SE428379B - Bioluminiscens bestemning av atp och reagens herfor - Google Patents

Description

7806296-5 ' 2 10 15 20 25 30 35 av reagenset innefattar bestämning av ATP samt substanser och enzym som deltar i ATP-omsättande reaktioner inom klinisk kemi och klinisk mikrobiologi samt inom biokemisk och biologisk forskning (speciellt bioenergetik).

ATP-beroende bioluminiscensreagens, där ATP är den allmänt vedertagna förkortningen för adeonsintrifosfat, är sålunda förut kända, vilka är baserade på ett enzym, luciferas, och det ena av de bägge substraten, nämligen D-luciferin, samt magnesiumjoner eller vissa andra metalljoner, till vilka det andra substratet, ATP, måste komplexbindas för att kunna reagera. När ATP bringas i kontakt med reagenset, sker den reaktion, eller snarare den följd av luciferaskatalyserade reaktioner, som i schematiskt förenklad och delvis hypotetisk form visas i fig. l. Reaktionerna l-3 har studerats i detalj för luciferas från den vanliga amerikanska eldflugan Photinus pyralis, och dessa reaktioner representerar sålunda den kända tekniken. Flera översiktsartiklar har publicerats under senare âr; se DeLuca, M. (1976), “Advances in Enzymology", (A. Meister, ed.)Vol. 44, 37-68, John Wiley & Sons, New York och Mc Elroy, W.D., Seliger, H.H. och DeLuca, M. (1974), "The Physiology of Insecta“, 2nd ed (M. Rockstein, ed.) Vol ll, 411-460, Academic Press, New York.

I reaktion l bildas av luciferas (E), ATP och D-luciferin (LH2) fritt pyrofosfat (PPi)och enzymbundet luciferyladenylat. Denna reaktion är inte hastighetsbegränsande för det totala reaktions- förloppet. Det uppkomna enzym-luciferyladenylatkomplexet genom- går två för den initiala ljusemissionen hastighetsbegränsande steg, dels en konformationsförändring, dels en avgivning av en proton från luciferyladenylat (se DeLuca, M. och Mc Elroy, W.D., (1974), Biochemistry, lå, 921-925). I reaktion 2 oxideras luciferyladenylat med syre under bildning av AMP (adsnosinmonofosfat) och exciterat oxiluciferin (Px), vilka bägge förblir enzymbundna, samt koldioxid.

Oxiluciferin övergår_i reaktion 3 till grundtillståndet under ut- sändande av foton. Energin för utsändandet av en foton har erhållits ur oxidationen av luciferin och inte ur brytandet av pyrofosfat- Kbindningen i ATP.

Det i reaktion 3 bildade enzym-oxiluciferin-AMP-komplexet är stabilt och kan isoleras genom gelfiltrering, om reaktionen utföres i när- varo av pyrofosfatas (Gates, B.J. och DeLuca, M. (1975), Arch., 10 15 20 25 30 35 7806296-5 Biochem. Biophys.j I69, 616-621). I frånvaro av pyrofosfatas isole- ras ett enzym-oxiluciferin-komplex utan AMP som har samma aktivitet som fritt enzym (se sistnämnda artikel av Gates och DeLuca).

Stabiliteten hos enzym-oxiluciferin-AMP-komplexet medför att blandningen av luciferas, D-luciferin och ATP ger upphov till en ljusblixt snarare än en konstant ljusemission. Den maximala ljus- intensiteten uppnås inom en sekund och avtar därefter till en steady state-nivå, där återbildningen av fritt enzym sker med i huvudsak samma hastighet som ljusemissionen. Steady state-nivån är dock inte helt konstant, framförallt beroende på att de fria produkterna hämmar reaktionen.

Bestämningen av ATP har vanligen utförts på ett sådant sätt att provet med okänd ATP-koncentration blandats med bioluminiscensreagenset innehållande luciferas, D-luciferin och magnesiumjoner. I syfte att uppnå maximal tillförlitlighet hos analysen bör blandningen lämpligen ske med en given hastighet och i mätposition, så att de initiala delarna av ljuskurvan kan registreras (se Lundin, A., och Thore, A. (1975), Anal. Biochem., 66, 47-63). Sedan det mått på ljusintensiteten som har använts vid bestämningen registrerats, har analysen upprepats med ett prov innehållande en känd ATP- koncentration och med ett nollprov utan ATP. Ur dessa tre mätningar har den okända ATP-koncentrationen kunnat beräknas. Om provet har innehållit ämnen, som kan interferera med analysen, har inre standardmetodik utnyttjats, d.v.s. provet har analyserats med och utan tillsats av en känd ATP-koncentration.

Redan 1952 demonstrerades att ATP-beroende bioluminiscenssystem är användbara för bestämning av inte bara ATP utan även i princip varje substans och enzym som deltar i ATP-omsättande reaktioner (Strehler, B.L. och Totter, J.R. (1952) Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41). Möjlgheten att sätta bioluminiscensreagens till ATP-omsättande system för att kontinuerligt följa ATP-kocentrationen genom mätning av ljusintensiteten har emellertid fått mycket liten praktisk be- tydelse. Detta har berott på att luciferasets aktivitet under reaktionen avtagit genom produkthämning enligt ovan, dels på att luciferasreagensen varit kontaminerade med ATP-omsättande system.

Intresset för metoden har emellertid vaknat på nytt i och med att det med renat luciferas och en syntetisk preparation av D-luciferin visades möjligt att under en reaktionstid på flera minuter få en I 4 försumbar minskning av såväl ljusintensiteten som ATP-koncentrationen (Lundin, A. och Thore, A. (1975) Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41).

Lämpliga analysbetingelser har undersökts och metoden visats använd- 10 15 20 25 30 35 bar för ATP-koncentrationer upp till 10-6M (Lundin, A., Rickardsson, A. och Thore, A., (1977), "Proceedings of the 2nd Bi-Annual ATP Methodology symposium, SAI Technology Company, San Diego). Trots upprepade försök kunde reagens med ovannämnda egenskaper beredas endast vid ett fåtal tillfällen.

Det har emellertid varit möjligt att visa den analytiska användbar- heten av reagens med ovannämnda egenskaper för kinetisk bestämning av substrat och enzym för "endpoint-bestämning" av substrat, för att följa fotofosforylering, och för att följa lytiska reaktioner (Lundin, A., Rickardsson, A., och Thore, A. (1976), Anal. Biochem. lä, 611-620; Lundin, A., Rickardsson, A., och Thore, A. (1977), “Proceedings of the 2nd Bi-Annual ATP Methodology Symposium, SAI Technology Company, San Diego; Lundin, A., Thore, A., och Baltscheffsky, M. (1977), FEBS rett. lg, 13-76; Lunain, A. (1978), “Methods in Enzymology (M. DeLuca, ed.), Vol. 57, Academic Press, New York; Lundin, A., och Baltscheffsky, M. (1978), “Methods in Enzymology (M. DeLuca, ed.) Vol. 57, Academic Press, New York; Lundin, A., och Styrelius, I. (1978), Clin.Chem. Acta; och Thore, A., och Eriksson, A. C. (1977), FOA-rapport.

Svårigheterna att på ett kontrollerbart sätt bereda ett reagens med ovannämnda egenskaper har emellertid medfört att de ovan om- _ talade applikationerna inte har kunnat få någon användning utanför det egna laboratoriet.

Innan föreliggande uppfinning började användas, varierade ljusnivåns stabilitet i olika reagens från ett avtagande med några procent per minut till att mindre än halva ljusintensiteten återstod efter l minut. Enligt föreliggande uppfinning har det dock visat sig att tillsats av D-luciferinanaloger gör det möjligt att på ett kontroller- bart sätt bereda reagens med önskade egenskaper, d.v.s. en stabil ljusnivå. Effekten av D-luciferinanaloger på ljusnivåns stabilitet har ej tidigare observerats, och det borde i analytiska sammanhang ligga nära till hands att undvika nämnda analoger, eftersom de visats hämma ljusreaktionen kompetitivt med D-luciferin (Denburg, Med D-luciferinanalog förstås i föreliggande fall substanser som J.L.). 10 15 20 25 30 35 7806296-5 hämmar den tidigare omtalade luciferasreaktionen, och denna hämning är kompetitiv i förhållande till D-luciferin. Vilka D-luciferinanaloger som ger önskat resultat avgörs enkelt genom att dessa sättes i hämmande koncentrationer till reagens och ljusnivâns stabilitet vid ATP-tillsats uppmätes. Även om uppfinningen icke är begränsad till någon speciell teori vad beträffar reaktionsmekanismen vid tillsats av D-luciferin- analog, torde nämnda tillsats innebära att en mindre andel av den totala luciferasmängden komer att föreligga som inaktivt enzym- produktkomplex. Allteftersom den fria enzymkoncentrationsn minskar genom bildning av enzym-produktkomplex, dissocieras troligen enzym-luciferin-analogkomplexet under bildning av fritt enzym, såsom visas i reaktion 5 i fig. l, där I representerar D-luciferin- analogen. Genom användningen av D-luciferinanalogen, d.v.s. den kompetitiva hämmaren, kan luciferasmängden ökas utan motsvarande ökning av reaktionshastigheten. Detta gäller oavsett om D-luciferin- analogen reagerar med ATP enligt reaktion l eller bildar ett enzym- hämmarkomplex enligt reaktion 5. Förutsättningen är enbart att reaktionen är reversibla och snabbare än reaktion 2-4 (till reaktion 4 återkommer mera nedan).

I den mån fritt AMP och fritt oxiluciferin bildas vid reaktionen, kan det även vara av intresse att studera huruvida detta skulle påverka produkthämningen. Om man antar den hypotetiska situationen att l0_6M ATP skulle leda till bildning av l0_6M AMP och l0_6M oxiluciferin, skulle, eftersom Ki för AMP är 2,4 x 10-4M (se Lee, R.T., Denburg, J.L. och McElroy, W.D. (1970) Arch. Biochem.

Biophys. lål, 38-52), hämningen från AMF påverka luciferasaktivi- teten med mindre än 0,5%. Däremot skulle bildningen av oxiluciferin, vars Ki är 2,3 x lO_7M (Goto, T., Kubota, I., Suzuki, N. och Kishi, Y. (1973) "Chemiluminescence and Bioluminescence" (M.J.

Cormier, D.M. Hercules, och J.Lee, eds.) sid 325-335, Plenum Press, New York) sänka luciferasaktiviteten kraftigt. Följaktligen kan det under vissa förhållanden vara viktigt att motverka effekten av bildningen av fritt oxiluciferin. Tillsats av D-luciferinanalog gör att hämningen av luciferaset redan från början är så stor att tillskottet i hämning från det oxiluciferin som kontinuerligt bildas under reaktionen blir försumbart. Tillsats av hämmande koncentra- tioner av D-luciferinanalog stabiliserar följaktligen ljusnivån. 10 15 20 25 30 35 '7806296-5 Vid analysen bör koncentrationen av D-luciferin vara mättande d.v.sL så hög att en liten ändring av densama ej påverkar reak- tionshastigheten. Detta är viktigt eftersom små volymändringar annars påverkar reaktionshastigheten. Vidare kan komponenter i biologiska prover minska den för luciferasreaktioen tillgängliga D-luciferinkoncentrationen och därmed hämma denna reaktion. En tillfredsställande noggrannhet i analysen kan följaktligen endast uppnås med mättande koncentrationer av D-luciferin. Genom inbland- ning av D-luciferinanalog i D-luciferin kan skenbar mättnad'uppnås vid låga koncentrationer av D-luciferin utan att analysens noggrann- het påverkas på annat sätt än att känsligheten sänks. Detta är en ytterligare.fördel hos uppfinningen eftersom D-luciferin är en dyrbar substans, som endast i undantagsfall kan tillsättas i mättande koncentrationer.

Den genom tillsats av D-luciferinanalog minskade luciferasaktivi- teten kan kompenseras genom att man ökar luciferashalten. Häri- _genom kan förhållandet luciferin/luciferas optimeras med avseende på t.ex. kostnad för reagensframställningen utan att analysens känslighet påverkas. Vilka utomordentliga möjligheter uppfinningen öppnar i detta avseende, inses lätt av det faktum att världsmark- naden enbart för en av de utvecklade applikationerna är ca 5 miljoner analyser årligen. En säkning av kostnaderna för reagenset med t.ex. enbart något öre per analys innebär redan det betydande kostnads- Wbesparingar, vilket innebär att föreliggande uppfinning även i detta avseende innebär ett mycket väsentligt bidrag till tekniken på området.

Sammanfattningsvis kan man därför konstatera att användningen enligt uppfinningen av D-luciferinanaloger_gör det möjligt att dels optimera förhållandet luciferin/luciferas med avseende på t.ex. framställningskostnaden för reagenset, dels öka ljusnivåns stabilitet. I En lämplig koncentration av D-luciferinanalog är en sådan som _ger en hämning av luciferasreaktionen och därmed ljusintensiteten med åtminstone 25%, eftersom vid lägre grad av hämning effekten på ljusnivåns stabilitet och den erforderliga koncentrationen av D-luciferin för mättnad blir alltför liten för att vara ekonomiskt och analytiskt av betydelse. Ett speciellt föredraget område är 50-90%..En hämning av intensiteten med mera än ca 90% gör bl.a. 10 15 20 25 30 35 7 7806296~5 att kraven på registreringsutrustningen blir onödigt stora eller att luciferashalten behöver ökas så mycket att analysen blir oekonomisk. Vidare kan analytisk interferens lätt uppstå vid höga halter av luciferas.

Enligt en speciellt föredragen utföringsform av uppfinningen sätter man till reagenset den tidigare omtalade kompetitiva hämmaren i kombination med pyrofosfat. Det är känt att för luciferas- reaktionen hämmande koncentrationer av pyrofosfat motverkar ned- gången av ljusintensiteten (McElroy, W.D., Hastings, J.W., Coulombre, J. och Sonnenfeld, V. (1953), Arch. Biochem. Biophys. gg, 399-416). Detta har emellertid aldrig tidigare använts för att för- bättra analysbetingelserna vid bestämningen av ATP.

Enligt föreliggande uppfinning har det överraskande visat sig att man genom kombinerad användning av pyrofosfat i en mycket lägre koncentration än tidigare, företrädesvis i en högsta koncentration av 164m och speciellt högst 1o'5 omtalad koncentration, kan erhålla en synnerligen stabil ljusnivå.

Genom denna kombination kan samma stabilitet hos ljusnivån uppnås M, och kompetitiv hämmare i ovan som det vid användning av antingen pyrofosfat eller D-luciferin- analog krävs betydligt högre hämning av luciferas för att uppnå. Vid en kompetitiv hämning med D-luciferinanalog omkring 50% och en koncentration av pyrofosfat på l0_6M har det sålunda visat sig möjligt att erhålla en lutning hos ljusintensitetkurvan som under- stiger 3%, och vid en hämning av ungefär 75% och en koncentration 6M har man lyckats uppnå en lutning hos ljus- av pyrofosfat på l0_ intensitetkurvan av storleksordningen 1%. En sådan stabil ljusintensi- tet innebär naturligtvis att billigare och enklare registrerutrust- ningar kan användas och framför allt ger det mycket goda förutsätt- ningar för kontinuerliga analyser av ATP-omsättande reaktioner. Även om uppfinningen inte heller i detta fall är begränsad till någon speciell teori vad beträffar reaktionsmekanismen, är det troligt att pyrofosfatet reagerar med AMP i enzym-oxiluciferin-AMP- komplexet enligt reaktion 4 i fig. l. För bildning av ATP från pyro- fosfat och AMF åtgår energi. Denna utvinnes troligen då enzymet över- går till sin ursprungliga konformation från den konformation, som uppstod före oxidationsreaktionen (reaktion 2 i fig. 1). Konforma- tionsförändringen skulle kunna förklara varför produkthämningen är non-kompetitiv (Lemasters, J.J; och Hackenbrock, C.R. (1977) Bio- 10 u 20 25 30 35 ?806296~5 8 chemistry lå, 445-447), under det att oxiluciferin är en kompetitiv hämmare (se den tidigare omtalade publikationen av Goto §t_al., 1973). Reaktionen med pyrofosfat skulle alltså förändra en kraftig non-kompetitiv hämning till en svagare kompetitiv hämning. Effekten av den kompetitiva hämningen på ljusnivån kan enligt uppfiningen motverkas med tillsats av D-luciferinanalog (se ovan). Enligt reak- tion 4 i fig. l, ger luciferasreaktionen i närvaro av pyrofosfat inte någon nettoförbrukning av ATP, vilket bidrar till att ge en stabil ljusnivå.

Förutom att pyrofosfatet deltar i frigörandet av enzym från enzym-oxiluciferin-AMP-komplexet, kan det vid hämmande koncentra- tioner verka genom att driva reaktion l i fig. l baklänges. Genom tillsats av pyrofosfatet kan härigenom den totala enzymkoncentra- tionen ökas, utan att motsvarande ökning av ljusintensiteten er- hålles. En mindre andel av den totala enzymkoncentrationen kommer härigenom att föreligga som inaktivt enzym~produktkomplex. Detta bidrar till att hämmande pyrofosfatkoncentrationer ger en stabil ljusnivâ. rEnligt ännu en föredragen utföringsform av uppfinningen kan man till bioluminiscensreagenset sätta koenzym A, d.v;s. antingen i kombination med den kompetitiva hämmaren eller i kombination med den kompetitiva hämmaren och pyrofosfatet. Även tillsatsen av koenzym A har sålunda visat sig stabilisera ljusnivån. Det faktum att man kan erhålla en uppgång av ljusintensiteten genom tillsats av enbart koenzym A är i och för sig förut känt genom publikationen av Airth, R.L., Rhodes, W)C. och McElroy, W.D. (1958), Biochem. Biophys.

Acta, 21, 519- , men användningen av koenzym A för att förbättra analysbetingelserna vid bestämning av ATP har emellertid tidigare ej föreslagits.

Reaktionsmekanismen för koenzym A är sålunda troligen den att föreningen reagerar med oxiluciferin i enzym-oxiluciferin-AMP-k0m- plexet enligt reaktion 4 i fig. l (där koenzym A har beteckningen COA). Reaktionen mellan koenzym A och oxiluciferin förändrar den non-kompetitiva produkthämningen i enzym-oxiluciferin-AMP-komplexet till en svag kompetitiv hämning från AMP, vilken är försumbar under normala analytiska betingelser.

Sammanfattningsvis gäller sålunda att koenzym A utövar sin effekt utan att hämma luciferasreaktionen, vilket däremot gäller för 10 15 20 25 30 35 9 7806296-5 D-luciferinanaloger och i vissa fall pyrofosfat. Sistnämnda hämning spelar emellertid i många analytiska tillämpningar inte någon roll, eftersom luciferasmetoden ändock uppvisar tillräcklig känslighet.

Där så icke är fallet, kan luciferaskoncentrationen ökas, förutsatt att luciferaspreparatet inte innehåller alltför höga halter av för- oreningar, som interfererar med analysen. Vid vissa speciella till- lämpningar av föreliggande uppfinning kan det därför vara av speciellt intresse att använda ett synnerligen rent luciferaspreparat. Olika metoder för rening av luciferas är i och för sig förut kända, och någon av dessa metoder kan användas i de flesta fall. En föredragen utföringsform av uppfinningen för tillämpningar med höga krav på renhet hos luciferaset är användning av ett reagens som innehåller luciferas, vilket är renat genom isoelektrisk fokusering. Luciferaset kan vidare skyddas från ospecifik inaktivering genom.val av reaktions- betingelser och tillsats av skyddande substanser, t.ex. bovint serum- albumin, tiolföreningar och/eller EDTA (etylendiamintetraättiksyra).

För användningen av pyrofosfat och koenzym A gäller att denna användning kan begränsas av förekomsten i biologiska prover av enzymsystem som bryter ned dessa substanser. I förekommande fall kan effekten av sådana enzymsystem förhindras genom tillsats av hämmare som inte påverkar luciferasreaktionen. Pyrofosfatasaktivi- tet kan t.ex. hämmas med mangan- eller fluoridjoner. Det är med tanke på D-luciferinanalogernas syntetiska natur mindre troligt att dessa skulle utsättas för enzymatisk nedbrytning i biologiska prover.

Vid framställningen av bioluminiscensreagens med önskade egenskaper kommer valet av substans eller kombination av substanser inom gruppen D~luciferinanaloger, pyrofosfat och koenzym A att avgöras av applikationen. Detta beror på att olika applikationer varierar med avseende på kravet på känslighet, provsammansättning, förekommande interfererande reaktioner och reagensets prisnivå, lagringsstabili- tet etc. Med tanke på att föreliggande uppfinning har gjort det möj- ligt att välja inom en stor grupp av substanser, torde det för fack- mannen på området inte innebära några svårigheter att finna en lämp- lig reagenssammansättning för varje enskild applikation.

Förutom de ovan omtalade fördelarna med och applikationerna av föreliggande uppfinning kan tilläggas att kontinuerlig mätning av ATP-omsättande reaktioner med det nya, förbättrade bioluminiscens- reagenset enligt uppfinningen har en känslighet som normalt är 10 15 20 25 30 35 7806296-5 l0 flera tiopotenser högre än motsvarande spektrofotometriska metod.

Arbetsmetodiken kan däremot sägas vara mycket lik den för kopplade spektrofotometriska analyser baserade på t.ex. NAD+/NADH-omvandling. Även vid bestämning av ATP i icke ATP-omsättande system, d.v.s. i prover med konstant ATP-koncentration har reagens med ovannämnda egenskaper uppenbara fördelar. Eftersom ljuset är konstant ställs inga krav på hastigheten för blandning av reagens och prov. Bland- ningen behöver inte heller ske i mätposition och ljusmätningen kan pågå under valfri tid. Detta ökar såväl känslighet som reproducerbar- het. Även vid bestämning av ATP i cellulära system.har reagenset enligt uppfinningen stora fördelar genom att man kan mäta halten extra-cellulärt och halten intra-cellulärt ATP i samma prov. Härvid mätes först halten av extracellulärt ATP, varefter något lytiskt agens som inte påverkar luciferassystemet tillsättes och ljusök- ningen svarande mot halten intracellulärt ATP mätes. Även om de olika komponenterna för bioluminiscensreagenset enligt uppfinningen för enkelhets skull har beskrivits såsom ingående i reagenset från början, är det naturligtvis underförstått att de vid förfarandet kan tillsättes separat. Sålunda kan t.ex. en eller flera av komponenterna tillsättas i samband med den för inställning av önskat pH-värde erforderliga bufferten.

Uppfinningen kommer nu att belysas ytterligare genom följande icke-begränsande exempel.

Exempel Detta exempel, som hänför sig till fig. 2, illustrerar hur D-luci- ferinanaloger (i detta fall L-luciferin) och pyrofosfat kan använ- das samverkande så att_reagens med stabil ljusnivå uppnås redan vid en måttlig hämning. Luciferas har i exemplet renats med iso- elektrisk fokusering. I fig. 2 visas ljusintensiteten som funktion av tiden efter tillsats av en konstant ATP-halt (10-6M ATP i slut- koncentration i reaktionsblandningen). I reaktionsblandningen (slutvolym l ml) ingår i samtliga fall luciferas, D-luciferin (ll0¿ug/ml), magnesiumacetat (10 mM), bovint serumalbumin (0,l%), EDTA (2mM), samt 0,1 M tris(hydroximetyl)aminometanbuffert justerad till pH 7,75 med ättiksyra.

Fig. 2a.visar den ljuskurva som erhålles utan ytterligare till- 10 15 7806296-5 ll satser. Reagens med avtagande ljusnivå enligt 2a är helt oanvänd- bara för kontinuerliga mätningar i ATP-omsättande system. Fig. 2b visar effekten av tillsats av L-luciferin (l0¿ug/ml), varvid häm- ningen blir ungefär 70%. Ljuskurvans lutning är i och för sig acceptabel, men den initiala toppen gör att reagenset icke är användbart vid dessa höga ATP-koncentrationer för kontinuerliga mätningar i ATP-omsättande system. Vid högre tillsatser och därmed högre hämning erhålles emellertid rakare ljuskurvor och användbara reagens. Fig. 2c visar effekten av tillsats av pyrofosfat (l0_6M).

Ljuskurvans lutning är fortfarande för stor och det finns en liten initial topp. Vid högre och hämmande tillsatser blir ljuskurvan i allmänhet rakare. Fig. 2d visar effekten av L-luciferin (lolng/ml) och pyrofosfat (10-6 M). Såväl lutning som initial topp har i det närmaste helt försvunnit. Detta reagens lämpar sig väl för analy- tiska ändamål. Endast de reagens som innehåller L-luciferin (2b och 2d) och skenbart mättade med avseende på D-luciferin (se ovan) och endast dessa reagens ger följaktligen maximal analysnoggrannhet.

Claims (10)

vsoezes-5 12 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för bestämning av ATP-koncentrationer, t.ex. i ATP- omsättande system, varvid man bringar det prov, på vilket bestäm- ningen skall utföras, i kontakt med ett bioluminiscensreagens baserat på D-luciferin, luciferas och maqnesiumjoner eller andra vid denna teknik utnyttjade metalljoner och eventuellt pyrofosfat och/eller koenzym A, varigenom en reaktion sker, där ATP och D-luciferin bindes till luciferaset och ljus emitteras, och varvid man mäter intensiteten hos det emitterade ljuset, vilken intensitet är ett mått på ATP-koncentrationen, k ä n n e t e c k n a t a v, att man vid bestämningen använder ett reagens innehållande en förut- bestämd mängd av en eller flera kompetitiva hämmare av reaktionen i form av D-luciferinanalog(er) och i en koncentration som ger en hämning av åtminstone 25%, företrädesvis 50-90%, av ljusintensi- teten.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v, att man som D-luciferinanalog använder L-luciferin. a v, att

3._ Förfarande enligt krav l, k.ä n n e t e c k n a t 4 man använder pyrofosfatet i en högsta koncentration av 10- M, före- trädesvis högst :Lo"5M.

4. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e- t e c k n a t av, att man använder ett reagens som innehåller luciferas vilket är renat genom isoelektrisk fokusering.

5. gFörfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e- t e c k n a t a v, att man använder ett reagens som innehåller luciferas med en tillsats av bovint serumalbumin, tiolföreningar och/eller EDTA.

6. '6. Bioluminiscensreagens till användning för bestämning av ATP- koncentrationer, t.ex. i ATP-omsättande system, vilket reagens är baserat på D-luciferin, luciferas och magnesiumjoner eller andra vid denna teknik utnyttjade metalljoner och eventuellt även pyrofosfat och/eller koenzym A, knä n n e t e c k n a t a v att det även innehåller en förutbestämd mängd av en eller flera 7806296~5 13 kompetitiva hämmare i form av D-luciferinanalog(er) och i en koncentration som ger en hämning av åtminstone 25%, före- trädesvis 50~90%, av ljusintensiteten.

7. Reagens enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t a v,att D-luciferinanalogen är L-luciferin.

8. Reagens enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t a v, att pyrofosfatet föreligger i en högsta koncentration av 10-4 M, företrädesvis högst 1o'5M.

9. Reagens enligt något av kraven 6-8, k ä n n e t e c k n a t a v, att det innehåller luciferas vilket är renat genom isoelektrisk fokusering.

10. Reagens enligt något av kraven 6-9, k ä n n e t e c k n a t a v, att det innehåller luciferas med en tillsats av bovint serum- albumin, tiolföreningar, och/eller EDTA.