SE454514B - Intestinal deggdjurshormonprekursor samt kompositioner innehallande denna - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 454 514 2 retiner när det gäller stimulering av sekretionen av bikarbonat genom pankreas hos anestiserad katt ( Mutt, V. och Söderberg, U.

On the assay of secretin. Ark.Kem. 15, 63-68, 1959).

I föreliggande framställning är de förkortningar som använ- des för karakterisering av aminosyrorna och deras rester de tra- ditionella sàsom de återfinnas exempelvis i verket Organic Chemist- ry, andra utgåvan, Ralph J. Fessenden & Joan S. Fessenden, Willard Grant Press, Boston, Mass., sidorna 852 och 853.

På samma sätt som de kända naturliga sekretinerna finner di- agnostisk användning är sekretinprekursorerna enligt föreliggande uppfinning högst användbara vid bestämning av pankreas- och gall- blåsfunktioner. Enligt denna sida av uppfinningen innefattar en komposition för diagnostisk användning i detta avseende en effek- tiv diagnostisk mängd av sekretinprekursorn enligt föreliggande uppfinning i kombination med en bärare, som ej inverkar störande på den använda diagnostiska proceduren. r Sekretinprekursorn enligt föreliggande uppfinning är dessu- z tom terapeutiskt användbar, i det att den stimulerar pankreatisk sekretion hos däggdjur om den administreras på lämpligt sätt. En- ligt denna sida av uppfinningen åstadkommes en komposition för sà- dan användning innefattande en effektiv terapeutisk mängd av sek- retinprekursorn enligt uppfinningen i kombination med en ogiftig, farmaceutiskt acceptabel bärare. I detta sammanhang innefattar upp- finningen även ett förfarande för behandling av gastrointestinala störningar innefattande administration av en terapeutiskt effektiv mängd av sekretinprekursorn enligt föreliggande uppfinning eller en komposition enligt föreliggande uppfinning på en patient som skall behandlas.

Föreliggande uppfinning innefattar sålunda inom sin ram far- maceutiska kompositioner, vilka innefattar den intestinala dägg- djurshormonprekursorn enligt föreliggande uppfinning i förening med en farmaceutiskt acceptabel bärare. Vid klinisk praxis admini- streras kompositionerna enligt föreliggande uppfinning normalt parenteralt genom det faktum, att hormonprekursorn såsom varande en peptid är känslig för biologiskt aktiva omgivningar. Oral el- ler rektal administration kan emellertid vara tänkbar under an- vändning av kompositioner av typen slow release som gör det möj- ligt för den aktiva bestàndsdelen att uppnå stället för det pri- mära intresset, nämligen tunntarmen. 10 15 Z0 25 30 35 454 514 Beredningar enligt uppfinningen för den föredragna paren- terala administrationen innefattar sterila vatten- eller vatten- fria lösningar, suspensioner eller emulsioner. Exempel på vatten- fria lösningsmedel eller suspenderingsmedia är propylenglykol, vegetabiliska oljor, såsom olivolja, och injicerbara organiska estrar, såsom etyloleat. Dessa kompositioner kan även innehålla adjuvantia, såsom konserverings-, våt-, emulger- och disperger- ingsmedel. De kan vara steriliserade exempelvis genom filtrering genom ett bakteriekvarhållande filter, genom införlivning av ste- riliseringsmedel i kompositionen, genom bestrålning eller genom upphettning. De kan även framställas i form av sterila fasta kom- positioner vilka kan upplösas i ett sterilt injicerbart medium o- medelbart före användning. Kompositionen kan såväl som via den van- ligare íntravenösa intramuskulära vägen även administreras genom intraartikulär injektion.

Procenttalen av den aktiva beståndsdelen i kompositionen en- ligt uppfinningen kan varieras så länge som de utgör en sådan an- del, att en lämplig dos för önskad stimulerande effekt på pankreas erhålles. Uppenbarligen kan flera enhetsdosformer administreras vid ungefär samma tidpunkt. Kompositionerna innehåller i allmänhet från 0,1% till ca 80 viktprocent aktiv beståndsdel.

Den allmänna dosen beror pà den önskvärda stimulerande ef- fekten, admínistrationssättet och behandlingens varaktighet. Hor- monprekursorn enligt föreliggande uppfinning kan administreras varje dag eller i enlighet med läkarens önskemål mindre ofta, ex- empelvis en gång i veckan.

Föreliggande uppfinning innefattar även ett förfarande för stimulering av pankreatisk sekretion hos en patient som lider av gastrointestinal störning, och denna metod innefattar administre- ring på patienten en mängd av hormonprekursorn eller komposition enligt uppfinningen tillräcklig för att bekämpa sådan störning.

Uppfinningen kommer att ytterligare illustreras nedan i ett exempel som beskriver isoleringen och karakteriseringen av CH sekretínprekursor enligt föreliggande uppfinning.

EXEMPEL Utgångsmaterialet Den övre delen av porcintarmen kokades, frystes och sönder- delades. Det erhållna pulvret extraherades med 0,5 M ättiksyra, och peptiderna adsorberades på alginsyra. Därefter utfördes elu- 10 15 20 25 30 35 454 514 ering med 0,2 M HC1 och utfällning med NaCl. Det erhållna elua- tet gelfiltrerades på Sephadex G25 (Pharmacia Fine Chemicals) i 0,2 M ättiksyra. Extraktion utfördes med metanol, och lösliga ma- terial utfälldes med eter. Den erhållna lösningen gelfiltrerades på Sephadex G25 (Pharmacia Fine Chemicals) i 0,2 M ättiksyra. Den bildade lösningen underkastades jonbytarkromatografi på CM-cellu- losa, och eluering utfördes sedan med 12,5 mM fosfatbuffert vid ett pH av 8. Med avseende på detaljer i proceduren se Said, S.I. och Mutt, V. Isolation from porcine-intestinal wall of a vasoac- tive octacosapeptide related to secretin and to glucagon. Eur.J.

Biochem. 28, 199-204, 1972.

Eluatet underkastades vidare tvâ ytterligare CM-kromatogra- fier. I den första utfördes eluering i en 0,02 M fosfatbuffert vid pH 6,4 med en saltgradient av 0-0,3 M NaCl. En fraktion eluerande vid ca 0,15 M NaCl kromatograferades ytterligare på en andra CMC- kolonn eluerad med en stegvis gradient vid pH 8 i NH4HCO3 vid oli- ka koncentrationer.Den fraktion som här kallas "utgângsmaterial" eluerades med 0,04 M NH4HC03 från denna kolonn. Utgångsmaterialet -renades ytterligare med högeffektiv vätskekromatografi (HPLC).

HPLC HPLC med omvänd fas utfördes i en /ußondapak C18 kolonn (7,8 x 300 mm) eller en LKB Ultropac TSK ODS-120T kolonn (3,9 x 300 mm) med 0,12% trifluorättiksyra (TFA) i vatten och 0,1% TFA i acetonitril som rörliga faser. Jonbytarkromatografi utfördes i en LKB Ultropac TSKS35 CM-kolonn (7,5 x 150 mm) med 0,02 natrium- fosfatbuffert vid pH 6,4 och en NaCl-gradient av från 0 till 0,3 M NaCl. Både reversfas- och jonbytar-HPLC utfördes med ett instru- ment från Waters Associated.

Biologisk aktivitet_ Den biologiska aktiviteten uppmättes genom förmågan att sti- mulera sekretion av alkali i pankreasvätskan hos anestiserad katt (Mutt, V. och Söderberg, U. On the assay of secretin. Art.Kem. 15, 63-68, 1959). Provet jämfördes med en sekretin standard med en fastställd aktivitet av 3500 enheter per mg.

Proteolytisk fragmentering Peptiden uppslöts med TPCK-behandlat trypsín i 6 timmar el- ler TLCK-behandlatchymotrypsin i 4 timmar i 1% NH4HCO3, pH 8 i rumstemperatur. Förhållandet peptid till enzym var 50:1 räknat på vikten. Enzymerna var inköpta från Worthington (trypsin) och 10 15 20, 25 30 35 454 514 Merck (chymotrypsin). De proteolytiska fragmenten separerades genom HPLC med revers fas i en /ußondnmk C18 kolonn såsom beskri- vits ovan. De använda gradienterna var för trypsinfragment 0-40% acetonitril i TFA i 40 minuter vid en strömningshastíghet av 1 ml per minut och för chymotrypsinfragment 10-25% acetonitril i TFA i 30 minuter vid en strömníngshastíghet av 1 ml per minut.

Analys av aminosyrasammansättning Hydrolys utfördes i evakuerade rör innehållande 6M HCI med 0,1% B-merkaptoetanol vid 110°C i 24 timmar. Alla hydrolysat ana- lyserades i en Beckman 121 aminosyraanalysator bortsett ifrån tryp- sínuppslutningarna, vilka analyserades i ett amínosyraanalyssystem från Waters Assocíated under användning av förkolonnderivatisering med 0-phtalaldehyd (OPA) (Roth, N. Analytical Chemistry 43, 880- , 1971).

Identifikation av fritt arginin Trypsinuppslutníngsblandningen behandlades med PITC (Koop, D.R. Morgan, E.T., Tarr, G.E. och Coon, M.J. J.Biol.Chem. 257, 8472-8480, 1982) till bildning av fenyltiokarbamylderivatet av de fragment som bildats under trypsinuppslutningen av sekretinvari- anten. Blandningen av trypsinpeptider och eventuellt fri PTC-amí- nosyra kördes sedan på en Spherisorb C18 kolonn (3/u) i ett HPLC- system för separation av PTC-aminosyror. Det använda systemet var det som beskrives av Heinrikson och Meredith (Heinrikson, R.L., och Meredith, S.C. Analytical Biochem. 136, 65-74 1984).

RESULTAT Under reningen av VIP och efterforskning av variantformer av detta (Dimaline, R. och Dockray, G.J. Multiple immunoreactive forms of vaso-active intestinal peptíde in human colonic mucosa.

Gastroenterology 75, 387-392, 1978) observerades en viss fraktion ha sekretin- snarare än VIP-liknande bioaktivitet.

Den slutliga reningen av sekretinvarianten eller prekursorn från utgángsmaterialet erhöllas genom tre HPLC-kromatografier.

Det första HPLC-steget var kromatografi med revers fas i en /uBon- dapak C18 kolonn under användning av en gradient av 32-38% i 0,12% TFA, 30 minuter vid en strömníngshastighet av 2 ml per minut. Kro- matogrammet visas i fig. 1. Den aktiva fraktionen underkastades vi- dare ett jonbytar~HPLC-steg i en LKB Ultropac CM kolonn eluerad med en gradient av 0,12 till 0,3M NaCl i en 0,02 M fosfatbuffert pH 6,4 i 15 minuter och isokratísk eluering vid 0,3 M NaCl i sam- 10 15 20 25 30 35 454 514 ma buffert under ytterligare 15 minuter. Strömningshastigheten var 1 ml per minut. Avsaltning genom HPLC i revers fas under an- vändning av en LKB Ultropac ODS kolonn gav även viss rening (fig.2) och den isolerade peptiden ansågs vara ren efter detta steg. Ak- tiva fraktioner identífierades med bioessay för sekretin (beskri- vet under "Utgángsmateríalet") genom reningsproceduren.

Den totala aminosyrasammansättningen för den intakta pepti- den visas i tabell 1. Jämförelse av denna aminosyrasammansättning med den för sekretin anger, att den isolerade peptiden skiljer sig från porcint sekretin genom att det innehåller en Lys-rest och en ytterligare rest vardera av Arg och Gly. För att undersöka om den renade peptiden är en variantform av sekretin utfördes trypsin- uppslutning av densamma och de erhållna fragmenten separerades med HPLC i revers fas. Kromatogrammen för trypsinfragmenten av den re- nade peptiden och av sekretin visas i fig. 3 och 4. Endast ett frag- ment eluerade vid olika positioner i de två kromatogrammen. Detta fragment motsvarade det C-terminala fragmentet TS såsom visas ge- nom aminosyrasammansättningen. Varje trypsinfragment av den isolera- de peptiden hydroliserades och underkastades analys med avseende på total aminosyrasammansâttning. Aminosyrasammansättningarna av tryp- sinpeptiderna visas i tabell 3. C-terminalfragmentet av peptiden, TS, innehåller en extra Gly- och en Lys-rest jämfört med motsvaran- de fragment av sekretin, under det att de andra fragmenten (T4-TS) är identiska med sekretinfragmenten. Chymotrypsinnedbrytning av sek- retin och av den isolerade peptiden utfördes parallellt och ledde i båda fall till ett flertal fragment. Med ett undantag visades je fragment av peptiden vara identiskt med ett fragment i sekretin V81'- och vice versa.

Aminosyrasammansättningen av de två icke identiska fragmenten bestämdes (tabell 2). Sammansättningen för sekretinfragmentet var Gly1, Glx1, Leuï, Valï, vilket otvetydigt visar att det represente- rar den C-terminala Gln-Gly-Leu-Val-NH2-sekvensen av sekretin. Sam- mansättningen för polypeptidfragmentet var Arg1, Glyz, Glx1, Leuï, Lysï, Valï indikerande sekvensen Gln-Gly-Leu-Val-Gly-Lys-Arg. Er- farenheterna anger följaktligen att polypeptiden bestod av sekretin förlängd C-terminalt med Gly-Lys-Arg. Om så är fallet bör fritt ar- ginin avspjälkas från densamma vid trypsinnedbrytning och detta vi- sades även vara fallet; en trypsinuppslutning derivatiserade med PITC (Koop, D.R., Morgan, E.T., Tarr, G.E. och Coon, M.J. J.Bio1. 10 15 ~a 454 514 Chem. 257, 8472-8489, 1982) och applícerades på ett HPLC-system för detektering av PTC-aminosyror. Samtliga fem trypsinpeptid- derivat och fritt PTC-argínin kunde härvid detekteras.

Ovanstående data visar, att den isolerade polypeptiden enligt uppfinningen är en varíantform av sekretin med en C-ter- minal förlängning med Gly-Lys-Arg. Detta står i god överensstäm- melse med kunskapen att i peptídhormonperkursorproteiner en gly- cinrest átföljd av parade basíska rester vanligen representerar amíderhgs- resp. spjälkníngssignaler.

En ren sekretinprekursor testades med avseende på bioakti- vitet i ovan beskrivet sekretinbíoessay. Såsom visas i fig. S är sekretin-Gly-Lys-Arg ca 1,5 gång aktivare än sekretinet självt.

Det bör observeras, att uppfinningen ej är begränsad till de konkreta detaljer och kännetecken hos ovan beskrivna exempel och att modifikationer kan utföras på polypeptidstrukturen utan att man avviker från uppfinningsidén. Uppfínningen är sålunda ej begränsad på annat sätt än enligt omfattningen av bílagda patent- krav. 454 514 TABELL 1 Aminosyrasammansäçtning av sekretínvarianten. Värdena är nol- förhállanden utan korrigering för förstöríng, ofullständig hydrolys eller förorening. Siffrorna inom parentes represen- terar de förutsagda antalen av varje aminosyra i sekretínva- rianten.

Amínoszra I Sekretinvariant Sekretin Lys 1.1 (1) - His 1.3 (1) 1 Arg 4.9 (S) 4 Asx 2.1 (Z) 2 Thr 1.8 (2) 2 Ser 3.3 (4) 4 Glx 3.0 (3) 3 sly 3.0 (s) z Ala 1.2 (1) 1 Val 1.0 (1) 1 Leu 6.0 (6) 6 Phe 1.0 (1) 1 Totalt 30 27 454 514 N. ..-°. - - - - - ... ...o 2...

... ... S. o... 2. o.. - 2. ... ... o.. _ å.. ... ...o ... o.. - 1 - | .š .. - - . ... o.. - - S.. ... o.. ... .... - 1 - ... o.. ...w 2. N.. ... n.. ... N.. - - ... o.. å.. 9 - 1 - ... ...o - 2.. ...N Sw - - - - - 2. o.~ 2... - - - o 2. o.. - ... m.. ä..

T. o... | ... ...o 2. o... 2. o... 2. ...o 9:. - .. - - - 2. ...o m...

, T. ...o T. o.. - | - - E... 9 - mhwm |awmm»am%%%%% mh vb mh wæ .H |oGfiE< wcwëwmnwnfluouxøm ww:æuæ>m uuoä w hoaæwoøfifim umflwudm am wuwcmhmm Eon. wcnonwwflw .wcfinwwouæw noflfiø mßfiohvßn wfiwcmum uflfiøwo .wcwumuwumm Hmm Gofiuxwwhox :mus cwmcwfifimshwwfioä hm mGowwm> .nmuømfinm>=fiuvuMow mon umufimäwmwwcfimmzuuoëßnu mfimøfisumuno Hmm :oo Gmucøswmuwcwwmxhu >m .mwflEbuwm:mEEwmmu%modHE< N AAmm

Claims (11)

454 514 PATENTKRAV

1. Intestinal daggdjurshormonprekursor, k a n n e - t e c k n a d av följande peptidstruktur: His-Ser-Asp-Gly-Thr-PherThr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-L-M- Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-Gly-N-0, vari L är Glu eller Asp, M ar Gly eller Ser och N och 0 ar ut- valda bland Lys och Arg.

2. Hormonprekursor enligt patentkravet 1, k a n n e - t e c k n a d därav, att L år Glu och M är Gly.

3. 5. Hormonprekursor enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a d därav, att L är Asp och M är Ser.

4. Hormonprekursor enligt något av patentkraven l till 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att N är Lys och 0 är Arg.

5. Hormonprekursor enligt något av patentkraven l till 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att N är Arg och O är Lys.

6. Hormonprekursor enligt något av patentkraven l till S till diagnostisk användning för bestämning av pankreas- eller gallblåsfunktion.

7. Hormonprekursor enligt något av patentkraven 1 till S till terapeutisk användning för att stimulera pankreatisk sekre- tion hos däggdjur innefattande människan.

8. Hormonprekursor enligt patentkravet 4 eller S till tera- peutisk användning för att stimulera pankreatisk sekretion hos människan.

9. Komposítion för användning vid stimulering av pankrea- tisk sekretion hos däggdjur innefattande människan, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den innefattar såsom aktiv komponent en effektiv terapeutisk mängd av en intestinal dâggdjurshormonprekur- sor med följande peptidstruktur: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-L-M- Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-Gly-N-O, vari L år Glu eller Asp, M är Gly eller Ser och N och 0 är ut- valda bland Lys och Arg i kombination med en ogiftig bärare här- för.

10. Komposítion för användning vid stimulering av pankrea- tisk sekretion hos människan, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar såsom aktiv komponent en effektiv terapeutisk' In ll 454 514 mängd av en hormonprekursor med följande peptidstruktur: His-Ser-Asp-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-L-M- A1a-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-Gly-N-0, varu _Lar Glu eller Asp, M är Gly eller Ser och N och O är ut- valda bland Lys och Arg i kombination med en ogiftig bärare härför. ,

11. ll. Komposítion för diagnostisk användning vid bestämning av pankreas- eller gallblåsfunktion, k a n n e t e c k n a d därav, att den innefattar såsom aktiv komponent en effektiv diagnostisk mängd av en hormon med följande peptidstruktur: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-L-M- Ala-Arg-Leu-G1n-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-Gly-N-0, vari L är Glu eller Asp, M är Gly eller Ser och N och O är ut- valda bland Lys och Arg i kombination med en icke störande bä- rare härför.