SE446688B - Medel for avlegsnande av mikroorganismer fran vevnader, vilket bestar av ett protein som kan bindas till mikroorganismerna - Google Patents

Description

www :ëçfl til! 446 ess 1 angriper mikroorganismerna genom behandling med desinfektions- medel eller antibiotika, men detta är ineffektivt och medför eterna med normalfloran. Ett annat sätt är fuktiga koksaltkom- de angivna olägenh mekanisk rengöring av sarvävnad medelst presser. Olägenheter härmed är bl.a. att vävnadsläkningen s och att sadana kompresser maste bytas ofta. Det senare t exempel på ett mer indirekt sätt att avlägsna patogena Det sekret som utsöndras hämma är et mikroorganismer fran sarvävnader. fràn sarvävnader är ett utmärkt substrat för mikroorganismer- na, och genom att man minskar mängden av detta sa minskas även växtmöjligheterna för mikroorganismerna. Andra metoder vari detta indirekta sätt användes är behandling av sar medelst ¶ V i! S lämpliga polymerer i exempelvis partikelform, vilka absorberar det sekret som utsöndras från sarvävnaderna. Vissa av dessa sekretabsorberande polymerer innehaller komplexbunden jod (s.k. jodoforer>, och med dessa uppnår man samtidigt en sek- retabsorptions- och en desinfektionseffekt.

Föreliggande uppfinning avser ett medel för avlägsnande av mikroorganismer från vävnader utan någon större påverkan av normalfloran.

En dominerande orsak till primära sarinfektioner och post- operativa infektioner är vissa grampositiva kooker, såsom Staphylocooous aureus och s.k. B-hemolyserande streptokooker A C och G. Patogena stafylokooker finns överallt i av grupp A, omgivningen, även i sjukhusmiljö där man räknar med att upp k till 80 % av personalen kan vara smittbårare. Gula stafylo- Q kooker (S.aureus) koloniserar särskilt vissa hudpartier, såsom armhålor, bäokenbotten och händer samt även i näsan. Även i torra eksem är saväl vita som gula stafylokooker mycket van- ligt förekommande. Den vanliga halsflussbakterien Strepto- oocous pyogenes (grupp A streptokook) förekommer även i hög frekvens hos vårdpersonal och patienter. Nosokomiala infek- tioner (s.k. sjukhussjukal sprids genom exogen smitta (fran exempelvis personal till patient) eller endogen smitta (pa- tienter med dessa mikroorganismer pa hud ooh slemihinnor in- fekterar egna sar) och har blivit ett allt större problem. För f k att nedbringa frekvensen av dessa infektioner har man hittills _ i: a _. _.-. _ , _,..e .... ..» ,.., fi-.ewan-s. 446 683 använt klassiska preventiva atgärder, såsom noggrann preopera- tiv hudrengöring och omläggning av infekterade eksem i separa- ta utrymmen.

Det första steget i de flesta infektionsprooesser utgöres av mikroorganismens bindning till vävnad. Nikroorganismerna bind- er specifikt, antingen direkt till någon komponent pa epitel- cellens yta eller till extracellulära molekyler i blodkoagel eller bindeväv som exponeras för mikroorganismer vid en epi- telskada. helt ny princip för av- nader, vilken baserar sig g till vävnadspro- Föreliggande uppfinning bygger pa en lägsnande av mikroorganismer fràn väv pa inhibition av mikroorganismers bindnin teiner pa slemhinnor, hud och i sar. n oellyta ett protein (protein komplementbindande delen Patogena stafylokocker har pa si A) som specifikt bindes till den (Fc-delen) av immunglobuliner tillhörande olika klasser hos ett stort antal djurarter. Denna bin d avlägsnande av antikroppar protein A bundet till en dningsspecificitet använd- es vid immunologiska tester och vi vid extrakorporal cirkulation medelst fast fas.

Det är även känt att stafylokooker agglutineras av normalserum fran olika djurarter. Denna reaktion beror pa en specifik bindning mellan bakterieytan och fibrin/fibrinogen.

A Det har nu visat sig att receptorer liknande de som finnes hos stafylokocker även finnes hos andra mikroorganismer. Frekvens- okocker och strepto- h andra typer av infek- studier av exempelvis stammar av stafyl kooker isolerade från sarinfektioner oc tioner visar att förmågan att binda exem virulens. vid exempelvis in- us aureus samt koagulas- pelvis íibronektin bidrar till mikroorganismernas fektioner orsakade av Staphylococc negativa stafylokooker bidrar denna bindningsförmaga till virulensen genom möjliggörande av initial vävnadskolonisation. k.- .. . ._ a.. ,,i..........r-.,..».... . -g5mgæ- A-, eååâ ie_ i 25 30 35 HO H5 (s 446 ess 4 Det har nu överraskande visat sig att proteiner eller fragment därav, eventuellt bundna till en bärare, är ett lämpligt medel för avlägsnande av mikroorganismer från vävnad. Föreliggande uppfinning avser således ett medel för avlägsnande av mikro- organismer från vävnad, såsom slemhinnor, hudoch sårvävnad, vilket består av åtminstone ett protein eller fragment därav, vilket kan bindas till mikrcorganismerna, och eventuellt en bärare till vilken proteinet eller fragmentet är bundet.

Lämpliga proteiner som kan användas enligt uppfinningen är fibrinogen, fibronektin, något immunglobulin, albumin, hapto- globin, B-2-mikroglobulin, kollagen, laminin, entaktin eller cnondronektin. Vidare kan man använda fragment av dessa pro- teiner. Dessa fragment kan vara peptider med en molekylvikt av 5xl02 - 105 , lämpligen 5x1D2 - 5x10 .

Lämpliga bärare som kan användas enligt uppfinningen är nagot polymert material, såsom agaros eller derivat därav, stärkelse eller derivat därav, cellulosa eller derivat därav, dextran eller derivat därav eller ett alginat. Vidare kan man som bärare använda något fibermaterial ingående i absorptionspro- dukter, såsom en kompress, en tampong eller liknande.

Proteiner eller fragment därav kan på känt sätt bindas till bäraren medelst en kovalent bindning via kolhydratdelen, pri- mära aminogrupper, sulfhydryl- eller karboxylgrupper i pro- teinet, exempelvis medelst divinylsulfon, epiklorhydrin, kar- bcdiimid, medelst transaminering eller via cyanbromidbryggor, eller genom kända biospecifika interaktioner, såsom fibronek- tins bindning till gelatin, glykoproteiners bindning till lektin eller antigeners bindning till antikroppar.

Proteiner eller fragment därav kan även absorberas direkt på bararen.

Föreliggande uppfinning belyses närmare i följande exempel: §§gmpgl_1: Hudområden på lår tvättades med fysiologisk kok- saltlösning. Därefter applicerades cirka 107 och l09 Staphylo- *re _-:_ ' ~ 'W än. * us ~ mix -. ..

J: _ w 5 446 eat -w-waågy-v .__-sewe- ÉÉ» _ __ _. oooous aureus (stam Newman) pa flera olika hudytor.Gel av sapharasew ae. u111 v11ken ribronektln oundits, annrinqaaes 1 2-3 mm tjocka lager pa en del av de hudomräden pa vilka stam Newman applioerats. Fibronektinet hade bundits till en cyan- bromidaktiverad gel av Sepharose® 48 genom att 10 mg fibronek- tin per ml cyanbromidaktiverad gel inkuberats i 2 timmar vid rumstemperatur under försiktig omröring. Reaktionen avbröts genom att 1M glyoinlösning sattes till reaktionsblandningen, varefter inkubationen forsattes under ytterligare 30 min. Före användning tvättades gelen noggrant. Ren Sepharoseø 48 använ- des som kontrollgel och applicerades på samma sätt pa de övri- ga med stam Newman applioerade hudomradena. Samtliga hudom- räden torkades med fläkt (kall luft). Efter 20-30 min av- lägsnades saväl försöksgel som kontrollgel med steril skal- 5 i å : F E É ß pell. Därefter anbringades nytt material av de bada gelerna och proceduren upprepades sa att behandlingen skedde totalt 3 ggr, ooh det under cirka 2 timmar.

Efter den upprepade proceduren visar odling att stam Newman nästan helt avlägsnats (endast enstaka bakteriekolonier iakt- togs) under det att odlingar fran hudpartier där kontrollgel anbringats endast visade en liten minskning i bakterietal. j à §¿g@gg¿_g: Försöket i exempel 1 upprepades, men i stället för stam Newman användes Staphylocoocus aureus (stam V 8). Samma typ av kontrollgel användes. Vid den efterföljande odlingskon- r 1 trollen iakttoqs en tillväxt av stam V8 som var avsevärt --.-š-.5:_x.>:,\_-_-. __ större än den för stam Newman. §§gmggl_§: Försöket i exempel 2 upprepades, men i stället för fibronektin användes fibrinogen. Bindningen av fibrinogen till gel av sepnaruse® as astadkdms pa samma satt som för tlbrsnek- tin i exempel 1. Även här användes gel av ren Sepharoseø 48 :+4- .x.:-_ som kontrollgel.

Efter den upprepade proceduren visar odling att stam V8 nästan helt avlägsnats (endast enstaka bakteriekolonier iakttogs) under det att odlingar från hudpartier som behandlats med kontrollgel endast visade en liten minskning i bakterietal. «--»....,--1.-...~..e... , «.~.-.»--~ .- _ . - -.- a._.i...._.._.i..._....-,..i....__.._.-. nu. __, __. .,.,, , _ _,__$__,_. .__ un" _ _ f-ssss-etlfl- _- _ ',¿%al» ?; gg ; ~ » 4 _ i~al,i_ - _ l,,a,_ ¿í_ 1 , _, 30 w Us '40 #5 446 sea 6 Dessa exempel visar att stam Newman har íibronektinreceptor et att stan V8 bindes mycket svagt till fibronektin, Vidare frangar att en stan under d men däremot har fibrinogenreceptor. med Fn-receptor specifikt avlägsnas. el 4 - 19: Exempel 1 upprepades under användande av Sta- šššflfl-- ..... _- phylococcus aureus, stam SA 113 och stam Cowan 1, sant grupp A streptokock, stam H 15757 och stam 11270. immunglobulin G, fibri- De proteiner som användes var albumin, var bundna till en gel nogen respektive fibronektin, ooh dessa av Sepharoseø 48 pa samma sätt som fibrinonektin i exempel 1.

Gel av ren Sepharoseø 43 användes i samtliga försök som kon- trollgel.

Genomförandet av den i exempel 1 beskrivna proceduren gav vid efterföljande odling nedanstående resultat för respektive mikroorganism och protein.

Staphylococcus aureus (stam SA 113) visade sig odlingsnegativ (endast enstaka bakteriekolonier iakttogs) da fibronektin användes, under det att positiva odlingsresultat av denna stan erhölls da albumin, immunglobulin G respektive fibrinogen användes.

Staphylococcus aureus (stam Cowan 1) visade sig odlingsnegativ da immunglooulin G, fibrinogen respektive fibronektin använ- des, under det att positiva odlingsresultat av denna stam er- hölls da albumin användes.

Grupp A streptokock (stam H 15757) visade sig odlingsnegativ da albumin respektive libronektin användes, under det att positiva odlingsresultat för denna stan erhölls da innunglobu- lin G respektive fibrinogen användes.

Grupp A streptokock (stam 11270) visade sig odlingsnegativ da fibrinogen användes, under det att positiva odlingsresultat för denna stam erhölls da albumln, inmunglobulin G respektive -.»-....._,~_, __ _ __ 4_ _ _ g __ _... . ., .e k. ..... ,._..,., __...,_...,« f 7:!!!- s.;ioo 446 688 tibronektin användes.

Odlingar fran hudpartier där kontrollgel anbringats visade i samtliga íall positiva odlingsresultat.

Sjukhuspersonal med konstaterad kolonisering av s aureus indelades i tva Samt- §zsmasL_Z0= antibiotikaresistent Staphylooooou s- respektive kontrollgrupp). sade positiva odlingsresultat vid n behandlades med bon- vilka tussar infördes lika stora grupper (försök liga försökspersoner uppvi upprepade provtagningar. Försöksgruppe ullstussar doppade i fibronektinlösning, i näsborrarna och hölls kvar där under ett ävenledes de doppade par timmar, var- efter de ersattes med nya bomullstussar, i fibronektinlösningen. Prooeduren upprepades så att behand- lingen skedde totalt 3 ggr. Ko samma sätt, varvid dock obehandlade ntrollgruppen behandlades pa bomullstussar användes. onerna i kontrollgruppen efter den upp- under det Prover tagna på pers n visade positiva odlingsresultat, repade prooedure n var helt nega- att prover tagna pa personerna i försöksgruppe tiva . §¿ggggL_21: Möss (20-30 g, CBA-stam) rakades och underkastades en brännskada av andra eller tred internationell standard och pa en yta av 1 x 1 om eus (stam Cowan 1) användes som mikroorga- je graden, och det enligt 2 min). Staphyloooocus aur mikroorganism i detta försök. Suspensioner av 10 1 saltlösning (fosfatbuffrad> iordningställdes och ion pa bränn- nismer per m samtliga möss bepenslades med 0,5 ml suspens Mössen indelades i försöks- ooh kontrollgrupp. För- tin bundet till gel av behandlades med skadan. söksgruppen behandlades med fibronek 48 under det att kontrollgruppen 48. Behandlingen tillgiok sa att gelan nflytande skikt av cirka 2-3 nu t skikt genom avskrapning med och behandlingen upprepade: Sepharose® ren gel av Sepharosem patördes sarytan i ett samma tjocklek. Efter avlägsnande av et skalpell pafördes ett nytt skikt, till det att totalt 3 gelskikt paíörts ooh avlägsnats. Där- elter togs prover fran brännskadeytan, vilka odladas. »a~^-<|-1.er~_&~...\.,_ . _, _ _' HM , f wa MQ 'Jl ZG 35 HC 446 688 5 försöksgruppen visade sig odlings Prover från möss i kon- n 3 kolonier upp Prover från möss i negativa (d.v.s 1-3 kolonier) efter 1 dygn. trollgruppen visade sig odlingspositiva (mer ä till sammanflytande växt) ännu efter 3 dygn. v möss som i exempel 21 användes. I šëSm2sl-Z2= Samma typ e LK 499, stället för S. aureus anvân men i övrigt upprepades proceduren i exempel 21. des Staphyloooocus capitis, öss i försöksgruppen visade sig odlingsnegativa s i kontrollgruppen Prover från m på dygn 2, under det att prover från mös var odlingspositiva ännu efter dygn 4.

Samma typ av möss som i exempel 21 användes. I §!šE2šl-Z3= es Staphylooooous haemolytious, stället för S. aureus använd men i övrigt upprepades prooeduren i exempel 21.

Prover fran möss i såväl försöksgrupp som kontrollgrupp var odlingspositiva efter 3 dygn.

Samma procedur och stam som i exempel 21 användes, §!âmEsL-Zí= es med íibrinogen bundet men mössen i försöksgruppen behandlad till gel av Sepharose® AB.

Prover fran möss i försöksgruppen visade sig odlingsnegativa pa dygn 2, under det att prover fran möss i kontrollgruppen var odlingspositiva pa dygn 4. §5gmggl_g§: Samma procedur och stam som i exempel 22 användes, des med iibrinogen bundet till gel av Sepharosem 43.

Prover fràn möss i såväl íörsöks- som kontrollgrupp visade sig odlingspositiva efter h dygn. §§gmggL_gg: Samma procedur och stam som i exempel 23 användes, men mössan i íörsöksgruppen behandlades med íibrinogen bundet till gel av Sepharoseø 48. . ..._..-»r-a.ßq>>~ w-lv- .~-v----~-.,,.4~..v.

'~="HL-ku-...«...-«..~....,,..,...-... ”_ WW h » - .NW _! . -.æ~_~sa_s<_f-.____ _ __ eesesíáiïla. ”k I \ f wfiw 1 Jb 20 25 H0 H5 446 688 9 Prover fran möss i saväl försöks- som kontrollgrupp visade sig odlingspositiva efter 4 dygn.

Av utföringsexemplen framgår att olika mikroorganismer bindes till olika proteiner. De visade bindningarna mellan respektive mikroorganism och protein har bekräftats med in vitro-försök.

Dessa har utförts genom att respektive mikroorganism har in- kuberats med respektive protein, vilket har varit märkt med radioaktiv jod. Efter avslutad inkubation har mängden radio- aktivt märkta proteiner bundna till respektive mikroorganism uppmätts. I de fall där mikroorganismen avlägsnats vid be- handling med ett protein (odlingsnegativa prover) har således in vitro-försök visat att respektive mikroorganism bundits till det radioaktivt märkta proteinet, under det att i de fall där mikroorganismerna ej har avlägsnats (odlingspositiva prover) efter behandling med ett protein har in vitro-försök visat att det ej föreligger någon bindning mellan motsvarande mikroorganism respektive radioaktivt märkt protein.

Nan kan givetvis även binda proteinerna till fibermaterial ingående i nagon absorptionsprodukt, såsom kompresser eller tamponger i ooh för avlägsnande av mikroorganismer fran sar- vävnad eller annan vävnad. Kompresser till vilka proteiner bundits är lämpliga vid behandling av sar. Tamponger till vilka protein bundits kan användas exempelvis vid operationer för torkande av operationssar, eller sasom menstruationstam- ponger, där de kan användas för avlägsnande av de mikroorga- nismer som orsakar den s.k. tampongsjukan.

Medel enligt föreliggande uppfinning kan även användas för avlägsnande av mikroorganismer i särhàlor, vilka t.ek. uppstår efter öppnande av absoesser, sasom analabsoesser¿\::Fvid med- let lämpligen kan vara bundet till ett förbandsmaterial som är utformat efter sàrhalans form för att fylla upp denna och hindra att denna förslutes. Ett sadant förbandsmaterial kan exempelvis utgöras av ett fiber- eller granulatformigt absorp- tionsmaterial inneslutet i ett hölje av ett hydrofobt mate- rial. Vidare kan proteinet inga i en spolvätska för av- lägsnande av mikroorganismer vid lokala infektioner. i :å

Claims (10)

H0 H5 446 688 lo PATENTKRAV

1. Medel för avlägsnande av mikroorganismer från vävnader, såsom slemhinnor, hud- ooh sarvävnad, k ä n n e t e c k n a t av att det består av åtminstone ett protein eller lragment därav, vilket kan bindas till mikroorganismerna, och even- tuellt en bärare till vilken proteinet eller fragmentet därav är bundet.

2. Medel enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att pro- teinet eller fragment därav år fibrinogen, fibronektin, ett immunglobulin, albumin, haptoglobin, ß-2-mikroglobulin, kolla- gen, laminin, entaktin eller chondronektin.

3. Medel enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att frag- mentet av proteinet är ett fragment av fibrinogen, fibronek- tin, ett immunglobulin, albumin, haptoglobin,ß-2-mikroglobu- lin, kollagen, laminin, entaktin eller chondronektin.

4. Medel enligt krav 3, k ä n n e t e o k n a t av att frag- mentet är en peptid med en molekylvikt av 5x102 - 105 .

5. Medel enligt nagot av kraven 1-4, k ä n n e t e c k n a t av att bäraren utgöres av ett polymert material, sasom agaros eller derivat därav, stärkelse eller derivat därav, cellulosa eller derivat därav, dextran eller derivat därav eller ett alginat.

6. Medel enligt nagot av kraven 1-4, k ä n n e t e c k n a t av att bäraren utgöres av ett fibermaterial ingående i absorp- tionsprodukter, sasom en kompress eller en tampong.

7. Medel enligt nagot av kraven 1-6, k ä n n e t e o k n a t av att proteinet eller fragmentet därav är bundet till bäraren medelst divinylsulton, epiklorhydrin, karbodiimid, medelst transaminering, via oyanbromidbryggor eller genom biosplciíik interaktion. “"'“" '*~:----~ u- -ww _» at, _ _ __________*___________« _ v___~___ __ ” 'i ”_““~v@1!v~ M.. -.-«»f~~«»~.-»\...w-..-...l..~-.-.alal. -.. l e... ZO 446 688 11

6. Medel enligt nagot av kraven 1-6, k ä n n e t e o k n a t av att proteinet eller fraqmentet därav är absorberat pa bära- ren. såsom fibrinogen, fibronektin, ett B-2-mikroglobulin, kolla- eller fragment såsen

9. Användning av proteiner, immunglobulin, albumin, haptoglobin, entaktin eller ohondronektin, gen, laminin, nande av mikroorganismer från vävnader, därav för avlägs slemhinnor, hud- och sàrvävnader. ndning av proteiner eller fragment därav enligt krav

10. Anvä av att proteinet eller fragmentet 9, k ä n n e t e c k n a d därav är bundet till eller absorberat på en bärare. :w i ._ ...så 2"; __ l i _ _. .l...._.f-a.~.»._..-.......-..fl.~,,-J -'4'