SE453962B - Sett att framstella en vattenhaltig liposomerberedning - Google Patents

Description

50 55 MO 453 1962 ständsdelar, dvs. sådana som förekommer tillsammans med lipid- skikten snarare än med den vattenhaltiga liposomfasen, formas föreningen vanligen som en film tillsammans med en fosfolipid I fråga om vattenlösliga biologiskt aktiva föreningar inkapslas före- med användning av ett vanligt organiskt lösningsmedel. ningen vanligen i liposomerna genom att man dispergerar en for- mad fosfolipidfilm med en vattenlösning av föreningen. Den in- kapslade föreningen avskiljes därefter från den fria föreningen genom centrifugering, kromatografi eller någon annan lämplig metod. Beträffande biologiskt aktiva beståndsdelar, som före- kommer tillsammans med liposomernas lipidfas, innehåller liposo- mer, som framställts enligt ovanstående förfarande, vanligtvis största delen av föreningen bunden i de lipida dubbelskikten, och avskiljning av den fria föreningen är inte så kritisk som vid förekomsten av vattenlösliga biologiskt aktiva beståndsdelar, som icke bindas till lipiden.

Det ovan nämnda förfaringssättet lämpar sig inte att använda i stor skala. Dessutom har vattenhaltiga liposomdispersioner en- dast begränsad stabilitet och lagringstiden är därför begränsad.

Vidare kan liposomerna bilda aggregat och falla ut som sediment. Även om sedimenten vanligen kan dispergeras på nytt kan den ur- sprungliga dispersionens struktur och storleksfördelning föränd- ras. Man kan reducera aggregation och sedimentering genom att införa laddade lipider i liposomerna, men detta utgör inte någon garanti för tillfredsställande lagringstid. Förlust av den bio- logiskt aktiva föreningen från liposomerna till det omgivande vattenhaltiga mediet utgör en annan faktor, som begränsar möj- ligheten för preparaten som praktisk doseringsform. Detta är särskilt allvarligt för vattenlösliga föreningar med låg molekyl- víkt men även lipidlösliga föreningar kan fördelas till det om- givande vattenhaltiga mediet tills ett jämviktsförhållande upp- nåtts. givande vattenhaltiga mediet i stor mängd kan förlusten utgöra Om föreningen föreligger i ringa mängd och/eller det om- en betydande proportion av det totala innehållet av den biolo- giskt aktiva föreningen i liposomerna.

Samtliga dessa faktorer begränsar användningen av liposomer som praktiska bärare av biologiskt-aktiva föreningar, särskilt inom läkemedelsterapin. -En lösning kan vara att framställa och lagra HO ' somerna i stor omfattning. § 453 962 filmen med lipid och biologiskt aktiv förening och därefter dis- pergera filmen för bildning av liposomer allt efter behov ome- delbart före användningen. Framställning av film i enhetsdoser och lagring uppvisar emellertid stora praktiska svårigheter och detta förslag utgör,inte någon praktisk lösning av de ovan an- givna problemen.

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för framställning av en vattenhaltig liposomberedning innehållande vatten, minst en liposombildande amfipatisk lipid, minst en biologiskt aktiv förening och eventuellt minst ett hjälpmedel, kännetecknat av att man dispergerar en frystorkad, potentiell liposomblandning i ett vattenhaltigt medium. Det är överraskande, att då en frys- torkad, potentiell liposomblandning dispergeras i ett lämpligt vattenhaltigt medium, t.ex. en isotonisk saltlösning, bildas _ liposomer, som liknar de, som man framställt medelst det ovan nämnda filmdispersionssättet. I fråga om en lipidlöslig eller lipidbunden biologiskt aktiv förening inkorporeras denna i lipo- Å andra sidan, såsom förklaras ne- dan, är sättet enligt uppfinningen inte så lämpligt för de vat- tenlösliga biologiskt aktiva föreningar, som icke bindes till lipider. De ovan nämnda frystorkade blandningarna dispergerar lätt, då de skakas i ett vattenhaltigt medium och det tycks, som om de leder till liposomberedningar med en snävare storleksför- delning än motsvarande beredning, som man framställt genom att dispergera en formad film. Detta kan vara fördelaktigt med tanke på reproducerbarheten av liposomberedningarnas effekt.

Ett lämpligt vattenhaltigt medium för användning vid sättet en- ligt uppfinningen är exempelvis destillerat vatten, isotonisk saltlösning eller en steril eller icke-steril buffertlösníng.

Den frystorkade, potentiella liposomblandningen kan framställas såsom beskrives i den samtidiga patentansökan 7803276-8 genom att man löser minst en liposombildande amfipatisk lipid, minst en biologiskt aktiv förening och eventuellt minst ett hjälpmedel i ett lösningsmedel, som förblir i fast form under frystorknings- processen, och därefter frystorkar lösningen. Lösningsmedlet Lämpliga lösningsmedel är Eventuellt kan innehålla en eller flera ämnen. t-butanol, dioxan, ättiksyra, pyridin och piperidin.

HO, 453 962 kan en eller flera andra vätskor, som medverkar till att be-_ ståndsdelarna löses, t.ex. vatten eller kloroform, också före- finnas. Vilken som helst konventionell frystorkningsanordning och vilket som helst konventionellt förfarande kan användas för att frystorka nämnda lösning. ' Denna frystorkade, potentiella liposomblandning kan alternativt framställas såsom beskrives i den samtidiga patentansökan genom att man medelst vilket som helst känt sätt framställer en vattenhaltig liposomkomposition innehållande vatten, minst en liposombildande amfipatisk lipid, minst en biologisk aktiv före- ning och eventuellt minst ett hjälpmedel, och därefter frystor- kar den vattenhaltiga liposomkompositionen. Den vattenhaltiga liposomkompositionen kan exempelvis framställas medelst filmdis- persionsmetoden. Vilken som helst konventionell frystorknings- anordning och vilket som helst konventionellt förfarande kan an- vändas för att frystorka den vattenhaltiga liposomkompositionen.

Vilken amfipatisk lipid som helst, som man vet är lämplig för framställning av liposomer på känt sätt kan användas vid utövan- Sålunda kan en mångfald li- pider användas enligt uppfinningen, men man föredrager sådana, det av sättet enligt uppfinningen. som är icke-immunogena och biologiskt nedbrytbara. Exempel på lämpliga lipider utgör fosfolipiderna, t.ex. naturliga leciti- ner, såsom lecitin frän ägg eller från sojabönor, eller syntetis- ka lecitiner, t,ex. mättade syntetiska lecitiner, som dimyris- toyl-fosfatidylkolin, dipalmitoyl-fosfatidylkolin eller distea- royl-fosfatidylkolin, eller omättade syntetiska lecitiner, som exempelvis dioleyl-fosfatidylkolin eller dílinoleyl-fosfatidyl- kolin. Man kan använda antingen en enstaka fosfolipid eller en blandning av fosfolipider.

Som ovan nämnts, kan den biologiskt aktiva beståndsdelen utgöras av vilken förening som helst, som uppvisar en biologiskt intres- sant egenskap. Sålunda kan föreningen utgöras av ett läkemedel, protein, enzym, hormon, vitamin eller en märkförening. Det in- ses härvid att sättet enligt uppfinningen är särskilt värdefullt med avseende på lipidlösliga eller lipidbundna biologiskt aktiva föreningar (som inkluderar vissa vattenlösliga föreningar, t.ex, vissa proteiner). Det ovan nämnda sättet är icke så lämpligt NO 453 962 för vattenlösliga, icke lipidbundna biologiskt aktiva föreningar, eftersom i dylika fall endast en relativt ringa fraktion av föreningen inkorporeras i liposomerna vid dispergering av den frystorkade blandningen. Icke desto mindre är denna olägenhet godtagbar under förutsättning att ett lämpligt överskott av den vattenlösliga biologiskt aktiva föreningen inkorporeras i den frystorkade blandningen. Då liposomer framställes från en dylik blandning måste den fria föreningen, om närvaro av en fri biolo- giskt aktiv förening i det yttre vattenhaltiga mediet är till nackdel, avlägsnas genom någon av de ovan angivna metoderna.

Om sättet enligt uppfinningen är lämpligt med avseende på en vatten-löslig, icke lipidbunden, biologiskt aktiv förening be- ror sålunda på samtliga relevanta omständigheter, inkluderande 1) beskaffenheten av föreningens verkan, 2) föreningens styrka, 3) den mängd av föreningen, som inkorporerats i liposombered- ningen enligt föreliggande uppfinning och U) önskvärdheten att den fria föreningen förekommer i det yttre vattenhaltiga mediet eller ej.

Eventuella hjälpmedel inkluderar ett ämne, som åstadkommer en ne- gativ laddning, t.ex. fosfatidsyra från ägg, dipalmitoyl-fosfa- tidsyra, dicetylfosfat eller gangliosid från hjärna av nötkrea- tur, eller ett ämne, som åstadkommer positiv laddning, t.ex. stearylamin eller stearylaminacetat, eller ett ämne, som påver- kar de fysikaliska egenskaperna i de lipida dubbelskikten i li- posomerna på ett önskvärt sätt genom att t.ex. överföra dem till en mer flytande eller mer fast form allt efter önskan, t.ex. kolesterol.

Uppfinningen skall i det följande belysas närmare med hjälp av följande exempel utan att dock vara begränsad till'dessa.

Exempel 1 Dipalmitoyl-fosfatidylkolin (i det följande benämnt "DPPC", 59,6 mg), 5u-kof-tisoi-z1-paimitlerc (i de: följande benämns "3n-cP", 6,5H mg) och stearylacetat (3,81 nmjlöstes i omdestillerad t-buta- nol (3 ml) vid 6000. kolv och frystes som en tunn film genom att man sänkte ned och Lösningen överfördes till en 250 ml rund- svängde om kolven i en fryssblandning av metanol och koldioxid i fast form. Lösningsmedlet avlägsnades därefter i vakuum med en kommersiell frystorkníngsapparat. Härvid erhöll man en frys- H0 453 962 torkad, potentiell liposomerblandning som ett pulver, som kunde förvaras i slutna behållare tills man hade behov av detsamma.

Destillerat vatten (10 ml) sattes till det frystorkade pulvret, varefter den bildade blandningen uppvärmdes till ca 7000 på ett vattenbad. Genom att försiktigt skaka kolven bringade man pulv- ret att dispergera, varvid man erhöll en mjölkaktig suspension, som vid mikroskopisk undersökning visade sig innehålla liposomer.

Dubbla prover (50 pl) av suspensionen togs för scíntillationsräk- ning för att fastställa steroidinnehållet före tvättning. Åter- stoden av suspensionen späddes till 25 ml volym med destillerat vatten och ultracentrifugerades vid 120 000 g under 30 minuter.

Liposomproppen dispergerades till 10 ml volym med destillerat vatten och två prover (50 pl) av den tvättade suspensionen uttogs för scintillationsräkning. Jämförelse av uträkningarna före och efter tvättning visade att 90'% av den i det frystorkade pulvret kvarvarande steroiden inkorporerats i de tvättade liposomerna.

Exempel 2 DPPC (H9 mg) och BH-CP (7 mg) löstes i omdestillerad t-butanol (5,o5 ml) vid 6o°c. räkning och den återstående lösningen frystes omedelbart på väg- Två prover (5 pl) uttogs för scintillations- gen av en 250 ml rundkolv genom nedsänkning iien frysblandning (metanol och koldioxid i fast form). t-butanolen avlägsnades därefter med en kommersiell frystorkningsanordning. Härvid er- höll man en frystorkad potentiell liposomblandning. Denna blandning skrapade man av från kolvens väggar och tre prover (10,11 och 12,7 mg) vägdes upp och infördes i små flaskor. tillerat vatten (2,5 ml) sattes till varje flaska, varefter Des- blandningarna uppvärmdes till 50°C på ett vattenbad. Blandning- en dispergerades därefter genom kraftig omskakning för bildning av liposomer. Två prover (50 pl) av varje liposomberedning ut- togs för scintillationsräkning. Liposomberedningarna sattes till torra, vägda ultracentrifugrör, späddes till 10 ml med destillerat vatten och ultracentrifugerades vid 120 000 g H0 minuter vid UOC. De överliggande vätskorna avlägsnades från li- pídpropparna och två av de tre propparna torkades i en vakuum- ugn till en vikt med 50 vikt% vattenhalt. uppslammades i vatten (2,5 ml) och två prover (50 pl) uttogs för Den tredje proppen scintillationsräkníng. 50 ;35 NO 453 962 De radioaktiva beräkningarna visade att efter dispergering av de tre frystorkade proverna i vatten förelåg 863 U % av den ur- sprungliga steroiden i dispersionerna. Det radioaktiva bort- fallet härrörde från förlusten av en mindre fraktion av den potentiella liposomblandningen under frystorkningen. Då det tredje provet hade tvättats återstod 73 % avden totala steroi- den i förbindelse med liposomer.

Därefter uppvägdes tvâ prov (6 mg) av båda torkade liposomprop- parna och infördes i provbehållare för differential scanning- kalorimetri (i det följande benämnd "DSC") DSC-spektra av bland- ningar mellan O-5000 registrerades på en differential scanning- kalorimeter enligt Perkin Elmer. Även kontrollprover för DSC framställdes genom att man blandade samma viktmängder av DPPC och BH-CP som i den ursprungliga blandningen och därefter blan-D dade desamma med 50 vikt% vatten. v DSC-spektra av dessa kontrollblandningar De tjänade som "non liposom"- kontrollblandningar. uppmättes på samma sätt som ovan.

DSC-spektrum av enbart DPPC består av en huvudtransitionsendoterm vid Ä1oC och en pre-transitíonsendaterm vid BSOC. Huvudendoter- mens "ha1vtopp“-linjebredd är ca 3°C. De ovan beskrivna försö- ken visade att båda topparna i "non-liposom"-kontrollblandning~ arna observerades i DSC-spektra av blandningarna och linjebredden förblev vid ca BOC. icke-liposomblandningar) förändrar icke steroiden lipidens DSC- Detta tyder på att i enkla blandningar (dvs. spektrum. Spektra av de två liposomberedningarna uppvisade endast en transition (huvudendotermen), och linjernas medelbredd hos beredningarna utgjorde 5,800, en betydlig utvidgning i jäm- förelse med kontrollblandningarna. Denna utvidgning härrör från den molekylära växelverkan mellan lipid och steroid i de lipo- Det kan där- att liposomer, som framställts somer, som framställts på det ovan nämnda sättet. för inte råda någon tvekan om, på det ovan nämnda sättet, innehöll steroiden i liposomerna.

Exempel 3 Lecitin från ägg (16,1 mg), fosfatinsyra från ägg (2 mg) och 3 hälldes i en 250 ml rundkolv. att man roterade kolven och blåste in en H-CP (1,66 mg) löstes i kloroform (5 ml), varefter lösningen Lösningsmedlet avlägsnades vid rumstemperatur genom HO -ström av torrt kväve i den. 453 962 Härvid erhöll man en lipidfilm, som man därefter dispergerade i rumstemperatur i vatten (5 ml), Dubbla prover (50 pl) Återstoden av liposombered- varvid man erhöll en liposomberedning. uttogs för scintillationsräkning. ningen späddes till 25 ml med destillerat vatten i ett ultra- centrifugrör och ultracentrífugerades vid 120 000 g 30 minuter.

Den överliggande vätskan avlägsnades från liposomproppen, var- efter man dispergerade proppen i destillerat vatten (5 ml). Två prover (50 pl) uttogs från denns dispersion, och inkorporeringen av steroid uppmättes genom scintillationsräkning. Ãterstoden av liposomdispersionen frystes ned med en blandning av metanol och koldioxid i fast form, varefter lösningsmedlet avlägsnades med en kommersiell frystorkningsanordníng. Härvid erhöll man en frystorkad, potentiell liposomblandning.

Den frystorkade blandningen lagrades 5 dagar, varefter man till- satta 0,9 %-ig (vikt/volym) saltlösning (5 ml). Liposomer bil- dades då man försiktigt skakade blandningen i en kolv vid rums- temperatur. Undersökning i mikroskop bekräftade närvaron av li- posomer. Två dagar senare tvättades liposomerna två gånger med 0,9 %-ig (vikt/volym) saltlösning på samma sätt som ovan, men med saltlösning i stället för vatten. Liposomernas steroidinne- håll fastställdes genom scintillationsräkning. Vid jämförelse av dispersionernas radioaktivitet före och efter frystorkningen framgick, att 72 % av steroiden i den tvättade beredningen före frystorkningen kvarblev i de tvättade liposomer, som bildades efter frystorkningen. §xempel U DPPC (29,8 mg) och 3H-CP (3,32 mg) löstes i kloroform (5 ml) och anbringades som en tunn film på väggen av en 250 ml rundkolv ge- nom avdunstning av lösningsmedlet vid rumstemperatur med en ström torrt kväve._ Destillerat vatten (10 ml) sattes därefter till kol- ven, varefter blandningen uppvärmdes till 7000 på ett vattenbad.

Liposomer bildades genom att man omskakade den varma blandningen på en bänk-vibrationsblandare. Två prover (50 pl) av den bildade dispersionen uttogs för scintillationsräkning. återstoden av dispersionen tvättades två gånger genom utspädning till 25 ml med destillerat vatten och ultracentrifugering vid 120 000 g 30 minuter. Den tvättade liposomproppen dispergerades på nytt i des- tillerat vatten (10 ml), varefter två prover (50 pl) uttogs HO 453 962 för scintillationsräkning. Denna dispersion (5 ml) frystes ned i en blandning av metanol och koldioxid i fast form, varefter lösningsmedlet avlägsnades i vakuum med en kommersiell frystork- ningsanordning. Härvid erhöll man en frystorkad, potentiell liposomblandning, som lagrades tills man behövde den.

Destillerat vatten (5 ml) sattes till den frystorkade blandningen, varefter den bildade blandningen upphettades till 70°C på ett vattenbad och omskakades försiktigt. Undersökning i mikroskop av den bildade mjölkaktiga suspensionen visade, att den bestod av en suspension av liposomer med en snäv storleksspridning.

Suspensionen ultracentrifugerades vid 120 000 g 30 minuter, var- efter liposomproppen dispergerades på nytt i destillerat vatten (5 ml). för fastställande av det slutliga steroidinnebållet i lip050men_ Scintillationsräkning visade, att 78 % av steroiden, som inkor- porerats i den ursprungliga tvättade dispersionen förekom i den Två prover (50 pl) av den bildade dispersionen uttogs färdigtvättade liposomberedningen, som bildats av den frystorkade blandningen.

DSC (se exempel 2) på sådana liposomer, som framställts av den ursprungliga filmen och dylika som framställts av den frystorkade blandningen utvisade, att lipid-transitionsendoterme svar utvidgad av steroiden i liposomerna och att denna utvidgning bibehölls sedan den frystorkade blandningen dispergerats i des- tillerat vatten. Detta visade, att steroiden inkorporerats i de slutliga liposomerna, som framställts av den frystorkade blandningen. Éšempel 5 Alla de i detta exempel beskrivna förfaringssätten utfördes i ett sterilt rum (sterilíserat med formaldebyd, och därefter ge- nomblåst med steril luft), med vidtagande av konventionella asep- tiska försiktighetsmått.

Speedivac Centrifugal Freeze-dryer, modell 6 PS) steriliserades med formaldehyd och genomblâstes därefter med steril luft. Den Frystorkningsanordningen (Edwards andra använda anordningen steriliserades antingen med torr värme eller genom autoklavering.

DPPC (697,2 mg) dipalmitoylfostatidsyra (99,6 mg) och kortisol- H0 453 962 _ 10 -21-palmitat (99,6 mg) löstes vid 60°C i omdestillerad t-butanol (60 ml). att man lät den passera genom ett 0,22 P "MF-millipor" filter (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) och hölls vid 5000. 2 ml prover av den sterila lösningen Den varma lösningen steriliserades omedelbart genom Detta gjordes två gånger. placerades i små sterila 5 ml flerdosflaskor. Flaskornas inne- håll frystorkades med den ovan nämnda frystorkningsanordníngen, varefter varje flaska tillslöts med en steril gummitillslutning På så sätt erhöll man tillslut- na prover av en steril frystorkad, potentiell liposomblandning. och en flerdoskapsyl av metall.

En steril 0,9 %-ig (vikt/volym) vattenlösning av natriumklorid infördes i en av de ovan nämnda tillslutna flaskorna, som där- efter upphettades till 5000 på ett vattenbad-och kraftigt omska- kades. Härvid erhöll man en steril liposomberedning, som var lämplig att administrera genom injicering.

Exempel 6 Lecitin från ägg (15 mg), kolesterol (2,09 mg) och dicetylfosfat (1,55 mg) löstes i kloroform (5 ml) och anbringades som en tunn film på väggen av ett provrör. 1251-angiotensin II (0,1 mg) i 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,4, 1 ml) sattes till röret. Lipiden dispergerades i det vattenhaltiga mediet med en bänk-vibrationsblandare för bildning av liposomer. Liposomdis- persionen tvättades två gånger genom utspädning till 26 ml med 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,H), följt av ultra- centrifugering vid 120 000 g 1 timme. Den tvättade liposomprop- pen dispergerades på nytt i 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,U, 5 ml) och två prover (0,25 ml) uttogs för scintillations- räkning, U ml av den återstående suspensionen placerades i ett provrör, frystes med (metanol/koldioxid i fast form) och frys- torkades. Den bildade frystorkade, potentiella liposombland- ningen suspenderades på nytt i 3,5 millimolar fosfatbuffertlös- ning (pH 7,H, 2 ml) och tvättades två gånger på samma sätt som ovan. Den tvättade liposomproppen suspenderades på nytt i 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,U, H ml).

(O,25 pl) uttogs för scintillationsräkning.

Två prover 26 % av den ursprung- liga mängden av angiotensin II stannade kvar i liposomerna efter ' 28% av dessa 26 %, dvs. 7 % av den ursprungliga mängden angiotensin den första framställningen och tvättningen av liposomerna. 453 962 11 II stannade kvar i liposomerna efter frystorkning och omkonsti- tuering.

Den i detta exempel och i exempel 7 använda 3,3 millimolar fos- fatbuffertlösníngen framställdes genom att man löste kaliumdi- vätefosfat (O,895 g) och dinatriumvätefosfatdihydrat (H,765 g) i destillerat vatten, varefter lösningen späddes till 1 liter med destillerat vatten.

Ešempel 7 Lecitin av ägg (15 mg), kolesterol (2,09 mg) och dicetylfosfat (1,55 mg) löstes i kloroform (5 ml) och anbringades i en tunn film på väggen av ett provrör. BH- Inulin (5 mg) i 3,3 milli- molar fosfatbuffertlösning (pH 7,U, 1 ml) sattes till röret.

Lipiden dispergerades i inulinlösningen med en bänk-vibrations- blandare för bildning av liposomer. Liposomdispersionen tvätta- des två gånger genom utspädning till 26 ml med 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,H) följt av ultracentrifugering vid 120 000 g 1 timme. på nytt i 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,U, Den tvättade liposomproppen dispergerades 2,1 ml), varefter två prover ( 1 pl) uttogs för scíntillationsräkning.

Den återstående suspensionen frystes ned (blandning av metanol och koldioxid i fast form) och frystorkades i ett provrör. Den bildade frystorkade, potentiella liposomblandningen suspendera- des på nytt i 3,3 millimol fosfatbuffertlösning (pH 7,H, 1 ml) för bildning av liposomer och tvättades två gånger på samma sätt som ovan. Den tvättade liposomproppen suspenderades på nytt i 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,5, 2 ml), varefter två prover (1 pl) uttogs för scintillationsräkning. 21 % av den ur- sprungliga mängden inulin hade stannat kvar i liposomerna efter den första framställningen och tvättningen av liposomerna. 17 % av dessa 21 %, dvs. 4 % av den ursprungliga mängden inulin stannade kvar i liposomerna efter frystorkning och omkonstítue- ring.

Claims (8)

10 15 20 25 z 30 453 962 12 Patentkrav

1. Sätt att framställa en vattenhaltig liposomberedníng inne- hållande vatten, minst en liposombildande amfipatisk lipid, minst en biologiskt aktiv förening och eventuellt minst ett hjälpmedel, k ä n n e t e c k n a t av att man dispergerar en frystorkad, potentiell liposomblandning i ett vattenhaltigt medium.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att det vat- tenhaltiga mediet utgöres av destíllerat vatten, isotonisk salt- lösning eller en steril eller icke-steril buffertlösning.

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att lipiden utgöres av en fosfolipid. b

4. H. Sätt enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att fosfo- lipiden är ett naturligt eller syntetiskt lecitin.

5. Sätt enligt något eller några av kraven 1-H, k ä n n e - t e c k n a t av en lipídlöslig eller lipidbunden förening. av att den biologiskt aktiva föreningen utgöres

6. Sätt enligt något eller några av kraven 1-5, k ä n n e - t e c k n a t av att den biologiskt aktiva föreningen är ett läkemedel.

7. Sätt enligt något eller några av kraven 1-6, k ä n n e - t e c k n a t av att man använder ett hjälpmedel, som utgöres av antingen ett ämne som åstadkommer en negativ laddning eller ett ämne som åstadkommer en positiv laddning.

8. 4Sätt enligt något eller några av kraven 1-7, k ä n n e - t e c k n a t av att man använder kolesterol som hjälpmedel.