NO151099B - Fremgangsmaate for bestemmelse av naervaer av en spesifikk immunokjemisk forbindelse i en kroppsvaeske - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en spesifikk immunokjemisk forbindelse i en kroppsvæske.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av spesifikke immunokjemiske forbindelser slik som antistoffer eller antigener i kroppsvæsker. Disse spesifikke immunokjemiske forbindelser vil heretter bli angitt som analytter.

Bestemmelse av slike analytter gir meget nyttig medisinsk informasjon. Eksempelvis utføres nå graviditetstesting, syfilis-testing og blodfaktortesting ved konvensjonelle immunokjemiske metoder. Mesteparten av disse metoder innbefatter en visuell inspeksjon over dannelsen av utfelte eller agglutinerte antigen-anti-stoffkomplekser. Disse metoder krever enkelte ganger flere for-søk ved forskjellige reagensforhold for å sikre nøyaktighet og krever også en individuell visuell inspeksjon for hvert testresul-tat. Det har også anvendt radioaktive og fluorescerende merker for å unngå den visuelle bestemmelse. Imidlertid har disse metoder enkelte ganger medført problemer enten ved bruk av kostbare eller ubestandige merker, eller når det gjelder følsomheten eller sikker-heten og håndteringen av radioaktive materialer. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse gjør bruk av immunreagenser merket med partikler slik som magnetiske materialer som er sikre

å håndtere og som kan lett påvises med høyfølsomme og lett tilgjengelige elektronisk utstyr. Denne fremgangsmåte lar seg lett tilpasse automatisk eller halvautomatisk operasjon.

Anvendelse av magnetiske partikler i serologisk testing er kjent, men tidligere har magnetiske partikler bare vært anvendt for å fjerne eller utskille forskjellige komponenter fra en væske-prøve. Eksempelvis beskriver US patentskrift 4.018,886 og US patentskrift 3,970,518 anvendelse av magnetisk aktive partikler for å oppsamle utvalgte proteiner, etterfulgt av splitting av proteinene fra de magnetiske partikler og en visuell undersøkelse for utfelte proteiner. Hersh et al. beskriver i US patentskrift 3,933,997 anvendelse av magnetiske partikler for å konsentrere radioaktive merker på en testsubstans.

Ingen av de angitte publikasjoner beskriver anvendelse av magnetisk påvisning for å oppnå det ønskede resultat.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en spesifikk immunokjemisk forbindelse i en kroppsvæske, ved hvilken a) en overflate bringes i kontakt med væsken, hvilken overflate er belagt med reseptorreagenser som er spesifikt reaktive overfor den spesifikke immunokjemiske forbindelse, b) den belagte overflate bringes i kontakt] med et immunreagens omfattende en immunforbindelse som er spesifikt reaktiv overfor reseptorreagensene eller med et kompleks av den spesifikke immunokjemiske forbindelse og reseptorreagenset, hvilken immunforbindelse er kombinert med reaktansmerker som e!r i stand til å påvirke elektrisk reaktans,

c) uomsatt immunreagens fjernes fra overflaten, og

d) den elektriske reaktans for overflaten måles,

hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved Jat reaktansmerkene er

magnetiserbare metall- eller metalloxydpa!rtikler.

Nærvær av en analytt slik som et spesifikt antigen

eller antistoff i en kroppsvæske, kan påvises ved å avsette en prøve av kroppsvæsken på en overflate belagt med et reseptorreagens som er spesifikt reaktivt med analytten. Hvis analytten er tilstede, vil den danne et kompleks med reseptorreagenset.

i

Overflaten bringes deretter i kontakt med et immunreagens omfattende en immun-komponent som er spesifikt reaktiv med enten reseptorreagenset eller med et kompleks av reseptorreagenset og analytten. Immunreagenset omfatter også partikler som har karakter-istika som er i stand til å påvirke elektrisk reaktans. Det vil si at de er meget små fragmenter som påvirker overflatens dielek-

i

trisitetskonstant, ledningsevnen eller magnetisk permeabilitet. Disse partikler vil i dette tilfelle bli ångitt som reaktansmerker. Immunreagenset påføres generelt til overflaten som en væskesuspen-sjon. Uomsatt immunreagens fjernes deretter fra overflaten og overflaten undersøkes med hensyn til forandringer i dielektrisk konstant, ledningsevne eller magnetisk permeabilitet. I en direkte test er immunreagenset reaktivt med reseptorreagens-analyttkomplekset, og hvis reaktansmerker ■ 'finnes å være festet til overflaten, indikerer dette nærvær av analytten i kroppsvæsken. I en indirekte test er immunreagenset reaktivt med reseptorreagenset, men ikke med reseptorreagens-analyttkomplékset. Hvis ingen reaktansmerker påvises på overflaten, indikerer dette nærvær av analytt i kroppsvæsken. I en konkurrerende test avsettes kroppsvæsken og

i

immunreagenset på overflaten samtidig. Mengden av reaktansmerker på overflaten er et mål for mengden av analytt i kroppsvæsken. Dette

i

systemet kan anvendes manuelt, men kan lett tilpasses automatisk operasjon.

Fig. 1 i de medfølgende tegninger er en tegning over et testkort som er anvendbart ved fremgangsmåten) ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 2 viser skjematisk de reaksjoner som er innbefattet.

Konvensjonelle anordninger kan anvendes for å påvise nærvær av reaktansmerker på testoverflaten. Hvis for eksempel reaktansmerkene påvirker de dielektriske egenskaper på overflaten, vil kapasitetmåling røbe hvor vidt partiklene er tilstede. Hvis i et annet eksempel partiklene er magnetiske, kan magnetiske pick-up hoder slik som de som finnes i standard bånd-registreringsutstyr anvendes. Kapasitet-, ledningsevne-, og magnetisk permeabilitetsmålinger som ikke krever direkte kontakt med testoverflaten foretrekkes, men målinger hvor det gjøres bruk av direkte kontakt mellom overflaten og detektoren utelukkes ikke. For å påvise nærvær av partiklene foretrekkes det at testoverflaten er inert når det gjelder den egenskap som skal måles. Imidlertid er det mulig å arrangere reseptorreagenset på overflaten i bånd eller å fremkalle en periodisk magnetisering på overflaten slik den som produseres ved et magnetisk båndregistreringssystem og deretter føre overflaten ved en bestemt hastighet bak en detektor som vil overvåke frekvensen. Den overvåkede frekvens vil være en funksjon av arrangementet

av båndene av reseptorreagenset eller indusert periodisk magnetisering og overflatens bevegelseshastighet. Testoverflaten i seg selv behøver således ikke å være fullstendig fri for elektrisk reaktans for å betraktes som inert for formålet.

I et foretrukket system for påvisning av nærvær av magnetiske merker, er testoverflaten tilstøtende til en re-feranseoverflate belagt med magnetiske partikler. Under for-løpet av immunreaksjonene kan både testoverflaten og feferanse-overflaten magnetiseres på en periodisk måte. Detektorkretsen kan bringes til å påvise bare den del av signalet fra testoverflaten som er i fase med signalet fra referanseoverflaten.

Dette arrangement nedsetter virkningene av systemstøy og gir

en øket følsomhet.

Testoverflaten må også være i stand til å bindes til reseptorreagenset og virke ikke-interferrerende på testresultatet. Overflaten kan være flat eller kan ha nedsenkninger eller små fordypninger i hvilke hver test utføres. Selv om mange materialer er egnede testoverflater, foretrekkes plastkort eller bånd. Testoverflaten på hvilken reseptorreagenset bindes kan være innen lukkede plastpakker eller poser. Disse pakker kan også inneholde immunreagensene i et separat område beregnet for til - setning til testoverflaten etter tilsetning av prøven.

Nærvær av en forandring i elektrisk reaktans slik som magnetisk aktivitet kan bestemmes selv når en meget liten mengde av reaktansmerker er tilstede. Derfor vil hver test vanligvis bare kreve en liten dråpe kroppsvæske og testområdet kan være meget lite. Følgelig kan et stort antall adskilte testområder, og om ønsket referanseområder arrangeres1 på et enkelt kort eller bånd. De adskilte områder kan enten være en serie av tester for forskjellige valgte proteiner eller én serie av tester for det samme protein hvor konsentrasjonen av immunreagens på test-overf laten varieres over et område for å i gi en indikasjon, ikke bare på nærvær av det valgte protein, meri også den tilnærmede konsentrasjon i kroppsvæsken.

Reseptorreagenset kan festes til testoverflaten ved over-flateadsorbsjon, gel-omslutning, covalent: binding eller andre lignende metoder. Av disse foretrekkes covalent binding. Et-

i

hvert system av reseptorfestning som er i stand til å orientere molekylene på testoverflaten slik at de vil ha maksimal aktivitet foretrekkes også. Reseptorreagenser innbefatter ikke bare antistoffer, men også vev eller cellulære reseptorproteiner, serum-transportproteiner og lecitiner. jAv disse har antistoffer sannsynligvis den bredeste anvendelighet.| Andre klasser av forbindelser slik som chelatineringsmidler kan også virke som anvendbare reseptorreagenser hvis de reagerer med den substans som skal påvises i kroppsvæsken med tilstrekkelig spesifisitet for å forhindre falske resultater bevirkelt av konkurrerende reaksjoner.

De materialer som er anvendbare soml reaktansmerker som kombineres med immunforbindelser under dannelse av immunreagenser, er magnetiserbare metall- eller metalloxydpartikler som vil påvirke den elektriske reaktans til testoverflaten. Det vil si at disse materialer, hvis de fordeles som fint opp-

delte pulvere på testoverflaten, vil påvirke de dielektriske, ledningsevne- eller magnetiske egenskaper til overflaten. For-delen med foreliggende oppfinnelse liggerji bruk av partikler som er påvisbare i meget små mengder med meget følsomme, men godt utviklede og lett tilgjengelige elektriske komponenter. Enn-videre vil bruk av slike materialer forhindre at det oppstår problemer med hensyn til kortvarig eller ustabil aktivitet og håndteringsfare som man støter på ved bruk av radioaktive

I

merker. De mest foretrukne metaller og metalloxyder er de som utviser ferromagnetisme. Slike materialer kan omsettes med antistoffene og påføres på testoverflaten mens de foreligger i en avmagnetisert tilstand.- Så snart disse er blitt påført, kan hele overflaten utsettes for et magnetfelt for å magnetisere partiklene for påvisningsformål. Denne magnetiske aktivitet er da lett påvisbar med forskjellige velkjente anordninger slik som et standard magnetisk båndsystem eller Hall effektdetektor. Magnetiserbare metall- og metalloxydpartikler innbefatter slike som jernpulver, nikkel, cobolt, Cr02, CoO, NiO, Mn203 og magnetisk jernoxyd.

Foretrukne magnetiske materialer er de magnetiske oxyder

av jern, cobolt, nikkel, krom og mangan og oxydbelagte par-

tikler av jern og nikkel.

For å tilveiebringe tilstrekkelig overflateareal for binding av immunforbindelsene, foretrekkes det at reaktansmerkene har et stort overflateareal, minst 100 m 2/gram. Partikler i området 0,01 til 50^,um i diameter foretrekkes.

Disse materialer kan bindes til immunforbindelser etter kjente metoder. Reaktansmerkene kan innkapsles med en organisk polymer til hvilken immunforbindelsene kan bindes, eller overflaten kan silanbehandles på kjent måte. Organiske forbindelser kan deretter festes til silankjeden. US patentskrift 3.954*666 beskriver polymerinnkapsling av kjernematerialer og US 3.983.299 beskriver anvendelse av silankjeder for å binde organiske forbindelser til uorganiske partikler. Teknikker for immobilisering av enzymer på magnetiske bærere som vil være like anvendbare overfor antistoffer, er beskrevet i Enzymology, XLIV, side 324-326.

I

I

Festemåten for de reaktive organiske forbindelser til reaktansmerkene utgjør ingen del av foreliggende oppfinnelse. Således kan andre bindingsmetoder også anvendes så lenge de ikke innvirker på evnen til kompleksdannelse for immunforbindelsene. Immunforbindelsene velges slik at de er spesifikt reaktive med enten reseptorreagensene eller med komplekset av reseptor-reagensen og den kroppsvæskesubstans som skal bestemmes.

Da fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør bruk av elektronisk heller enn visuell inspeksjon kan den lett tilpasses automatisk operasjon. Som anvendt her menesjmed uttrykket "automatisk" ikke at det utelukkes en hver mulighet for at de enkelte operasjoner kan utføres manuelt. Under henvisning til figur 1

er et foretrukket testkort 1 vist å ha flere områder 2 på hvilke reseptorreagenser er bundet. Separate områder med forskjellige reseptorreagenser kan tilveiebringes eller det samme reseptorreagens kan bindes til hvert område i forskjellige konsentrasjo-ner. Kortet har en trykt testidentifikasjon 3, så vel som en maskinlesbar kode 4, som inneholder den nødvendige informasjon for automatisk operasjon Eventuelt kan kortet ha en rubrikk 5 for innføring av pasientidentifikasjonskode.

Figur 2 viser skjematisk et testområde 2 på et testkort ifølge figur 1. Reseptorreagenser 10 bindes til testområdet. Pasientkroppsvæske inneholdende antistoffene 11, hvis nærvær

skal bestemmes,tilsettes til hvert testområde. Antistoff 11,

hvis dette er tilstede, danner et kompleks 12 med reseptorreagenset. Testområdet utsettes deretter for immunreagens 13 som om-fattes av en immunforbindelse 14 bundet til et reaktansmerke 15. Dette immunreagens danner kompleks 16 med 'reseptorreagens-pasient-antistof f kompleks, hvis dette er tilstede,<1> på testområdet.

Et foretrukket system for utførelse ' av oppfinnelsen vil innbefatte en stasjon for innføring av de nødvendige testkort for de ønskede tester. Kort kan innføres individuelt eller i gruppe alt etter behov. Kortene føres automatisk til en prøve-tilsetningsstasjon hvor en liten dråpe av |en pasients kroppsvæske påføres til hver av testområdene på jkortet. En automatisk dreven anordning kan innbefatte temperaturkontroll og en stasjon for ekvilibrering av kroppsvæsken på testområdene i på forhånd-bestemte tidsrom. Kortene føres deretter jtil en stasjon hvor

i

immunreagenset påføres til hver av testområdene. Igjen kan det være innarbeidet temperaturkontroll og ekvilibreringssystemer. Deretter fjernes overskudd av immunreagens og kortet undersøkes deretter med hensyn til nærvær av gjenværende reaktansmerker i testen ved å måle forandringer i elektrisk reaktans av korttest-områdene.

Det skal bemerkes at i den spesielle utførelsesform som

er beskrevet føres testkortet gjennom hver stasjon. Andre ut-førelsesformer hvor hver operasjon utføres på et kort holdt i en enkel stilling i en automatisk drevet eller halvautomatisk drevet anordning likeledes er anvendbar.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes for påvisning av et vidt område av materialer innbefattende, men ikke begrenset til antigener og antistoffer av viral, bakteriell, cellulær og human opprinnelse i tillegg til hormoner, legemiddel metabolitter og spesifikke proteiner. Eksempelvis er fremgangsmåten anvendbar for påvisning av humane autoantistoffer, for eksempel et antithyroglobulin, antigen - proteiner slik som kom-plementfaktorer, proteinhormoner, immunoglobuliner og fri lette og tunge kjeder, for eksempel thyroxinbindende globulin, og forskjellige arter av mikroorganisme-antigener og antistoffer slik som hepatitis A og B virus. Dette er primært avhengig av til-gjengeligheten av et egnet materiale som kan tjene som et reseptorreagens som spesifikt er aktivt med den substans som skal bestemmes.

Eksempel 1

Ved bestemmelse av et humant antistoff, IgG, kan en serum-prøve forfortynnes med en proteinbufferløsning inneholdende 0,12 % svineserumalbumin og fosfatbuffret saltvann ved pH 7,7 + 0,2. Natriumazid, 0,1 % et antimikrobielt middel kan tilsettes i fortynningsmidlet som konserveringsmiddel.

Den fortynnede pasientprøve kan kvantitativt overføres til et testreaksjonskort. Fast fase-bæreren. bestående av anti-

humant IgG kovalent bundet til polyamidavledet ark fremstilt som følger:

10 g nylon-6 film kan suspenderes i 300 ml 3N HC1 og omrøres ved 30°C i 4 timer, fjernes fra løsningen og vaskes kraftig med vann, ethanol og ether. Carboxylinnholdet i en nylon-6 film hydrolysert i 4 timer er | 30-90ymol/g.

i

Koplingen av antistoffet til den!depolymeriserte nylon-6 bærer kan utføres ved carbodiimidaktivering. Den totale reak-sjon innbefatter kondensasjon mellom carboxylgruppen på bæreren og amingrupper i antistoffet. Reaksjonen utføres i 2 trinn.

i

Et gram av den syrebehandlede nylon-6 film tilsettes til

en løsning av 50 mg 1-cyclohexyl-3-(2-morfolinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluensulfat i 10 ml vann. Reåksjonsblandingen justeres til pH 4-5 med 6N HCl, og reaksjonen tillates å fortsette ved 30°C i 2-4 timer. Filmen fjernes deretter og vaskes flere ganger med vann for a fjerne overskudd|av carbodiimid.

Den aktiverte film innføres deretter i en løsning inneholdende kommersielt tilgjengelig anti-j-humant IgG i konsentra-sjoner på 1 - 50 mg protein i 10 ml vann. Etter justering av

i

løsningen til pH mellom 4-5 fortsettes■reaksjonen å forløpe 2

til 4 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4°C. Reak-sjonsløsningen dekanteres deretter fratog filmen vaskes med vann eller buffer.

Testoverflaten kan deretter ekvilibreres med den fortynnede prøve i tilstrekkelig tid til å tillate at antistoffbinding finner sted. Den første ekvilibrering kan typisk være 30 minutter ved - 32°c. Reaksjonssonene kan deretter vaskes med samme protein-

i

bufferløsning og ristes for å vaske uabsorbert antigen fra overflaten,

Testreagenssonene kan deretter dyppes i et overskudd av geiteanti-human IgG merket med magnetiske partikler. For ekvilibrering på kortet fortynnes immunpartiklene i fosfat-saltvann-buffer ved pH 7,5 + 0,5 inneholdende Oi, 12 % svineserumalbumin. Etter ekvilibrering kan testreaksjonsoverflåtene vaskes med BSA fosfatbuffer ved pH 7,7 + 0,2.

Reaks jonsoverf låtene magnetisereis i et magnetfelt og testkortet føres gjennom en detektor som er i stand til å bestemme nærvær av magnetiske partikler.

i

Eksempel 2

Dette eksempel viser bestemmelse av antistoffer rettet

mot spesifikke antigener.

En serumprøve ble forfortynnet med en proteinbufferløsning inneholdende 0,1 % svineserumalbumin og tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (tris) buffret til pH 6,5 +_ 0,4. Natriumazid, 0,1 % et antimikrobielt middel ble tilsatt i fortynningsmidlet som et konserveringsmiddel.

Den fortynnede prøve ble kvantitativt overført til en test-reaks jonsoverf late . Fastfasebæreren bestående av humant serumalbumin- kovalent bundet til enten polyamid eller polymetacrylsyre-avledete polymerer ble fremstilt som følger: Den totale koplingsreaksjon mellom albumin og filmer kan innbefatte tverrbinding mellom amino eller carboxylgrupper i filmen og proteinet. Tverrbinding kan oppnås ved bruk av et polyfunksjonelt aziridinreagens som er meget reaktivt overfor materialer inneholdende aktive hydrogenatomer. Filmene for festing av humant serumalbumin ble først sus-pendert i en 1% løsning av "XAMA" (polyfunksjonelt aziridin). Etter omrøring ved 27°C i 30 minutter ble filmene fjernet fra løsningen og vasket med destillert vann. De vaskede filmer ble deretter omrørt i en løsning inneholdende human serumalbumin (1 mg/ml) i 12 timer ved 4°C. Den immobiliserte albuminfilm-reaktant kan deretter vaskes gjentatte ganger med trisbuffer (pH 6,5 - 0,4) ved 4°C. Vaskingene fortsettes inntil intet ytterligere albumin frigis fra filmen. Representative grader for albuminbinding til filmene er angitt i det etterfølgende:

Testoverflaten for anti-HSA ble ekvilibrert med den fortynnede prøve i tilstrekkelig tid for å muliggjøre anti-HSA-binding. Reaksjonsoverflaten ble deretter vasket med samme trisbufferløs-ning (pH 7,4 +<_> 0,4) som ble anvendt i -eksempel 1 for å fjerne ubundet prøve-etterlatenskaper fra overflaten.

Testreagenskortet ble deretter neddyppet i overskudd av geiteanti-humanserumalbumin merket med; magnetiske partikler.

For ekvilibrering ble immunanti-HSA-partiklene fortynnet i en trisbuffer ved pH 6,5 + 0,5 inneholdende 0,12 % geiteserumalbu-min. Etter ekvilibrering ble testreaksjonsoverflåtene vasket fri for ubundet partikler med geiteserumalbumintrisbuffer.

De gjenværende magnetiske partikler på reaksjonsoverflaten kan magnetiseres som svar på et'magnetisk signal med kjent frekvens. Testkortet kan deretter føres gjennom en detektor som er i stand til å påvise nærvær av de magnetiske partikler. Påvisningen av reaktansegenskapene til testoverflaten kan avhjelpes med instrumentteknikker slik som faselåsningsan-vendelser, fasefølsom likeretting og andre vanlige elektroniske forsterkningssystemer som er kjent for fagmannen.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en spesifikk immunokjemisk forbindelse i en kroppsvæske, ved hvilken a) en overflate bringes i kontakt med væsken, hvilken overflate er belagt med reseptorreagenser som er spesifikt reaktive overfor den spesifikke immunokjemiske forbindelse, b) den belagte overflate bringes i kontakt med et immunreagens omfattende en immunforbindelse som er spesifikt reaktiv overfor reseptorreagensene eller med et kompleks av den spesifikke immunokjemiske forbindelse og reseptorreagenset, hvilken immunforbindelse er kombinert med reaktansmerker som er i stand til å påvirke elektrisk reaktans, c) uomsatt immunreagens fjernes fra overflaten, og d) den elektriske reaktans for overflaten måles, karakterisert ved at reaktansmerkene er magnetiserbare metall-' eller metalloxydpa.rtikler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at partiklene er valgt fra gruppen bestående av magnetiske oxyder av jern, cobolt, krom, nikkel og mangan og oxydbelagte partikler av jern og nikkel.