SE431257B - Sett och anordning for immunanalys med magnetisk metall eller metalloxid som merksubstans - Google Patents

Description

7â1fl351-2 Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för bestämning av närvaron av utvalda immunokemiska svarssubstanser såsom antikroppar eller antigen i kroppsvätskor. Dessa utvalda substanser benämnes hädanefter analyssubstanser. g Bestämningen av sådana analyssubstanser ger mycket användbar medicinsk information. Så utföres t.ex. havande- skapstest, syfilistest och blodfaktortest alla numera med konventionella immunokemiska metoder. Det mesta av dessa metoder omfattar visuell inspektion av bildningen av utfällda eller agglutinerade antingen-antikropps-komplex. Desa för- dfaranden erfordrar ibland många upprepningar vid olika reagens- förhållanden för att säkerställa rätt resultat och erforduar även en individuell, visuell inspektion för varje testresultat.

Man har även använt radioaktiva och fluorescerande märksubstan- ser för att undvika subjektiv, visuell bestämning. Dessa för- faranden är emellertid ibland förknippade med problem såsom användningen av dyra eller obeständiga märksubstanser eller när det gäller känsligheten eller säkerheten vid hanteringen av radioaktiva material. Vid förfarandet enligt föreliggande -uppfinning användes immunreagens märkta med partiklar såsom 7810351-2 varon av analyssubstansen i kroppsvätskan. På samma sätt, i ett indirekt test, omsättes immunreagenset med receptor- reagenset men inte med receptorreagens-analyssubstans-komplexet.

Om inga reaktanssubstanser upptäckes på ytan påvisas närvaron av analyssubstansen i kroppsvätskan. I ett kompetetivt test placeras kroppsvätskan och immunreagenset på ytan samtidigt.

Mängden reaktanssubstanser på ytan är ett mått på mängden analyssubstans i kroppsvätskan. Detta system kan användas manuellt, men det kan lätt anpassas för automatisk hantering.

Uppfinningen beskrives närmare med referens till de bifogade ritningarna av vilka fig. 1 beskriver ett testkort, som är användbart enligt uppfinningen, fig. 2 är en schematisk återgivning av de reaktioner, som ingår i uppfinningen.

Kända förfaranden kan användas för att bestämma när- varon av reaktanssubstanserna på testytan. Om reaktanssub- stanserna t.ex. påverkar dielektricitetsegenskaperna hos ytan, avslöjar en kapacitansmätning om partiklarna finns närvarande. I ett annat exempel, om partiklarna är magnetiska, kan magnetiska avkänningshuvuden användas såsom de, som före- kommer i vanlig bandregistreringsutrustning. Kapacitivitets-, konduktivitets- och magnetisk permeabilitets-mätningar, som inte erfordrar direkt kontakt med testytan, föredrages, men mätningar med användning av direkt kontakt mellan ytan och detektorn uteslutes inte. För att man skall kunna påvisa när- varon av partiklarna föredrages att testytan är inert i för- hållande till den egenskap, som skall mätas. Det är emellertid möjligt att anordna receptorreagenset i band på ytan eller att inducera en periodisk magnetisering på ytan såsom den, som alstras av ett magnetiskt bandregistreringssystem och där- efter föra ytan med en speciell hastighet förbi en detektor, som registrerar frekvensen. Den bestämda frekvensen är en funktion av placeringen av banden av receptorreagens eller inducerad periodisk magnetisering och ytans rörelsehastighet.

Själva testytan behöver således inte vara fullständigt fri från elektrisk reaktans för att anses vara inert för de syften, som avses med uppfinningen. I ett föredraget system för att lifsiåråsfšdli-iá"till" bestämma närvaron av en magnetisk märksubstans belägges test- ytan nära en referensyta med magnetiska partiklar. Under immun- reaktionerna kan både testytan och referensytan magnetiseras på ett periodiskt sätt. Detektorkretsen kan fås att bestämma endast den del av signalen från testytan, som motsvarar signalen från referensytan. Detta arrangemang minskar effekterna av systemstörning och ger ökad känslighet. D Testytan måste också kunna fästa vid receptorreagenset och inte interferera med testresultatet. Testytan kan vara slät eller ha fördjupningar eller gropar, vari varje test utföres. Även om många material är lämpliga testytor, föredrages plast- kort eller -remsor. Den testyta, på vilken receptorreagenset fästes, kan föreligga innesluten i plastförpackningar eller påsar. Dessa förpackningar kafiäven innehålla immunreagenset i ett separat utrymme, vilket immunreagens är avsett att sättas till testytan efter tillsats av prov.

Närvaron av förändring i elektrisk reaktans såsom magnetisk aktivitet kan bestämmas även när en mycket liten mängd av reaktanssubstansen är närvarande. Därför erfordrar varje test vanligen endast en droppe kroppsvätska, och test- ytan kan vara mycket liten. Följaktligen kan ett stort antal separata testytor och om så önskas referensytor anordnas på ett enda kort eller band. De separata ytorna kan antingen vara en serie tester för olika utvalda proteiner eller en serie tester för samma protein, när koncentrationen av immunreagenset på testytan varieras inom ett intervall för att utvisa inte endast närvaron av det utvalda proteinet utan även dess unge- färliga koncentration i kroppsvätskan.

Reeeptorreagenset kan fästas vid testytan med ytabsorp- tion, inneslutning i gel, kovalent bindning eller andra liknande förfaranden. Av dessa föredrages kovalent bindning. Vilket system som helst för fastgörning av receptorn så att reagens- molekylerna på testytan orienteras så att de får maximal aktivi- tet föredrages även. Receptorreagenset omfattar inte endast anti- kroppar utan även cellulära receptorproteiner eller Vävnads- receptorproteiner, serumtransportproteiner och lektiner. Av dessa har troligen antikroppar den mest omfattande tillämpbar- heten. Andra klasser av föreningar såsom kelatbildande medel kan även vara värdefulla receptorreagens om de reagerar med den rs1os51-2 substans, som skall bestämmas i kroppsvätskan, med tillräcklig specificitet så att felaktiga resultat, orsakade av konkurreran- de reaktioner, undvikes.

De material, som är användbara såsom reaktanssubstanser, som förenas med immunföreningarna och bildar immunreagenset är de, som förändrar den elektriska reaktansen i testytan.

Det betyder att dessa material om de fördelas såsom ett finfördelat pulver pâ testytan förändrar de dielektriska, konduktiva eller magnetiska egenskaperna hos ytan. Fördelen med föreliggande uppfinning består i användning av partiklar, som kan upptäckas i mycket små mängder av mycket känsliga men väl utvecklade och lättillgängliga elektriska komponenter.

Vidare undviker man vid användning av sådana material proble- men med övergàende aktivitet och hanteringsrisker, som före- ligger vid användning av radioaktiva märksubstanser. De mer fördragna metallerna och metalloxiderna är de, som företer ferromagnetism. Sådana material kan omsättas med antikroppar- na och anbringas på testytan i ett demagnetiserat tillstànd.

När de en gång anbringats kan hela ytan exponeras för ett mag- netiskt fält för magnetisering av partiklarna för att de skall kunna upptäckas.

Denna magnetiska aktivitet kan därefter lätt upptäckas med olika välkända anordningar såsom ett vanligt magnetband- system eller en Hall-effekt-detektor. Magnetiska material in- kluderar, men begränsas inte till, metaller och legeringar såsom järnpulver, nickel, kobolt, CrO2, “Ferrofluid" (en fer- romagnetisk vätska, framställd av Ferrofluids Corporation), C00, NiO, Mn2O3, magnetiska plumbitföreningar, magnetiska järnoxider och “Alnico“, en legering av aluminium, nickel, kobolt och koppar. Andra värdefulla material är organiska lad- dade komplex med hög elektrisk konduktivitet såsom N-metylfe- nazinum-tetracyanokinodimetan, [Öe(NO3)6Mg(Hí)6]3.6H2O-kristal- ler, Bi2Se3-kristaller och tetrahiofulvalenkomplex med tetra- cyano-p-kinodimetan eller K2Pt(CN4)BrO3.H2O och amorfa mate- rial med magnetiska egenskaper såsom kalkogeniderna, t.ex. europium-kalkogenideroch kalkogenida glaspartiklar.

Föredragna magnetiska material är de magnetiska oxider- na av järn, kobolt, nickel, krom och mangan och oxidbelagda partiklar av järn eller nickel. :f-sfi .oss 1- 2 För att åstadkomma en tillräcklig ytarea för att fästa immunföreningarna skall företrädesvis reaktanssubstansenna ha en stor ytarea, minst 100 m2/g. Partiklar med en diameter i intervallet 0,01-50/um föredrages.

Dessa material kan fästas vid immunföreningarna med kända förfaranden. Reaktanssubstanserna kan inkapslas med en organisk polymer, till vilken immunföreningarna kan bindas, eller kan ytan silaniseras med vanliga förfaranden. Organiska föreningar kan därefter fästas vid silanbindningen. Den ameri- kanska patentskriften 3 954 666 beskriver polymerinkapslingar av kärnmaterial, och den amerikanska patentskriften 3 983 299 beskriver användning av silanbindningar för att binda organiska föreningar till oorganiska partiklar. Förfaranden för att göra enzymer orörliga på magnetiska bärare, vilka förfaranden lika- väl skulle kunna tillämpas på antikroppar, beskrives i methods in Enzymology, 44 sid. 324-326. Det sätt på vilket de raktiva organiska föreningarna fästes vid reaktanssubstan- serna är inte föremål för föreliggande uppfinning. Sålunda kan även andra bindningsförfaranden användas så länge de inte interfererar med immunföreningarnas mümflkmbihüxme fönmkm; hmmm* föreningarna utväljs så att de är specifikt reaktiva med an- tingen receptorreagensen eller med komplexet mellan receptor- reagenset och den substans i kroppsvätskan, som skall bestämmas.

Eftersom förfarandet enligt föreliggande uppfinning utnyttjar elektronisk och inte visuell avläsning, kan det lätt anpassas till automatiska förfaranden. Med uttrycket :"automatisk" avses inte att utesluta möjligheten att en del av förfarandena kan utföras manuellt.

På fig. l visas ett.föredraget testkort l försett med flera ytor 2, till vilka receptorreagens bundits. Separata ytor med olika receptorreagens kan anordnas, eller kan samma receptorreagens bindas till varje yta i olika koncentrationer.

Kortet har en tryckt testidentifiering 3 samt en kod 4, som kan läsas av en maskin, och som innehåller den nödvändiga in- formationen för automatisk hantering. Valfritt kan kortet ha ett utrymme 5, där en patients identifieringskod kan införas.

Fig. 2 visar schematiskt en testyta 2 på ett testkort i fig. 1. Receptorreagensen 10 binds till testytan. Kroppsvätska .i 7810351-2 från en patient, innehållande antikropparna ll, vars närvaro skall bestämmas, sättes till varje testyta. Antikroppen ll, om den finns närvarande, bildar ett komplex 12 med receptor- reagenset. Testytan exponeras därefter för immunreagenset 13, som består av en ímmunförening 14, bunden till en reaktans- substans 15. Detta immunreagens bildar komplex 16 med komplexet mellan receptorreagenset och patientens antikropp, om sådan föreligger, på testytan.

' Ett föredraget system för utföring av uppfinningen består av en station, där de erforderliga testkorten för de önskade testen införes. Kort kan införas individuellt eller i grupp efter behov. Korten föres automatiskt till en station för provtillsats, där en droppe av en patients kroppsvätska anbringas på varje testyta på kortet. En automatisk anordning kan innehålla temperaturkontroll och en station för att bringa kroppsvätskan i jämvikt på testytorna under en förutbestämd tid. Kortet föres därefter till en station, där immunreagenset anbringas på varje testyta. Återigen kan system för tempera- turkontroll och jämviktsinställning föreligga. Därefter av- lägsnas överskott av immunreagens, och kortet undersökes därefter med avseende på närvaron av reaktanssubstanser, som finns kvar i testet, genom att man mäter förändringar i elekt- risk reaktans hos kortets testytor.

Det skall framhållas att i den speciella beskrivna. utföringsformen föres testkortet igenom varje station. Andra utföringsformer där varje operation utföres på ett kort, som förblir vid ett enda ställe i en automatiserad eller halv- -automatiserad anordning kan även användas.

Förfarandet enligt denna uppfinning kan tillämpas vid bestämningav många olika material inkl., men ej begränsat till, antigener och antikroppar av viruellt, bakteriellt, cellulärt och humant ursprung förutom hormoner, läkemedels- metaboliter och specifika proteiner. Förfarandet är t.ex . tillämpbart vid bestämning av humana antikroppar, t.ex. anti- tyroglobulin, antigena proteiner såsom komplementfaktorer, proteinhormoner, immunoglobuliner och fria lätta och tunga kedjor, t.ex. tyroxinbindande globulin och olika slag av mikroorganismantigener och mikroorganismantikroppar såsom hepatitis A och B virus. Användnfingen av uppfinningstanken J än 033100402 är primärt beroende på tillgängligheten av lämpligt material, som kan tjänstgöra som ett receptorreagens, specifikt reaktivt med den substans, som skall bestämmas.f Exempel 1 Vid bestämning av en human antikropp, IgG, kan ett serumprov först spädas med en proteinbuffertlösning innehållande 0,l27% bovinserumalbumin och fosfatbuffrad fysiologisk kok- saltlösning vid pH 7,7 I 0,2. Natriumazid 0,1 %, ett antimikro- biellt medel, kan sättas till det utspädda provet såsom konserveringsmedel.

Det utspädda patientprovet kan kvantitativt överföras till ett testreaktionskort. Den fasta fasen eller bäraren bestående av anti-humant IgG, kovalent bundet till derivati- serade polyamidark, framställes på följande sätt: Nylon-6-film (l0 g) kan suspenderas i BN H01 (300 ml) och omröras fyra timmar vid 30°C, avlägsnas från lösningen och omfattande tvättas med vatten, etanol och eter. Karboxyl- halten i en nylon-6-film, som hydrolyseras fyra timmar, är ca 30-90/umol/g. 0 Kopplingen av antikroppen till den depolymeriserade nylon-6-bäraren kan utföras genom karbodiímidaktivering.

Den totala reaktionen omfattar kondensationen mellan karboxyl- gruppen på bäraren och amingruppen på antikroppen. Reaktionen utföres i två steg.

Ett gram av den syrabehandlade nylon-6-filmen sättas till en lösning av 50 mg 1-cyklohexyl-3-(2-morfolinoetyl)- -karbodiimid-meto-p-toluensulfat i 10 ml vatten. Reaktions- blandningen justeras till pH 4-5 med 6N H01, och reaktionen får fortsätta vid 30°C under 2-Ä timmar. Filmen avlägsnas därefter och tvättas flera gånger med vatten för avlägsning av överskott av karbodiímid.

Den aktiverade filmen införes därefter i en lösning, innehållande kommersiellt tillgänglig anti-humant IgG i koncentrationer om l-50 mg protein i 10 ml vatten. Efter justering av lösningen till ett pH-värde mellan H och 5 fortsättes reaktionen 2-4 timmar vid rumstemperatur eller över natt vid Ä°C. Reaktionslösningen dekanteras därefter, och filmen tvättas med vatten eller buffert.

Testytan kan därefter bringas i jämvikt med det ut-J 7310351-2 spädda provet under en tillräckligt lång tid för att antikropps- bindning skall kunna ske. Den första jämvikten kan typiskt ske inom 30 min. vid 52°C. Reaktionszonerna kan därefter tvättas med samma proteinbuffertlösning och skakas för att tvätta bort icke absorberat antigen från ytan.

Testreagenszonerna kan därefter sänkas ned i ett över- skott av ge/tanti-humant IgG, märkt med magnetiska partiklar.

För att jämvikt skall inträda på kortet spädes immunpartiklarna lämpligen i fosfatbuffert-fysiologiskt koksalt vid pH 7,5 I 0,5 innehållande 0,12% bovinserumalbimin. Efter det att jämmikt inträtt kan testreaktionsytorna tvättas med BSA-fosfatbuffert iv PH 7.7 i 0.2- Reaktionsytorna magnetiseras i ett magnetfält, och testkortet föres igenom en detektor, som kan bestämma närvaron av magnetiska partiklar.

Exempel 2 Detta exempel visar bestämningen av antikroppar, riktade mot specifika antigener.

Ett serumprov späddes med proteinbuffertlösning inne- hållande 0,1 % bovinserumalbumin och tris-(hydroximetyl)- -aminometan (Tris) buffrad vid pH 6,5 ¿ 0,ß. Natriumazid, 0,1 %, ett antimikrobiellt medel, sattes till det utspädda provet såsom konserveringsmedel.

Dauwfimawwæöwfiüæsmmfimfiwtfllm testreaktionsyta. Den fasta fasen, bäraren, bestående av humant serumalbumin, kovalent bundet till derivatiserad polyamid- eller polymetakrylsyrapolymerer framställdes på följande sätt: Den totala kopplingsreaktionen mellan albumin och filmer kan omfatta tvärbindning mellan amino- eller karboxyl- grupperna i filmen och proteinet. Tvärbindning kan åstadkommas genom användning av ett polyfunktionellt aziridin-reagens, som är mycket reaktivt med material, som innehåller aktiva väten.

Filmerna för bindning av humant serumalbumin suspenderades först i en l % lösning av XAMA-polyfunktionell aziridin (Cordova Chemical, Sacramento, California). Efter omrörning vid 27°C under 30 minuter avlägsnades filmerna från lösningen och tvättades med destillerat vatten. De tvättade 4 7e1o3s1à2ii 10 filmerna omrördes därefter i en lösning innehållande humant serumalbumin (l mg/ml) under 12 timmar vid H00. Det immobili- serade albuminfílmreagenset kan därefter tvättas upprepade gånger med *sne-buffert (pH 6,5 3 0,11) vid 14°c. 'rväctningarna fortsättes, tills albumin ej längre frigöras från filmen.

Representativa halter av albuminbindning till filmerna återges nedan: Film (/ug/omg) Ytgrupper Surlyn Ga 3,5 Mylar<)jonomer harts- polyester (flam/behandlad) 7,3 inga ytgrupper e polykarbonat nylon (HCl-behandlad) 16,0 aktiverade ytgrupper etylen-malein-anhydrid 31,0 Testytan för anti-HSA bringades i jämvikt med det utspädda provet under en tillräckligt lång tid för att anti- -HSA-bindning skulle äga rum. Reaktionsytan tvättades därefter med samma Tris-buffertlösning (pH 7,4 1 0,4), som användes i exempel 1, för att avlägsna icke bundna provrester från Ytan.

Testreagenskortet nedsänktes därefter i ett överskott av getanti-humanserum-albumin märkt med magnetiska partiklar.

För jämvikt späddes immun anti-HSA partiklarna pålämpligt sätt i Tris-buffert vid pH 6,5 3 0,5 innehållande 0,12 % getserum- albumin. Efter jämnvikt tvättades testreaktionsytorna fria från icke bundna partiklar med getserumalbumin-Tris-buffert.

De magnetiska partiklar, som är kvar på reaktions- ytan, kan magnetiseras som svar på en magnetisk signal med känd frekvens. Testkortet kan därefter föras igenom en detek- tor, som kan upptäcka närvaron av de magnetiska partiklarna.

Upptäckten av reaktansegenskaperna hos testytan kan underlättas med instrumentförfaranden enligt faslåsningsprincipen, med faskänslig likriktning och andra vanliga elektroniska för- stärkarsystem, som är kända för fackmannen inom tekniken.

Med uttrycken "huvudsakligen bestående av " och "huvudsakligen kännetecknas av" uteslutas inte ytterligare J 78110351-2 11 förfaringssteg eller beståndsdelar, som inte förhindrar att fördelarna med uppfinningen kan förverkligas.

L_

Claims (5)

w oo ...i o m 01 -n-à I h) li Patentkrav

1. Sätt att bestämma närvaron av en analyssubstans i en kropps- vätska, varvid a) kroppsvätskan bringas i kontakt med en yta, som är belagd med receptorreagens, som specifikt kan reagera med analyssubstansen, b) den belagda ytan bringas i kontakt med immunreagens, innehål- lande immunförening, som specifikt kan reagera med receptorrea- gensen eller med ett komplex av analyssubstansen och receptorrea- gensen, vilken immunförening är förenad med reaktanssubstanser, som kan påverka elektrisk reaktans, c) icke omsatt immunreagens avlägsnas från ytan och d) ytans elektriska reaktans mätes, k ä n n e t e c k n a t av att reaktanssubstanserna är magnetiska metaller och metalloxider.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att reaktans- substanserna är partiklar valda från den gruPPf som består av de magnetiska oxiderna av järn, kobolt, krom, nickel och mangan, samt oxidöverdragna partiklar av järn och nickel.

3. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att recep- torreagenset är bundet till ytan genom adsorption, inneslutning i gel eller kovalent bindning.

4. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att ytan är fäst vid testinformation, som kan läsas av maskin.

5. Automatiserat analyssystem för att bestämma närvaron av en analyssubstans i en kroppsvätska, varvid a) kroppsvätskan bringas i kontakt med en yta, som är belagd med receptorreagens, som specifikt kan reagera med analyssubstansen, b) den belagda ytan bringas i kontakt med immunreagens, innehållan- de immunförening, som specifikt kan reagera med receptorreagensen eller med ett komplex"av analyssubstansen och receptorreagensen, vilken immunförening är förenad med reaktanssubstanser, som kan påverka elektrisk reaktans, A 7810351-2 I3 c) icke omsatt immunreagens avlägsnas från ytan och d) ytans elektriska reaktans mätes, vilket analyssystem k ä n n e t e c k n a s av att det inkluderar en testyta med ett därtill bundet receptorreagens, vilket receptor- reagens specifikt reagerar med en komponent i en kroppsvätska, en station för anbringning av ett prov från en kroppsvätska på test- ytan, anordning för applicering av ett immunreagens på testytan, vilket immunreagens består av immunföreningar, som specifikt rea- gerar med receptorreagenset eller med ett komplex av receptorreagen- set och komponenten i kroppsvätskan, vilka immunföreningar är över- dragna på reaktanssubstanser, som innefattar partiklar, som kan pâ- verka elektrisk reaktans, anordning för avlägsning av överskott av immunreagens samt anordning för bestämning av reaktanssubstanser- na på testytan.