DE69928541T2

DE69928541T2 - Luziferase assay, zusammensetzungen und testsätze zu damit in zusammenhang stehenden verwendungen

Info

Publication number: DE69928541T2
Application number: DE69928541T
Authority: DE
Inventors: Irena Bronstein; E. Corinne OLESEN; C. John VOYTA; Yu-Xin Yan
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-09-01
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2019-09-02
Also published as: US6183978B1; DE69928541D1; WO2000014270A1; EP1109930A1; EP1109930B1; AU5701299A; ATE310833T1; CA2342920A1; EP1109930A4; JP2002524086A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Assayformat zur Detektion der Anwesenheit von Luciferase als ein Reportermolekül oder Zielmolekül in einem Assay. Der Assay ist insbesondere wertvoll bei Assays zur Detektion von Luciferase, die in einer biologischen Probe als das Expressionsprodukt eines Luciferasegens, das als ein Reportergen in eine Wirtszelle transfiziert wurde, anwesend ist. Zusätzlich werden Zusammensetzungen, verwendbar in dem Assayverfahren, und Kits zur Durchführung des Assays adressiert.
STAND DER TECHNIK
Chemilumineszensassays unter Verwendung von Luciferase als ein Enzym, um die Gegenwart von ATP in einem biologischen System oder einer biologischen Probe anzuzeigen, sind weit in der Literatur beschrieben. Luciferase katalysiert chemilumineszente Lichtfreisetzung gemäß dem folgenden Reaktionssystem:

1) Luciferase + Luciferin + ATP + Mg⁺⁺ ↔ Luciferase-Luciferin-AMP + PPi
2) Luciferase-Luciferin-AMP + O₂ → Oxyluciferin + AMP + CO₂ + Licht (562 nm)

Obwohl eine Vielfalt von Luciferaseenzymen identifiziert worden ist und alle, die eine ähnliche Reaktion unter Verwendung von ATP katalysieren, im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Anwendung verwendet werden können, ist die am besten charakterisierte Luciferase Glühwürmchen-Luciferase, das Enzym das für den charakteristischen „Blitz" („flash") dieses besonderen Käfers (P. pyralis) verantwortlich ist. Diese Luciferase ist ein Monomeres 61-62 kD-Enzym, welches die oben beschriebene Lichtemission mit einer Quantenausbeute von 0,88 katalysiert. Das natürlich bei pH 7,8 emittierte Licht ist ein grün-gelbes Licht (etwa 562 nm).
Luciferaseassays zur Quantifizierung des Luciferaseenzyms sind beschrieben in US-Patenten 5,650,289 und 5,283,179, Wood. Eine bekannte Schwierigkeit, auf die man beim Entwickeln von Luciferaseassays stößt, ist die Enzymkinetik, welche eine sehr schnelle Peakintensität, d.h. den „Lichtblitz" („flash of light"), gekoppelt mit einem schnellen Abklingen auf einen sehr niedrigen Level, produziert, wird in diesen Patenten extensiv diskutiert. Die Patente betreffen außerdem Versuche im Stand der Technik, dieses Problem zu lösen, einschließlich der Zugabe von Coenzym A (CoA) und/oder einer Sulfhydrylverbindung, wie beispielsweise Dithiothreitol (DTT), um größere Gesamtlichtfreisetzung zu unterstützen.
Eine große Vielfalt an Literatur ist entwickelt worden, die Luciferaseassays und Verfahren, sowohl die Peak-Lichtintensität als auch die Gesamt-Lichtemission zu erhöhen, betrifft. Unter den verschiedenen untersuchten Alternativen sind die Auswahl spezieller Lösungsmittel, Kricka, et al., Arch. Biochemistry und Biophysics 217, 674-681 (1982), anderer SH-Verbindungen, wie beispielsweise N-Acetylcystein, Lundin, Bioluminescence and Chemilumi nescence, und die Zugabe von Natriumarsenat und anderen Salzen, DeLuca et al., Analytical Biochemistry 95, 194-198 (1978).
Spezifische Assays, die diese Formulierungen einsetzen, um Zielmoleküle selbst bei picomolaren Konzentrationen zu detektieren, sind beschrieben in Olsson, et al., Journal of Applied Biochemistry 5, 437-445 (1983), Kimmich, et al., Analytical Biochemistry 69, 187-206 (1975), Brovko, et al., Analytical Biochemistry 220, 410-414 (1994), Momsen, Biochemical and Biophysical Research Communications 84, 816-822 (1978) und Holmsen, et al., Analytical Biochemistry 46, 489-501 (1972). Viele dieser Referenzen beschreiben die Rolle von Myokinase, auch bekannt als Adenylatkinase, zur Messung eines Adeninnucleotids mit einer Luciferasereaktion (siehe insbesondere Brovko, Momsen, Olsen und Holmsen, supra). Myokinase ist ein ubiquitäres Enzym, das man sowohl in prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen findet, mit einem Molekulargewicht von etwa 21 kDa in ihrer monomeren Form. Eine wichtige Eigenschaft von Myokinase ist ihre hohe Substratspezifität gegenüber Adeninnucleotiden, wobei sie mit ADP, AMP und ATP reaktionsfähig ist. Mykokinase katalysiert eine bidirektionale Reaktion: MgADP + ADP ↔ MgATP + AMP
Ebenso wie ATP und Mg⁺⁺ essentielle Komponenten sind, um die chemilumineszente Luciferasereaktion voranzutreiben, ist AMP ein bekannter Inhibitor der Licht-hervorbringenden Luciferasereaktion.
US-Patent 5,618,682, Scheirer, betrifft einen Luciferaseassay, basierend auf der Luciferase-Luciferin-Reaktion, von welcher beschrieben wird, dass sie Lichtemission über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden liefert. In diesem Assay wird eine Probe, von der man annimmt, dass sie Luciferase enthält, mit dem Luciferasesubstrat Luciferin, ATP, AMP und anderen Co-Faktoren zum Fördern katalytischer Aktivität kombiniert. Das wesentliche an diesem Patent ist die Kombination von sowohl ATP, zur Förderung der Luciferase-katalysierten Reaktion, als auch AMP, zur Verzögerung der Enzymkinetik, um eine anhaltende Lichtemission zu erzielen.
Wie von Scheirer genannt, ist Luciferase als ein Reportermolekül außerhalb der traditionellen Umgebung von ATP-Messung als ein Indikator von ATP-Synthese, Metabolismus oder als ein Indikator für die Anwesenheit von Bakterienzellen wichtig geworden. Eine Anzahl von Genen für Luciferase sind identifiziert worden, und von ihnen ist gezeigt worden, dass sie, wenn transfiziert, bei der Expression in heterologen Wirten effektiv sind. Folglich ist das Luciferasegen ein wichtiges Reportergen geworden, da die Detektion der Anwesenheit von Luciferase in einem Kandidaten einer rekombinanten Zelle in einer großen Vielfalt von Umgebungen verwendet werden kann, vorausgesetzt, dass Lichtemissionsintensität und -dauer gefördert werden können, um eine leichte Detektion und, was wichtig ist, automatisierte Detektion zu ermöglichen.
US-Patent 5,648,232 an Squirrel offenbart ein Verfahren zur Detektion der Anwesenheit und/oder Menge an Mikroorganismen in einer Probe durch Zugeben von Adenosindiphosphat (ADP) zu der Probe, von der vermutet wird, dass sie Mikroorganismen und/oder ihr intracelluläres Material enthält. Der Assay schließt das Bestimmen der Menge an Adenosintriphosphat (ATP), erzeugt von in der Probe vorhandener Adenylatkinase, und das Beziehen der Ergebnisse auf die Anwesenheit und/oder Menge an Mikroorganismus ein. Ein Biolumineszensassay, der Luciferase und Luciferin einschließt, ist außerdem offenbart. Assays für Adenylatkinase unter Verwendung des Luciferase- und Luciferin-Systems sind zudem in Brolin et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1 (1979), S. 163-169 und Rodionova et al., Fiziologiya Rastenii, 25, 4, S. 731-734 (1978) offenbart.
Dementsprechend bleibt es eine Aufgabe für den Durchschnittsfachmann, einen Luciferaseassay zu entwickeln, welcher gleichzeitig ausreichende Sensitivität und Lichtintensität, über einen anhaltenden Zeitraum liefert, um automatisierte Chemilumineszensdetektion der Anwesenheit von Luciferase in einer Probe, insbesondere als ein Reportergen in Assays rekombinanter Zellen, zu erlauben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die obigen Aufgaben und andere Aufgaben, die vollständiger unten entwickelt werden, werden durch einen Assay auf die Anwesenheit von Luciferase gelöst, welcher sowohl die Signalintensität von Luciferasedetektion gegenüber bestehenden Verfahren erhöht, als auch für verlängerte Lichtemission sorgt, so dass verstärkte automatisierte Detektion erreicht werden kann. Im Gegensatz zu Formulierungen im Stand der Technik, die AMP verwenden, um das Abklingen des Lichtsignals zu verhindern, und ein anfängliches ATP-Einsatzmaterial („charge") einsetzen, um die Luciferasereaktion zu fördern, setzt der erfinderische Assay zusätzlich zu Luciferin ADP und Myokinase ein. Die Assayzusammensetzung enthält außerdem Magnesium, eine essentielle Komponente für die Luciferase- und Myokinase-Reaktionen und setzt vorteilhaft Dithiothreitol (DTT) oder eine andere Sulfhydrylverbindung oder ein Gemisch von Sulihydrylverbindungen ein, um die Stabilität der Luciferase, die in der Probe anwesend sein kann, zu steigern.
Ein erster Puffer (Puffer A) beinhaltet als einen essentiellen Bestandteil Myokinase. Optionale Bestandteile, die eine größere Signalintensität liefern können, schließen Magnesium und eine reduzierende Sulfhydrylverbindung, wie beispielsweise DTT oder β-Mercaptoethanol, ein. Dieser Puffer umfasst außerdem konventionelle Puffermittel, wie beispielsweise N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin (Tricin) oder andere zwitterionische Puffer, EDTA, andere oberflächenaktive Substanzen, wie beispielsweise Triton X-100, und kann Trägermaterialien, wie beispielsweise Glycerin, umfassen.
Beim Durchführen des Assays werden zwei Reaktionspuffer hergestellt, wobei der zweite ADP und D-Luciferin als essentielle Komponenten umfasst. Dieser Reaktionspuffer kann ferner umfasst sein von konventionellen stabilisierenden Komponenten, die die Luciferasereaktion nicht beeinflussen, wie beispielsweise Dextran.
Puffer A, umfassend als essentielle Bestandteile Myokinase und optional Magnesium, vorzugsweise in der Form von MgSO₄, wird zu einem Reaktionsgefäß gegeben, das die zu testende biologische Probe, typischerweise Zellen in Kulturmedium, obwohl Zelllyse- Präparationen auch konventionell verwendet werden, umfasst. Anschließend wird Puffer B zu dem Reaktionsgefäß gegeben und das Gefäß wird bei Umgebungsbedingungen einen kurzen Zeitraum lang, etwa 10 Minuten, inkubiert. Danach wird das Gefäß in ein Lumineszens-Messgerät, wie beispielsweise ein Luminometer oder ein anderes Licht-Detektionsgerät, um Lichtintensität zu bestimmen, gestellt. In einer alternativen Ausführungsform können die zwei Reaktionspuffer einen kurzen Zeitraum lang kombiniert oder „vorgemischt" („premixed") werden und dann zu der biologischen Probe gegeben werden.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1-5 demonstrieren das Chemilumineszensverhalten des erfinderischen Assays.
In 1 wird der erfinderische Assay mit einem kommerziell erhältlichen Assay, Luc-Lite^TM, verglichen. Signal/Rauschen („S/N")-Werte werden über einen Bereich von Enzymkonzentrationen für den Assay angegeben.
2 demonstriert die Kinetiken und Signalintensität, erreicht mit der Reaktion, durchgeführt an transfizierten Hela-Zellen, verglichen mit einem kommerziell erhältlichen Assay.
3, unter Verwendung einer festgelegten Luciferase-Konzentration wird der Effekt variierender Zugabemengen von Myokinase (in Puffer A), ausgedrückt als relative Lichteinheiten („relative light units; RLU") graphisch dargestellt.
4 stellt eine ähnliche graphische Darstellung dar, die den Effekt variierender Konzentrationen von MgSO₄ (in Puffer A) über die Zeit zeigt. Es sollte angemerkt werden, dass das im Assay vorhandene Kulturmedium zusätzliches Mg⁺⁺ beisteuert.
In 5 ist der Effekt des Vormischens der zwei Puffer, vor der Kombination mit Zellkultur (transfizierte SK-NSH-Zellen, die das Luciferasegen tragen) angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Von dem Luciferase-Assay dieser Erfindung, der auf der Zugabe von Myokinase zusammen mit ADP basiert, ist gezeigt worden, dass er, im Gegensatz zu erhältlichen Stand der Technik-Assays eine Zunahme bei der Emissionsintensität und anhaltende Emission bietet. Unter der Marke LucLite ist ein weit verwendeter Luciferase-Assay erhältlich. In 1 wird der Assay dieser Erfindung, bezeichnet als Luc-Screen^TM, mit diesem kommerziell erhältlichen Luciferase-Assay verglichen. Wie klar in 1, worin die Signal/Rauschen-Werte („signal/noise values") für die beiden Assay über einen weiten Bereich von Enzymkonzentrationen bereitgestellt sind, widergespiegelt, weist die beanspruchte Erfindung verbessertes Leistungsverhalten auf. Dieser Assay wurde gemäß der unten beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt, und er erzeugt eine Sensitivitätszunahme. Wie in 2 gezeigt, weist dieser Assay eine ungefähr 5-fache Zunahme bei der Signalintensität, verglichen mit einem kommerziell erhältlichen Assay, auf. Die erhöhte Signalintensität sorgt für verbesserte Assayleistung, die seine Verwendung mit Proben, enthaltend das gebräuchliche Kulturmedium-Additiv Phenolrot, erlaubt. Gleichzeitig bleibt das anhaltende Glühen, im Gegensatz zu dem im Stand der Technik angetroffenen „Blitz" über einen ausgedehnten Zeitraum bestehen. Dies ist günstig für die Automatisierung des As says und hohen Inspektionsdurchsatz, typischerweise erreicht unter Verwendung von Mikrotiterplatten, welche 96, 384 oder mehr Vertiefungen beinhalten können. Folglich liefert der Assay hohe Signalintensität mit großer Sensitivität. In Assays von diesem Typ ermöglicht der erfindungsgemäße Luciferase-Assay (als Luc-Screen^TM bezeichnet) die Detektion von bis zu so geringen Mengen wie 50 Femtogramm des Luciferase-Enzyms.
Der Assay verlangt nach der Verwendung von zwei Reaktionspuffern. Reaktionspuffer B verwendet ADP und D-Luciferin als essentielle Bestandteile. ADP ist die ultimative Quelle von sowohl einem Reaktanten, ATP, als auch einem Verzögerer, AMP. Die ADP-Konzentration reicht von 0,2 μM bis 50 mM, vorzugsweise 2 μM bis 10 mM und wird in Beispielen bei 5 mM verwendet. D-Luciferin ist in kleineren Mengen, 0,2 μM bis 2 mM, vorzugsweise 2 μM bis 1 mM, und als ein Beispiel, 0,5 mM, vorhanden. Dieser Puffer kann, tut dies aber nicht notwendigerweise, Pufferzusammensetzungsmaterialien, wie beispielsweise Dextran, einbeziehen. Wenn einbezogen, sind diese in Mengen von 0 bis 10 mg/ml, vorzugsweise 1 bis 5 mg/ml und 2 mg/ml, als Beispiel, eingeschlossen.
Puffer A beinhaltet als eine essentielle Komponente Myokinase und kann Tricin oder ein ähriliches Puffermittel, das dem Fachmann gut bekannt ist, einschließen. Der Reaktionspuffer umfasst 0,01 bis 50 Einheiten(„unit")/ml Myokinase
Magnesium, das als MgSO₄ vorliegt, kann in Mengen von 0 bis 100 mM, vorzugsweise in einem Bereich von 0,08 bis 20 mM, vorhanden sein. Ein exemplarischer Wert ist 1 mM als MgSO₄.
Vorteilhaft können reduzierende Verbindungen einschließlich DTT, β-Mercaptoethanol oder andere im Fachgebiet anerkannte Sulihydrylverbindungen vorhanden sein, um die anwesende Luciferase zu stabilisieren. Der SH-Luciferase-Stabilisierer kann über einen weiten Bereich von 0 bis 104 mM, vorzugsweise 5 bis 75 mM, und als ein Beispiel 60 mM, vorhanden sein. Zusätzliche Komponenten, wie beispielsweise EDTA und Triton X-100, können außerdem vorhanden sein. Glycerin ist außerdem optional vorhanden über einen weiten Bereich von 0 bis 20%. Der exemplarische Reaktionspuffer ist unterhalb dargelegt.
Luc-Screen^TM-Assay-Reaktionspuffer-Zusammensetzung
Es sollte angemerkt werden, dass viele Zellkulturmedien-Zubereitungen Phenolrot als einen pH-Indikator oder -Überwacher umfassen. Die Gegenwart von Phenolrot produziert typischerweise eine 2- bis 4-fache Abnahme bei der Signalintensität, wenn das Kulturmedium Phenolrot enthält.
Das Signal dieser Reaktion wird typischerweise unter Verwendung eines Luminometers oder ähnlich lichtsensitiven Instruments gelesen, obwohl andere konventionelle Instrumente verwendet werden können. Um stetige Lichtemission aufrechtzuerhalten, sollte die Temperatur während des Assays und der Messphase bei etwa 25 bis 27°C aufrechterhalten werden.
Wie oben beschrieben, ist der Assay dafür vorgesehen, die Anwesenheit von Luciferase in Zellen in Gegenwart von Kulturmedium zu detektieren. Wenn es jedoch notwendig oder erwünscht ist, kann das Kulturmedium durch PBS, enthaltend 0,5 bis 2 mM Mg⁺⁺ und 1 mM Ca⁺⁺, ersetzt werden.
Ein Standard-Testprotokoll ist unterhalb dargelegt.
Luc-Screen^TM-Assay
Testprotokoll

1. Reaktionspuffern A und B wird erlaubt, auf Raumtemperatur aufzuwärmen.
2. 50 μl Puffer A werden zu jeder Vertiefung, die Zellen in 100 μl Kulturmedium mit oder ohne Phenolrot enthält, gegeben.
3. 50 μl Puffer B werden zu jeder Vertiefung gegeben.
(Das Timing zwischen den Zugaben von Puffer A und Puffer B ist für das Assay-Leistungsverhalten nicht kritisch).
4. Die Mikroplatte wird bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert.
5. Die Mikroplatte wird in ein Luminometer gelegt und die Signalintensität wird gemessen.

Die Effektivität dieses Assays beim Detektieren von Luciferase ist in 5 wiedergegeben.
Das obige Protokoll wird eingesetzt beim Detektieren von Luciferase, durch Lichtemission, mit SK-NSH-Zellen, transfiziert mit dem Gen für P. pyralis-Luciferase. Selbst in Gegenwan von Phenolrot ist die Signalintensität ziemlich stark und ermöglicht verlängerte Lichtemission die Automatisierung. 5 illustriert die Effekte des „Vormischens", d.h. des Kombinierens der zwei Puffer vor deren Zugabe zum Zellkulturmedium. Wie gezeigt, verbessert das Vormischen die Signalintensität mäßig, hat jedoch keinen wesentlichen Gesamteinfluss auf das Assayverhalten.
Der hierin beschriebene Assay ist hoch-sensitiv, erzeugt ein starkes anhaltendes Signal und ist an Automatisierung anpassbar. Das System ist sensitiver mit höherer Lichtsignalintensität als das führende kommerzielle System und ist relativ insensitiv gegenüber nichtautomatisierten Schwankungen, wie beispielsweise Konzentration, Timing von Schritten und dergleichen.
Die Erfindung ist oben sowohl allgemein als auch mit Bezug auf spezifische Ausführungsformen beschrieben worden. Die spezifischen Ausführungsformen sollen nicht limitierend sein und Variationen, insbesondere nicht-kritische Reaktionspufferinhalte, Konzentrationen, Timing, Temperatur und dergleichen, werden dem Fachmann ohne das Ausüben erfinderischer Fähigkeit einfallen. Diese Variationen werden innerhalb des Bereichs der Erfindung verbleiben, wenn es nicht durch die Anspruchsvorträge, die unten dargelegt sind, spezifisch ausgeschlossen ist.

Claims

Verfahren zum Prüfen auf die Anwesenheit von Luciferase in einer biologischen Probe, das umfasst: Kombinieren der Probe mit einer Reaktionszusammensetzung, welche Luciferin, Adenosindiphosphat (ADP) und Myokinase umfasst; Inkubieren-lassen der Reaktionszusammensetzung mit der biologischen Probe; und Inspizieren der inkubierten biologischen Probe und Reaktionszusammensetzung, um zu bestimmen, ob Licht emittiert wird, wobei die Lichtemission indikativ für die Anwesenheit von Luciferase in der biologischen Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionszusammensetzung ferner eine Luciferase-stabilisierende reduzierende Sulfhydryl(SH)-Verbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionszusammensetzung ferner eine Quelle von Mg⁺⁺-Ionen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Reaktionszusammensetzung ferner eine Quelle von Mg⁺⁺-Ionen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionszusammensetzung wenigstens ein Puffermittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionszusammensetzung wenigstens eines aus Dextran und Glycerin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionszusammensetzung durch Kombinieren zweier Reaktionspuffer gebildet wird, wobei der erste Puffer Myokinase umfasst, und der zweite Puffer ADP und Luciferin umfasst, und der erste und zweite Reaktionspuffer kombiniert werden, um die Reaktionszusammensetzung zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der erste Reaktionspuffer eine Quelle von Mg⁺⁺-Ionen und eine Luciferasestabilisierende reduzierende Sulfhydryl(SH)-Verbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Luciferasestabilisierende reduzierende Sulfhydryl(SH)-Verbindung Dithiothreitol, β-Mercaptoethanol oder Gemische davon ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der erste Reaktionspuffer ein zwitterionisches Puffermittel und Glycerin umfasst, und der zweite Reaktionspuffer Dextran umfasst.
Kit zum Durchführen eines Luciferase-Assays zur Detektion der Anwesenheit von Luciferase, der umfasst: einen ersten Reaktionspuffer, welcher Myokinase umfasst, und einen zweiten Reaktionspuffer, welcher ADP und Luciferin umfasst.
Kit nach Anspruch 11, wobei der erste Reaktionspuffer ein Magnesiumsalz umfasst.
Kit nach Anspruch 11, wobei der erste Reaktionspuffer eine Luciferase-stabilisierende reduzierende Sulfhydryl(SH)-Verbindung umfasst.
Kit nach Anspruch 12, wobei der erste Reaktionspuffer eine Luciferase-stabilisierende reduzierende Sulfhydryl(SH)-Verbindung umfasst.
Kit nach Anspruch 11, wobei der erste Reaktionspuffer Glycerin umfasst und der zweite Reaktionspuffer Dextran umfasst.
Kit nach Anspruch 11, wobei der erste Reaktionspuffer ein zwitterionisches Puffermittel umfasst.