SE531588C2 - Sätt att detektera tidigare etanolintag - Google Patents

Description

25 35 531 E88 ax; (Alling et al., som ersätter kolindelen i fosfatidylkolin med etanol. Reak- tionen visas i fig. l. 1983). Reaktionen katalyseras av fosfolipas D Studier har stött användning av Peth i blod som en markör för alkoholmissbruk (för översikt, se Var- ga et al., 2001). (1998) (1998) har beskrivit ett sätt där Peth bestäms direkt i blod.

I sättet isoleras en lipidfraktion för blod och Peth separe- Gunnarsson et al. och Varga et al. ras fràn andra föreningar med vätskekromatografi och detekte- ras med masspektrometri eller evaporativ ljusspridningsdetek- tering. Ett dagligt intag av endast 50 g etanol under 2-3 veckor (1000 g kumulativt) behövs för att Peth skall vara po- sitivt (> gräns för detektering) i blod vid mätning med väts- kekromatografi och evaporativ ljusspridningsdetektering. I två färska studier, vilka vardera använder ett väsentlig bat- teri av olika markörer, demonstreras en extraordinär hög spe- cificitet för Peth när nyktra försökspersoner fràn kända al- koholpatienter undersöks (Wurst et al., 2003 och Wurst et al., 2004).

Gaskromatografi med masspektrometri som kräver derivatisering av Peth har också använts för Peth-analys.

Inget av de ovan nämnda sätten för att analysera Peth har hög känslighet vid detektering av alkoholkonsumtion. Vidare gör den stora mängden arbete och komplexitet sätten olämpliga för kliniskt rutinarbete. Detta innefattar uttagande av flera milliliter venöst blod i provtagningsrör, ett förfarande som måste utföras av en tränad fackman.

Immunanalysmetoder: En antikropp har framställts mot fosfati- dylalkohol (US 2004/0203070) vilket möjliggör en väsentligt enklare analys för att detektera hög konsumtion av alkohol.

Denna antikropp är emellertid inte specifik mot Peth eftersom den också binder till andra fosfolipider. Känslighet och spe- cificitet kan sålunda ifrågasättas liksom även den praktiska användningen av denna immunanalys. (_71 l0 15 20 25 30 35 531 538 iQ» Fortfarande har inte ett sätt som uppfyller alla viktiga krav utvecklats.

Kapillärelektroforesmetodik (CE-metodik) för separationen och bestämningen av Peth. Ett sätt baserat har nu utvecklats på CE för Peth är inte en okomplicerad lösning av ett problem och är oväntat. Peth är en onormal fosfolipid med ovanliga kemiska egenskaper och kräver speciella organiska lösningsme- del för upplösning. Molekyler som skall analyseras med CE kräver i allmänhet att de är laddade vilket gäller för Peth först vid högre pH. Ultraviolett (UV) en relativt dålig detekteringsmetod för fosfolipider eftersom detektering anses som dessa molekyler har begränsade ljusabsorberande delar i sin struktur. Det satt som nu har utvecklats omfattar icke-vatten- haltiga media, stapling och konventionell UV-detektering.

Peth bestäms i extrakt av humana blodprov. Separation av Peth från andra föreningar i provet utförs inom mindre än 5 min.

Sättet underlättar mindre provvolymer, mikroliter istället för milliliter av blod och utförs omkring 10 gånger snabbare jämfört med tidigare kromatografiska metoder. Det beskrivna CE-sättet erbjuder provtagning av prov i kapillär istället för provtagning in i vanliga vakuumblodprovsrör.

Fördelar med sättet enligt uppfinningen jämfört med tidigare teknik innefattar högsta möjliga specificitet tillsammans med hög känslighet, mycket små provvolymer och förbättrad snabb- het.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett sätt för att be- stämma alkoholkonsumtion från ett kroppsprov från människa och/eller icke-humant djur. Sättet enligt uppfinningen karak- teriseras av att Peth bestäms från provet med hjälp av ljus- detektering, varvid närvaron och nivån av Peth i provet kor- relerar med människan och/eller det icke-humana djurets eta- nolkonsumtion. En ny analytisk kemisk separationsmetod för 10 25 30 35 E34 EEE Peth presenteras. För första gången har en kapillär elektro- foresseparationsmetod för Peth utvecklats.

Huvudaspekten för uppfinningen avser ett sätt i vilket Peth separeras och koncentreras on-line, benämnt "stapling”, genom användning av kapillärelektrofores med specificerade kemiska lösningar, benämnda ”separationsmedia”.

Kort beskrivning av ritningarna Fig. l: Bildning av fosfatidyletanol.

Fig. 2: Elektroferogram av Peth-analys.

Fig. 3: Illustration av staplingseffekt.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Ett sätt för att beskriva etanolintag i en människa OCh/eller ett icke-humant djur från ett biologiskt prov, där fosfatidyl- etanol bestäms från provet med hjälp av kapillärelektrofores, varvid närvaron eller nivån av fosfatidyletanol i provet kor- relerar med människans och/eller det icke-humana djurets eta- nolintag. Den idé som ligger bakom föreliggande uppfinning är att en kapillärelektroforesmetod för Peth nu har utvecklats framgångsrikt. Man har oväntat funnit att en kapillärelektro- foresmetod leder till ett känsligare och mycket snabbare sätt att bestämma Peth i biologiska prov. Bestämningen av tidigare alkoholintag i biologiska prov genom detektering och kvanti- fiering av Peth med föreliggande sätt kräver förbehandling av prov genom extraktion, mest vanligtvis utförd med organiska lösningsmedel. Detta är nödvändigt eftersom Petb i biologiska prov förekommer antingen bunden till cellmembran, lipoprotei- ner, andra partiklar eller i form av lipidvesiklar och sålun- da màste frisättas för att förekomma som upplösta fria mole- kyler. Efter extraktion utförs vanligtvis ett koncentrations- steg på provet genom indunstning.

Fram till nyligen har tensider använts i elektrofores för att separera hydrofoba föreningar såsom fosfolipider, varvid tek- l0 20 25 30 35 531 538 niken kallas micellar elektrokinetisk kromatografi (MEKC).

Några få publikationer har beskrivit användningen av icke- vattenhaltig kapillärelektrofores (NACE) fosfolipider. för separation av Ett sätt där icke-vattenhaltig kapillärelektrofores tillsam- mans med stapling erhàllen genom att sänka jonstyrkan i pro- vet används för att bestämma Peth. Kapillären är ett cylind- riskt rör för vilket längden kan vara mellan l och 50 cm och innerdiametern kan vara mellan l och 100 pm. Bestämningen av Peth utförs med UV-detektering. Uppfinningen beskriver för första gången e:t sätt där NACE tillsammans med stapling an- vänds för separation av en lipidförening. Huvudfördelen med uppfinningen är att laddade lipidföreningar såsom fosfolipi- der och Peth kan separeras elektroforetiskt och detekteras vid tillräcklig: låga nivåer (0,05-5 uM) med konventionell UV-detektering. UV-detektering anses som en enkel standardde- tekteringsmetod med låg känslighet för lipider. Eftersom mer eller mindre alla kommersiella CE-enheter är utrustade med en UV-detektor erbjuder uppfinningen omedelbar användning med de flesta enheter. I sättet består separationsmediet av en elek- trolyt som är ammoniumformiat, ammoniumacetat, ammoniumpropi- onat eller en blandning av två eller tre av dessa alternativ.

Separationsmediet innehåller inget vatten. Provinförande kan utföras hydrodynamiskt eller elektrokinetiskt. Separations- spänningen kan variera mellan 40 V/cm och 5000 V/cm. i samband med uppfinningen betyder om ledningsförmågan i det införda provet, Stapling innehållande Peth, är lägre än den för elekt- rolytlösningen. I uppfinningen åstadkommes detta genom en lägre koncentration av elektrolyt (lägre jonstyrka) i det in- förda Peth-provet jämfört med elektrolytlösningen. Effekten av stapling i uppfinningen förbättrar detekteringsgränsen med l80-250 gånger jämfört med ett liknande system utan stapling.

Sättet att bestämma fosfatidyletanol är avsett speciellt för att detektera och övervaka ohämmat intag och hög konsumtion av alkohol på ett tillförlitligt sätt. 10 15 20 25 30 35 531 588 Sättet i följande exempel är optimerat för att mäta Peth i humana blodprov.

Exempel: Blodprovstagning Antingen kapillärt eller venöst humant blod uppsamlas i ett blodprovtagningsrör innehållande antikoagulant.

Beredning av blodprov För humana blodprov tillsätts en volym blod under omrörning till 33 volymer hexan:2-propanol (3:2 volym/VOlym) OCÖ fÖï5 om vidare under 5 s. Centrifugering av blandningen utförs vid 1500 x g under 10 min och supernatanten uppsamlas för fort- satt analys.

Peth-standardlösning och humana blodextrakt indunstas under kväve till torrhet och löses upp i separationsmedium före analys.

Instrumentutrustning NACE-separationer utförs på ett kapillarelektröforessystem utrustat med UV-detektor. En kapillär av smält kiseldioxid med 75 um innerdiameter, 375 um ytterdiameter med en total längd av 24 cm (17,2 cm till detektor) används.

Separationsbetingelser 40 till 60 % acetonitril och 26-40 % 2-propanol med 60-90 mM ammoniumacetat som elektrolyt och med 5-15 % hexan och 2-10 % metanol som ytterligare modifierare används som separations- medium. Anmärkning: Inget vatten är inkluderat, sålunda NACE.

Proven är upplösta i separationsmediet med undantag för att Denna 30-50 mM ammoniumacetat används istället. Anmärkning: 10 15 20 25 30 531 538 ...,;_¿ reduktion av elektrolyt, som sänker jonstyrkan, orsakar prov- stapling. Proven införs hydrodynamiskt vid 34 mbar under 2-4 s men kan också införas elektrokinetiskt. är 3-8 nl. UV-detektering utförs vid 200 nm. Separationsspän- ningen är 10-20 kV.

Injektionsvolymen Separationer körs mot negativ pool. Ka- pillärtemperaturen är inställd på 25°C i körningar. Före dag- lig användning sköljs kapillären successivt med > 100 volymer av 0,5 M natriumhydroxid, destillerat vatten, metanol respek- tive separationsmedium. Mellan körningarna sköljs kapillären med 8 volymer separationsmedium. Alla lösningar avgasas i ett ultraljudvattenbad.

Ett sätt där närvaron eller nivån av Peth i det biologiska provet bestäms via ett mikrochip Det beskrivna sättet kan miniatyriseras till mikrochipformat.

Detta betyder nedskalning av förfaranden, speciellt separa- tionen av Peth i en anordning i vilket längden för separa- tionskanalen är < 5 cm och den inre vidden för denna kanal är < 50 um.

Ett sätt där närvaron eller nivån av Peth kan bestämmas i det biologiska provet som har en volym mindre än 100 pl och/eller vikt mindre än 100 pg En stor fördel med sättet är möjligheten att analysera mycket små mängder och volymer av biologiska prov. Skada och lidande kan minskas i människor och icke-humana djur vid borttagandet av mindre prov. Andra fördelar är minskat arbete och att provtagning kan utföras av oprofessionella.

Ett sätt där Peth bestäms i vilket biologiskt prov som helst med potential att innehålla Peth, t.ex. blod, vävnader, celler Detta är för att uppvisa riskabelt och skadligt drickande.

Konsumtion överstigande 24 doser alkohol i man och 16 doser alkohol i kvinnor per vecka eller alternativt mer än 7 doser i män och mer än 5 doser i kvinnor vid ett enda tillfälle kan anses som hög alkoholkonsumtion. En dos motsvarar omkring 12 lO 20 25 30 35 53% E33 g ren etanol. Sättet kan också användas för att finna och studera alkoholrelaterade sjukdomar.

Screening och/eller övervakning av intaget av etanol i en människa via sättet I närvaro av alkohol i kroppen inkorporeras en etanolmolekyl i fosfolipider i en reaktion katalyserad av fosfolipas D där vanligtvis vatten inkorporeras. Mängden fosfatidyletanol i kroppen korrelerar med alkoholkonsumtion.

Det sätt där sättet utförs 1 till 7 dagar, veckor eller måna- der efter etanolintag Detekterbar fosfatidyletanol förblir i kroppen under minst en till flera dagar efter konsumtion, till och med två veckor i några fall, beroende på nivån vid starten for nykterhet. Des- sa tidsramar beror emellertid på sättets känslighet och kan sålunda förändras närhelst en känsligare metod utvecklas.

Det sätt där närvaron eller nivån av Peth mäts i mer än en typ av prov Ett prov som skall undersökas kan vara vilket biologiskt prov som helst med potential att innehålla Peth; blOd, nader eller celler. eïï me* t.ex. väv- Provet kan också vara en biopsi, dikolegalt prov, ett post mortem-prov eller ett prov taget från vävnader av ett embryo eller foster. Indirekt kan det också användas för att detektera aktiviteten och placeringen av fosfolipas D, exempelvis från cell- eller vävnadskulturer eller histologiska prov.

Det sätt där sättet kombineras med åtminstone ett andra sätt för att bestämma etanolintag i en människa och/eller icke- humant djur 10 15 20 25 30 35 53'§ 588 (fi Situationer kan förekomma där Peth ensam inte är tillräcklig för att bestämma etanolintag eller vid tillfällen där Peth behöver bekräftas genom något annat sätt.

Sättet omfattar vidare korrelering av etanolintaget och/eller nivån av Peth som bestäms i kroppsprovet till en nivå av Peth detekterad i ett livsmedel, livsmedelsliknande substans, dryck eller medicinering förtärd av människan och/eller det icke-humana djuret före eller vid tidpunkten för erhållandet av kroppsprovet Markören Peth kan snart komma att ha viktig delaktighet i om- råden för allmän hälsa och allmän säkerhet som en mer objek- tiv metod för att bekräfta alkoholreiaterade sjukdomar, för- hindra missbruksutveckling och förhindra trafikolyckor och våldsbeteende. Användningen av denna markör, antingen ensam eller tillsammans med andra markörer för biologiskt till- stånd, förväntas leda till väsentlig förbättring i behand- lingsresultat, terapieffektivitet och hälsa, sociala och so- cioekonomiska fördelar som kommer att vara svåra att över- skatta.

Definition: ”Peth” i samband med uppfinningen betyder den fosfatidyletanolmolekyl i vilken de båda fettsyradelarna kan variera men huvudsakligen består av 1620 (palmitinsyra), l8:O (stearinsyra), l8:l l8:2 och 20:4 (oljesyra), (linolsyra) (arakidonsyra).

Definition: ”Stapling” i samband med uppfinningen betyder om ledningsförmågan för det införda provet är lägre än den för elektrolytlösningen att den högre elektriska fältstyrkan och de högre migreringshastigheterna för provkomponenterna resul- terar i att provzonerna skärps när de kommer in i elektrolyt- lösningen. 531 588 lill* Referensförteckning Hannuksela, M.L., Liisanantti, M.K., Nissinen, A.E.T., Savolainen, MJ. (2007) Biochemícal markers of alcoholism. Clin. Chem. Lab. Med. 45, xxx-xxx.

Laposata, M. (1999) Assessment of ethanol intake-current tests and new assays on the horizon. Am J Clin Pathol 112: 443450 ' Alling, C., Gustavsson, L., Änggård, E. (l 983) An abnormal phospholipid in rat organs añer ethanol.

F EBS Lett. 152, 24-28.

GunnarssonjT., Karlsson, A.,“Hansson, P., Johnson, G., Alling, C., & Odham, G. (1998) Determinatíon of phosphatidylethanol in blood from alcoholic-males using high-performance liquid chromatography and evaporative light scattering or electrospray mass spectrometric detection, J .Chromatogi-.B Biomed. Sci. Appl. 705: pp. 243 to 249.

Varga, A., Hansson, P., Lundqvist, C., & Alling, C. (1998) Phosphatidyletltanol in blood as a marker of ethanol consumption in healthy volunteers: comparison With other markers, Alcohol Clm. Exp. Res. 22: pp. 1832 to 1837.

Varga A Moller K, Hanson P Aradottir S, Alling C (2001) Phosphatidylethanol; clinical significance and biochernical basis. In New and upcoming markers of alcohol consumption. Wurst F. M. (ed) Darrnstadt, Steinkopff-Springer Verlag, pp 75-92 Wurst F M, Vogel R, J achau K, Varga A, Alling C, Alt A, Skipper G E (2003) Ethylglucuronide discloses recent covert alcohol use not detected by standard testing in forensic psychiatnc inpatients.

Alcoholism Clinical and Experimental Research 27: 471476 Wurst F M, Alexson S, Wolfersdorf M, Bechtel G, Forster S, Alling C, Aradottir S, Jachau K, Huber P, Allen J P, Auwärter V, Pragst F (2004) Concentration of fatty acid ethyl esters in hair of alcohohcs: Comparison to other biological state rnarkers and self reported ethanol intake. Alcohol Alcohol 39z33~ 3 8

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 531 583 PATENTKRAV - Ändrade

1. Sätt att detektera etanolintag i en människa och/eller icke-humant djur från ett biologiskt prov, där fosfatidyletanol (Peth) bestäms från provet med hjälp av kapillärelektrofores, varvid närvaron eller nivån av Peth i provet korrelerar med etanolintaget för människan och/eller det icke-humana djuret.

2. Sätt enligt krav 1, där icke-vattenhaltig kapillär elektrofores tillsammans med stapling, erhållen genom att sänka jonstyrkan i provet, används för att bestämma Peth.

3. Sätt enligt krav 1, biologiska provet bestäms via ett mikrochip. där närvaron eller nivån av Peth i det

4. Sätt enligt krav 1, där närvaron eller nivån av Peth kan bestämmas i det biologiska provet som har en volym mindre än 100 pl och/eller en vikt lägre än 100 pg.

5. Sätt enligt krav l, där Peth bestäms i något biologiskt prov med potential att innehålla Peth, inkluderande blod, vävnad eller celler.

6. Screening och/eller övervakning av intaget av etanol i en människa via sättet enligt krav 1.

7. Sätt enligt krav 1, där sättet utförs 1 till 7 dagar, veckor eller månader efter etanolintag.

8. Sätt enligt krav 1, där sättet kombineras med minst ett andra sätt för att bestämma etanolintag i en människa och/eller ett icke-humant djur.

9. Sätt enligt krav 1, i mer än en typ av prov. där närvaron eller nivån av Peth mäts 10 512V! 538

10. Sätt enligt krav 1, vilket dessutom omfattar: korrelering av det etanolintag och/eller den nivå av Peth som bestäms i kroppsprovet med en nivå av Peth detekterad i ett livsmedel, livsmedelsliknande substans, dryck eller medicinering förtärd av människan och/eller det icke-humana djuret före eller vid tidpunkten för erhållandet av kroppsprovet.