SI21137A - Derivati azafenilalanina - Google Patents

Abstract

Opisani so novi derivati azafenilalanina s formulo I ter njihove farmacevtsko sprejemljive soli, pri čemer imajo substituente v opisu navedene pomene. Spojine se uporabljajo kot antikoagulanti.ŕ

Description

Področje tehnike, na katerega se nanaša izum

Izum spada v področje farmacevtske industrije in se nanaša na nove derivate azafenilalanina, njihovo uporabo, postopke za njihovo pripravo in farmacevtske izdelke, ki jih vsebujejo.

Novi derivati azafenilalanina se uporabljajo kot antikoagulanti.

Tehnični problem

Obstaja stalna potreba po novih zdravilih z antikoagulantnim delovanjem, zlasti takšnih, ki bi bila peroralno aktivna, čim bolj selektivna in s čim manj stranskimi učinki.

Stanje tehnike

Trombin je kot serinska proteaza eden od ključnih encimov v procesih strjevanja krvi in razvoju tromboze (Edit, J. F.; Allison, P.; Noble, S.; Ashton, J.; Golino, P.; McNard, J.; Buja, L. M.; VVillerson, J. T., J. Ciin. Invest. 1989, 84, 18.).

Znana je kristalna struktura serinskih proteaz trombina in serina (Bode, W.; Turk, D.; Karshikov, A. J., Protein Sci. 1992, 1, 426.

Sedaj uporabljani antikoagulanti imajo veliko stranskih učinkov in omejeno učinkovitost.

Nizkomolekularni trombinski inhibitorji naj bi imeli selektivno učinkovitost in možnost peroralne aplikacije. Znani so reverzibilni in ireverzibilni antagonisti trombina (Kimball, S. D., Curr. Pharm. Design 1995, 1, 441, Das, J.; Kimball, S. D., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 999, Kimball, S. D., Blood Coagulation and Fibrinolysis 1995, 6, 511, Breznik, M.; Pečar, S., Farm. Vestn. 1997, 48, 545, Leung, D.; Abbenante,

G.; Fairlie, D.P., J. Med. Chem. 2000, 43, 305).

Večina reverzibilni antagonistov trombina izhaja iz peptidomimetično modificirane strukture D-Phe-Pro-Arg. Cilj sprememb je zagotoviti kemično stabilnost, selektivnost in učinkovitost.

Kot zdravilo je v uporabi učinkovina argatroban opisana v EP 8746. Napsagatran je selektivni reverzibilni inhibitor opisan v EP 559046. Meta substituirani fenilalaninski derivati z amidinsko ali amidoksimsko strukturo so selektivni inhibitorji trombina poznani iz WO 92/08709. Amidinofenilalaninski derivati in aminopiridilalaninski derivati, ki so opisani v WO 95/13274, imajo selektivno antitrombotično delovanje.

Azapeptidi so peptidomimetiki, pri katerih je Ca atom zamenjan z dušikom. Prednost takšne izoelektronske substitucije je ohranitev kemijske integritete spremenjene aminokisline in le majhna konformacijska sprememba, kar je pomembno za proces molekularnega prepoznavanja in stabilizacijo kompleksa ligand-receptor in metabolična stabilizacija (Gante, J., Synthesis 1989, 405, Gante, J., Angew. Chem. 1994, 106, 1780).

Skupina trombinskih inhibitorjev z azafenilalaninskim fragmentom, ki je bila opisana v SI-20025, je imela submikromolarne inhibitorne konstante v in vitro testih.

Znana je priprava N-naftilsulfonil aminokislin (Pendleton.R.G., et al. J. Pharm. Exp. Ther. 1979, 208, 24) in derivatov 1,2,3,4-tetrahidroizokinolinskih derivatov kot gradnikov pri sintezi novih inhibitorjev trombina (Pendelton, R. G.; Gessner, G.; Weiner, G.; et al., J. Pharm. Exp. Ther. 1978, 208, 24).

Opis rešitve tehničnega problema z izvedbenimi primeri

Izum se nanaša na nove derivate azafenilalanina in njihove analoge s splošno formulo (I)

R¹

v kateri pomenijo

NH₃ ⁺ Cl'

R¹ ostanek s formulo kjer je R⁴ = H, alkil (Ci-C₃), OH, O-alkil (Ci-C₃), NH₂;

R² ostanek s formulo

kjer je R⁵ = H, alkil (C1-C3), COOR¹⁰,

R⁶ = H, alkil (0τ-0₃), COOR¹⁰,

R⁷ = H, alkil (C1-C3), COOR¹⁰,

R¹⁰ = H, alkil (C_rC₃),

R⁸ = H, alkil (Ci-C3), cikloalkil (C3-C6), R⁹ = H, alkil (C1-C3), cikloalkil (C3-C₆), R¹¹ = H, alkil (C1-C3), benzil,

X = CH, O, S,

Y= NR¹², O, S,

R¹²= H, COCH₃, alkil (C^Ca);

R³ ostanek s formulo

/^NH3^C' v primeru, ko je R - Γ

Izum se nanaša tudi na njihove farmacevtsko sprejemljive soli z antikoagulantnim delovanjem in na farmacevtske pripravke, ki jih vsebujejo. Izum se nanaša tudi na postopke za pripravo derivatov azafenilalanina in analogov s splošno formulo (I).

Derivate azafenilalanina s splošno formulo (I), ko je R¹= ^H2N^-^NR“ > pripravimo tako, da

a) 4-cianobenzaldehid s formulo (II)

CN (H)

CHO pretvorimo z BOC-karbazatom s formulo (III)

(Hi) v spojino s formulo (IV)

CN

Yy

I n

N'

I

NH (IV) ki jo s postopkom redukcije s katalitskim hidrogeniranjem presnovimo v spojino (V) (V)

HN I

CL .NH ki reagira s trifozgenom in aminom s formulo (VI)

R⁵ R⁶

HN

R⁷ (VI) kjer imajo R⁵, R⁶ in R⁷ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (VII ali Vlil),

(Vil) (Vlil) ali s trifozgenom in aminom s formulo (IX)

Γ

HN.

^R9 (IX) kjer imata R⁸ in R⁹ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (X),

kjer ima R¹¹ enak pomen kot v formuli (I), do spojine (XI)

kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I).

Zaščitno BOC skupino v spojini (XI) odstranimo s HCI (g) v HOAc pri sobni temperaturi in dobimo spojino (XII),

CN (XII)

NH* ci'

J kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I).

Spojina XII nato reagira z aromatskim sulfonilkloridom ali naftilsulfonil-aminokislino z aktivirano karboksilno skupino do spojine (XIII)

(XIII)

Spojino (XIII) formulo (XIV) in R³ enak pomen kot v formuli (I).

presnovimo s hidroksilaminom v brezvodnem etanolu do spojine s (XIV)

R¹

kjer imajo R¹ = skupino OH.

, R² in R³ enak pomen kot v formuli (I), R⁴ pa predstavlja

Spojino (XIII) presnovimo z uvajanjem plinastega HCI v metanolno raztopino, dodatkom amonijevega acetata in ponovnim uvajanjem HCI v spojino (XV) kjer je R¹= ^H2^N\^^NR4 , r² j_n r³ imata enak pomen kot v formuli (I), R⁴ pa predstavlja vodik.

R¹

Derivate azafenilalanina s splošno formulo (I), ko je R¹= |/^NH3^CI , pripravimo tako, da

a) 4-cianobenzaldehid s formulo (II)

CN

CHO pretvorimo z etilenglikolom v prisotnosti 4-toluensulfonske kisline v spojino (XVI)

CN

O O \_/ ki jo reduciramo z litijevim aluminijevim hidridom v spojino s formulo (XVII)

o o ki reagira z acetanhidridom do spojine (XVIII)

Spojino (XVIII) z 90% metanojsko kislino pretvorimo v spojino (XIX) ch₂nhcoch₃

CHO (XIX) ki jo pretvorimo z BOC-karbazatom s formulo (III) /Τ' (lil)

I o v spojino s formulo (XX)

CH₂NHCOCH₃ (XX)

ki jo s postopkom redukcije s katalitskim hidrogeniranjem presnovimo v spojino (XXI) ch₂nhcoch₃

J (XXI)

HN γν'^{Η 1} o t

ki reagira s trifozgenom in aminom s formulo (VI)

kjer imajo R⁵, R⁶ in R⁷ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (VII ali VIII),

(Vil) (Vlil) ali s trifozgenom in aminom s formulo (IX)

Γ

HN.

^RS (IX) kjer imata R⁸ in R⁹ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (X),

kjer ima R¹¹ enak pomen kot v formuli (I), do spojine (XXII)

-1010 kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I).

Zaščitno BOC skupino v spojini (XXII) odstranimo s HCI (g) v AcOH pri sobni temperaturi in dobimo spojino (XXIII), ch₂nhcoch₃ (XXIII)

I .

NH₃ Cl kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I), ki reagira z aromatskim sulfonilkloridom do spojine (XXIV) ch₂nhcoch₃ o

kjer imata R² in R³ enak pomen kot v formuli (I).

Spojino (XXIV) presnovimo s segrevanjem ob vrenju v 5M HCI v spojino (XXV)

in R³ pa imata enak pomen kot v formuli (I).

Izhodne spojine pripravimo, v kolikor ni navedeno drugače, po postopkih opisanih v literaturi; npr. spojino s formulo IV tako kot opisujejo A. Fassler, et. al., J. Med. Chem. 1996, 39, 3203-3215.

-1111

Izum se nanaša tudi na uporabo spojin s formulo I kot peroralnih in parenteralnih antikoagulantov. Lahko se uporabljajo pri zdravljenju in preprečevanju različnih oblik tromboze: (i) venskih trombembolizmov, pri katerih tromb nastane v veni (venska tromboza) zaradi pridobljenih (ležanje, operacija, poškodba, malignom, nosečnost in porod) ali prirojenih (pomanjkljivosti naravnih zaviralcev koagulacije) dejavnikov tveganja, odtrgan del tromba pa zoži ali zapre pljučne arterije (pljučna embolija), (ii) pri kardiogenih trombembolizmih, pri katerih nastane tromb v srcu zaradi motenj srčnega ritma, hibe srčnih zaklopk, umetnih srčnih zaklopk ali bolezni srčne mišice, odtrgan tromb pa povzroči embolije v periferne arterije, najpogosteje v možgane (ishemični inzult), (iii) arterijske tromboze, ki nastane na aterosklerotično spremenjeni arteriji in zoži ali zapre arterijo ter povzroči ishemijo srčne mišice (angina pektoris, akutni koronarni sindrom) ali odmrtje dela srčne mišice (srčni infarkt), zoži ali zapre periferno arterijo (ishemična bolezen perifernih arterij) in zoži ali zapre arterijo po posegu na žili (reokluzija ali restenoza po perkutani transluminali koronarni angioplastiki, reokluzija ali restenoza po perkutani transluminalni angioplastiki perifernih arterij) in (iv) pri stanjih (n. pr. komplikacijah v nosečnosti, pri metastazirajočih malignih boleznih, po obsežnih poškodbah, pri bakterijski sepsi), ko trombogeni dražljaj povzroči razsejano stvarjanje trombov v žilnem sistemu (diseminirana intravaskularna koagulacija).

Spojine s formulo I se lahko uporabljajo tudi kot dodatno zdravljenje v kombinaciji s trombolitičnim zdravljenjem pri svežem srčnem infarktu, v kombinaciji z aspirinom pri bolnikih z nestabilno angino pektoris, pri katerih bo opravljena perkutana transluminalna angioplastika in pri zdravljenju bolnikov s trombozo in heparinom izzvano trombocitopenijo.

Antikoagulacijska zdravila se uporabljajo tudi za preprečevanje strjevanja krvi, ki je v stiku z nebiološkimi površinami (žilne proteze, žilne opornice, umetne srčne zaklopke, sistemi za zunajtelesni krvni obtok, hemodializa) in in vitro pri pripravi bioloških vzorcev za preiskušanje ali shranjevanje.

-1212

Predmet izuma so tudi farmacevtski pripravki, ki vsebujejo spojine s formulo I. Lahko so v obliki različnih injekcij ali peroralnih pripravkov. Poleg učinkovine vsebujejo še različne standardne dodatke, odvisne od vrste uporabe. Farmacevtski pripravki so lahko pripravljeni po standardnih postopkih. Lahko so pripravljeni tudi v različnih oblikah, ki zagotavljajo kontrolirano in podaljšano sproščanje učinkovine. Odmerek, pogostost in način uporabe so odvisni od različnih dejavnikov, odvisni pa so tudi od posamezne učinkovine in njenih farmakokinetičnih lastnosti in bolnikovega stanja.

BIOLOŠKI TESTI

I. Encimska metoda

1. Določanje učinkovitosti trombinskih inhibitorjev

a) Princip

Trombin cepi amidne vezi v sintetičnem kromogenem substratu in pri tem se sprošča rumeno obarvan p-nitroanilin (p-NA). Količina sproščenega p-NA je premosorazmerna absorbanci, ki jo izmerimo s spektrofotometrom pri valovni dolžini 405 nm. Ob dodatku inhibitorja trombina se amidolitična aktivnost encima zniža. Učinkovitost inhibitorja izrazimo s konstanto inhibicije (K,).

b) Reagenti

Trombin (humani trombin, 308 NIH enot, Sigma): vsebino stekleničke raztopimo z destilirano vodo, da dobimo osnovno raztopino 20 NIH enot/mL. To razpipetiramo po 0,5 mL in shranimo pri -70°C. S HBSA pufrom pripravimo tik pred uporabo delovno raztopino trombina z aktivnostjo 2 NIH enot/mL. Končna koncentracija trombina v mikrotitrski plošči je 0,5 NIH enot/mL.

Kromogeni substrat za trombin (S-2238, Chromogenix, 25 mg). Pripravimo 1 mM raztopino substrata, razpipetiramo po 0,5 mL in shranimo pri -20°C. Pred uporabo

-1313 pripravimo z destilirano vodo 160 in 80 μΜ raztopini substrata. Končni koncentraciji substrata v reakcijski zmesi sta 40 oz. 20 μΜ (Km = 2,6 μΜ).

HBSA pufer, pH 7,5: 10 mM Hepes pufer (HEPES, Sigma), 150 mM NaCl in 0,1% (w/v) govejega serumskega albumina (98% goveji serumski albumin, Sigma) raztopimo v bidestilirani vodi. pH uravnamo z 0,1 M raztopino NaOH.

Inhibitorji: Raztopimo jih z DMSO, da dobimo 10 mM osnovno raztopino. Delovne raztopine (končne koncentracije od 10 do 100 μΜ) pripravimo z destilirano vodo. Maksimalna koncentracija DMSO v mikrotitrski plošči ni presegla 3%.

c) Potek dela

Meritve izvajamo v mikrotitrski plošči. V luknjice mikrotitrske plošče odpipetiramo po 50 μΙ_ HBSA pufra, 50 μΙ_ raztopine inhibitorja različnih koncentracij (v primeru kontrole 50 μΙ_ HBSA pufra) in 50 μΙ_ raztopine trombina. Zmes v plošči inkubiramo 15 minut pri temperaturi 25°C. Po inkubaciji dodamo 50 μ!_ kromogenega substrata in mikrotitrsko ploščo vstavimo v spektrofotometer (Tecan, Sunrise). Merimo porast absorbance pri valovni dolžini 405 nM in temperaturi 25°C 15 minut vsakih 10 sekund.

Za določanje konstante inhibicije (Kj) uporabimo 40 in 20 μΜ substrat. Vsako meritev izvedemo v trojniku in za izračun rezultata upoštevamo poprečno vrednost treh meritev.

d) Določanje konstante inhibicije ( K,)

Kj določimo po principu, ki sta ga opisala Cheng in Prusoff (Biochem Pharmacol, 1973). Merimo začetne hitrosti reakcije v prisotnosti in v odsotnost inhibitorja. Spremembo absorbance v časovni enoti (v) izračunamo iz začetnega, linearnega dela reakcije. Za kompetitivne inhibitorje velja, da je ^v; _ K,+S in iz tega sledi da je

-1414 ^K' (h/^.)+O'((v„/v,)-l)

I = koncentracija inhibitorja, S = koncentracija substrata, Km = Michaelisova konstanta, v₀ = začetna hitrost reakcije brez inhibitorja, v, = začetna hitrost reakcije ob prisotnosti inhibitorja.

Meritve izvedemo z dvema koncentracijama inhibitorja in dvema koncentracijama substrata. Za vsako kombinacijo uporabljenih koncentracij substrata in inhibitorja izračunamo K, in kot rezultat upoštevamo njihovo poprečno vrednost.

2. Določanje selektivnosti inhibitorske aktivnosti proti trombinu glede na inhibicijo tripsina

a) Princip

Zaradi sorodnosti trombina in tripsina glede specifičnosti proti substratu, ki je posledica primerljive strukture aktivnega mesta, določamo selektivnost inhibitorske aktivnosti proti trombinu glede na inhibicijo tripsina, ki je nespecifična serinska proteinaza. Inhibitorsko aktivnost proti trombinu določimo tako, kot je opisano zgoraj. Inhibicijo tripsina merimo na enak način kot merimo inhibicijo trombina, vendar uporabimo drug kromogeni substrat. Za oba encima izračunamo K. Iz razmerja K za tripsin / K, za trombin sklepamo na selektivnost inhibitorja.

b) Reagenti

Tripsin (goveji, 6000 BAEE enot/mg proteina, Sigma): Pripravimo osnovno raztopino tripsina z aktivnostjo 300 Ε/mL, ki jo razpipetiramo po 0,2 mL in shranimo pri -70° C. Tik pred uporabo osnovno raztopino odmrznemo in pripravimo s HBSA pufrom delovno raztopino z aktivnostjo 4 mE/mL. Končna aktivnost tripsina v mikrotitrski plošči je 1 mE/mL.

Kromogeni substrat za tripsin (S-2222, Chromogenix, 25 mg): Pripravimo 2 mM raztopino substrata, razpipetiramo po 0,3 mL in shranimo pri -20°C. Pred uporabo

-1515 osnovno raztopino odmrznemo in pripravimo 400 in 200 μΜ raztopini substrata. Končni koncentraciji substrata v reakcijski zmesi sta 100 oz. 50 μΜ. (Km = 25 μΜ)

HBSA pufer, pH 7,5: enako kot pri metodi za trombin

Inhibitorji: Raztopimo jih z DMSO, da dobimo 10 mM osnovno raztopino. Delovne raztopine (končne koncentracije od 10 do 600 μΜ) pripravimo z destilirano vodo. Maksimalna koncentracija DMSO v mikrotitrski plošči ni presegla 10%.

Za določanje K uporabimo 100 in 50 μΜ substrat. Vsako meritev izvedemo v trojniku in kot rezultat upoštevamo poprečno vrednost teh treh meritev,

c) Potek dela

Potek dela je enak tistemu, ki je opisan pri merjenju inhibitorske aktivnosti proti trombinu. Uporabimo koncentracije reagentov opisane za določanje inhibitorne aktivnosti glede na tripsin.

d) Določanje konstante inhibicije ( K )

Postopamo enako kot je opisano pri določanju K za trombin.

e) Določanje selektivnosti

Določimo K za trombin in K za tripsin. Selektivnost definiramo kot razmerje:

K.-(tripsin) selektivnost = —--—

K. (trombin)

3. Določanje selektivnosti inhibitorske aktivnosti proti trombinu glede na inhibicijo faktorja Xa

a) Princip

Selektivnost inhibitorske aktivnosti proti trombinu glede na inhibicijo faktorja Xa ugotavljamo zaradi sorodnosti obeh encimov in podobne strukture aktivnega mesta. Inhibitorsko aktivnost proti trombinu določimo tako, kot je opisano zgoraj. Inhibicijo FXa merimo na enak način kot merimo inhibicijo trombina s kromogenim substratom

-1616

S2238. Za oba encima izračunamo K,. Iz razmerja Kj za FXa / K, za trombin sklepamo na selektivnost inhibitorja.

b) Reagenti

Faktor Xa (Chromogenix, 71 nkat): vsebino stekleničke raztopimo z destilirano vodo, da dobimo osnovno raztopino 10 nkat/mL. To razpipetiramo po 0,5 ml_ in shranimo pri -20°C. S HBSA pufrom pripravimo tik pred uporabo delovno raztopino FXa z aktivnostjo 2 nkat/mL. Končna aktivnost FXa v mikrotitrski plošči je 0,5 nkat/mL.

Kromogeni substrat za FXa (S-2222, Chromogenix, 25 mg). Pripravimo 2 mM raztopino substrata, razpipetiramo po 0,5 mL in shranimo pri -20°C. Pred uporabo pripravimo z destilirano vodo 800 in 400 μΜ raztopini substrata. Končni koncentraciji substrata v reakcijski zmesi sta 200 oz. 100 μΜ (K_m = 164 μΜ).

HBSA pufer, pH 7,5: enako kot pri metodi za trombin

Inhibitorji: Raztopimo jih z DMSO, da dobimo 10 mM osnovno raztopino. Delovne raztopine (končne koncentracije od 5 do 300 μΜ) pripravimo z destilirano vodo. Maksimalna koncentracija DMSO v mikrotitrski plošči ni presegla 3%.

c) Potek dela

Potek dela je enak tistemu, ki je opisan pri merjenju inhibitorske aktivnosti proti trombinu. Uporabimo koncentracije reagentov opisane za določanje inhibitorne aktivnosti glede na FXa.

d) Določanje konstante inhibicije ( K )

Postopamo enako kot je opisano pri določanju K, za trombin.

e) Določanje selektivnosti

Določimo K, za trombin in K, za FXa. Selektivnost definiramo kot razmerje:

selektivnost =

Kj(FXa) Kj (trombin)

-1717

II. Koagulacijske preiskave

S koagulacijskimi preiskavami (trombinskim časom, aktiviranim parcialnim tromboplastinskim časom in protrombinskim časom) merimo čas strjevanja normalne zmesne plazme v koagulacijskem aparatu po dodajanju različnih koncentracij inhibitorja. Rezultate izrazimo kot koncentracijo inhibitorja, ki čas strjevanja podaljša za dvakrat.

1. Trombinski čas (TČ)

a) Princip

Določitev trombinskega časa se uporablja pri laboratorijski kontroli zdravljenja z nefrakcioniranim heparinom, pri kontroli trombolitičnega zdravljenja, pri ugotavljanju motenj nastajanja fibrina in za ugotavljanje težkih oblik pomanjkanja fibrinogena. Trombinski čas je podaljšan, kadar je koncentracija fibrinogena zmanjšana, kadar so prisotni razgradni produkti fibrinogena ali inhibitorji trombina. Postopek je tak, da plazmi dodamo trombin. Trombin pretvori fibrinogen v fibrin, ki ga ugotovimo kot nastanek strdka.

b) Reagenti

Trombin (Test Thrombin Reagent, 1,5 IU/mL): liofiliziran goveji trombin raztopimo v 5 mL HEPES pufra (25 mM, pH 7,4).

Normalna zmesna plazma'. Vsaj 10 navidezno zdravim preiskovancem odvzamemo vensko kri v 0,11 M raztopino natrijevega citrata (1 del natrijevega citrata in 9 delov krvi). Kri centrifugiramo takoj po odvzemu pri 2000 x g za 30 minut in 4°C . Odstranimo plazmo, jo razpipetiramo po 2 mL ter hranimo pri - 70°C.

Inhibitorji: Inhibitorje raztopimo v DMSO (10 mM osnovna raztopina) in redčimo z destilirano vodo, da dobimo delovne raztopine (najvišja koncentracija 100 μΜ)

-1818

c) Potek dela

V kiveto koagulacijskega aparata (Fibrintimer, Dade/Behring), ogreto na 37°C odpipetiramo 90 μΙ_ plazme in 10 uL inhibitorja. Inkubiramo 5 min. pri 37°C. Dodamo 200 μΙ_ raztopine trombina, ogrete na 37°C. Po dodatku trombina vključimo merjenje časa, ki ga merimo do nastanka strdka.

2. Aktivirani parcialni tromboplastinski čas (APTČ)

a) Princip

APTČ uporabljamo kot presejalno metodo za ugotavljanje motenj intrinzičnega dela koagulacijskega sistema. Metoda je občutljiva na pomanjkljivosti koagulacijskih faktorjev Vlil in IX in kontaktnih faktorjev. Ob pomanjkanju faktorjev ali ob prisotnosti inhibitorjev (npr. lupusnih antikoagulantov, heparina) izmerimo podaljšane APTČ. Postopamo tako, da inkubiramo plazmo z optimalno količino fosfolipidov in kontaktnega aktivatorja, da aktiviramo faktorje intrinzičnega koagulacijskega sistema. Dodajanje kalcija sproži koagualcijski proces. Merimo čas do nastanka fibrina.

b) Reagenti

Fosfolipidi z aktivatorjem (Pathromtin SL, Dade/Behring): delci silicijevega oksida, rastlinski fosfolipidi, natrijev klorid (2,4 g/L), HEPES (14,3 g/L), pH

7,6 in natrijev azid (< 1 g/L). Pred uporabo mora imeti sobno temperaturo in mora biti dobro premešan.

Kalcijev klorid: 0,025 mol/L

Normalna zmesna plazma: enako kot pri trombinskem času.

Inhibitorji: enako kot pri trombinskem času.

c) Potek dela

V kiveto koagulacijskega aparata (Fibrintimer, Dade/Behring), ogreto na 37°C, odpipetiramo 90 μί plazme in 10 pL inhibitorja. Inkubiramo 5 min. pri 37 °C.

-1919

Dodamo 100 μ!_ fosfolipidov z aktivatorjem. Inkubiramo 2 min. pri 37 °C. Dodamo 100 pL kalcijevega klorida pri 37°C. Po dodatku kalcijevega klorida, začnemo meriti čas do nastanka strdka.

3. Protrombinski čas (PČ)

a) Princip

Protrombinski čas je hitra in občutljiva presejalna metoda za ugotavljanje motenj v ekstrinzičnem delu koagulacijskega sistema (faktorji II, V, VII in X). Zaradi visoke občutljivosti na te koagulacijske faktorje je metoda posebno primerena za spremljanje oralnega antikoagulacijskega zdravljenja, za prepoznavanje dednih in pridobljenih motenj teh faktorjev in za preverjanje sintetične sposobnosti jeter. Protrombinski čas je podaljšan ob pomanjkanju koagulacijskih faktorjev ter ob prisotnosti inhibitorjev. Postopamo tako, da plazmi dodamo optimalno količino tromboplastina in kalcija ter merimo čas do nastanka strdka.

b) Reagenti

Tromboplastin (Thromborel S, Dade/Behring): človeški tromboplastin iz posteljice s kalcijevim kloridom in stabilizatorji; raztopimo v 4 mL destilirane vode. Pred uporabo ogrevamo reagent vsaj 30 minut na 37° C.

Normalna zmesna plazma: enako kot pri trombinskem času.

Inhibitorji: enako kot pri trombinskem času.

c) Potek dela

V kiveto koagulacijskega aparata (Fibrintimer, Dade/Behring), ogreto na 37°C odpipetiramo 90 pL plazme in 10 pL inhibitorja. Inkubiramo 5 min. pri 37°C. Dodamo 200 pL tromboplastina, ogretega na 37°C. Po dodatku tromboplastina začnemo meriti čas do nastanka strdka.

-2020

Rezultati bioloških testov

Spojina	Ki - trombin (μΜ)	Ki - tripsin (μΜ)	Ki - faktor X (μΜ)	PČ (s)	TČ (s)	APTČ (s)
1	6.9
2	12.6
3	10.3		4.9	769	591	396
4	9.0	6.2	37.0
5	8.6	2.5
6	4.0	23.4	59.5
7	23.0	65.5
8	21.0	30.0	63.6	364	1238	893
9	0.92	13	73.9	92	30	893
10	1.3	39.4	76.2	60	25	63
11	1.6	6.9	55.7	202	47	140
12	3.3	13.6	41.1	218	72	158

Spojina 1

Spojina 2

-2124

Spojina 3

Spojina 4

Spojina 5

-2212-

-23Spojina 8

N

-24Spojina 11

NHo Cl'

Spojina 12

H₃C

ch₃

Nhk Cl'

-25Izum pojasnjujejo, vendar nikakor ne omejujejo naslednji izvedbeni primeri.

PRIMER 1 /V-{2-[2-(1-azepanilkarbonil)-2-(4-cianobenzil)hidrazino]-2-oksoetil}-2naftalensulfonamid

1.00 g ( 3.77 mmol) 2-[(2-naftilsulfonil)amino]ocetne kisline raztopimo v 20ml diklormetana in ji ob mešanju dodamo 420 mg (3.87 mmol) etil kloroformiata in 516 mg (4.00 mmol) N-etil-N,N-diizopropilamina. Reakcijsko zmes mešamo 1 uro pri sobni temperaturi, nato dodamo uprašen 2-(1-azepanilkarbonil)-2-(4cianobenzil)hidrazinijev klorid (1,00 g; 3,24 mmol). Po dodatku mešamo 3 dni pri sobni temperaturi.

Na rotavaporju odstanimo topilo in preostanek raztopimo v 50 ml etilacetata, ter nato spiramo z 1M HCI, 1M NaOH in destilirano vodo. Organsko fazo sušimo z natrijevim sulfatom in odstranimo topilo pod znižanim tlakom. Surov produkt prekristaliziramo iz etanola.

Izkoristek; 1.34 g (79%)

Tališče: 149-151 °C

IR (KBr, cm'¹); 3410, 3253, 2919, 2232, 1708, 1613, 1440, 1343, 1156, 659 ¹H-NMR (DMSO-de): δ (ppm) 1.46 (m, 8H, CH2-azepin₃',4',5,6'); 1,65 (m, 4H, CH₂azepin₂',₇'); 3.33 (m, 2H, CO-CH₂-NH); 4.09 (m, 1H, NHCO); 4.47 (s, 2H, Ar- CH₂),

7.58 in 7.79 (2d, 2H vsak, J₂,₆= 8.27, J_3i5=8.27, Ar-H₂,₃,₅,₆); 7.69-8.47 (m, 7H, Ar-H (naftalen)); 10.29 (s, 1H NHSO₂)

Molekulska masa : izračunana : 519 (C27H29N5O4S); ugotovljena ; 520 ( MH⁺)

PRIMER 2

-264-((1-(1 -azepan i I karboni I )-2-(2-(( 1 -nafti Isu Ifon i I )am i no]aceti l}h idrazino) metil] -/Vhidroksibenzenkarboksimidamid /\/-{2-[2-(1-azepanilkarbonil)-2-(4-cianobenzil)hidrazino]-2-oksoetil}-2naftalensulfonamid (400 mg. 0.77 mmol) raztopimo v brezvodnem etanolu in dodamo hidroksilamin (28.0 mg, 0.85 mmol). Reakcijsko zmes segrevamo ob vrenju 12 ur.

Na rotavaporju odstranimo topilo in produkt speremo z etrom.

Izkoristek: 386 mg (87 % )

Tališče: 104-108 °C

IR (KBr, cm’¹): 3359, 2624, 1782, 1640, 1422, 1345, 1157, 1075, 750, 661 ¹H-NMR (CDCI₃):6 (ppm) 1.49-1.89 (m, 8H, CH₂-azepin₃,4,5,6'); 2.07 (m, 4H, CH₂azepin₂,₇); 3.48 (m, 2H, CO-CH₂-NH); 4.18 (s, 1H, NHCO); 4.68 (m, 2H, Ar- CH₂), 4.90 (s, 1H, =N-OH); 7.42 in 7.61 (2d, 2H vsak, J₂,₆= 8.17, J₃,₅=8.15, Ar-H₂,₃,₅,₆); 7.648.34 (m, 7H, Ar-H (naftalen)); 8.42 (s, 2H, NH₂-amidoksim); 10.35 (s, 1H NHSO₂) Molekulska masa: izračunana 552 (C₂7H₃₂N₆O₅S), izmerjena 553 ( MH⁺)

PRIMER 3

Amino{4-[(1 -(1 -azepanilkarbonil)-2-{2-[(1 -nafti Isulfoni I )ami no]aceti I} hidrazino)metil]fenil}metaniminijev klorid /V-{2-[2-(1-azepanilkarbonil)-2-(4-cianobenzil)hidrazino]-2-oksoetil}-2naftalensulfonamid (520mg, 1.00 mmol) raztopimo v 25 ml brezvodnega etanola in uvajamo HCI plin 20 min. Po končanem uvajanju raztopino mešamo 4 ure pri sobni temperaturi, nato dodamo amonijev acetat (85.0 mg, 1.10 mmol). Reakcijsko zmes pustimo 2 dni pri sobni temperaturi. Ponovno uvajamo HCI plin 20 min. Po 1 uri odfiltriramo nastali amonijev klorid in uparimo etanol na rotavaporju. Produkt prelijemo z etrom, in odfiltriramo s presesavanjem.

Izkoristek: 481 mg (84 %)

IR (KBr, cm’¹): 2969, 2758, 1783, 1669, 1344, 1158, 1076, 749, 660,

-272Τ ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ (ppm) 1.57-1.76 (m, 8H, CH₂-azepin₃',₄',₅',6'); 3.03 (m, 4H, CH₂-azepin₂’,7'); 3.37 (m, 2H, CO-CH₂-NH); 4.31 (m, 1H, NHCO); 4.74 (s, 2H, ArCH₂), 7.62 in 7.90 (2d, 2H vsak, J₂,₆= 8.14, J₃,₅=8.19, Ar-H₂,₃,₅,₆); 7.35-8.49 (m, 7H, Ar-H (naftalen)); 9.30 (s, 1H NHSO₂); 9.42 (2s, 2H, amidin)

Molekulska masa : izračunana : 537 (C₂7H₃₃N₆O₄S); ugotovljena : 538 ( MH⁺)

PRIMER 4

2-806^1-/^-(1 -azepanilkarbonil)-/V-(4-cianobenzil)-1,2,3,4-tetrah idro-7izokinolinsulfonohidrazid

2-(1-azepanilkarbonil)-2-(4-cianobenzil)hidrazinijev klorid (2.01 g, 6.51 mmol) raztopimo v 30 ml diklormetana. Dodamo 900 mg (6.98 mmol) N-etil-N,Ndiizopropilamina in 1.93 g (8.00 mmol) 2-acetil-1,2,3,4-tetrahidro-7-izokinolinsulfonil klorida. Reakcijsko zmes mešamo 2 dni pri sobni temperaturi. Na rotavaporju odstanimo topilo in preostanek raztopimo v 50 ml etilacetata, ter nato spiramo z 1M HCI, 1M NaOH in destilirano vodo. Organsko fazo sušimo z natrijevim sulfatom in odstranimo topilo pod znižanim tlakom. Surov produkt prekristaliziramo iz etanola. Izkoristek: 629 mg (19%)

Tališče: 142-144°C

IR (KBr, cm'¹): 3415, 3197, 2915, 2224, 1648, 1422, 1329, 1156, 985, 786, 595 ¹H-NMR (DMSO-d₆); δ (ppm) 1.36-1.61 (m, 12H, CH₂-azepin); 2.09 (s, 3H, CO-CH₃);

2.81 in 2.91 (2t, 2H, J=6.34, CH₂-izokinolin₃); 3.10 (m, 2H, , CH₂-izokinolin₄); 3.66 m, 2H, , CHz-izokinolim); 4.26-4.41 (m, 2H, Ar- CH₂), 7.35 in 7.52 (2d, 2H vsak, J₂,₆= 8.17, J₃,5=8.17, Ar-H₂,3,5,₆); 7.31-7.80 (m, 3H, Ar-H (izokinolin)); 9.40 (s, 1H NHSO₂) Molekulska masa : izračunana : 509 (C₂₆H₃iN₅O₄S); ugotovljena : 510 ( MH⁺)

PRIMER 5 (4-{[2-[(2-aceti 1-1,2,3,4-tetrah idro-7-izokinol i n i I )su Ifon i l]-1 -(1 azepanilkarbonil)hidrazino]metil}fenil)(imino)metanaminijev klorid

-282-acetil-/V-(1-azepanilkarbonil)-/\/'-(4-cianobenzil)-1,2,3,4-tetrahidro-7izokinolinsulfono- hidrazid (600 mg, 1.18 mmol) raztopimo v 25 ml brezvodnega etanola in uvajamo HCI plin 20 min. Po končanem uvajanju raztopino mešamo 4 ure pri sobni temperaturi, nato dodamo amonijev acetat (100.0 mg, 1.32 mmol). Reakcijsko zmes pustimo 2 dni pri sobni temperaturi. Ponovno uvajamo HCI plin 20 min. Po 1 uri odfiltriramo nastali amonijev klorid in uparimo etanol na rotavaporju. Produkt prelijemo z etrom, in odfiltriramo s presesavanjem.

Izkoristek : 312 mg ( 47 %)

Tališče: 221-224°C

IR (KBr, cm’¹): 3417, 3287, 2946, 1636, 1423, 1334, 1158, 1091, 1036, 608 ¹H-NMR (CDCIs): δ (ppm) 1.22-1.74 (m, 12H, CH₂-azepin); 2.19 (s, 3H, CO-CH₃2.91 (m, 2H, CH₂-izokinolin₃); 3.28 (m, 2H, , CH₂-izokinolin₄); 3.86 m, 2H, , CH₂izokinolini); 4.35 (m, 2H, Ar- CH₂), 7.21-7.72 (m, 7H, Ar-H); 7.96 (s, 1H NHSO₂) Molekulska masa C₂₆ H35 N₆ O₄S : izračunana : 527; ugotovljena : 528 ( MH ⁺)

PRIMER 6

7-{[2-{4-[amino(iminijo)metil]benzil}-2-(1-azepanilkarbonil)hidrazino]sulfonil}-1,2,3,4tetrahidroizokinolinijev diklorid (4-{[2-[(2-aceti 1-1,2,3,4-tetrahidro-7-izokinol i ni l)sulfon i l]-1 -(1 azepanilkarbonil)hidrazino] metil}fenil)(imino)metanaminijev klorid (600 mg, 1.07 mmol) raztopimo v 15ml 4M HCI in segrevamo 2 uri ob vrenju. Vodo in nastalo ocetno kislino odparimo na rotavaporju, dobljen brezbarven kristaliničen produkt pa speremo z etrom.

Izkoristek: 432 mg ( 72 % )

Tališče: 226-228 °C

IR (KBr, cm'¹): 2932, 2598, 1698, 1669, 1424, 1382, 1235, 1155, 914, 736, 668 ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ (ppm) 1.15-1.35 (m, 8H, CH₂- azepin₃,₄’,5',₆’); 2.51 (m, 4H, CH₂-azepin₂',₇'); 3.08 (m, 2H, CH₂-izokinolin₃); 3.21 (m, 2H, , CH₂-izokinolin₄); 3.66 m,

-292Η, , CH₂-izokinolini); 4.26-4.41 (m, 2Η, Ar- CH₂), 7.35 in 7.52 (2d, 2H vsak, J₂,₆= 8.17, J₃,5=8.17, Ar-H₂,₃,5,₆); 7.31-7.80 (m, 3H, Ar-H (izokinolin)); 9.40 (s, 1H NHSO₂) Molekulska masa : izračunana : 509 (C₂₆H₃iN₅O4S); ugotovljena : 510 ( MH⁺)

PRIMER 7 /V-(1 -azepanilkarbonil)-/V-(4-cianobenzil)-1 -(2-naftilsulfonil)-2-pirolidinkarbohidrazid

2.20 g ( 7.21 mmol) 1 -(2-naftilsulfonil)prolina raztopimo v 35 ml diklormetana in mu ob mešanju dodamo 815 mg (7.50 mmol) etil kloroformiata in 1.20 g (9.30 mmol) Netil-N,N-diizopropilamina. Reakcijsko zmes mešamo 1 uro pri sobni temperaturi, nato dodamo uprašen 2-(1-azepanilkarbonil)-2-(4-cianobenzil)hidrazinijev klorid (2.00 g,

6.48 mmol). Po dodatku mešamo 3 dni pri sobni temperaturi.

Na rotavaporju odstanimo topilo in preostanek raztopimo v 50 ml etilacetata, ter nato spiramo z 10% citronsko kislino, 5% razt. NaHCO₃ in destilirano vodo. Organsko fazo sušimo z natrijevim sulfatom in odstranimo topilo pod znižanim tlakom. Surov produkt preobarjamo iz acetona.

Izkoristek: 0.82 g (23%)

Tališče: 158-159°C

IR (KBr, cm'¹) 3461, 2234, 1708, 1614, 1527, 1428, 1342, 1156, 1082, 1015 759, 662, 548

H-NMR (DMSO-de): δ (ppm) 1.47 (s, 4H, CH₂), 1.64 (s, 4H, CH₂), 1.75 (m, 4H, CH₂),

3.24 (m, 4H, CH₂), 3.24 (m,2H, CH₂), 4.12 (m, 1H, CH). 4.47 (s, 2H, Ar-CH_?), 7.57 (d, 2H, J=8.29 Hz, Ar-H³'⁵), 7.71 (dqu, 2H, ^=7.16 Hz, J2=1.50 Hz, Ar-H), 7.80 (d, 2H, J=8.29 Hz, Ar-H²’⁶), 7.84 (dd, 1H, Ji=8.67 Hz, J2=1.89 Hz, Ar-H), 8.07 (d, 1H, J=7.91 Hz, Ar-H), 8.15 (m, 2H, Ar-H), 8.47 (s, 1H, Ar-H), 10.29 (s,1 H, NH)

Molekulska masa : izračunana : 559 (C₃₀H₃₃N₅O₄S); ugotovljena : 560 ( MH⁺)

PRIMER 8

-3050

Amino{4-[(1-(1-azepanilkarbonil)-2-{[1-(2-naftilsulfonil)-2pirolidinil]karbonil}hidrazino)metil]fenil}metaniminijev klorid

A/^,-(1-azepanilkarbonil)-/V-(4-cianobenzil)-1-(2-naftilsulfonil)-2-pirolidinkarbohidrazid (754 mg, 1.35 mmol) raztopimo v 25 ml brezvodnega etanola in uvajamo HCI plin 20 min. Po končanem uvajanju raztopino mešamo 4 ure pri sobni temperaturi, nato dodamo amonijev acetat (115.0 mg, 1.50 mmol). Reakcijsko zmes pustimo 2 dni pri sobni temperaturi. Ponovno uvajamo HCI plin 20 min. Po 1 uri odfiltriramo nastali amonijev klorid in uparimo etanol na rotavaporju. Produkt prelijemo z etrom, in odfiltriramo s presesavanjem.

Izkoristek: 320 mg (40 %)

Tališče: 123-127°C

IR (KBr, cm'¹): 3034, 1781, 1681, 1602, 1402, 1347, 1158, 1076, 1010, 823, 748, 660 ¹H-NMR (DMSO-de): δ (ppm) 1.57 (m, 4H, CH2-azepin4',5'); 1.76 (m, 4H, CH2azepin3’,6'); 2.03 (m, 4H, CH2-prolin); 3.02 (m, 4H, CH2-azepin2',7'); 3.32 (m, 2H, CH2prolin); 3.63 (q, 1H, J=3.63 Hz, CH2-prolin); 4.96 (s, 2H, Ar- CH2), 7.52 (d, 2H, J=8.18 Hz, Ar-H³’⁵), 7.68 (dqu, 2H, J,=7.14 Hz, J2=1.67 Hz, Ar-H), 7.81 (d, 2H, J=8.18 Hz, Ar-H²'⁶), 7.93 (dd, 1H, 3,=8.59 Hz, J₂=2.11 Hz, Ar-H), 8.12 (m, 3H, Ar-H),

8.49 (s, 1H, Ar-H), 9.41 (s, 4H, NH₂-C=NH₂ ⁺) 9.59 (s,1 H, NH)

Molekulska masa : izračunana : 599 (C30H37N5O4SCI); ugotovljena : 577 (( M-HCI)H⁺)

PRIMER 9 /\f-(1-azepanilkarbonil)-/V-(4-cianobenzil)-2-(2-naftiloksi)acetohidrazid

750 mg ( 3.71 mmol) 2-(2-naftiloksi)ocetne kisline in 1.00 g (3.24 mmol) 2-(1azepanilkarbonil)-2-(4-cianobenzil)hidrazinijevega klorida raztopimo v 15 ml dimetilformamida. Ob mešanju dodamo 500 mg (3.70 mmol) 1-hidroksi-benzotriazola in 748 mg (3.90 mmol) EDC. Reakcijsko zmes mešamo 1 dan pri sobni temperaturi.

-312>4

Na rotavaporju odstanimo topilo in preostanek raztopimo v 50 ml etilacetata, ter nato spiramo z 10% citronsko kislino, 5% razt. NaHCO₃ in destilirano vodo. Organsko fazo sušimo z natrijevim sulfatom in odstranimo topilo pod znižanim tlakom. Surov produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (MF=CH₂CI₂:MeOH 9:1).

Izkoristek: 963 mg (63%)

Tališče: 142-144°C

IR (KBr, cm'¹) 3228, 2925, 2854, 2227, 1630, 1509, 1426, 1216, 1120, 960, 838, 748, 547

H-NMR (CDCI₃): δ (ppm) 1.55 (m, 4H, CH₂-azepin₄’,5’); 1.75 (m, 4H, CH₂-azepin₃',₆);

3.43 (t, 4H, J=5.86 Hz, CH₂-azepin₂,₇); 4.54 (s, 2H, CH₂); 4.68 (s, 2H, Ar-CH₂); 7.06 (s,1H, NH); 7.34 (d, 2H, J=8.40 Hz, Ar-H^3,5); 7.39-7.58 (m, 3H, Ar-H); 7.47 (d, 2H, J=8.40 Hz, Ar-H^2,6); 7.68-7.84 (m, 3H, Ar-H); 8.14 (s, 1H, Ar-H)

Molekulska masa : izračunana : 456 (C₂7H₂₈N₄O₃); ugotovljena : 457 ( MH⁺)

PRIMER 10:

terc-butil 2-{4-[(acetilamino)metil]benzil}-2-[(4-metil-1 -piperidinil) karbon i l]-1 hidrazinkarboksilat

1.26 g (4.39 mmol) bis-triklorometilkarbonata raztopimo v 20 ml diklorometana in raztopino prepihamo z argonom. 2.50 g (8.53 mmol) terc-butil 2-{4[(acetilamino)metil]benzil}-1-hidrazinkarboksilata raztopimo v 30 ml diklorometana, dodali 1.65 g (12.79 mmol) diizopropiletilamina ter zmes po kapljicah dodajamo v raztopino bis-triklorometilkarbonata. Med kapljanjem reakcijsko zmes hladimo na ledeni kopeli. Nato mešamo še pol ure pri sobni temperaturi. Dodamo 2.04 ml (25.60 mmol) 4-metilpiperidina in mešamo še eno uro pri sobni temperaturi. Nato reakcijsko zmes ekstrahiramo s 4χ 25 ml 10% raztopine citronske kisline, s 30 ml nasičene raztopine NaHCO₃, ter spiramo s 30 ml prečiščene vode in z 20 ml nasičene raztopine NaCI. Organsko fazo sušimo z Na₂SO₄. Pod znižanim tlakom odparimo topilo in preostanku dodamo 10 ml dietiletra. Izpade je bela oborina, ki jo odfiltriramo s presesavanjem.

-322>2Izkoristek: 2.10 g (59%)

Tališče: 124-126°C

IR (KBr, cm'¹) 3282, 2923, 2858, 1727, 1638, 1443, 1253, 1158, 1020, 978, 757, 611 H-NMR (CDCI₃): δ (ppm) 0,95 (d, 2H, J=6.40 Hz, pip-CH₃); 1,10-1,25 (m, 2H, pipCH₂); 1,44 (s, 9H, C(CH₃)₃); 1,60- 1,73 (m, 3H, pip-CH?, pip-CH); 2,03 (s, 3H, C0CH₃), 2,82 (m, 2H, pip-CH?): 3,92 (d, 2H, J=13,19 Hz, pip-CH?); 4,42 (d, 4H, J=5,65 Hz, CH₂-Ar-CH₂), 5,89 (s, 1H, NH-CO); 6,27 (s, 1H, NH-COO); 7,27 (s, 4H, Ar-H) Molekulska masa : izračunana : 418 (C₂₂H₃₄N₄O4); ugotovljena : 419 ( MH⁺)

PRIMER 11:

2-{4-[(acetilamino)metil]benzil}-2-[(4-metil-1 -piperid in i l)karbon i I] hidrazinijev klorid

2.65 g (6.33 mmol) terc-butil 2-{4-[(acetilamino)metil]benzil}-2-[(4-metil-1-piperidinil) karbonil]-1-hidrazinkarboksilata raztopimo v ocetni kislini (20 ml) in uvajamo plin HCI pol ure. Pod znižanim tlakom odparimo kislino in preostanek prelijemo z dietiletrom. S stekleno palčko drgnemo ob steni bučke dokler ne dobimo belega praška. Medtem še dvakrat odlijemo dietileter in nalijemo novega.

Izkoristek: 1.98 g (88%)

Tališče: 196-198°C

IR (KBr, cm’¹) 3419, 3256, 2926, 2685, 1689, 1552, 1434, 1235, 972, 728 H-NMR (CDCI₃): δ (ppm) 0,97 (d, 2H, J=6,03 Hz, pip-CH₃); 1,19 (m, 2H, pip-CH?): 1,52-1,70 (m, 3H, pip-CH?, pip-CH); 2,07 (s, 3H, CO-CH₃); 2,91 (t, 2H, J=12,43 Hz, pip-CH?): 3,96 (d, 2H, J=12,43 Hz, pip-CH?): 4,31 (d, 2H, J=4,15 Hz, Ar-CH₂); 4,61 (s, 2H, Ar-CH?); 7,26 (d, 2H, J=7,91 Hz, Ar-H); 7,32 (d, 2H, J=7,92 Hz, Ar-H); 7,99 (s, 1H, NH-CO)

Molekulska masa : izračunana : 354.5 (0₁7Η₂₇Ν₄0₂ΟΙ); ugotovljena : 319 ((M-HCI)H⁺, 100)

-33PRIMER 12:

N-(4-{[1 -[(4-meti 1-1 -pi peridinil )karbon i l]-2-( 1 -nafti Isulfon i I )h idrazino] metil}benzil)acetamid

1.98 g (5.59 mmol) 2-{4-[(acetilamino)metil]benzil}-2-[(4-metil-1piperidinil)karbonil]hidrazinijevega klorida in 1.39 g (6.13 mmol) naftalen-2sulfonilklorida smo raztopili v diklorometanu (25 ml), dodali 2.16 g (16.7 mmol) diizopropiletilamina in mešali pri sobni temperaturi 3 dni. Ekstrahirali smo s 4χ 25 ml 10% citronske kisline in s 30 ml nasičene raztopine NaHCO₃ in organsko fazo spirali s 30 ml prečiščene vode in s 30 ml nasičene raztopine NaCI. Sušili smo z Na₂SO₄. Pod znižanim tlakom smo odparili diklorometan in dobili smo penasto trdno snov bledo rjavorumene barve.

Izkoristek: 1.89 g (67%)

Tališče: 80-83°C

IR (KBr, cm'¹) 3285, 2925, 1656, 1546, 1430, 1338, 1165, 970, 750, 554 H-NMR (CDCI₃): δ (ppm) 0,52 (d, 3H, J=6,03 Hz, pip-CH₃); 1,28 (m, 2H, pip-CHA 1,64 (m, 3H, pip-CH₂, pip-CH ); 2,05 (s, 3H, CO-CH₃); 2,32-2,71 (m, 2H, pip-CH_?); 3,72 (m, 2H, pip-CH₂); 4,32 (m, 2H, Ar-CH₂); 4,41 (d, 2H, J=5,66 Hz, Ar-CH₂); 5,72 (s, 1H, NH-CO); 7,16 (d, 2H, J=8,29 Hz, Ar-H); 7,22 (d, 2H, J=7,91 Hz, Ar-H); 7,46 (s, 1H, naft-H); 7,62 (m, 2H, 2xnaft-H); 7,81 (dd, 1H, Τ=8,67 Hz, J₂=1,88 Hz, naft-H);

7,94 (q, 3H, J=7,66 Hz, 3xnaft-H); 8,45 (s, 1H, NH-SO₂)

Molekulska masa : izračunana : 508 (C₂7H₃₂N₄O₄S); ugotovljena : 509 ( MH⁺)

PRIMER 13:

(4-{[1 -[(4-metil-1 -pi peridini I )karbon i l]-2-( 1 -nafti Isulfoni I )hidrazi no] metil}fenil)metanaminijev klorid

1.89 g (3.72 mmol) N-(4-{[1 -[(4-metil-1 -piperidinil)karbonil]-2-(1 naftilsulfonil)hidrazino]metil}benzil)acetamida raztopimo v 30 ml segretega

-34izopropilnega alkohola (60°C). Dodamo 30 ml 4M HCI in segrevamo 5 ur pri temperaturi refluksa. Pod znižanim tlakom odparimo topilo. Produkt očistimo s kolonsko kromatografijo, kjer je stacionarna faza silikagel, kot mobilno fazo pa uporabimo diklorometan : metanol (9:1).

Izkoristek: 550 mg (29%)

Tališče: 156-160°C

IR (KBr, cm’¹) 3285, 2925, 1656, 1546, 1430, 1338, 1165, 970, 750, 554

H-NMR (CDCI₃): δ (ppm) 0,17 (m, 2H, pip-CH_?), 0,44 (d, 3H, J=6,03 Hz, pip-CH₃),

1,22 (d, 2H, J=10,54 Hz, pip-CH₂, pip-CH), 2,27-2,74 (m, 2H, pip-CH₂), 3,53 (s, 2H, pip-CH?), 3,97 (s, 2H, Ar-CH?) 4,32 (m, 2H, Ar-CH_?), 7,22 (d, 2H, J=8,29 Hz, Ar-H), 7,42 (d, 2H, J=8,29 Hz, Ar-H), 7,64-7,75 (m, 3H, 3xnaft-H), 7,77 (dd, 1H, ^=8,67 Hz, J₂=1,88 Hz, naft-H), 7,81-8,00 (m, 1H, naft-H), 8,02-8,18 (m, 2H, 2xnaft-H), 8,46 (d, 1H, J=1,88 Hz, NH-SO₂)

Molekulska masa : izračunana : 502.5 (C₂5H₃₁N₄O₃SCI); ugotovljena : 467 ((M-HCI)H⁺)

PRIMER 14:

terc-butil 2-{4-[(acetilamino)metil]benzil}-2-(4-morfolinilkarbonil)-1hidrazinkarboksilat

1.26 g (4.39 mmol) bis-triklorometilkarbonata raztopimo v 20 ml diklorometana in raztopino prepihamo z argonom. 2.50 g (8.53 mmol) terc-butil 2-{4[(acetilamino)metil]benzil}-1-hidrazinkarboksilata raztopimo v 30 ml diklorometana, dodali 1.65 g (12.79 mmol) diizopropiletilamina ter zmes po kapljicah dodajamo v raztopino bis-triklorometilkarbonata. Med kapljanjem reakcijsko zmes hladimo na ledeni kopeli. Nato mešamo še pol ure pri sobni temperaturi. Dodamo 2,23 ml (25,60 mmol) morfolina in mešamo še eno uro pri sobni temperaturi. Nato reakcijsko zmes ekstrahiramo s 4* 25 ml 10% raztopine citronske kisline, s 30 ml nasičene raztopine NaHCO₃, ter spiramo s 30 ml prečiščene vode in z 20 ml nasičene raztopine NaCI.

-35Organsko fazo sušimo z Na₂SO₄. Pod znižanim tlakom odparimo topilo in preostanku dodamo 10 ml dietiletra. Izpade je bela oborina, ki jo odfiltriramo s presesavanjem. Izkoristek: 1.81 g (52%)

Tališče: 125-128°C

IR (KBr, cm'¹) 3308, 2980, 2857, 1728, 1641, 1430, 1289, 1114, 1025, 873, 746, 604 H-NMR (CDCb): δ (ppm) 1,46 (s, 9H, C(CH₃)₃), 2,03 (s, 3H, CO-CH₃), 3,44 (t, 4H, J= 4,71 Hz, 2xmorf-CH₂), 3,68 (t, 4H, J=4,71 Hz, 2xmorf-CH₂), 4,43 (d, 2H, J=5,65 Hz, Ar-CH?), 4,49 (s, 2H, Ar-CH?), 5,84 (d, 1H, NH-CO), 6,27 (s, 1H, NH-COO), 7,27 (s, 4H, Ar-H)

Molekulska masa : izračunana : 406 (0₂₀Η₃οΝ₄0₅); ugotovljena : 407 ( MH⁺)

PRIMER 15:

2-{4-[(acetilamino)metil]benzil}-2-(4-morfolinilkarbonil)hidrazinijevega klorid

1,81 g (4,46 mmol) terc-butil 2-{4-[(acetilamino)metil]benzil}-2-(4-morfolinilkarbonil)1- hidrazinkarboksilata raztopimo v ocetni kislini (20 ml) in uvajamo plin HCI pol ure. Pod znižanim tlakom odparimo kislino in preostanek prelijemo z dietiletrom. S stekleno palčko drgnemo ob steni bučke dokler ne dobimo belega praška. Medtem še dvakrat odlijemo dietileter in nalijemo novega.

Izkoristek: 0.92 g (60%)

Tališče: 209-211°C

IR (KBr, cm'¹) 3427, 1685, 1560, 1432, 1274, 1112, 1022, 892, 571

H-NMR (CDCI₃): δ (ppm) 1,88 (s, 3H, CO-CH₃), 3,46 (d, 4H, J=4,90 Hz, 2xmorf-CH_?), 3,61 (d, 4H, J=4,90 Hz, 2xmorf-CH?). 4,25 (d, 2H, J=6,03 Hz, Ar-CH?). 4,50 (s, 2H, Ar-CH₂), 7,28 (s, 4H, Ar-H), 8,43 (s, NH-CO)

Molekulska masa : izračunana : 342.5 (Ci₅H₂₃N₄O₃CI); ugotovljena : 307 ((M-HCI)H⁺, 100)

PRIMER 16:

-3656

N-(4-{[1 -(4-morf ol in i Ikarboni I )-2-( 1 -nafti Isu Ifon i l)hidrazi ηο] metil}benzil)acetamid

0,92 g (2,69 mmol) 2-{4-[(acetilamino)metil]benzil}-2-(4morfolinilkarbonil)hidrazinijevega klorida) in 0,67 g (2,95 mmol) naftalen-2sulfonilklorida smo raztopili v diklorometanu (25 ml), dodali 1,04 g (8,06 mmol) diizopropiletilamina in mešali pri sobni temperaturi 3 dni. Ekstrahirali smo s 4* 25 ml 10% citronske kisline in s 30 ml nasičene raztopine NaHCO₃ in organsko fazo spirali s 30 ml prečiščene vode in s 30 ml nasičene raztopine NaCl. Sušili smo z Na₂SO₄. Pod znižanim tlakom smo odparili diklorometan in dobili smo penasto trdno snov bledo rjavorumene barve.

Izkoristek: 0.66 g (50%)

Tališče: 84-88°C

IR (KBr, cm'¹) 3426, 2856, 1655, 1420, 1340, 1274, 1166, 1114, 1024, 752, 547 H-NMR (CDCI₃): δ (ppm) 2,05 (s, 3H, CH₃), 3,14 (s, 4H, 2*morf-CH₂), 3,33-3,40 (m, 2H, morf-CH₂), 3,58-3,81 (m, 2H, morf-CH_?), 4,30 (m, 2H, Ar-CH₂), 4,41 (d, 2H, J=5,65 Hz, Ar-CHA 5,77 (s, 1H, NH-CO), 7,19 (m, 4H, Ar-H), 7,38 (s, 1H, naft-H),

7,68 (m, 2H, 2xnaft-H), 7,81 (dd, J,= 8,67 Hz, J₂=1,86 Hz, naft-H), 7,95 (m, 3H, 3xnaft-H), 8,44 (s, NH-SO₂)

Molekulska masa : izračunana : 496 (C₂5H₂₈N₄O₅S); ugotovljena : 497 ( MH⁺)

PRIMER 17:

(4-{[1 -(4-morfolinilkarbonil)-2-(1 -naftiIsulfoniI)hidrazino] metil}fenil)metanaminijev klorid

0,66 g (1,33 mmol) N-(4-{[1-(4-morfolinilkarbonil)-2-(1-naftilsulfonil)hidrazino] metil}benzil)acetamida raztopimo v 30 ml segretega izopropilnega alkohola (60°C). Dodamo 30 ml 4M HCI in segrevamo 5 ur pri temperaturi refluksa. Pod znižanim tlakom odparimo topilo. Produkt očistimo s kolonsko kromatografijo, kjer je

-37' v stacionarna faza silikagel, kot mobilno fazo pa uporabimo diklorometan : metanol (9:1).

Izkoristek: 340 mg (52%)

Tališče: 124-126°C

IR (KBr, cm’¹) 3411, 16662, 1504, 1459, 1419, 1335, 12272, 1211, 1166, 1113, 1067, 1023, 830, 754, 688, 544

H-NMR (CDCb); δ (ppm) 2,96 (m, 2H, morf-CHA 3,11 (m, 6H, 3*morf-CHA 3,97 (d, 2H, J=5,66 Hz, Ar-CH?), 4,17-4,52 (m, 2H, Ar-CH_?), 7,22 (d, 2H, J=7,53 Hz, Ar-H), 7,41 (d, 2H, J=7,92 Hz, Ar-H), 7,82-7,66 (m, 3H, 3*naft-H), 7,99-7,84 (m, 1H, naftH), 8,03-8,21 (m, 3H, 3*naft-H), 8,47 (s, 1H, NH-SO₂)

Molekulska masa : izračunana : 490.5 (C25H31N4O3SCI); ugotovljena : 455 ((M-HCI)H⁺)

Lek, tovarna farmacevtskih

Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo

Claims (8)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Spojine s formulo I

   R¹

   O)

   R³X

   N ^R² NH v kateri pomenijo

   R¹ ostanek s formulo h₂n^nr<

   ,NH, Cl kjer je R⁴ = H, alkil (Ci-C₃), OH, O-alkil (Ci-C₃), NH₂;

   R ostanek s formulo

   R⁵ R⁶ —N

   R⁷

   -N

   -N

   OOR¹¹

   V-X

   R⁸

   X \_R9 kjer je R⁵ = H, alkil (CrCa), COOR¹⁰,

   R⁶ = H, alkil (Ci-C₃), COOR¹⁰,

   R⁷ = H, alkil (θ!-θ₃), COOR¹⁰,

   R¹⁰ = H, alkil (CrC₃),

   R⁸ = H, alkil (CrCa), cikloalkil (C3-C6), R⁹ = H, alkil (Ci-C3), cikloalkil (C₃-C₆), R¹¹ = H, alkil (Ci-C₃), benzil,

   X = ch₂, o, s,

   -39i*)

   Y= NR¹², Ο, S,

   R¹²= H, COCH₃, alkil (Ci-C₃);

   R³ ostanek s formulo °' 'P

   Ά h,c.

   o,o o

   O, .o ca.....οτ-'-οο·'

   o. o ali ostanek s formulo v primeru, ko je R¹= ,νηΪοι ter njihove farmacevtsko sprejemljive soli.
2. 2. Spojine s formulo I po zahtevku 1 označene s tem, da se uporabljajo kot terapevtsko aktivne snovi.
3. 3. Postopek za pripravo spojin s formulo I po zahtevku 1 označen s tem, da

   H₂N^NR4

   a) v primeru , ko je R¹= '
4. 4-cianobenzaldehid s formulo (II)

   -40CN (H) ko

   CHO pretvorimo z BOC-karbazatom s formulo (lil) (III) v spojino s formulo (IV)

   CN

   AT

   N'

   I

   -N H (IV) ki jo nato s postopkom redukcije s katalitskim hidrogeniranjem presnovimo v spojino (V)

   CN (V)

   HN

   ΧΎ^{ΝΗ 1} o

   J ki reagira s trifozgenom in aminom s formulo (VI)

   HN

   R⁷ (VI) kjer imajo R⁵, R⁶ in R⁷ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (VII ali Vlil),

   TJ (VII) (Vlil)

   -41ali s trifozgenom in aminom s formulo (IX)

   Γ

   HN.

   ^R9 (IX) kjer imata R⁸ in R⁹ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (X),

   COOR¹¹

   HN (X) kjer ima R¹¹ enak pomen kot v formuli (I), do spojine (XI) kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I);

   ter nato zaščitno BOC skupino v spojini (XI) odstranimo s HCI (g) v HOAc pri sobni temperaturi in dobimo spojino (XII), kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I), ki reagira z aromatskim sulfonilkloridom ali naftilsulfonil-aminokislino z aktivirano karboksilno skupino do spojine (XIII)

   -4242CN kjer imata R² in R³ enak pomen kot v formuli (I), ki jo nato presnovimo s hidroksilaminom v brezvodnem etanolu do spojine s formulo (XIV)

   R¹

   I

   NH ^H2^N\^>^NR4 kjer je R¹= | , R² in R³ pa imata enak pomen kot v formuli (I), R⁴ pa predstavlja skupino OH;

   ali jo presnovimo z uvajanjem plinastega HCI v metanolno raztopino z dodatkom amonijevega acetata in ponovnim uvajanjem HCI v spojino (XV),

   R¹ r O kjer je h₂n^nr<

   R¹= ' R² in R³ imata enak pomen kot v formuli (I), R⁴ pa predstavlja vodik;

   ter v primeru

   -43b) ko je R¹=

   NH, Cl te

   4-cianbenzaldehid s formulo (II)

   CN

   CHO pretvorimo z etilenglikolom v prisotnosti 4-toluensulfonske kisline v spojino (XVI)

   CN ki jo nato reduciramo z litijevim aluminijevim hidridom v spojino s formulo (XVII) ch₂nh₂ ό

   1 (XVII) °\_/° ki reagira z acetanhidridom do spojine (XVIII) ch₂nhcoch₃ ά

   1 (XVIII)

   C> Ό ki jo z 90% metanojsko kislino pretvorimo v spojino (XIX) cho (xix) ki jo pretvorimo z BOC-karbazatom s formulo (III)

   -44(III)

   JA v spojino s formulo (XX) ch₂nhcoch₃ > (XX) >fY^{H 1} o ki jo s postopkom redukcije s katalitskim hidrogeniranjem presnovimo v spojino (XXI) ch₂nhcoch₃ (xxi)

   R⁵ R^s ki reagira s trifozgenom in aminom s formulo (VI)

   HN

   R⁷ (VI) kjer imajo R⁵, R⁶ in R⁷ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (VII ali Vlil), ^HvJ (Vil) (Vlil) ali s trifozgenom in aminom s formulo (IX)

   Γ

   HN, ^R9 (IX) kjer imata R⁸ in R⁹ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (X),

   -45^b ;oor¹¹

   H N J (^χ) kjer ima R¹¹ enak pomen kot v formuli (I), do spojine (XXII) kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I);

   nato zaščitno BOC skupino v spojini (XXII) odstranimo s HCI (g) v AcOH pri sobni temperaturi in dobimo spojino (XXIII), ch₂nhcoch₃ (XXIII) nh; _cr kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I), ki reagira z aromatskim sulfonilkloridom do spojine (XXIV) ch₂nhcoch₃ o

   (XXIV)

   R2

   I ,NH

   R* kjer imata R² in R³ enak pomen kot v formuli (I) ter jo nato presnovimo s segrevanjem ob vrenju v 5M HCI v spojino (XXV)

   R’

   O (XXV)

   -46kjer je R¹= , R² in R³ pa imata enak pomen kot v formuli (I).

   4. Uporaba spojin s formulo I za pripravo zdravil z antikoagulantnim delovanjem.
5. 5. Farmacevtski pripravki, označeni s tem, da vsebujejo terapevtsko učinkovito množino spojine s formulo I po zahtevku 1 in farmacevtsko sprejemljive pomožne snovi.
6. 6. Farmacevtski pripravki po zahtevku 5 označeni s tem, da se uporabljajo kot antikoagulanti.
7. 7. Farmacevtski pripravki po zahtevku 5 označeni s tem, da se uporabljajo za zaviranje trombina v krvi človeka in drugih sesalcev.
8. 8. Farmacevtski pripravki po zahtevku 5 označeni stem, da se uporabljajo za zaviranje nastanka fibrina in trombusov v krvi človeka in drugih sesalcev.

   Lek, tovarna farmacevtskih in kemičnih izdelkov, d.d.

   Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo