DK156765B

DK156765B - Fremgangsmaade til fremstilling af et liposomforstadium, som kan dispergeres i et egnet vandigt medium til fremstilling af et vandigt liposompraeparat

Info

Publication number: DK156765B
Application number: DK206578AA
Authority: DK
Inventors: John Raymond Evans; Francis James Thomas Fildes; Jean Elizabeth Oliver
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1977-05-10
Filing date: 1978-05-10
Publication date: 1989-10-02
Also published as: DK156765C; DK122388A; IT1094811B; NO150184B; CH650944A5; SE453962B; NO153121B; BE866697A; FI63856B; AU3423578A; SE8201351L; IL54270A; GB1575343A; FI781012A; DK122388D0; FR2390159A1; NO153121C; US4311712A; NO840064L; IE780464L

Description

DK 156765 B

Opfindelsen angàr en fremgangsmâde ti1 fremstilling af et li-posomforstadium, som kan dispergeres i et egnet vandigt medium til fremstilling af et vandigt 1iposompræparat, og som omfat-ter oplosning af mindst ét 1iposomdannende, amphipatisk lipid, 5 mindst én 1ipidoploselig eller lipidbundet biologisk aktiv forbindelse, der kan være et lægemiddel, og eventuelt mindst ét hjælpestof i et oplosningsmiddel.

I litteraturen findes der omfattende beskrivelser af liposo-10 mer, og deres struktur er velkendt. De har sædvanligvis en loglignende multilame!larstruktur, som omfatter en række phosphol id-dobbel tlag adskilt fra hinanden ved hjælp af vandigt materiale. En anden liposomtype, som kendes, bestâr af et en-kelt phospholipid-dobbeltlag, som omfatter vandigt materiale? 15 disse unilamellare former betegnes undertiden som "blærer". I en ârrække har der været voksende interesse for anvendelsen af liposomer som bærere for forbindelser, der er af interesse pâ grund af deres biologiske egenskab, f.eks. medikamenter, pro-teiner, enzymer, hormoner, vitaminer og mærkeforbindelser etc.

20 Det mâ forstàs, at den brede gruppe af biologisk intéressante forbindelser, som omfatter medikamenter (til mennesker og dyr), men ikke er begrænset hertil, i denne tekst vil blive benævnt som "biologisk aktive forbindelser".

25 Indkapslingen af en biologisk aktiv forbindelse i liposomer kan opnâs pâ en række forskellige mâder. Den mest almindeligt anvendte omfatter stebning af en film af phospholipid (med eller uden et ladet lipid) ved fordampning fra en oplosning i et organisk oplosningsmiddel, f.eks. chloroform, og derpà 30 dispergering af filmen i et egnet vandigt medium. I tilfældet med 1 ipidoploselige biologisk aktive forbindelser, dvs. de, som forbinder sig med lipidlagene frem for liposomernes van-dige fase, stebes forbindelsen sædvanligvis som en film sammen med et phospholipid, idet der anvendes et almindeligt organisk 35 oplosningsmiddel. I tilfældet med vandopleselige biologisk aktive forbindelser indkapsles forbindelsen sædvanligvis i liposomer ved at dispergere en stobt phospholipidfilm med en van-dig oplosning af forbindelsen. Den i ndkapslede forbindelse

DK 156765 B

2 skilles derpà fra den fri forbindelse ved centrifugering, kro-matografi eller en anden egnet fremgangsmàde. I tilfældet med biologisk aktive forbindelser, som forbindes med liposomernes lipidfase, forudsat at de indgâr i en mængde under deres 5 maksimale 1ipidoploselighed eller under den maksimale mængde, som kan bindes til lipidet, indeholder de ved den ovennævnte metode fremstillede liposomer sædvanligvis storstedelen af forbindelsen bundet i 1 ipid-dobbeltlagene, og separering af den fri forbindelse er ikke sâ kritisk som i tilfældet med 10 vandoploselige biologisk aktive forbindelser, som ikke bindes til 1i p i d .

Den ovenfor beskrevne fremgangsmàde egner sig ikke selv til anvendelse i stor màlestok. Vandige 1iposomdispersioner har 15 desuden kun begrænset stabilitet, og deres lagringstid er der-for begrænset. Liposomerne kan desuden sammenhobes og udfælde som et sédiment. Selv om sàdanne sedimenter sædvanligvis kan gendispergeres, kan strukturen og storrelsesfordelingen fra den oprindelige dispersion blive ændret. Sammenhobning og se-20 dimentation kan reduceres ved inkorporeringen af ladede 1 i p i — der i liposomerne, men dette garanterer ikke en tilfredssti1-lende lagringsholdbarhed. Tabet af den biologisk aktive forbindelse fra liposomerne til det udvendige vandige medium er en anden faktor, som begrænser disse præparaters potentiel som 25 praktiske doseringsformer. Dette er særligt alvorligt for lav-molekylære vandoplcselige forbindelser, men ogsâ lipidoplose-lige forbindelser kan gà over i det ydre vandige medium, ind-til der er opnàet ligevægt. Hvis indholdet af forbindelse er ringe, og/eller voluminet af det udvendige vandige medium er 30 stort, kan dette tab repræsentere en signifikant mængde af’ det samlede indhold af den biologisk aktive forbindelse i liposo-merne.

Aile disse faktorer begrænser anvendelsen af liposomer som 35 praktiske bærere af biologisk aktive forbindelser, specielt i medikamentterapi. En losning kunne være at fremstille og lagre den 1 ipid/biologisk aktive forbindelse-film og derpà disperge-re filmen til dannelse af liposomer efter behov umiddelbart 3

DK 156765B

for brug. Enhedsdosisfi1mfremstiΠing og lagring repræsenterer imidlertid store praktiske vanskeligheder, og denne idé giver derfor ikke nogen praktisk l0sning pâ de ovenfor anforte pro-blemer.

5

Den foreliggende opfindelse vedrorer en fremgangsmàde, som tiIvejebringer en praktisk lesning.

Fremgangsmâden ifolge opfindelsen til fremstilling af et lipo-10 somforstadium, der kan dispergeres i et egnet vandigt medium til fremstilling af et vandigt 1iposompræparat, og som omfat-ter oplosning af mindst ét 1iposomdannende amphipatisk lipid, mindst én 1ipidoploselig eller lipidbundet biologisk aktiv forbindelse, der kan være et lægemiddel, og eventuelt mindst 15 êt hjælpestof i et oplesningsmiddel, er ejendommelig ved, at oplosningen frysetorres til dannelse af en frysetorret, poten-tialliposom, blanding, idet der anvendes et oplesningsmiddel, som forbliver fast under fryseterringen. Enhver sædvanlig fryseterringsmetode kan anvendes til at gennemfore fremgangs-20 màden if0lge opfindelsen. I det folgende vil udtrykket "fryse-torrede, potentiel 1iposom, blandinger" blive anvendt for de frysetorrede blandinger, som kan opnâs ifolge opfindelsen, og som ved dispergering i et egnet vandigt medium giver de mnske-de 1iposompræparater. Nâr en fryseterret, potentiel!iposom, 25 blanding fremstillet ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen, gendispergeres i et egnet vandigt medium, f.eks. isotonisk saltvand, dannes der uventet liposomer, som ligner de, der blev fremstillet ved hjælp af den kendte filmdispersionsmeto-de. I tilfældet med en 1ipidoploselig eller lipidbundet biolo-30 gisk aktiv forbindelse inkorporeres forbindelsen i liposomerne i stor udstrækning. De frysetorrede blandinger dispergeres let ved omrystning med et vandigt medium, og det viser sig, at de forer til 1iposompræparater med en mere snæver storrelsesfor-deling end et tilsvarende præparat, som opnâs ved at disperge-35 re en stobt film. Dette kan være fordelagtigt med hensyn til reproducerbarheden af 1iposompræparaternes virkning.

Fremsti11ingen af liposomer er ogsà beskrevet i DK fremlæggel-seRskrift nr. 141.082. UK Datentskrift nr. 1.487.989. Chemical 4

DK 156765B

Abstracts, 85, 25402a (1976) og New England Journal of Medi-cine, 23. september 1976, 704-710, men i ingen af disse be-skrîves frysetorring af en blanding af en biologisk aktiv for-bindelse og et 1iposomdannende lipid, som beskrevet og som er 5 gjort krav pâ ifolge opfindelsen.

Eksempler pâ egnede amphipatiske lipider er naturlige lecithi-ner, f.eks. æglecithin eller sojabonnelecithin eller synteti-ske lecithiner, f.eks. mættede syntetiske lecithiner, f.eks.

10 dimyristoyl-phosphatidylcholin, dipalmitoyl-phosphatidylcholin eller distearoyl-phosphatidylcholin eller umættede syntetiske lecithiner, f.eks. dioleyl-phosphatidyIcholin eller dilinole-yl-phosphatidylcholin. Der anvendes et enkelt amphipatisk lipid eller en blanding af amphipatiske lipider.

15

Som anfort ovenfor kan den biologisk aktive forbindelse være enhver lipidloselig eller lipidbundet forbindelse med en egen-skab af biologisk interesse. Forbindelsen kan sâledes være et lægemiddel, protein, enzym, hormon, vitamin eller mærkeforbin-20 delse. De 1ipidoploselige eller lipidbundne biologisk aktive forbindelser omfatter nogle vandoploselige forbindelser, f.eks. nogle proteiner.

De éventuelle hjælpestoffer omfatter et stof, som giver en ne-25 gativ ladning, f.eks. ægphosphatidsyre, dipalmitoylphosphatid-syre, dicetylphosphat eller oksehjernegangliosid eller et stof, som giver en positiv ladning, f.eks. stearylamin eller stearylaminacetat eller et stof, som pâvirker de fysiske egen-skaber af 1 ipiddobbeltlagene i liposomerne i en gunstig ret-30 ning, f.eks. gor dem mere flydende eller faste efter onske, f.eks. cholestérol. >

Som angivet ovenfor har egnede oplosningsmidler den evne at kunne oplose den ovennævnte blanding af bestanddele. Oplos-35 ningsmidlet kan bestà af et eller flere stoffer. Oplosnings-midlerne forbliver faste under frysetorringsprocessen, uden at det er nodvendigt med udvendig afkoling (udvendig afkoling anvendes naturligvis ved processens start). Særligt foretrukne 5

DK 156765B

oplesningsmidler er t-butanol, n-butanol, dioxan, eddikesyre, pyridin eller piperidin. Der kan eventuelt ogsâ indgâ en eller flere andre væsker, som hjælper med til at oplese bestanddele-ne, f.eks. vand eller chloroform.

5

Liposomforstadiet, som er fremstillet ifelge opfindelsen, kan hensigtsmæssigt anvendes til fremstilling af vandige liposom-præparater.

10 Opfindelsen illustreres af felgende eksempler.

Eksempel 1

Dipalmitoylphosphatidylcholin (i det felgende benævnt "DPPC", 15 59,6 mg) 3H-cortisol-21-palmitat (i det felgende benævnt "3H-CP", 6,54 mg) og steary1 aminacetat (3,81 mg) blev oplest i gendesti1leret t-butanol (3 ml) ved 60°C. Oplesningen blev overfert til en 250 ml rundbundet kolbe og frosset som en tynd film ved at neddyppe og skvulpe flasken rundt i en fryseblan-20 ding af methanol og fast carbondioxid. Oplesningsmidlet blev derpâ fjernet under vakuum under anvendelse af et kommercielt fryseterringsapparat. Der blev sâledes opnâet en fryseterret, potentiel liposom, blanding som et pulver, der kunne lagres i lukket beholder indtil brug.

25

Destilleret vand (10 ml) blev sat til det frysetorrede pulver, og den resulterende blanding blev opvarmet til ca. 70°C pâ et vandbad. Let omrystning af kolben fik pulveret til at disper-gere og gav en mælkeagtig suspension, som ved mikroskopisk 30 undersogelse viste sig at indeholde liposomer. Dobbeltprever (50 μΐ) af suspensionen blev udtaget til scintillationstæl1ing til bestemmelse af steroidindholdet fer vaskning. Resten af suspensionen blev fortyndet til 25 ml volumen med destilleret vand, og ultracentrifugeret ved 120.000 g i 30 minutter. Lipo-35 sommassen blev dispergeret til 10 ml volumen med destilleret vand og dobbeltprever (50 μΐ) af den vaskede suspension blev udtaget til scintillationstælling. Sammenligning af tallene fer og efter vaskning viste, at 50% af steroidet, som var til-

DK 156765B

$ bage i det frysetorrede pulver, blev inkorporeret i de vaskede 1iposomer.

Eksempel 2 5 DPPC (49 mg) og 3H-CP (7 mg) blev oplost i gendestilleret t-butanol (5,05 ml) ved 60eC. Dobbeltprever (5 μΐ) blev udtaget til scintillationstælling, og den resterende oplesning blev straks frosset pâ væggen af en 250 ml rundbundet kolbe ved 10 neddypning i en fryseblanding (methanol-fast carbondioxid). t-butanolen blev derpà fjernet ved hjælp af et kommercielt fry-setorringsapparat. Der blev sàledes opnàet en frysetorret, po-tential liposom, blanding. Denne blanding blev skrabet af kolbevæggen, og tre prover (10, il og 12,7 mg) blev afvejet i 15 proveglas. Destilleret vand (2,5 ml) blev sat til hvert prove-glas, og blandingen blev opvarmet til 50°C pâ et vandbad. Blandingen blev derpâ dispergeret til dannelse af liposomer ved kraftig omrystning. Dobbeltprover (50 μΐ) af hvert lipo-sompræparat blev udtaget til sointi11ationstæl1ing. Liposom-20 præparaterne blev sat til terre, afvejede ultracentrifugeror, fortyndet til 10 ml med destilleret vand og ultracentrifugeret ved 120.000 g i 40 minutter ved 4eC. De overliggende væsker blev fjernet fra lipidmassen, og to af de tre portioner blev torret i en vakuumovn til en vægt, som repræsenterer 50 vægt% 25 vandindhold. Den tredie portion blev gensuspenderet i vand (2,5 ml), og dobbeltprover (50 μΐ) blev udtaget til scintilla-tionstael 1 ing.

De radioaktive ta! viste, at efter dispersion af de tre fryse-30 torrede prover i vand, indgik der 86±4% af det oprindelîge steroid i dispersionerne. Tab af radioaktivitet skyldtes tabet af en ringe brokdel af potentiel 1iposomblandingen under fry-setorringen. Efter vaskning af den tredie prove forblev 73% af den samlede steroidmængde forbundet med liposomer.

Dobbeltprover (6 mg) af begge torrede 1iposompropper blev derpà afvejet i provebeholdere til differentialscanningkalorime-tri (i det folgende benævnt "DSC"). DSC-spektra for blandin- 35 7

DK 156765B

gerne mellem OeC og 50eC blev bestemt pà et Perkin Elmer dif-f.erentialscanningkalor imeter. Kontrolprever til DSC blev ogsâ fremstillet ved at blande de samme vægtmængder DPPC og 3H-CP som i den oprindelige blanding og derpâ blande dem med 50 5 vægt% vand. Disse tjente som "ikke-1iposom"-kontrolblandinger. DSC-spektra af disse kontrolblandinger blev mâlt som beskrevet ovenfor.

DSC-spektret for DPPC alene bestod af en hovedtransition en-10 dotherm ved 41eC og en præ-transition endotherm ved 35eC. "Halvspids" liniebredden af hovedendothermen er ca. 3°C. De ovenfor beskrevne forseg viste, at i "ikke-1iposom"-kontrol-blandingerne blev begge spidser observeret i blandingernes DSC-spektra, og liniebredden forblev ved ca. 3°C. Dette anta-15 ges at vise, at i simple blandinger (dvs. ikke-1iposomer) æn-drer steroidet ikke lipidets DSC-spektrum. Spektra af dobbelt-1iposompræparaterne viste kun én transition (hovedendothermen), og gennemsnitsliniebredden af de præparater var 5,8°C, en væsentlig udvidelse i sammenligning med kontrolbîandinger-20 ne. Denne udvidelse skyldes den molekylære indvirkning af lipid og steroid i liposomerne fremstillet ved hjælp af den ovennævnte metode. Der kan derfor ikke være nogen tvivl om, at de ved hjælp af den ovennævnte metode fremstillede 1iposomer indeholdt steroidet i liposomerne.

25

Eksempel 3 Æglecithin (16,1 mg), ægphosphatidsyre (2 mg) og 3H-CP (1,66 mg) blev oplost i chloroform (5 ml), og oplosningen blev hældt 30 i en 250 ml rundbundet kolbe. Oplosningsmidlet blev fjernet ved stuetemperatur ved at rotere flasken og blæse en ter ni-trogenstrem deri. Lipidfilmen, der blev opnâet derved, blev derpâ dispergeret ved stuetemperatur i vand (5 ml), hvilket giver et 1iposompræparat. Dobbeltprover (50 μΐ ) blev udtaget 35 til scinti1lationstæl1ing. Resten af 1iposompræparatet blev fortyndet til 25 ml med destilleret vand i et ultracentrifuge-rer og ul tracentr i fugeret ved 120.000 g i 30 minutter. Den overliggende væske blev fjernet fra 1iposomproppen, og proppen

DK 156765 B

s blev dispergeret i destilleret vand (5 ml), Dobbeltprover (50 μ1) blev udtaget af denne dispersion, og inkorporeret steroid blev mâlt ved scintillationstælling. Resten af 1iposomdisper-sionen blev frosset under anvendelse af en methanol-fast car-5 bondioxidblanding, og oplosningsmidlet blev fjernet under anvendelse af et kommercielt frysetorringsapparat. Der blev sâ-ledes opnâet en frysetorret, potential liposom, blanding.

Den fryseterrede blanding blev lagret i 5 dage, og hertil blev 10 sat 0,9% vægt/volumen saltvand (5 ml). Liposomer blev dannet ved jævn omrystning af blandingen i en kolbe ved stuetempera-tur. Mikroskopisk undersogelse bekræftede nærværelse af liposomer. To dage senere blev liposomerne vasket to gange med 0,9% vægt/volumen saltvand ved hjælp af den ovenfor beskrevne 15 metode, bortset fra, at der blev anvendt saltvand i stedet for vand. Liposomer med steroidindhold blev bestemt ved hjslp af scinti11ationstælling. Sammenligning af radioaktiviteten af dispersionerne fer og efter fryseterring viste, at 72% af til-stedeværende steroid i det vaskede præparat fer fryseterring 20 blev bevaret i de vaskede liposomer, som blev dannet efter fryseterri ng.

Eksempel 4 25 DPPC (29,8 mg) og 3H-CP (3,32 mg) blev oplest i chloroform (5 ml) og stebt som en tynd film pâ vaggen af en 250 ml rundbun-det kolbe ved fordampning af oplesningsmidlet ved stuetempera-tur under anvendelse af en strem af ter nitrogen. Destilleret vand (10 ml) blev derpà sat til kolben, og blandingen blev 30 opvarmet til 70°C pâ et vandbad. Liposomer blev dannet ved at omrere den varme blanding pâ en bankvibromixer. Dobbeltprever (50 μΐ) af den resulterende dispersion blev udtaget til scin-tillationstælling. Resten af dispersionen blev vasket to gange ved fortynding til 25 ml med destilleret vand og ultracentri-35 fugeret ved 120.000 g i 30 minutter. Den vaskede liposomprop blev gendispergeret i destilleret vand (10 ml), og dobbeltpre-ver (50 μ!) blev udtaget til scinti llationstæl 1 ing. Denne dispersion (5 ml) blev frosset i en fryseblanding bestàende af 9

DK 156765B

meth'-anol og fast carbondioxid, og oplosningsmidlet blev fjer-net under vakuum under anvendelse af et kommercielt frysetor-ringsapparat. Der blev sâledes opnâet en frysetorret, poten-tialliposom, blanding, som blev lagret til den skulle anven-5 des.

Destilleret vand (5 ml) blev sat til den fryseterrede blanding, og den resulterende blanding blev opvarmet til 70eC pà et vandbad og omrystet jævnt. Mikroskopisk undersegelse af den 10 resulterende mælkeagtige suspension viste, at den bestod af en suspension af liposomer med en snæver sterrelsesfordeling. Denne suspension blev ultracentrifugeret ved 120.000 g i 30 minutter, og 1iposomproppen blev derpâ gendispergeret i des-tilleret vand (5 ml). Dobbe1tprover (50 μΐ) af den resulteren-15 de suspension blev udtaget til bestemmelse af liposomets ende-lige steroidindhold. Scinti1lationstæl1ing viste, at 78% af steroidet, som blev inkorporeret i den oprindeligt vaskede dispersion, forefandtes i det færdigvaskede 1iposompræparat, som blev dannet af den frysetorrede blanding.

20 DSC (se eksempel 2) pâ liposomerne fremstillet af den oprin-delige film og de, som blev fremstillet af den fryseterrede blanding viste, at 1ipidtransitionsendothermen blev udvidet ved hjælp af steroidet i liposomerne, og at denne udvidelse 25 blev bevaret efter, at den frysetorrede blanding blev disper-geret i destilleret vand. Dette viste, at steroidet blev inkorporeret i slutliposomerne, som blev fremstillet af den fry-seterrede blanding.

30 Eksempel 5

Aile fremgangsmàderne, som beskrives i dette eksempel, blev gennemfort i et sterilt rum (steri1iseret med formaldehyd og derpâ renset med steril luft) under anvendelse af almindelige 35 aseptiske forholdsregler. Fryseterringsapparatet (Edwards

Speedivac Centrifugal freeze-dryer, mode! 5PS) blev sterili-seret med formaldehyd og derpâ renset med steril luft. Det andet apparatur, der blev anvendt, blev enten steriliseret ved 10

DK 156765B

DPPC (697,2 mg), dipal mitoy1phosphatidsyre (99,6 mg) og korti-sol-21-palmitat (99,6 mg) blev oplest ved 60°C i gendestille-ret t-butanol (60 ml). Den varme oplesning blev straks steri-liseret ved passage gennem et 0,22 μ "MF-mi11ipore" filter 5 (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) og holdt ved en tem-peratur pâ 50°C. Denne passage blev gennemfert to gange. 2 ml prover af den stérile oplosning blev anbragt i 5 ml stérile multidosispreveglas. Indholdet af proveglassene blev frysetor-ret under anvendelse af det ovennævnte frysetorringsapparat, 10 og hvert proveglas blev derpâ lukket under anvendelse af en steril gummilukning og en metalmultidosiskapsel. Der blev sà-ledes opnâet lukkede prover af en steril frysetorret, potentiel liposom, blanding.

15 En steril 0,9% vægt/volumen vandig oplosning af natriumchlorid blev indfort i et af de ovenfor nævnte lukkede proveglas, som derpâ blev opvarmet til 50°C pâ et vandbad og omrystet kraf-tigt. Der blev sàledes opnâet et sterilt 1iposompraparat, som var velegnet til administration ved injektion.

20

Eksempel 6 Æglecithin (15 mg), cholestérol (2,09 mg) og dicetylphosphat (1,55 mg) blev oplost i chloroform (5 ml) og stobt som en tynd 25 film pâ et proverors vægge. 125I-angiotensin II (0,1 mg) i 3,3 mM phosphatpuffer (pH 7,4, 1 ml) blev sat til roret. Lipidet blev dispergeret i det vandige medium ved hjælp af en bænkvi-bromixer til dannelse af liposomer. Liposomdispersionen blev vasket to gange ved fortynding til 25 ml med 3,3 mM phosphat-30 puffer (pH 7,4), efterfulgt af ultracentrifugering ved 120.000 g i 1 time. Den vaskede liposomprop blev gendispergeret i 3,3 mM phosphatpuffer (7,4, 5 ml), og dobbeltprover (0,25 ml) blev udtaget til scintillationstælling. 4 ml af den resterende suspension blev anbragt i et proveror, frosset (methanol-fast 35 carbondîoxid) og frysetorret. Den resulterende frysetorrede, potentiel liposom, blanding blev gensuspenderet i 3,3 mM phos-phatpuffer (pH 7,4, 2 ml) og vasket to gange som fer. Den vaskede liposomprop blev gensuspenderet i 3,3 mM phosphatpuffer 11

DK 156765B

(pH 7,4, 4 ml). Oobbeltprever (0,25 μΐ) blev udtaget til scintillât i onstæl 1 i ng . 26% af den oprindelige mængde angiotensin II blev bevaret i liposomerne efter den ferste liposomfrem-stilling og vaskning. 28% af disse 26%, dvs. 7% af den oprin-5 delige mængde angiotensin II blev bevaret i liposomerne efter fryseterring og rekonstitution.

Den 3,3 mM phosphatpuffer (pH 7,4), som blev anvendt i dette eksempel og eksempel 7, blev fremstillet ved at oplose kalium-10 dihydrogenphosphat (0,895 g) og dinatriumhydrogenphosphatdihy-drat (4,765 g) i destilleret vand og supplere oplosnîngen til 1 liter med destilleret vand.

Eksempel 7 15 Æglecithin (15 mg), cholestérol (2,09 mg) og dicetylphosphat (1,55 mg) blev oplost i chloroform (5 ml) og stebt som en tynd film pà et preverers vægge. 3H-inulin (5 mg) i 3,3 mM phos-phatpuffer (pH 7,4, 1 ml) blev sat til reret, Lipidet blev 20 dispergeret i inulinoplesningen ved hjælp af en bænkvibromixer til dannelse af liposomer. Liposomdispersionen blev vasket to gange ved fortynding til 26 ml med 3,3 mM phosphatpuf fer (pH 7,4), efterfulgt af ultracentrifugering ved 120.000 g i 1 time. Den vaskede liposomprop blev gendispergeret i 3,3 mM 25 phosphatpuffer (pH 7,4, 2,1 ml), og dobbeltprever (1 μΐ) blev udtaget til scintillationstælling. Den resterende suspension blev frosset (methanol-fast carbondioxidblanding) og fryseter-ret i et preveror. Den resulterende fryseterrede, potentiel liposom, blanding blev gensuspenderet i 3,3 mM phosphatpuffer 30 (pH 7,4, 1 ml) til dannelse af liposomer og vasket to gange som fer. Den vaskede liposomprop blev gensuspenderet i 3,3 mM phosphatpuf fer (pH 7,4, 2 ml), og dobbel tprever (1 μΐ) blev udtaget til scintillationstælling. 21% af den oprindelige mængde inulin blev bevaret i liposomerne efter den ferste li-35 posomf remst i 11 i ng og vaskning. 17% af disse 21%, dvs. 4% af den oprindelige mængde inulin blev bevaret i liposomerne efter frysetorring og rekonstitution.

Claims

1. Fremgangsmàde til fremstilling af et 1iposomforstadium, 5 der kan dispergeres i et egnet vandigt medium til fremstilling af et vandigt liposompræparat, og som omfatter oplesning af mindst êt 1iposomdannende, amphipatisk lipid, mindst ên li-pidoploselig eller lipidbundet biologisk aktiv forbindelse, der kan være et lægemiddel, og eventuelt mindst ét hjælpestof 10 i et oplosningsmiddel, kendetegnet ved, at oples-ningen fryseterres til dannelse af en fryseterret, potential-liposom, blanding, idet der anvendes et oplesningsmiddel, som forbliver fast under frysetorringen.

2. Fremgangsmàde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at lipidet er et phospholipid.

3. Fremgangsmàde ifolge krav 2, kendetegnet ved, at phospholipidet er en naturlig lecithin. 20

4. Fremgangsmàde ifolge krav 2, kendetegnet ved, at phospholipidet er en syntetisk lecithin.

5. Fremgangsmàde ifolge krav 3 eller 4, kendeteg-25 net ved, at lecithinet er «glecithin eller dipalmitoyl- phosphatidyl-cholin.

6. Fremgangsmàde ifolge ethvert af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at den biologisk aktive forbindelse er 30 en vandopleselig ikke lipidbunden forbindelse.

7. Fremgangsmàde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes et hjælpestof, som er et stof, som tilveje-bringer en negativ ladning. 35

8. Fremgangsmàde ifolge krav 7, kendetegnet ved, at stoffet er ægphosphatidsyre, dipalmitoylphosphatidsyre, dicetylphosphat eller oksehjernegangliosid. DK 156765B

9. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes et hjælpestof, som er et stof, som tilveje-bringer en positiv ladning.

10. Fremgangsmâde if0lge krav 9, kendetegnet ved, at stoffet er stearylamin eller stearylaminacetat.

11. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at hjælpestoffet er cholestérol. 10

12. Fremgangsmâde ifelge krav 1, kendetegnet ved, at oplesnlngsmidlet har et smeltepunkt, som er nær ved stue-temperatur.

13. Fremgangsmâde ifelge krav 12, kendetegnet ved, at oplosningsmidlet er t-butanol, n-butanol, dioxan, eddike-syre, pyridin eller piperidin.

14. Fremgangsmâde ifelge ethvert af kravene 1 til 13» k e n -20 d e t e g n e t ved, at vand eller chloroform ogsâ indgâr i nævnte oplesning, som udsættes for frysetorring. 25 30 35