SE454115B - Homogenfasanalys med lantanidkelat som merksubstans - Google Patents

Description

15 20 25 30 454115 2 När antikroppen binder den märkta liganden kommer den signal som används för analysen att modifieras. I ett dylikt system kan intensiteten hos den uppmätta signalen direkt relateras till den okända koncentrationen av liganden i provet. Immunkemiska markörer, som använts för att märka ligander, och vilka efter reaktionen med antikroppen på grund av en förändrad fysikalisk omgivning ger en modifierad signal omfattar fria radikaler (se (1972) JAMA ggl, 1231-1234), fluorescenta molekyler (se Ullman et al. (1976) J. Biol. Chem. 21, 4172-4178) samt kemiluminiscenta molekyler (se Kohen et al. (1979) FEBS Letters lgg, 20l-205).

Leute et al.

Ett relativt stort antal homogena_fluorescensspektro- skopiska immunanalytiska metoder har utvecklats vilka alla baserar sig på att den biospecifika affinitetsreak- tionen på ett eller annat sätt påverkar markörens fysi- kaliska egenskaper så att en förändring i signal kan registreras. Denna fluorescensspektroskopiskt registrer- bara signalförändring kan t ex utgöras av utsläckning, förändring i polarisation, excitationsöverföring eller protektion. Omfattande översiktsartiklar har nyligen publicerats vilka ger en god överblick av de för tillfället kända fluoroimmunanalytiska bestämningar som kan utföras i homogena system (se Smith et al. (1981) Ann. Clin.

Biochem. lå, 253-274, Ullman (1981) “Recent Advances in Fluorescence Immunoassay Techniques".

I de nämnda översiktsartiklarna beskrivs också de be- gränsningar som både heterogena och homogena fluorescens- immunanalytiska bestämningar är utsatta för, nämligen den höga bakgrundsfluorescens som åtföljer alla konventio- nella fluorescenta markörer och fluorescensspektroskopiska analyser. Detta har utgjort den största begränsningen för en vidareutveckling av känsliga analysmetoder som baserar sig pâ fluorescens. 35 Föreliggande uppfinning avser ett förfarande där den tids- l0 15 20 25 30 35 454115 3 upplösta fluorescensens fördelar kombineras med en homo- gen analysprincip vid biospecifika affinitetsreaktioner företrädesvis immunologiska reaktioner. Uppfinningens kännetecken framgår därvid av de efter beskrivningen följande patentkraven.

Uppfinningen kommer nu närmare att förklaras bl a med hänvisning till tvâ utföringsexempel av vilka det första illustreras av diagrammet i Fig. 1 och det andra av dia- grammet enligt Fig. 2.

Vid tidsupplöst fluorescens exciteras den fluorescenta markören med en pulserande ljusimpuls med kort varaktighet och fluorescensen detekteras först efter det att en viss tid förflutit från excitationspulsen. Under den tid som förflyter mellan excitation och detektion kommer fluo- rescensen från eventuella störkällor att avklinga så att endast signalen från den för tidsupplöst fluorescens an- vändbara markören detekteras. En dylik markör bör ha en så hög fluorescens som möjligt, en relativt lång emissions- våglängd, stort Stokes shift och en kemisk byggnad som gör det möjligt att koppla marköen kovalent till anti- gener, haptener och antikroppar. En fluorescensmarkör som uppfyller de ovan angivna egenskaperna finns beskriven i den svenska patentansökan 7902079-8 och utgöres av ett lantanidkelat bildat av en lantanid och en aromatisk /3-diketon, varvid lantaniden är bunden till antigen, hapten eller antikropp via en EDTA-analog så att ett fluorescerande lantanidkelatkomplex bildas. Markörens fluorescenslivstid är lång, 50 - 1000 psek, vilket gör den ytterst lämplig för den tidsupplösta detektions- principen. Fluorescensen från markören kan antingen mätas då markören är bunden til antigen, hapten eller antikropp eller så kan lantaniden under lämpligt valda förhållanden friställas från dessa varvid fluorescensen framkallas i lösning i närvaro av en aromatisk /Û-diketon och en synergistisk förening som t ex trioktylfosfinoxid. Det senare förfarandet finns beskrivet i den svenska patent- ansökan 8102753-4. 10 15 20 25 30 35 454115 . i Vid tidsupplöst fluorescens, som baserar sig på att olika kelat av lantanider användes som fluoroforer, är É fluorescensens intensitet samt dess livslängd helt be- I roende av det använda kelatets, d v s ligandens egen- 5 skaper. Lantanidjonerna i lösning har en mycket låg fluorescensintensitet, vilken i och för sig är beroende av jonernas elektronkonfiguration. Bland lantaniderna har europium och terbium den mest gynnsamma konfigurationen. E Trots att fluorescensen härstammar från metalljonen har det emellertid visats att de i processen deltagande orga- niska liganden har en mycket viktig funktion (se Crosby et al. (1961) J. Chem.Phys. åg, 743, Crosby et al. (1962), J. Phys. Chem. §§, 493). T ex lantanid-/Q-diketon kelaten (M (/Û-diketon)3) har en mycket intensiv fluorescens vars intensitet och livslängd är beroende av den i kelatet in- gående'/3-diketonen och den omgivande lösningens samman- š sättning (se Filipescu et al. (1964) J.Phys.Chem. §§, 324, Sinha (1966) in Complexes of the Rare Earths, Pergamon Press, New York). För att den i kelatet ingående lantanidjonen skall fluorescera bör åtminstone följande förutsättningar uppfyllas: l. 3.

Den organiska,liganden bör exciteras. Liganden med lämpliga elektronorbital (57') absorberar energi (en foton) varvid den exciteras från singlet grundtill- stånd till någon av vibrationsnivåerna i det första exciterade singlet tillståndet.

En energiövergâng inom liganden bör äga rum. Energin överförs från ett exciterat singlet tillstånd till ett exciterat triplet tillstånd inom liganden.

En förutsättning för en intramolekylär energiöver- föring inom lantanidkelatet bör finnas. Energin överförs från ligandens exciterade triplet tillstånd till lantanidjonens resonansnivâ. För att detta skall äga rum och förorsaka en intensiv för lantaniden karakteristisk fluorescens måste åtminstone en av h. 10 15 20 25 30 35 454115 5 lantanidjonens resonansnivâer hefinna sig på en energinivå som är något under den exciterade ligan- dens. Därtill måste ligandens exciterade triplet tillstånd ha en relativt lång livslängd. 4. Ljusemissionen bör äga rum från lantanidjonen. Metall- jonen återgår till en lägre energinivâ varvid energin avges i form av en foton. Lantanidkelatets emissions- a spektra blir karakteristiskt för lantanidjonen, men liganden och miljön runt den kommer att påverka fluorescensens övriga fysikaliska egenskaper.

I den tidigare beskrivna principen för homogen immunanalys utförs en biospecifik affinitetsreaktion i lösning utan en separation mellan "fri" och "antikropp-bunden" kompo- nent, varvid t ex markörens fysikaliska egenskaper pâ- verkas utav reaktionen mellan antikropp och ligand. I föreliggande uppfinning har fördelarna med tidsupplöst fluorescens, med lantanidkelat som mörkörer, kombinerats med denna homogena analysprincip. Vid homogen analys kommer den märkta komponenten (antigen, hapten eller antikropp eller de reagerande komponenterna i en bio- specifik affinitetsreaktion) att bindas till biospecifika centra i t ex antikroppen varvid den kemiska omgivningen runt den märkta komponenten kommer att förändras. Ifall markören utgörs av ett lantanidkelat kommer bindningen till antikroppen eller den biospecifika molekylen högst sannolikt att påverka ligandfältet runt lantanidjonen genom att inverka pâ någon eller nâgra av de faktorer som deltar i absorption, överföring och emission av den exciterade energin. Bindningen av en med ett lantanidkelat märkt antigen till en specifik antikropp kan t ex föror- saka följande för homogen analys användbara förändringar i den fysikaliska fluorescenssignal som registreras med tidsupplöst fluorescens: l. En förändring i den tidsupplösta fluorescensens inten- sitet förorsakas av att bindningen till antikroppen påverkar egenskaperna hos ligandfältet runt lantanid- 10 15 20 25 30 454115 6 jonen. Detta innebär att den uppmätta signalen kan på grund av nämnda förändring antingen öka eller minska i intensitet. 2. En förändring i den tidsupplösta fluorescensens hal- veringstid. Denna förändring kan vara sammankopplad med en intensitetsförändring eller så kan halverings- tiden pâverkas medan kvantumutbytet är oförändrat.

Beroende på förändringarna i ligandfältet kan halve- ringstiden antingen förlängas eller förkortas. 3. En hämning i uppkomsten av ett energiabsorberande ligandfält runt den till antigenet bundna lantanidjonen.

Ifall lantanidjonen binds till antigenet via ett kelat som ej förmår absorbera den för fluorescensen nödvän- diga excitationsenergin utan det homogena analyssys- temet kräver t ex /2-diketoner för att det för energi- absorptionen nödvändiga ligandfältet runt lantanidjonen skall kunna bildas, så kommer bindningen mellan anti- kropp och antigen att förhindra uppkomsten av detta ligandfält.

Enligt uppfinningen utnyttjas de presenterade principerna vid homogena biospecifika affinitetsreaktioner. Uppfinningen kommer i det följande att ytterligare beskrivas med hjälp av att antal icke-begränsande utföringsexempel.

Exempel l. En homogen immunologisk bestämning av insulin med tidsupplöst fluorescens genom att mäta förändringar i halveringstid.

Europiummärkt insulin framställdes genom att konjugera aminofenyl-EDTA-Eu till insulin varvid Eu-kelatet först omvandlades till ett isotiocyanatderivat son användes för konjugeringen. 1.4 mg insulin löstes i 0.5 ml 0.1 M borat buffert pH 9.3 varefter 2 ggr den ekvivalenta mängden iso- tiocyanatderivat av aminofenyl-EDTA-Eu tillfördes. Reak- tionen fick äga rum över natten vid rumstemperatur. Den fria markören separerades från märkt insulin med gel- 454115 7 filtrering (Sephadex G-25). Konjugeringsgraden fastställdes till 0.5 'Eu/insulin molekyl genom att jämföra konjugatets fluorescensintensitet med en Eu-lösning med känd halt.

Immunanalysen utfördes i polystyrene rör (12 x 55 mm) till 5 vilka pipetterades 10 pl anti-insulin serum (utsp. l-4 20), l0_p1 märkt insulin (20 ng), 70}fl.0.05 M Tris-HC1 buffert, pH 7.7, innehållande 0.5% BSA, 0.05 får IgG och 50_uM DTPA, l04pl insulin standard (0, 10, 50, 200, 1000 och 10 000 ng), samt 1.0 ml av en lösning innehållande 20 ,uM ß -NTA, 100 pM 10 Topo, 0.30 Tween 20, 0.15 M Nac1 i 0.05 11 mus-Hcl buffert pH 8.0. Proven inkuberades i 4 timmar vid 37°C varefter fluorescensen för varje prov mättes i l0¿psec olika tid- punkter efter excitationen (100, 200, 300, 400, 480 och 600 fisec). Varje prov mättes tio gånger. Resultatet framgår ur 15 110116011 1.

Tabell 1. Fluorescensintensiteten för insulin standarder mätt olika tider efter excitationen.

Tid efter Insulinkoncentration (ng) excitationen 0 10 50 200 1000 10000 100 11374 13364 17850 19385 22122 26172 i 112 i 123 i 132 i 150 i 157 i 240 200 9050 11570 15602 17010 19613 22092 i96 i90 i1o2 i136 isß i144 300 0441 10225 13430 14071 10746 19046 i130 i137 i146 ine i23s i1s2 400 7510 0025 12013 12702 14019 17557 i120 i119 i9e i120 i179 i241 400 7039 0376 11070 12042 13940 10330 i123 i14s i112 i120 i03 +211 600 5847 6914 9030 9700 11450 13000 i1o4 i174 i204 i134 i11o iss 10 15 20 25 454115 8 Eftersom förändringen i signalens intensitet följer kinetiken för en första ordningens reaktion beräknades fluorescensintensitetens halveringstid för de använda insulin- koncentrationerna. Fluorescensintensiteten avtog snabbare vid lâg än vid hög insulinhalt. De beräknade halverings- tiderna användes för uppritande av en standardkurva i enlig- het med Fig. l på vilken koordinatan anger halveringstiden i mikrosekunder och abskissan mängden insulin i nanogram.

Exempel 2. En homogen immunologisk bestämning av insulin genom att mäta hämning i uppkomsten av ett energiabsorberande ligandfält runt det märkta insulinet som bundit antikropp.

Europiummärkt insulin framställdes enligt metoden som be- skrivits under Fig. l. Den immunanalytiska bestämningen utför- des i polystyrenrör (12 x 55 mm) till vilka pipetterades 70 pl 0.05 M Tris-HCl buffert pH 7.7, innehållande 0.5% BSA och 50)nM DTPA, 10 pl antiinsulin serum (utsp. l-ä 20), 10 pl märkt insulin (20 ng), 10 pl insulin standard (0, 10, 50, 200, 1000, 10000 ng), samt 1.0 ml av en lösning inne- hållande 20_pm /3-NTA, l00_pM TOPO, 0.3% Tween 20, 0.15 M NaCl i 0.05 M Tris-HCl buffert pH 8.0. Rören inkuberades i 4 timmar vid 37°C varefter tidsupplöst fluorescens för varje prov mättes i 250_psek 50)usek efter excitationen. Enligt bestämningsprincipen minskar provets fluorescensintensitet då mängden "kallt" insulin ökar. Resultatet framgår av Figur 2, där på koordinatan anges inhiberingen i procent och på abskissan mängden insulin i nanogram. u

Claims (4)

454 115 PATENTKRAV

1. Sätt vid kvantitativ bestämning i homogen fas under ut- nyttjande av en biospecifik affinitetsreaktion med deltagande av en med en analytiskt indikerbar grupp märkt komponent, k ä n n e t e c k n a t a v att den indikerbara gruppen är ett lantanidkelat som indikeras med hjälp av tidsupplöst fluorescens genom bestämning av fluorescensens intensitet och/eller halveringstid.

2. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t a v att lantaniden utgöres av europium.

3. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t a v att lantaniden utgöres av terbium.

4. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t a v att lantaniakelatet har ett iigandfält bildat av en /Û- diketon eller en synergistisk förening, t ex trioktylfosfin- oxid, eller en blandning av dessa.