3.42E-04	3.42E-04	3.42E-03	>3,42E-03
24 bis	>3,42E-03	>3,42E-03	3.42E-03	>3,42E-03	>3,42E-O3
25 I	3.42E-03	3.42E-03	3.42E-03	>3,42E-03	>3,42E-03
25 bis	>3,42E-03	>3,42E-03	>3,42E-03	>3,42E-03	>3,42E-03
| 27f I	NA	3.42E-03	>3,42E-03	3.42E-03	>3,42E-03
27b	3.43E-03	6.85E-04	3.43E-03	NA	NA
27d	NA	NA	NA	NA	NA
23	>3,45E-03	>3,45E-03	>3,45E-03	>3,45E-03	>3,45E-03
23b	>3,45E-03	>3,45E-03	>3,45E-03	>3,45E-03	>3,45E-03
22	>3,48E-03	1.74E-03	NA	NA	NA
22b I	>3,48E-03	>3,48E-03	1.74E-03	>3,48E-03	>3,48E-03
! 27c !	NA	>3,55E-03	>3,55E-03	>3,55E-03	>3,55E-03
28	>3,66E-03	>3,66E-03	>3,66E-03	>3,66E-03	>3,66E-03
28 bis	>3,66E-03	>3,66E-03	NA	NA	NA
29	>3,67E-03	>3,67E-03	>3,67E-03	>3,67E-03	>3,67E-03
29 bis	>3,67E-03	>3,67E-03	>3,67E-03	>3,67E-03	>3,67E-03
31	>4,28E-04	>4,28E-05	>4,28E-03	>4,28E-03	>4,28E-03
32	NA	NA	4.68E-05	4.68E-05	>4,68E-03

19	>5,69E-03	>5,69E-O3	NA	NA	NA
34	NA	NA	>5,76E-03	>5,76E-03	>5,76E-03
35	>5,76E-O3	>5,76E-03	>5,76E-03	>5,76E-03	>5,76E-03

Citácie

Hamann, M.T., Scheuer, P.J. J. Am. Chem. Soc., 1993. „Kahalalide F: Abioactive depsipeptide from the sacoglossan mollusk Elysia rufescens and the green alga Bryopsis sp“, zv. 115, str. 5825-5826.

Hamann, M.T. a kol. J. Org. Chem., 1996. Kahalalides: Bioactive peptides from marine mollusk Elysia rufescens and its algal diét Bryopsis sp“, zv. 61, str. 6594-6660.

García-Rocha, M. a kol. Cancer Lett., 1996. „The antitumoral compound kahalalide F acts on celí lysosomes“, zv. 99, str. 43-50.

Hamann, M.T. a kol. J. Org. Chem., 1998. Kahalalides: Bioactive peptides from marine mollusk Elysia rufescens and its algal diét Bryopsis sp“, zv. 63, str. 485 (oprava J. Org. Chem., 1996, zv. 61, str. 6594-6660.

Lloyd-Williams, P. a kol. Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins. CRC Press, Boca Raton (FL), 1997.

Goetz, G. a kol. J. Nat. Prod., 1997. „Two acyclic kahalalides from the sacoglossan mollusk

Elysia rufescens“, zn. 60, str. 562-567.

Goetz, G. a kol. Tetrahedron, 1990. „The absolute stereochemistry of kahalalide F“, zv. 55, str. 7739-7746.

Kan, Y. a kol. J. Nat. Prod., 1999, zv. 62, str. 1169-1172.

Horgen, F.D. a kol. J. Nat. Prod., 2000, zv. 63, str. 152-154.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kahalalidová zlúčenina napodobňujúca prírodný kahalalid, ktorá je biologicky aktívnou zlúčeninou so štruktúrou založenou na prírodnom základe, ale líšiacou sa v jednom alebo vo viacerých z nasledujúcich znakov:

   aspoň jedna aminokyselina, ktorá nie je rovnaká ako aminokyselina v pôvodnej zlúčenine;

   aspoň jedna metylénová skupina navyše vedľa metylénových skupín v acylovej skupine postranného reťazca pôvodnej zlúčeniny;

   aspoň jedna metylénová skupina vynechaná v acylovej skupine postranného reťazca pôvodnej zlúčeniny;

   aspoň jeden substituent pridaný do acylovej skupiny postranného reťazca pôvodnej zlúčeniny;

   aspoň jeden substituent vynechaný v acylovej skupine postranného reťazca pôvodnej zlúčeniny.
2. 2. Zlúčenina podľa nároku 1,vyznačuj úca sa t ý m, že jej štruktúra je značne podobná kahalalidu, ktorý je vybraný zo skupiny zahrňujúcej kahalalid A, kahalalid B, kahalalid C, kahalalid D, kahalalid E, kahalalid F, kahalalid G, kahalalid H a kahalalid J.

   Zlúčenina podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že napodobňuje kahalalid . F, ale líši sa od neho v postrannom reťazci.
3. 4. Zlúčenina podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jeden ďalší substituent v postrannom reťazci.
4. 5. Zlúčenina podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jeden halogénový substituent.
5. 6. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2až 5, vyznačujúca sa tým, že napodobňuje kahalalid F, ale líši sa od neho aminokyselinou v postrannom reťazci.
6. 7. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2až 5, vyznačujúca sa tým, že napodobňuje kahalalid F, ale líši sa od neho aminokyselinou v kruhu.
7. 8. Spôsob prípravy zlúčeniny napodobňujúcej kahalalid F, vyznačujúci sa tým, že uzavieranie kruhu prebieha podľa nasledujúcej schémy.· kde R'je skupina R-CO-N- alebo jej prekurzor, kde jedna alebo viacej aminokyselín môže mať chrániace skupiny a kde -COOH z Aa³ a/alebo -NH_; z Aa⁴ môže byť voliteľne chránené, aktivované alebo derivované.
8. 9. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu napodobňujúcu kahalalid, spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom.

   Použitie kahalalidovej zlúčeniny podľa nárokov 1 až 7 na prípravu liečiva na prevenciu alebo liečenie rakoviny.