RU2752498C2 - Стабильные клеточные линии для продуцирования ретровирусов - Google Patents
Стабильные клеточные линии для продуцирования ретровирусов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2752498C2 RU2752498C2 RU2018122636A RU2018122636A RU2752498C2 RU 2752498 C2 RU2752498 C2 RU 2752498C2 RU 2018122636 A RU2018122636 A RU 2018122636A RU 2018122636 A RU2018122636 A RU 2018122636A RU 2752498 C2 RU2752498 C2 RU 2752498C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- vector
- retroviral
- cell
- retrovirus
- Prior art date
Links
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 248
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 201
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 182
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 132
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 16
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims abstract 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 153
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 117
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 48
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 38
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 24
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 22
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 17
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 14
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 10
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 claims description 8
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 claims description 7
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 241001663880 Gammaretrovirus Species 0.000 claims description 4
- 241001664176 Alpharetrovirus Species 0.000 claims description 3
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 claims description 3
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 claims description 2
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 23
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 18
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 12
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 10
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 10
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 10
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 9
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 9
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 9
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 8
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 7
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 6
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 6
- 101710201961 Virion infectivity factor Proteins 0.000 description 6
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 4
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 4
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 3
- 229940037201 oris Drugs 0.000 description 3
- -1 parA Proteins 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 101150022349 sopA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150079130 sopB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101100278012 Escherichia coli (strain K12) dnaG gene Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 101000650854 Homo sapiens Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein alpha Proteins 0.000 description 2
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 2
- 241000713326 Jaagsiekte sheep retrovirus Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101100165173 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) basS gene Proteins 0.000 description 2
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 2
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 2
- 101100018382 Shigella flexneri icsP gene Proteins 0.000 description 2
- 101100421924 Thermus thermophilus (strain ATCC BAA-163 / DSM 7039 / HB27) spo0C gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 101150004979 flmA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 101150048892 parB gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 101150034434 repE gene Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 2
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241001231757 Betaretrovirus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241001663879 Deltaretrovirus Species 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000608297 Getah virus Species 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000726306 Irus Species 0.000 description 1
- 241000712902 Lassa mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000711828 Lyssavirus Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000725171 Mokola lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150101654 PSR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 241000713880 Spleen focus-forming virus Species 0.000 description 1
- 241000713675 Spumavirus Species 0.000 description 1
- 241000203615 Streptoalloteichus Species 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 1
- 241000039733 Thermoproteus thermophilus Species 0.000 description 1
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000711970 Vesiculovirus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 101150038738 ble gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 108010087471 cin recombinase Proteins 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000530 impalefection Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
- C12N15/8673—Special methods for packaging systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
- C12N7/025—Packaging cell lines, e.g. transcomplementing cell lines, for production of virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
- C12N7/045—Pseudoviral particles; Non infectious pseudovirions, e.g. genetically engineered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/00051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
- C12N2830/006—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB tet repressible
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/40—Vector systems having a special element relevant for transcription being an insulator
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Seal Device For Vehicle (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан вектор на основе нуклеиновых кислот для получения стабильной пакующей ретровирус клеточной линии, где вектор на основе нуклеиновых кислот содержит не присущий млекопитающим участок начала репликации и способность удерживать по меньшей мере 25 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) ДНК, и характеризуется тем, что указанный вектор на основе нуклеиновых кислот выбирают из искусственной хромосомы бактерий (BAC), искусственной хромосомы дрожжей (YAC), P1-полученной искусственной хромосомы, фосмиды или космиды, и содержит ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие: gag и pol белки, и env белок, где каждая из ретровирусных последовательностей нуклеиновых кислот имеет свой собственный промотор внутри вектора на основе нуклеиновых кислот и один или множество сайтов рекомбинации для интеграции указанных последовательностей нуклеиновых кислот в эндогенную хромосому клетки-хозяина млекопитающего сайт-специфичным образом. Изобретение также относится к применениям и способам, в которых используется указанный вектор на основе нуклеиновой кислоты с целью продуцировать стабильные линии клеток, пакующие и продуцирующие ретровирусы. Изобретение расширяет арсенал средств для продуцирования ретровирусных векторов. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к векторам на основе нуклеиновых кислот, содержащим гены, необходимые для продуцирования ретровирусов, и их применению. Также предоставлены способы создания линий клеток, пакующих/продуцирующих ретровирусы, содержащих векторы на основе нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
При генотерапии генетический материал доставляется в эндогенные клетки индивидуума, нуждающегося в лечении. Генетический материал может вносить новые гены индивидууму или вносить дополнительные копии предсуществующих генов, или вносить различные аллели или варианты генов, которые присутствуют у индивидуума. Системы вирусных векторов были предложены в качестве эффективного способа доставки генов для применения в генотерапии (Verma и Somia (1997) Nature 389: 239-242).
Конкретно, основой этих вирусных векторов являются члены семейства ретровирусов вследствие их способности интегрировать свой генетический груз в геном хозяина. Ретровирусные векторы сконструированы для содержания важнейших белков, необходимых для упаковки и доставки ретровирусного генома, но любые несущественные добавочные белки, включая те, которые ответственны за их профиль заболевания, удалены. Примеры ретровирусных векторов включают лентивирусные векторы, такие как основанные на вирусе иммунодефицита человека тип 1 (ВИЧ-1), который широко используют, поскольку они способны интегрироваться в непролиферирующие клетки.
В настоящее время большинство вирусных векторов получают посредством временной сотрансфекции вирусных генов внутрь линии клеток-хозяев. Вирусные гены вносятся с использованием бактериальных плазмид, которые существуют в клетке-хозяине в течение лишь ограниченного периода времени, потому что вирусные гены остаются на плазмидах и не интегрируются в геном. В связи с этим, временно трансфицированный генетический материал не передается последующим поколениям во время клеточного деления.
Существует несколько недостатков, связанных с временной трансфекцией, такие как вариабельность от партии к партии, высокая стоимость реагентов для трансфекции и трудность поддержания контроля качества (см. Segura et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(7): 987-1011). Процесс трансфекции сам по себе также является трудоемким и представляющим сложность при увеличении масштабов производства. Также существует сложная задача удаления загрязнения плазмидами, которые переносятся во время получения вектора (см. Pichlmair et al. (2007) J. Virol. 81(2): 539-47).
Обращаясь к проблемам, связанным с временной трансфекцией, присутствует желание разработать линии клеток, пакующие и продуцирующие ретровирусы, с целью упростить продуцирование ретровирусных векторов.
Пакующие линии клеток были произведены посредством трансфекции линии клеток, способной паковать ретровирусные векторы, с применением плазмид, где индивидуальные плазмиды несут ретровирусные гены упаковки и уникальные эукариотические селективные маркеры. Гены упаковки интегрированы в геном пакующей линии клеток и описываются как стабильно трансфицированные. За последние 20 лет были сделаны различные попытки произвести стабильные пакующие и продуцирующие линии клеток для ретровирусных векторов.
Сообщалось о многочисленных проблемах в отношении пакующих и продуцирующих линий клеток, полученных посредством интеграции компонентов ретровирусного вектора в геном клетки-хозяин. В первую очередь, последовательное введение компонентов ретровирусного вектора может быть трудоемким и ненастраиваемым. Также были проблемы с генетической и/или транскрипционной нестабильностью компонентов ретровирусного вектора при их интеграции в геном клетки-хозяина, поскольку участок интеграции является непредсказуемым (Ni et al. (2005) J. Gene Med. 7: 818-834.). Значительный спад продуктивности вирусного вектора также сообщался во время суспензионной адаптации и повышении масштаба производства продуцирующих линий клеток (Farson et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 981-997; Guy et al. (2013) Hum. Gene Ther. Methods. 24(2): 125-39).
Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставить способ создания стабильных линий клеток, пакующих и продуцирующих ретровирусы, посредством которого преодолевается один или несколько из неблагоприятных факторов, связанных с существующими способами.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения разработали новый способ создания пакующих и продуцирующих линий клеток, который включает применение векторов на основе нуклеиновых кислот, содержащих участок начала репликации, не присущий млекопитающим, и способность удерживать, по меньшей мере, 25 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) ДНК, таких как бактериальные искусственные хромосомы, содержащие гены ретровирусов, обязательные для продуцирования ретровирусного вектора. Это обеспечивает экспрессию ретровирусных генов, необходимых для продуцирования ретровирусных векторных частиц с дефектом репликации для устранения проблем, связанных со способами временной трансфекции.
Применение вектора на основе нуклеиновой кислоты, содержащего не присущий млекопитающим участок начала репликации и который обладает способностью удерживать, по меньшей мере, 25 т.п.н. ДНК (т.е. крупную конструкцию ДНК), имеет несколько преимуществ. В первую очередь, векторы могут быть сначала обработаны в клетках немлекопитающих (например, микробных клетках, таких как бактериальные клетки), вместо клеток млекопитающего, что делает их применение гораздо более легким (например, бактериальные искусственные хромосомы могут быть сначала обработаны в E. coli). Как только вектор на основе нуклеиновой кислоты был получен, он может быть введен в клетку млекопитающего, и можно выбирать любые клетки млекопитающего, которые имеют вектор на основе нуклеиновой кислоты, интегрированный в эндогенные хромосомы, с целью выделить стабильную линию клеток.
Введение нуклеиновых кислот ретровирусов в клетку млекопитающего также может происходить в один этап, что помогает уменьшить давление отбора и период сайленсинга. Это позволяет провести более быстрый скрининг потенциальных упаковывающих клеток и снижает стоимость материалов, так как используется только единичный вектор, в отличие от предыдущих способов, в которых используется множество плазмидных векторов. Конкретно, применение данной системы снижает стоимость производства посредством экономии на стоимости плазмиды, реагентов, необходимых для трансфекции (например, полиэтиленимина [PEI]), снижения количества необходимой обработки бензоназой (при этом способе снижено количество ДНК при сборе лентивируса, таким образом, меньше бензоназы необходимо для удаления избытка при переработке для выделения и очистки конечного продукта) и сниженной стоимости тестирования (нет необходимости в тестировании на предмет остаточной плазмиды в лентивирусном продукте).
Кроме того, в векторе на основе нуклеиновой кислоты присутствуют гены ретровирусов, обязательные для продуцирования ретровирусов (с или без вектора для переноса), таким образом, что при введении вектора в клетку млекопитающего, все гены ретровирусов, встроенные в вектор на основе нуклеиновой кислоты, будут интегрированы в одном локусе в составе эндогенного генома клетки млекопитающего. Это может устранить такие проблемы, как сайленсинг генов, который происходит, когда гены ретровирусов интегрированы случайным образом и в различные локусы внутри генома клетки-хозяина.
Применение векторов на основе нуклеиновой кислоты по изобретению, таким образом, предоставляет преимущества при создании линий клеток, пакующих и продуцирующих ретровирусы.
Таким образом, по первому аспекту изобретения, представлена клетка, продуцирующая ретровирусы, содержащая последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие:
gag и pol белки;
env белок или его функциональный заменитель; и
РНК геном ретровирусной векторной частицы,
где указанные последовательности нуклеиновых кислот все расположены в едином локусе внутри генома клетки, продуцирующей ретровирус.
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлен вектор на основе нуклеиновой кислоты, содержащий не присущий млекопитающим участок начала репликации и способность удерживать, по меньшей мере, 25 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) ДНК, характеризующийся тем, что указанный вектор на основе нуклеиновой кислоты содержит ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие:
gag и pol белки, и
env белок или его функциональный заменитель,
где каждая из ретровирусных последовательностей нуклеиновой кислоты расположена в виде индивидуальных экспрессирующих конструкций в составе вектора на основе нуклеиновой кислоты.
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлен способ получения стабильной ретровирусной пакующей линии клеток, содержащий:
(a) введение вектора на основе нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем документе, в культуру клеток млекопитающего; и
(b) отбор в культуре клеток млекопитающего, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодируемые на векторе, интегрированном в эндогенную хромосому клетки млекопитающего.
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлена ретровирусная упаковывающая клетка, полученная посредством способа, как определено в настоящем документе.
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлен способ получения репликативно-дефектной ретровирусной векторной частицы, содержащий:
(a) введение вектора на основе нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем документе, в культуру клеток млекопитающего;
(b) отбор в культуре клеток млекопитающего, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодируемые на векторе, интегрированном в эндогенную хромосому клетки млекопитающего; и
(c) дополнительное культивирование клетки млекопитающего в условиях, при которых получают репликативно-дефектную ретровирусную векторную частицу.
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлена репликативно-дефектная ретровирусная векторная частица, полученная посредством способа, как определено в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГУРА 1: Пошаговое руководство для конструирования BACpack-WTGP-277delU5 и BACpack-SYNGP-277delU5.
ФИГУРА 2: Отбор стабильного поликлонального пула
Адгезивные клетки HEK293T трансфицировали с применением BACpackWTGagPol-переноса с использованием фосфата кальция. Стабильные пулы получали после 2 недель отбора с помощью зеоцина. Чтобы увидеть, способны ли стабильные трансфектанты вырабатывать вирус, стабильные поли-пулы индуцировали с применением доксициклина в течение 48 часов. Вирусный супернатант собирали 48 часов после индукции, фильтровали через 0,22 мкм фильтр и титровали посредством трансдукции HEK293T клеток. GFP позитивные трансдуцированные клетки использовали для расчета трансдуцирующих единиц/мл (TU/мл).
ФИГУРА 3: Создание стабильных трансфекционных суспензионных клонов. HEK293 6E клетки трансфицировали с применением BACpackWTGagPol-переноса с использованием реагента 293fectin. Стабильные пулы получали после 2 недель отбора с применением зеоцина. Стабильные пулы клонировали посредством лимитирующего разведения в 96-луночных планшетах для получения клонов единичных клеток, которые затем размножали. GFP детектировали посредством флуоресцентной микроскопии лучших клонов 1, 14, 15 и 16, полученных с применением среды для адгезивных клеток (DMEM+FBS) с последующей адаптацией к суспензионных условиям культивирования (среда FreeStyle).
ФИГУРА 4: Индукция лентивируса в суспензионных клонах. Чтобы увидеть, способны ли стабильные HEK6E трансфектанты вырабатывать вирус, 20 мл стабильных суспензионных клонов индуцировали с применением доксициклина (2 мкг/мл) в течение 48 часов. Вирусный супернатант собирали 48 часов после индукции, фильтровали через 0,45μm фильтр и титровали посредством трансдуцирования HEK293T клеток. GFP позитивные трансдуцированные клетки использовали для расчета трансдуцирующих единиц/мл (TU/мл).
ФИГУРА 5: Векторные титры клонов, продуцированные в соответствии с примером 4. Результаты демонстрируют векторные титры от клонов 1 и 16, незначительно повышенные между пассажем 5 и пассажем 21.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не определено иначе, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют то же значение, какое обычно понятно специалисту в данной области, к которой принадлежит данное изобретение. Все патенты и публикации, упоминаемые в настоящем документе, полностью включены в качестве ссылки.
Термин «содержащий» охватывает «включающий» или «состоящий из», например, композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из X или может включать что-то дополнительное, например, X+Y.
Термин «состоящий по существу из» ограничивает объем признака до указанных материалов или этапов и таких, которые не оказывают существенного влияния на основную(ые) характеристику(и) заявленного свойства.
Термин «состоящий из» исключает наличие любого дополнительного(ых) компонента(ов).
Термин «приблизительно» по отношению к числовому значению x означает, например, x ± 10%, 5%, 2% или 1%.
Термин «вектор» или «вектор на основе нуклеиновой кислоты» относится к переносчику, который способен искусственным образом переносить чужеродный (т.е. экзогенный) генетический материал в другую клетку, где он может реплицироваться и/или экспрессироваться. Примеры векторов включают не присущие млекопитающим векторы на основе нуклеиновых кислот, такие как искусственные хромосомы бактерий (BACs), искусственные хромосомы дрожжей (YACs), P1-полученные искусственные хромосомы (PACs), космиды или фосмиды.
Другие примеры векторов включают вирусные векторы, такие как ретровирусные и лентивирусные векторы, которые представляют особый интерес в настоящей заявке. Лентивирусные векторы, так как те, которые основаны на вирусе иммунодефицита человека тип 1 (ВИЧ-1) широко используют, поскольку они способны интегрироваться в непролиферирующие клетки. Вирусные векторы могут быть сделаны репликативно-дефектными посредством расщепления вирусного генома на отдельные части, например, посредством помещения на отдельные плазмиды. Например, так называемое первое поколение лентивирусных векторов, разработанное в Salk Institute for Biological Studies, было сконструировано в виде трехплазмидной экспрессирующей системы, состоящей из пакующей экспрессирующей кассеты, оболочечной экспрессирующей кассеты и векторной экспрессирующей кассеты. «Пакующая плазмида» содержит полностью gag-pol последовательности, регуляторные (tat и rev) и добавочные (vif, vpr, vpu, nef) последовательности. «Оболочечная плазмида» содержит гликопротеин вируса везикулярного стоматита (VSVg) взамен нативного оболочечного белка ВИЧ-1, под контролем промотора цитомегаловируса (CMV). Третья плазмида («трансферная плазмида») несет длинные концевые повторы (LTRs), последовательность инкапсуляции (ψ), последовательность элемента ответа Rev (RRE) и CMV промотор для экспрессии трансгена внутри клетки-хозяина.
Второе поколение лентивирусных векторов характеризовалось делецией вирулентных последовательностей vpr, vif, vpu и nef. Пакующий вектор был сокращен до генов gag, pol, tat и rev, таким образом, повышая безопасность системы.
С целью улучшения лентивирусной системы были сконструированы векторы третьего поколения посредством удаления гена tat из пакующей конструкции и инактивации LTR из векторной кассета, таким образом, уменьшая проблемы, связанные с эффектами инсерционного мутагенеза.
Различные поколения лентивирусов описаны в следующих ссылочных источниках: первое поколение: Naldini et al. (1996) Science 272(5259): 263-7; второе поколение: Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15(9): 871-5; третье поколение: Dull et al. (1998) J. Virol. 72(11): 8463-7, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью. Обзор на предмет разработки лентивирусных векторов можно найти в Sakuma et al. (2012) Biochem. J. 443(3): 603-18 и Picanço-Castro et al. (2008) Exp. Opin. Therap. Patents 18(5):525-539.
Термин «не присущий млекопитающим участок начала репликации» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, где инициируется репликация, и которую получают из не присущего млекопитающим источника. Это позволяет векторам на основе нуклеиновых кислот по изобретению стабильно реплицировать и в то же время сегрегировать эндогенные хромосомы в подходящей клетке-хозяине (например, микробной клетке, такой как бактериальная или дрожжевая клетка), таким образом, что она является годной к передаче потомству клетки-хозяина, кроме случая, когда клетка-хозяин представляет собой присущую млекопитающему клетку-хозяин. В клетках млекопитающего векторы на основе нуклеиновых кислот с не присущими млекопитающим участками начала репликации будут либо интегрироваться в эндогенные хромосомы клетки млекопитающего или будут утеряны при репликации клетки млекопитающего. Например, векторы на основе нуклеиновых кислот с не присущими млекопитающим участками начала репликации, такие как бактериальные искусственные хромосомы (BAC), P1-полученная искусственная хромосома (PAC), космиды или фосмиды, способны стабильно реплицировать и в то же время сегрегировать эндогенные хромосомы в бактериальных клетках (таких как E. coli), однако если они вносятся в клетки млекопитающего, BAC, PAC, космида или фосмида будут либо интегрироваться или или будут утеряны при репликации клетки млекопитающего. Искусственные хромосомы дрожжей (YAC) способны стабильно реплицировать и в то же время сегрегировать эндогенные хромосомы в клетках дрожжей, однако если они вносятся в клетки млекопитающего, YAC будут либо интегрироваться, либо будут утеряны при репликации клетки млекопитающего. Таким образом, в этом контексте, векторы на основе нуклеиновых кислот по изобретению действуют в качестве резервуаров ДНК (т.е. для генов, обязательных для продуцирования ретровирусов), которые могут быть с легкостью перенесены в клетки млекопитающего для создания стабильных линий клеток для продуцирования ретровирусов. Примеры не присущих млекопитающим участков начала репликации включают бактериальные участки начала репликации, такие как oriC, oriV или oriS, или дрожжевые участки начала репликации, также известные как автономно повторяющиеся последовательности (ARS элементы).
Векторы на основе нуклеиновых кислот по настоящему изобретению содержат не присущий млекопитающим участок начала репликации и способны удерживать, по меньшей мере, 25 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) ДНК. В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты обладает способностью удерживать, по меньшей мере, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 или 350 т.п.н. ДНК. Следует понимать, что указания на «способность удерживать» имеют свое обычное значение и подразумевают, что верхний предел размера вставки для вектора на основе нуклеиновой кислоты составляет не менее, чем заявленный размер (т.е. не менее чем 25 т.п.н. ДНК).
Целью настоящего изобретения является включить гены, обязательные для ретровирусной упаковки, в единую конструкцию (т.е. вектор на основе нуклеиновой кислоты). Таким образом, векторы на основе нуклеиновых кислот по изобретению, должны быть способны удерживать большие вставки ДНК. Во избежание неопределенности, следует понимать, что указания на «векторы на основе нуклеиновых кислот» или «искусственные хромосомы» не относятся к природным бактериальным плазмидам (например, таким как плазмиды, применяемые в настоящее время в способах временной трансфекции), потому что они не способны удерживать, по меньшей мере, 25 т.п.н. ДНК. Максимальный размер вставки, которую может содержать плазмида, составляет приблизительно 15 т.п.н. Такие векторы на основе нуклеиновых кислот также не относятся к бактериофагам, которые, как правило, удерживают вставки максимум только 5-11 т.п.н. Таким образом, в одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты по изобретению не является плазмидой, бактериофагом или эписомой.
Термин «эндогенные хромосомы» относится к геномным хромосомам, обнаруживаемым в клетке-хозяине перед созданием или введением экзогенного вектора на основе нуклеиновой кислоты, такого как бактериальная искусственная хромосома.
Термины «трансфекция», «трансформация» и «трансдукция» как используют в настоящем документе, можно использовать для описания вставки не присущего млекопитающим или вирусного вектора в клетку-мишень. Вставку вектора, как правило, называют трансформацией для бактериальных клеток и трансфекцией для эукариотических клеток, хотя вставка вирусного вектора также могут называть трансдукцией. Специалист обычно осведомлен о различных широко используемых способах невирусной трансфекции, которые в качестве неограничивающих примеров включают применение физических способов (например, электропорация, сжимание клетки, сонопорация, оптическая трансфекция, слияние протопластов, импалефекция, магнитофекция, генная пушка или бомбардировка частицами), химические реагенты (например, фосфат кальция, сильно разветвленные органические соединения или катионные полимеры) или катионные липиды (например, липофекция). При многих способах трансфекции необходим контакт растворов плазмиды ДНК с клетками, которые затем выращивают и отбирают с помощью маркера экспрессии гена.
Термин «промотор» относится к последовательности, которая запускает экспрессию гена. Чтобы запустить высокий уровень экспрессии, предпочтительным может являться использование высоко эффективного промотора, такого как неретровирусный, высокоэффективный промотор. Примеры подходящих промоторов могут включать такой промотор, как немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека (CMV), промотор вируса бляшкообразования в селезенке (SFFV), промотор вируса саркомы Рауса (RSV) или промотор фактора элонгации 1-альфа человека (pEF).
Tet оперон (тетрациклин-контролируемая транскрипционная активация) можно использовать в способе индуцируемой экспрессии гена, где транскрипцию обратимым образом включают или выключают в присутствии антибиотика тетрациклина или одного из его производных (например, доксициклина). В природе, Ptet промотор экспрессирует TetR, репрессор, и TetA, белок, который откачивает антибиотик тетрациклин из клетки. В настоящем изобретении, Tet оперон может присутствовать или отсутствовать, например, в одном из вариантов осуществления Tet оперон может присутствовать в промоторе.
Термин «селективный маркер» относится к гену, который помогает выбрать клетки, активно экспрессирующие вставленный ген (например, трансген). Примеры подходящих селективных маркеров включают ферменты, кодирующие устойчивость к антибиотику (т.е. ген устойчивости к антибиотикам), например, канамицин, неомицин, пуромицин, гигромицин, бластицидин или зеоцин. Другим примером подходящих селективных маркеров являются флуоресцентные белки, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), красный флуоресцентный белок (RFP) или голубой флуоресцентный белок (BFP).
Термин «полиA сигнал» относится к последовательности сигнала полиаденилирования, например, размещенной на 3' трансгена, которая позволяет факторам организма-хозяина добавить полиаденозиновый (полиA) хвост к концу растущей иРНК во время транскрипции. ПолиA хвост это удлинение до 300 аденозиновых рибонуклеотидов, которое защищает иРНК от ферментативного расщепления и также способствует трансляции. Таким образом, векторы на основе нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут включать сигнальную последовательность полиA, такую как полиA сигналы бета глобина человека или бета глобина кролика, ранние или поздние полиA сигналы вируса обезьяны 40 (SV40), полиA сигнал инсулина человека или полиA сигнал гормона роста быка. В одном из вариантов осуществления сигнальной последовательностью полиA является полиA сигнал бета глобина человека.
Термин «интронная последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, которая удалена из финального продукта гена посредством РНК сплайсинга. Было показано, что применение нисходящего интрона энхансерной/промоторной области и восходящего интрона вставки кДНК повышает уровень экспрессии гена. Повышение экспрессии зависит от конкретной кДНК вставки. Таким образом, вектор на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может включать интроны, такие как интрон бета глобина человек, интрон II бета глобина кролика или химерный интрон бета глобина-иммуноглобулина человека. В одном из вариантов осуществления интроном является интрон бета глобина человек и/или интрон II бета глобина кролика.
Термин «пакующий линия клеток» относится к линии клеток со стабильно вставленными генами gag и pol белка и оболочечного гликопротеина. Альтернативно, термин «продуцирующая линия клеток» относится к пакующей линии клеток со стабильно вставленным вектором для переноса, содержащим трансген, представляющим интерес. Специалисту в данной области следует понимать, что векторы на основе нуклеиновых кислот, описываемые в настоящем документе, можно использовать для создания пакующих линий клеток (т.е. когда, по меньшей мере, gag, pol и env гены присутствуют на векторе на основе нуклеиновой кислоты и встроены в клетку-хозяин) или продуцирующих линий клеток (т.е. когда вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит вектор для переноса компонентов, предназначенных для встраивания в клетку-хозяин наряду с gag, pol и env генами).
Термин «стабильно трансфицированный» относится к линиям клеток, которые способны передавать введенные ретровирусные гены своему потомству (т.е. дочерним клеткам), или потому что трансфицированная ДНК была встроена в эндогенные хромосомы, или за счет стабильного наследования экзогенных хромосом.
ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
В соответствии с одним из аспектов изобретения, предоставлен вектор на основе нуклеиновой кислоты, содержащий не присущий млекопитающим участок начала репликации и способность удерживать, по меньшей мере, 25 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) ДНК, характеризующийся тем, что указанный вектор на основе нуклеиновой кислоты содержит ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие:
gag и pol белки, и
env белок или его функциональный заменитель.
Конкретно, каждая из ретровирусных последовательностей нуклеиновых кислот может быть организована как индивидуальные экспрессирующие конструкции внутри вектора на основе нуклеиновой кислоты.
Существующие способы создания ретровирусных векторов предполагают временную трансфекцию ретровирусных генов в клетку-хозяин. Однако с этим способом связано много недостатков, поскольку он дорогостоящий, трудоемкий и сложный в промышленном масштабе. Одним из возможных решений является конструирование пакующей линии клеток, которая стабильно встраивает ретровирусные гены упаковки во избежание проблем, связанных с временной трансфекцией и для снижения выхода вариабельных ретровирусных векторов.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что векторы на основе нуклеиновых кислот, описываемые в настоящем документе, можно использовать для создания ретровирусной пакующей линии клеток, которая устранит предшествующие трудности, связанные со способами продуцирования ретровирусных векторов. Например, известные способы продуцирования ретровирусных пакующих линий клеток предполагают множество раундов селекции, после того, как введен каждый ретровирусный ген. Этот процесс может занять до шести месяцев и требует огромных трудозатрат. Посредством включения всех ретровирусных генов в вектор на основе нуклеиновой кислоты, гены ретровирусов могут затем быть вставлены в эндогенные хромосомы клетки млекопитающего в один единственный этап. Таким образом, применение вектора на основе нуклеиновой кислоты, как предполагается в настоящем документе, должно уменьшить давление отбора, уменьшить временной период сайленсинга и обеспечить более быстрый скрининг потенциальных упаковывающих клеток. Кроме того, гены ретровирусов, включенные в вектор на основе нуклеиновой кислоты все будут интегрированы в эндогенные хромосомы клетки млекопитающего в единичном локусе, что снизит риск того, что отдельные ретровирусные гены подвергнутся сайленсингу, и гарантирует, что все гены ретровирусов будут равномерно экспрессироваться.
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют РНК геном ретровирусных векторных частиц. Следует понимать, что РНК геном ретровирусных векторных частиц, как правило, включен в «вектор для переноса», применяемый в способах временной трансфекции. Плазмидный вектор для переноса, как правило, содержит промотор (такой как CMV), 3' LTR (который может быть или может не быть самостоятельно инактивирующим (т.е. SIN) 3'-LTR), 5' LTR (который может содержать или может не содержать U5 область), последовательность инкапсулирования (ψ) и потенциально трансген, связанный с промотором.
В одном из вариантов осуществления множественные копии РНК генома ретровирусных векторных частиц (т.е. вектора для переноса) включены в вектор на основе нуклеиновой кислоты. Ожидается, что множественные копии вектора для переноса приведут к более высокому титру вирусного вектора. Например, вектор на основе нуклеиновой кислоты может включать две или более, например, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять или более копий РНК генома ретровирусных векторных частиц (т.е. вектора для переноса).
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты содержит один или множество сайтов рекомбинации. Это позволяет нацелиться на последовательности, которые надо интегрировать в эндогенные хромосомы клетки млекопитающего сайт-специфичным образом в присутствии фермента рекомбиназы. Фермент рекомбиназа катализирует реакцию рекомбинации между двумя сайтами рекомбинации.
Много типов систем сайт-специфичной рекомбинации известно в данной области, и в настоящем изобретении можно использовать любую подходящую систему рекомбинации. Например, в одном из вариантов осуществления сайт(ы) рекомбинации выбран(ы) или получен(ы) из int/att системы фага лямбда, Cre/lox системы бактериофага P1, FLP/FRT системы дрожжей, Gin/gix рекомбиназной системы фага Mu, Cin рекомбиназной системы, Pin рекомбиназной системы E. coli и R/RS системы плазмиды pSR1 или любого их сочетания. В дополнительном варианте осуществления сайтом рекомбинации является att сайт (например, из фага лямбда), где att сайт позволяет произвести сайт-направленную интеграцию в присутствии лямбда-интегразы. Следует понимать, что указание на «лямбда-интегразу» включает указания на мутантные интегразы, которые тем не менее совместимы с int/att системой, например, модифицированные лямбда-интегразы, описанные в WO 2002/097059.
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты выбран из: бактериальной искусственной хромосомы (BAC), искусственной дрожжевой хромосомы (YAC), P1-полученной искусственной хромосомы (PAC), фосмиды или космиды. В дополнительном варианте осуществления вектором на основе нуклеиновой кислоты является бактериальная искусственная хромосома (BAC).
Бактериальные искусственные хромосомы
Термин «бактериальная искусственная хромосома» или «BAC» относится к ДНК конструкции, полученной из бактериальной плазмиды, которая способна удерживать большую вставку экзогенной ДНК. Они могут, как правило, удерживать ДНК вставку максимум из приблизительно 350 т.п.н. BACs были разработаны на основе хорошо охарактеризованной бактериальной функциональной плазмиды фертильности (F-плазмида), которая содержит разделенные гены, которые способствуют равномерному распределению плазмид после деления бактериальной клетки. Это позволяет BACs быть стабильно реплицированной и сегрегированной наряду с эндогенными бактериальными геномами (такими как E. coli). BAC, как правило, содержит, по меньшей мере, одну копию участка начала репликации (такого как oriS или oriV ген), ген repE (для репликации и регуляции числа копий плазмиды) и разделяющие гены (такие как sopA, sopB, parA, parB и/или parC), которые обеспечивают стабильное поддержание BAC в бактериальных клетках. BACs в природе являются кольцевыми и сверхспиральными, что делает их восстановление более легким, чем для линейных искусственных хромосом, таких как YACs. Они также могут быть введены в бактериальные клетки-хозяева относительно легко, с применением простых способов, таких как электропорация.
В одном из вариантов осуществления бактериальная искусственная хромосома содержит oriS ген. В одном из вариантов осуществления бактериальная искусственная хромосома содержит repE ген. В одном из вариантов осуществления бактериальная искусственная хромосома содержит разделяющие гены. В дополнительном варианте осуществления разделяющие гены выбраны из sopA, sopB, parA, parB и/или parC. В еще одном дополнительном варианте осуществления бактериальная искусственная хромосома содержит sopA и sopB ген.
BAC для применения в настоящем изобретении можно получать из коммерческих источников, например, pSMART BAC из LUCIGEN™ (см. номер доступа генома EU101022.1 для полной последовательности нуклеотидного остова). Этот BAC содержит L-арабинозную «переписывающую» систему, которая также содержит oriV средне-копийный участок начала репликации, который является активным только в присутствии белка репликации TrfA. Ген для TrfA может быть встроен в геном бактериальных клеток-хозяев под контролем L арабинозного индуцибельного промотора araC-P BAD (см. Wild et al. (2002) Genome Res. 12(9): 1434-1444). Добавление L-арабинозы индуцирует экспрессию TrfA, которая активирует oriV, вызывая репликацию плазмиды до 50 копий на клетку.
Искусственные хромосомы дрожжей
Термин «искусственная дрожжевая хромосома» или «YAC» относится к хромосомам, в которых ДНК дрожжей встроена в бактериальные плазмиды. Они содержат автономно реплицирующуюся последовательность (ARS) (т.е. участок начала репликации), центромеру и теломеры. В отличие от BACs, YAC является линейной и, таким образом, содержит теломеры дрожжей на каждом конце хромосомы для защиты концов от деградации по мере перехода к потомству клетки-хозяина. YACs могут удерживать целый ряд размеров ДНК вставок; какой-либо из диапозона 100-2000 т.п.н.
P1-полученные искусственные хромосомы
Термин «P1-полученная искусственная хромосома» или «PAC» относится к конструкции ДНК, полученной из ДНК P1-бактериофага и бактериальной F-плазмиды. Они могут, как правило, удерживать ДНК вставку максимум из приблизительно 100-300 т.п.н. и используются в качестве клонирующих векторов в E. coli. PACs обладают преимуществами подобно, как у BACs, такие как легкость в очищении и введении в бактериальные клетки-хозяева.
Космиды и фосмиды
Термин «космида» относится к конструкциям ДНК, полученной из бактериальных плазмид, которые дополнительно содержат cos сайты, полученные из бактериофага лямбда. Космиды, как правило, содержат бактериальный участок начала репликации (такой как oriV), селективный маркер, клонирующий сайт и, по меньшей мере, один cos сайт. Космиды могут, как правило, принять ДНК вставку максимум 40-45 т.п.н. Было показано, что космиды являются более эффективными при инфицировании клеток E. coli, чем стандартные бактериальные плазмиды. Термин «фосмиды» относится к не присущим млекопитающим векторам на основе нуклеиновых кислот, которые являются подобными космидам, за исключением того, что они основаны на бактериальной F-плазмиде. Конкретно, в них используется участок начала репликации и распределительные механизмы F-плазмиды, чтобы обеспечить возможность клонирования больших фрагментов ДНК. Фосмиды могут, как правило, принимать ДНК вставку максимум 40 т.п.н.
РЕТРОВИРУСЫ
Ретровирусы являются семейством вирусов, которые содержат псевдодиплоидный одноцепочечный РНК геном. Они кодируют обратную транскриптазу, которая продуцирует ДНК из РНК генома, которая затем может быть вставлена в ДНК клетки-хозяина. Изобретение, описываемое в настоящем документе, можно использовать для продуцирования репликативно-дефектных ретровирусных векторных частиц. Ретровирусную векторную частицу по настоящему изобретению можно выбрать из или получить из любого подходящего ретровируса.
В одном из вариантов осуществления ретровирусную векторную частицу получают или выбирают из лентивируса, альфа-ретровируса, гамма-ретровируса или пенящего ретровируса, такого как лентивирус или гамма-ретровирус, конкретно, лентивируса. В дополнительном варианте осуществления ретровирусной векторной частицей является лентивирус, выбранный из группы, состоящей из ВИЧ-1, ВИЧ-2, SIV, FIV, EIAV и Visna. Лентивирусы способны инфицировать неделящиеся (т.е. покоящиеся) клетки, что делает их привлекательными ретровирусными векторами для генотерапии. В еще одном дополнительном варианте осуществления ретровирусная векторная частица представляет собой ВИЧ-1 или получена из ВИЧ 1. Геномную структуру некоторых ретровирусов можно найти в данной области. Например, подробности о ВИЧ-1 можно найти в NCBI Genbank (номер доступа генома AF033819). ВИЧ-1 является одним из наиболее изученных ретровирусов и, таким образом, часто используется в качестве ретровирусного вектора.
Ретровирусные гены
Последовательности нуклеиновых кислот, общие для всех ретровирусов, могут быть объяснены более подробно, как следует далее:
Длинные концевые повторы (LTRs): Основная структура ретровирусного генома содержит 5'-LTR и 3'-LTR, между или внутри которых расположены гены, требуемые для продуцирования ретровирусов. LTRs необходимы для интеграции и транскрипции ретровируса. Они также могут действовать как промотор последовательности для контроля экспрессии ретровирусных генов (т.е. они являются cis-действующими генами). LTRs состоят из трех субобластей, обозначенных U3, R, U5: U3 происходит из последовательности, уникальной для 3' конца РНК; R происходит из последовательности, повторяющейся на обоих концах РНК; и U5 происходит из последовательности, уникальной для 5' конца РНК. Таким образом, в одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит 5'- и 3'-LTR. В дополнительном варианте осуществления U5 область 5' LTR может быть удалена и замещена не-ВИЧ-1 полиA хвостом (см. Hanawa et al. (2002) Mol. Ther. 5(3): 242-51).
С целью решения вопросов безопасности, относящихся к созданию репликационно-компетентного вируса, был разработан самоинактивирующийся (SIN) вектор посредством удаления участка в U3 области 3′ LTR, которая включает TATA бокс и участки связывания для факторов транскрипции Sp1 и NF-κB (см. Miyoshi et al. (1998) J. Virol. 72(10):8150-7). Делецию переносят к 5′ LTR после обратной транскрипции и интеграции в инфицированных клетках, что приводит к транскрипционной инактивации LTR. Это известно как самоинактивирующаяся векторная система на основе лентивируса, которая может быть включена в настоящее изобретение.
ψ: Инкапсулирование ретровирусной РНК происходит посредством ψ (psi) последовательности, расположенной на 5' конце ретровирусного генома. Также хорошо известно в данной области, что последовательности ниже psi последовательности и распространяющиеся на gag кодирующую область вовлечены в эффективное продуцирование ретровирусного вектора (см. Cui et al. (1999) J. Virol. 73(7): 6171-6176). В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит ψ (psi) последовательность.
Участок связывания праймера (PBS): Ретровирусный геном содержит PBS, который находится после U5 области 5'-LTR. Этот сайт связывается с тРНК праймером, необходимым для инициации обратной транскрипции. В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит PBS последовательность.
PPT: Ретровирусные геномы содержат короткие фрагменты пуринов, называемые полипуриновые тракты (PPTs), рядом с 3' концом ретровирусного генома. Эти PPTs функционируют как РНК праймеры для синтеза плюс-цепи ДНК во время обратной транскрипции. Сложные ретровирусы (такие как ВИЧ-1) содержат второй, более центрально расположенный PPT (т.е. центральный полипуриновый тракт (cPPT)), который предоставляет второй сайт для инициации синтеза ДНК. Было показано, что ретровирусные векторы, кодирующие cPPT демонстрируют усиленную трансдукцию и экспрессию трансгена (см. Barry et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12(9):1103-8). В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит 3'-PPT последовательность и/или cPPT последовательность.
Геномная структура некодирующих областей, описанных выше, хорошо известна специалисту в данной области. Например, подробности о геномной структуре некодирующих областей в ВИЧ-1 можно найти в NCBI Genbank с номером доступа генома AF033819, или для ВИЧ-1 HXB2 (широко используемый ВИЧ-1 референтный штамм) с номером доступа генома K03455. В одном из вариантов осуществления некодирующие области получают из последовательностей, доступных по номеру доступа генома K03455, например, из пар оснований 454-1126 (для R-U5-PBS-Gag), 7622-8479 (для RRE) или 7769-8146 (для RRE), 4781-4898 (для cPPT), 9015-9120 & 9521-9719 (для dNEF-PPT-sinU3-R-U5).
Gag/pol: Экспрессия генов gag и pol основана на сдвиге рамки считывания между gag и gagpol. Они оба являются полипротеинами, которые расщепляются во время созревания. Белки основного структурного матрикса, капсида и нуклеокапсида ретровирусного вектора кодируются gag. Ген pol кодирует ретровирусные ферменты: i) обратная транскриптаза, обязательная для обратной транскрипции ретровирусного РНК генома до двухцепочечной ДНК, ii) интеграза, которая обеспечивает интеграцию ретровирусного ДНК генома в хромосому клетки-хозяин, и iii) протеаза, которая расщепляет синтезированный полипротеин, чтобы продуцировать зрелые и функциональные белки ретровируса. В одном из вариантов осуществления последовательность ретровирусной нуклеиновой кислоты, кодирующую gag и pol белки, получают из последовательности ВИЧ-1 HXB2, которая доступна по номеру доступа генома K03455, например, из пар оснований 790-5105.
Env: Ген env («оболочка») кодирует поверхностные и трансмембранные компоненты оболочки ретровируса (например, гликопротеины gp120 и gp41 ВИЧ-1) и вовлечен в слияние мембраны ретровируса и клетки. С целью расширения тканевого тропизма ретровирусного вектора, ретровирусные векторы, описываемые в настоящем документе, могут быть псевдотипированы с применением оболочечного белка от другого вируса. Псевдотипирование относится к процессу при котором диапазон ретровирусных векторов клетки-хозяина, включая лентивирусные векторы, может быть расширен или изменен посредством замены гликопротеинов (GPs) на ретровирусные векторные частицы (например, посредством применения GPs, полученных или извлеченных из других оболочечных вирусов или применения синтетических/искусственных GPs). Наиболее широко используемым гликопротеином для псевдотипирования ретровирусных векторов является вирус везикулярного стоматита GP (VSVg), вследствие его широкого тропизма и высокой стабильности векторных частиц. Однако специалисту следует понимать, что другие гликопротеины можно использовать для псевдотипирования (см. Cronin et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5(4):387-398, полностью включенный в настоящий документ в качестве ссылки). Выбор вируса, применяемого для псевдотипирование может также зависеть от типа клеток и/или органов, выбранных в качестве мишени, потому что было показано, что некоторые псевдотипы имеют предпочтения в типе ткани.
В одном из вариантов осуществления env белок или его функциональный заменитель получают из или извлекают из вируса, выбранного из везикуловируса (например, вирус везикулярного стоматита), лиссавируса (например, вирус бешенства, вирус Mokola), аренавируса (например, вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV)), альфавируса (например, вирус реки Росс (RRV), вирус Синдбис, вирус леса Семлики (SFV), вирус венесуэльского энцефалита лошадей), филовируса (например, вирус Эбола Рестон, вирус Эбола Заир, вирус Ласса), альфаретровирус (например, вирус лейкоза птиц (ALV)), бетаретровирус (например, ретровирус овец Jaagsiekte (JSRV)), гаммаретровирус (например, вирус лейкоза мышей Молони (MLV), вирус лейкоза гиббонов (GALV), эндогенный ретровирус кошачьих (RD114)), дельтаретровирус (например, T-лимфотропный вирус человека 1 (HTLV-1)), спумавирус (например, пенящий вирус человека), лентивирус (например, вирус Мэди-Висна (MVV)), коронавирус (например, SARS-CoV), респировирус (например, вирус Сендай, респираторно-синциатиальный вирус (RSV)), гепацивирус (например, вирус гепатита C (HCV)), вирус гриппа (например, вирус гриппа A) и вирус ядерного полиэдроза (например, вирус множественного ядерного полиэдроза совки калифорнийской люцерновой (AcMNPV)). В дополнительном варианте осуществления env белок или его функциональный заменитель получают из или извлекают из вируса везикулярного стоматита. В этом варианте осуществления можно использовать белок гликопротеин вируса везикулярного стоматита (VSVg), который позволяет ретровирусным частицам инфицировать более широкий диапазон клеток-хозяев и уменьшает вероятность того, что в ходе рекомбинации будут продуцироваться оболочечные белки дикого типа. В дополнительном варианте осуществления последовательность ретровирусной нуклеиновой кислоты, кодирующую env белок или его функциональный заменитель, получают из последовательности, доступной по номеру доступа генома J02428.1, например, из пар оснований от 3071 до 4720.
Структурные гены, описываемые в настоящем документе, являются общими для всех ретровирусов. Дополнительные вспомогательные гены можно найти в различных типах ретровирусов. Например, лентивирусы, такие как ВИЧ-1, содержат шесть дополнительных вспомогательных генов, известных как rev, vif, vpu, vpr, nef и tat. Другие ретровирусы могут иметь вспомогательные гены, которые аналогичны генам, описываемым в настоящем документе, однако они могут не всегда давать те же имена, что и в литературе. Ссылки, такие как Tomonaga и Mikami (1996) J. Gen. Virol. 77(Pt 8):1611-1621 описывают различные вспомогательные гены ретровирусов.
Rev: Вспомогательный ген rev («регулятор вириона») кодирует акцессорный белок, который связывается с элементом ответа Rev (RRE) и облегчает экспорт ретровирусных транскриптов. Белковый продукт гена позволяет фрагментам ретровирусной иРНК, которые содержат элемент ответа Rev (RRE) экспортироваться из ядра в цитоплазму. Спрогнозировано, что RRE последовательность должна образовывать сложную складчатую структуру. Эта конкретная роль rev отражает жесткую связь этапов сплайсинга и ядерного экспорта. В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты содержит RRE последовательность. В дополнительном варианте осуществления RRE последовательность получают из ВИЧ-1 HXB2 последовательности, которая доступна по номеру доступа генома K03455, например, из пар оснований от 7622 до 8479 или от 7769 до 8146, конкретно, пар оснований от 7622 до 8479.
Rev связывается с RRE и облегчает экспорт однократно сплайсированных (env, vif, vpr и vpu) или несплайсированных (gag, pol и геномная РНК) вирусных транскриптов, таким образом приводя к нижестоящим событиям, например, генной трансляции и упаковке (см. Suhasini и Reddy (2009) Curr. HIV Res. 7(1): 91-100). В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит вспомогательный ген rev или аналогичный ему ген (т.е. от других ретровирусов или функционально аналогичной системы). Включение гена rev обеспечивает эффективный экспорт РНК транскриптов генома ретровирусного вектора из ядра в цитоплазму, особенно если RRE элемент также включен в транскрипт, предназначенный для транспортировки. В дополнительном варианте осуществления ген rev содержит, по меньшей мере, 60% идентичность последовательностей, например, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей для пар оснований от 970 до 1320 номера доступа генома M11840 (т.е. ВИЧ-1 клон 12 кДНК, локус HIVPCV12). В альтернативном варианте осуществления ген rev содержит, по меньшей мере, 60% идентичность последовательностей, например, по меньшей мере, 70%, 80%, 90% или 100% идентичность последовательностей для пар оснований от 5970 до 6040 и от 8379 до 8653 номера доступа генома K03455.1 (т.е. вирус иммунодефицита человека тип 1, HXB2).
Считается, что вспомогательные гены играют роль в ретровирусной репликации и патогенезе, таким образом, многие существующие системы продуцирования вирусных векторов не включают некоторые из этих генов. Исключением является rev, который обычно присутствует, или система, аналогичная rev/RRE системе, потенциально используется. Таким образом, в одном из вариантов осуществления последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие один или несколько вспомогательных генов vpr, vif, vpu, tat и nef, или аналогичные вспомогательные гены, разорваны таким образом, что указанные вспомогательные гены удалены из РНК генома ретровирусных векторных частиц или неспособны кодировать функциональные вспомогательные белки. В дополнительном варианте осуществления, по меньшей мере, два или более, три или более, четыре или более, или все из вспомогательных генов vpr, vif, vpu, tat и nef, или аналогичные вспомогательные гены, разорваны таким образом, что указанные вспомогательные гены удалены из РНК генома ретровирусных векторных частиц или неспособны кодировать функциональные вспомогательные белки. Удаление функционального вспомогательного гена может не требовать удаления гена целиком; удаления части гена или разрыва гена будет достаточно.
Следует понимать, что последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие репликативно-дефектную ретровирусную векторную частицу могут быть такими же, или получены из, генов дикого типа ретровируса, на котором ретровирусная векторная частица основана, т.е. последовательности могут быть генетически или другим образом измененными версиями последовательностей, содержащихся в вирусе дикого типа. Таким образом, гены ретровирусов, встроенные в векторы на основе нуклеиновых кислот или геномы клеток-хозяев, могут также относиться к кодон-оптимизированным версиям генов дикого типа.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
Векторы на основе нуклеиновых кислот по изобретению могут содержать также дополнительные компоненты. Эти дополнительные качества можно использовать, например, чтобы помочь стабилизировать транскрипты для трансляции, повысить уровень экспрессии гена, и запустить/прекратить транскрипцию гена.
Ретровирусные векторные частицы, полученные по изобретению, можно использовать в способах генотерапии. Таким образом, в одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит один или несколько трансгенов. Этот трансген может быть терапевтически активным геном, который кодирует продукт гена, который можно использовать для лечения или улучшения состояния заболевания, являющегося целью. Трансген может кодировать, например, антисмысловую РНК, рибозим, белок (например, белок-супрессор опухолевого роста), токсин, антиген (который можно использовать для индуцирования антител или хелперных T-клеток или цитотоксических T-клеток) или антитело (такое как одноцепочечное антитело). В одном из вариантов осуществления трансген кодирует бета глобин.
Множественные копии вектора для переноса, содержащего трансген, как ожидается, приведут к более высокому титру ретровирусного вектора, таким образом, в одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты содержит множественные копии трансгена, например, две или более, конкретно, три или более копии трансгена. В некоторых случаях более чем один продукт гена необходим для лечения заболевания, таким образом, в дополнительном варианте осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит два или более, например, три или более, или четыре или более различных трансгенов.
Указания в настоящем документе на «трансген» относятся к гетерологичной или чужеродной ДНК, которая не присутствует или не достаточно экспрессируется в клетке млекопитающего, в которую ее вводят. Это может включать, например, случаи, когда целевой ген не экспрессируется должным образом в клетке млекопитающего, таким образом, корректная версия гена-мишени вводится в качестве трансгена. Таким образом, трансген может быть геном, представляющим потенциальный терапевтический интерес. Трансген может быть получен из другого типа клеток или от другого вида, или получен синтетически. Альтернативно, трансген может быть получен из клетки-хозяина, но функционально связан с регуляторными областями, которые отличаются от тех, которые присутствуют в нативном гене. Альтернативно, трансген может быть отличающейся аллелью или вариантом гена, присутствующего в клетке-хозяине.
Целью генотерапии является модифицировать генетический материал живых клеток для терапевтических целей, и она заключается во вставке функционального гена в клетку для достижения терапевтического эффекта. Ретровирусный вектор, полученный с использованием векторов на основе нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, описываемые в настоящем документе, можно использовать для трансфекции клеток-мишеней и индуцирования экспрессии гена, представляющего потенциальный терапевтический интерес. Ретровирусный вектор может, таким образом, быть использован для лечения млекопитающего индивидуума, такого как человеческий индивидуум, страдающий от состояния, включая в качестве неограничивающих примеров, наследственные нарушения, злокачественную опухоль и определенные вирусные инфекции.
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит элемент регуляции транскрипции. Например, любой из элементов, описываемых в настоящем документе, может быть функционально связан с промотором, таким образом, что экспрессия может контролироваться. Промоторы, упоминаемые в настоящем документе, могут включать известные промоторы, полностью или частично, которые могут действовать конститутивно или индуцибельно, например, в присутствии регуляторного белка. В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит высоко эффективный промотор, такой как CMV промотор. Этот промотор обладает преимуществом, заключающимся в стимуляции высокого уровня экспрессии элементов, закодированных на не присущем млекопитающим векторе на основе нуклеиновой кислоты. В дополнительном варианте осуществления CMV промотор содержит последовательность, полученную из цитомегаловируса человека штамм AD169. Эта последовательность доступна по номеру доступа генома X17403, например, из пар оснований от 173731 до 174404.
В одном из вариантов осуществления промотор (такой как CMV промотор) дополнительно содержит, по меньшей мере, один Tet оперон. Систему Tet оперона можно использовать для контроля экспрессии ретровирусных последовательностей, содержащихся внутри вектора на основе нуклеиновой кислоты. В кратком изложении, Tet репрессорный белок блокирует экспрессию посредством связывания с сайтом Tet оперона, который введен в промотор. Таким образом, когда Tet репрессор связывается с Tet опероном, экспрессия гена не осуществляется. При добавлении тетрациклина или доксициклина, Tet репрессор секвестируется, делая возможной промоторную активность, таким образом, экспрессия гена запускается. Системы Tet оперона являются широко доступными, например, Tet оперон, применяемый в pcDNA™4/TO экспрессирующем векторе млекопитающих, доступен в Invitrogen.
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит репрессорный белок для оперона устойчивости к тетрациклину («Tet репрессор» или «TetR»). В дополнительном варианте осуществления Tet репрессор является кодон-оптимизированным.
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит инсулятор, такой как инсулятор хроматина. Термин «инсулятор» относится к генетической последовательности, которая блокирует взаимодействие между промоторами и энхансерами. В дополнительном варианте осуществления инсулятор (такой как инсулятор хроматина) находится между каждой из ретровирусных последовательностей нуклеиновых кислот. Это помогает предотвратить промоторную интерференцию (т.е. когда промотор для одной единицы транскрипции мешает экспрессии соседней единицы транскрипции) между соседними ретровирусными последовательностями нуклеиновых кислот. Следует понимать, что если инсуляторы присутствуют в векторе на основе нуклеиновой кислоты между каждой из ретровирусных последовательностей нуклеиновых кислот, тогда они могут быть располагаться как индивидуальные экспрессирующие конструкции внутри вектора на основе нуклеиновой кислоты. Например, каждая последовательность, кодирующая ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот, имеет свой собственный промотор и/или интрон и/или полиA сигнал. В одном из вариантов осуществления хроматиновый инсулятор имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей, например, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей, с последовательностью инсулятора курицы (Gallus gallus) HS4 (например, см. номер доступа генома U78775.2, пары оснований от 1 до 1205).
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит селективный маркер. Это позволяет отбирать клетки, в которые встроены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие репликативно-дефектную ретровирусную векторную частицу. В дополнительном варианте осуществления селективным маркером является ген устойчивости к антибиотикам, такой как ген устойчивости к зеоцину, канамицину или пуромицину, конкретно, ген устойчивости к зеоцину (ZeoR). В еще одном дополнительном варианте осуществления ген устойчивости к зеоцину получают из гена Streptoalloteichus hindustans ble, например, см. номер доступа генома X52869.1 из пар оснований от 3 до 377.
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит полиA сигнал. Применение полиA сигнала имеет преимущество, заключающееся в способности защищать иРНК от ферментативной деградации и помощи при трансляции. В дополнительном варианте осуществления полиA сигнал получают из или извлекают из SV40, бычьего гормона роста и/или бета глобина человека. В одном из вариантов осуществления полиA сигнал получают из SV40 ранний полиA сигнал (например, см. номер доступа генома EF579804.1, пары оснований от 2668 до 2538 из минус цепи). В одном из вариантов осуществления полиA сигнал получают из полиA сигнала бета глобина человека (например, см. номер доступа генома GU324922.1, пары оснований от 3394 до 4162).
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит интронную последовательность. Известно, что применение интрона ниже энхансерной/промоторной области и выше кДНК вставки (т.е. трансгена) повышает уровень экспрессии вставки. В дополнительном варианте осуществления интронной последовательностью является последовательность интрона бета глобина человека или интрона бета глобина кролика II. В одном из вариантов осуществления интрон бета глобина человека получают из последовательности, доступной по номеру доступа генома KM504957.1 (например, из пар оснований от 476 до 1393). В одном из вариантов осуществления интрон бета глобина кролика II получают из последовательности доступной по номеру доступа генома V00882.1 (например, из пар оснований от 718 до 1290).
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE). Было показано, что наличие WPRE усиливает экспрессию и по этой причине вероятно полезен для достижения высоких уровней экспрессии. В дополнительном варианте осуществления WPRE получают из последовательности, доступной по номеру доступа генома J04514.1 (например, из пар оснований от 1093 до 1684).
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит внутренний участок связывания рибосомы (IRES). IRES является структурированным РНК элементом, который, как правило, обнаруживается в 5'-нетранслируемой области ниже 5'-кэпа (который необходим для сборки инициирующего комплекса). IRES распознается посредством факторов инициации трансляции, и обеспечивает кэп-независимую трансляцию. В дополнительном варианте осуществления IRES получают из генома вируса энцефаломиокрадита (EMCV) (например, см. номер доступа генома KF836387.1, пары оснований от 151 до 724).
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты дополнительно содержит участок множественного клонирования (MCS). MCS является коротким сегментом ДНК внутри вектора на основе нуклеиновой кислоты, который содержит множественные участки рестрикции (например, 10, 15 или 20 сайтов). Эти сайты, как правило, встречаются только один раз внутри вектора на основе нуклеиновой кислоты, чтобы с целью обеспечения того, чтобы эндонуклеаза резала только в одном сайте. Это дает возможность генам ретровирусов с легкостью быть вставленными с применением соответствующих эндонуклеаз (т.е. рестрикционных ферментов).
Специалисту в данной области следует понимать, что конструкции могут располагаться в любом порядке внутри вектора на основе нуклеиновой кислоты. В иллюстративном варианте осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты содержит следующую вставку: последовательность ретровирусной нуклеиновой кислоты, кодирующая gag и pol белки, последовательность ретровирусной нуклеиновой кислоты, кодирующая env белок или его функциональный заменитель (такой как VSVg), последовательность ретровирусной нуклеиновой кислоты, кодирующая вспомогательный ген rev (такая как кодон-оптимизированная rev последовательность) или аналогичный ему ген или функционально аналогичную систему, репрессорный белок оперона устойчивости к тетрациклину (TetR), внутренний участок связывания рибосомы и селективный маркер (такой как селективный маркер устойчивости к зеоцину) (т.е. GagPol-Env-Rev-TetRepressor-IRES-маркер устойчивости к антибиотикам-остающаяся BAC последовательность («BAC остов»); например: GagPol-(дикого типа)VSVg-(кодон-оптимизированный)Rev-TetRepressor-IRES-устойчивость к зеоцину-pSMARTBAC). В дополнительном варианте осуществления инсулятор (такой как хроматиновый инсулятор) присутствует между каждой из gagpol, env и rev последовательностей. В дополнительном варианте осуществления промотор присутствует до каждой из gagpol, env и rev последовательностей. В еще одном дополнительном варианте осуществления, по меньшей мере, одна копия последовательности вектора для переноса (т.е. содержащая последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют РНК генома ретровирусных векторных частиц) присутствует до gagpol последовательности.
В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты содержит следующую вставку: инсулятор (такой как хроматиновый инсулятор), промотор (такой как CMV промотор, необязательно содержащий последовательность Tet оперона), интрон (такой как интрон бета глобина человека), последовательность ретровирусной нуклеиновой кислоты, кодирующую gag и pol белки, ретровирусная нуклеиновая кислота, кодирующая RRE, полиA сигнал (такой как полиA сигнал бета глобина человека), инсулятор (такой как хроматиновый инсулятор), промотор (такой как CMV промотор, необязательно содержащий последовательность Tet оперона), интрон (такой как интрон бета глобина человека), последовательность ретровирусной нуклеиновой кислоты, кодирующая env белок или его функциональный заменитель (такой как VSVg), полиA сигнал (такой как полиA сигнал бета глобина человека), инсулятор (такой как хроматиновый инсулятор), промотор (такой как CMV промотор, необязательно содержащий последовательность Tet оперона), последовательность ретровирусной нуклеиновой кислоты, кодирующая вспомогательный ген rev или аналогичный ему ген или функционально аналогичную систему, полиA сигнал (такой как полиA сигнал бета глобина человека), инсулятор (такой как хроматиновый инсулятор), промотор (такой как CMV промотор), интрон (такой как интрон бета глобина кролика), репрессорный белок оперона устойчивости к тетрациклину (TetR), внутренний участок связывания рибосомы, селективный маркер (такой как селективный маркер устойчивости к зеоцину), полиA сигнал и участок множественного клонирования.
Последовательности нуклеиновых кислот могут быть введены в вектор на основе нуклеиновой кислоты последовательно. Это делает возможной селекцию после каждой интеграции для того, чтобы убедиться, что все требуемые последовательности нуклеиновых кислот успешно интегрированы в вектор на основе нуклеиновой кислоты. Альтернативно, по меньшей мере, две или более последовательностей нуклеиновых кислот вносятся в вектор на основе нуклеиновой кислоты одновременно.
Следует понимать, что дополнительные гены, описываемые в настоящем документе, могут быть введены в вектор на основе нуклеиновой кислоты посредством стандартных методов молекулярного клонирования, известных в данной области, например, с применением рестрикционных эндонуклеаз и методов лигирования. Кроме того, вектор на основе нуклеиновой кислоты, конкретно, BACs, PACs, фосмиды и/или космиды, может быть введен в бактериальные клетки-хозяева (такие как E. coli клетки, конкретно, E. coli штамм DH10B) стандартными способами, такими как электропорация.
USES
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлен вектор на основе нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем документе для применения при получении ретровирусной пакующей или продуцирующей линии клеток.
Векторы на основе нуклеиновых кислот, описываемые в настоящем документе, можно использовать для создания ретровирусной пакующей линии клеток, которая существенным образом упрощает продуцирование ретровирусного вектора. Следует понимать, что, если трансген включен в вектор на основе нуклеиновой кислоты, тогда это будет использовано для создания продуцирующей линии клеток.
Как описано в настоящем документе, будет полезным разработать стабильную ретровирусную пакующую (или продуцирующую) линию клеток с целью преодоления трудностей, связанных с временной трансфекцией. Векторы на основе нуклеиновых кислот, описываемые в настоящем документе, можно использовать для получения указанных пакующих линий клеток, поскольку они способны удерживать крупные ДНК вставки, содержащие обязательные гены, требуемые для ретровирусной упаковки, которые затем могут быть интегрированы в эндогенный геном клеток млекопитающего в один этап.
КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлена ретровирусная упаковывающая клетка, содержащая последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие:
gag и pol белки; и
env белок или его функциональный заменитель,
где указанные последовательности нуклеиновых кислот все расположены в едином локусе внутри генома ретровирусной упаковывающей клетки.
Преимуществом включения всех генов ретровирусов в крупный вектор на основе нуклеиновой кислоты является то, что их сначала можно получать в микробных клетках (таких как бактериальные или дрожжевые клетки), которые гораздо легче поддерживать и обрабатывать, до интеграции в клетки млекопитающего в один этап. Это облегчает давление отбора и сокращает временной период сайленсинга, как только гены ретровирусов были интегрированы в клетку млекопитающего. Характерной чертой этого способа является то, что все гены ретровирусов, требуемые для создания пакующей линии клеток присутствуют в едином локусе в эндогенном геноме, а не рассеяны случайным образом на всем протяжении эндогенного генома. Преимуществом этого является продуцирование ретровирусной упаковывающей клетки, которая экспрессирует все гены ретровирусов на одном и том же уровне, поскольку они расположены в едином локусе, по сравнению с предшествующими способами, при которых гены ретровирусов интегрированы случайным образом на всем протяжении эндогенного генома, что может привести к неравномерным уровням экспрессии.
В одном из вариантов осуществления ретровирусная упаковывающая клетка дополнительно содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют РНК геном ретровирусных векторных частиц. Она также может быть расположена в едином локусе с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими gag и pol белки и env белок или его функциональный заменитель.
Таким образом, по дополнительному аспекту изобретения, предоставлена ретровирусная продуцирующая клетка, содержащая последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие:
gag и pol белки;
env белок или его функциональный заменитель; и
РНК геном ретровирусных векторных частиц,
где указанные последовательности нуклеиновых кислот все расположены в едином локусе внутри генома ретровирусной продуцирующей клетки.
В одном из вариантов осуществления ретровирусная упаковывающая клетка является клеткой млекопитающего. В дополнительном варианте осуществления клетка млекопитающего выбрана из HEK 293 клетки, CHO клетки, Jurkat клетки, KS62 клетки, PerC6 клетки, HeLa клетки или их производного или функционального эквивалента. В еще одном дополнительном варианте осуществления клеткой млекопитающего является HEK 293 клетка, или полученная из HEK 293 клетка. Такие клетки могут быть адгезивными линиями клеток (т.е. они растут в один слой, прикрепленный к поверхности) или суспензионно адаптированными/неадгезивными линиями клеток (т.е. они растут в суспензии в среде для культивирования). В еще одном дополнительном варианте осуществления HEK 293 клеткой является HEK 293T клетка. Термин «HEK 293 клетка» относится к линии клеток эмбриональной почки человека 293, которая широко используется в биотехнологии. Конкретно, HEK 293T клетки широко используются для получения различных ретровирусных векторов. Другие примеры подходящих коммерчески доступных линий клеток включают линии клеток T REX™ (Life Technologies).
Следует понимать, что все варианты осуществления, описываемые для вектора на основе нуклеиновой кислоты в настоящем документе ранее, также могут быть применены к ретровирусным пакующим/продуцирующим клеткам по изобретению.
СПОСОБЫ
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлен способ получения стабильной ретровирусной пакующей линии клеток, содержащий:
(a) введение вектора на основе нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем документе в культуру клеток млекопитающего; и
(b) отбор в культуре клеток млекопитающего, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодируемые на векторе, интегрированном в эндогенную хромосому клетки млекопитающего.
В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего выбрана из HEK 293 клетки, HEK 6E клетки, CHO клетки, Jurkat клетки, KS62 клетки, PerC6 клетки, HeLa клетки или их производного или функционального эквивалента. В дополнительном варианте осуществления клеткой млекопитающего является HEK 293 клетка, или полученная из HEK 293 клетка. Такие клетки могут быть адгезивными линиями клеток (т.е. они растут в один слой, прикрепленный к поверхности) или суспензионно адаптированными/неадгезивными линиями клеток (т.е. они растут в суспензии в среде для культивирования). В еще одном дополнительном варианте осуществления HEK 293 клеткой является HEK 293T клетка или HEK 6E клетка. Другие примеры подходящих коммерчески доступных линий клеток включают линии клеток T REX™ (Life Technologies).
Специалист должен осознавать, что введение вектора на основе нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин можно проводить с применением подходящих известных в данной области способов, например, липид-опосредованная трансфекция, микроинъекция, слияние клеток (таких как микроклетки), электропорация или бомбардировка микрочастицами. В одном из вариантов осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты введен в клетку-хозяин посредством электропорации. Следует понимать, что выбор способа, применяемого для введения вектора на основе нуклеиновой кислоты, может быть сделан в зависимости от используемого типа клетки млекопитающего.
Оказавшись внутри клетки млекопитающего, вектор на основе нуклеиновой кислоты случайным образом интегрируется в эндогенный геном клетки млекопитающего. Таким образом, способ дополнительно содержит отбор клетки млекопитающего, в которую интегрировались нуклеиновые кислоты, кодируемые на векторе на основе нуклеиновой кислоты (например, с использованием селективного маркера устойчивости к антибиотикам, такого как маркер устойчивости к зеоцину).
Специалист обычно осведомлен о способах, содействующих интеграции вектора нуклеиновой кислоты, например, линеаризация вектора на основе нуклеиновой кислоты, если он в природных условиях является кольцевым (например, BACs, PACs, космиды или фосмиды). Вектор на основе нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать области совместной гомологии с эндогенными хромосомами клетки млекопитающего для направления интеграции в выбранный сайт внутри эндогенного генома. Кроме того, если на векторе на основе нуклеиновой кислоты присутствуют сайты рекомбинации, тогда их можно использовать для целенаправленной рекомбинации. Например, вектор на основе нуклеиновой кислоты может содержать loxP сайт, который обеспечивает целенаправленную интеграцию при комбинации с Cre рекомбиназой (т.е. с применением Cre/lox системы, полученной из P1 бактериофага). Альтернативно (или дополнительно), сайтом рекомбинации является att сайт (например, из фага лямбда), где att сайт позволяет произвести сайт-направленную интеграцию в присутствии лямбда-интегразы. Это обеспечит возможность генам ретровирусов быть направленными в локус внутри эндогенного генома, что обеспечит высокую и/или стабильную экспрессию.
Другие способы направленной интеграции хорошо известны в данной области. Например, способы индуцирования целенаправленного расщепления геномной ДНК можно использовать для содействия целенаправленной рекомбинации в выбранном хромосомном локусе. Эти способы часто предполагают применение сконструированных систем расщепления для индуцирования двухцепочечной поломки (DSB) или проникновение в эндогенный геном для индуцирования репарации поломки посредством естественных процессов, таких как негомологичное соединение концов (NHEJ) или репарация с использованием матрицы репарации (т.е. направляемая гомологией репарация или HDR).
Расщепление может происходить посредством использования специфических нуклеаз, таких как сконструированные нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALENs), с применением CRISPR/Cas9 системы со сконструированной cрРНК/tracr РНК (однонаправленная РНК') для направления специфического расщепления, и/или с применением нуклеаз на основе системы Аргонавт (например, из T. thermophilus, известной как 'TtAgo', см. Swarts et al. (2014) Nature 507(7491): 258-261). Целенаправленное расщепление с применением одной из этих нуклеазных систем может быть использовано для вставки нуклеиновой кислоты в специфическое целевое положение с использованием или HDR, или NHEJ-опосредованных процессов. Таким образом, в одном из вариантов осуществления способ дополнительно содержит интеграцию последовательностей нуклеиновых кислот, кодируемых на векторе на основе нуклеиновой кислоты в геном (т.е. эндогенную хромосому) клетки млекопитающего с использованием, по меньшей мере, одной нуклеазы, где, по меньшей мере, одна нуклеаза расщепляет геном клетки млекопитающего, таким образом, что последовательности нуклеиновых кислот интегрируются в геном клетки. В дополнительном варианте осуществления, по меньшей мере, одна нуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), TALE нуклеазы (TALEN), CRISPR/Cas нуклеазной системы и их сочетания.
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлена ретровирусная упаковывающая клетка, полученная посредством способа, определенного в настоящем документе.
Линию клеток, полученную с использованием способов, определенных в настоящем документе, можно использовать для продуцирования высокого титра ретровирусного вектора.
Указания в настоящем документе на термин «высокий титр» относятся к эффективному количеству ретровирусного вектора или частиц, которое способно трансдуцировать клетку-мишень, такую как клетка пациента. В одном из вариантов осуществления высоким титром является более 106 TU/мл без концентрирования (TU=трансдуцирующие единицы).
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлен способ получения репликативно-дефектной ретровирусной векторной частицы, содержащий:
(a) введение вектора на основе нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем документе, в культуру клеток млекопитающего;
(b) отбор в культуре клеток млекопитающего, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодируемые на векторе, интегрированном в эндогенную хромосому клетки млекопитающего; и
(c) дополнительное культивирование клетки млекопитающего в условиях, при которых получают репликативно-дефектную ретровирусную векторную частицу.
Как описано в настоящем документе ранее, в одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего выбрана из HEK 293 клетки, CHO клетки, Jurkat клетки, KS62 клетки, PerC6 клетки, HeLa клетки или их производного или функционального эквивалента. В дополнительном варианте осуществления клеткой млекопитающего является HEK 293 клетка, или полученная из HEK 293 клетка. Такие клетки могут быть адгезивными линиями клеток (т.е. они растут в один слой, прикрепленный к поверхности) или суспензионно адаптированными/неадгезивными линиями клеток (т.е. они растут в суспензии в среде для культивирования). В еще одном дополнительном варианте осуществления HEK 293 клеткой является HEK 293T клетка. Другие примеры подходящих коммерчески доступных линий клеток включают линии клеток T REX™ (Life Technologies).
Специалисту следует понимать, что условия, применяемые в способе, описываемом в настоящем документе, будут применяться в зависимости от клетки-хозяина. Типичные условия, например, предназначенная среда для культивирования или температура, хорошо известны в данной области. В одном из вариантов осуществления культивирование проводят посредством инкубации клетки млекопитающего в условиях увлажнения воздуха. В дополнительном варианте осуществления условия увлажнения воздуха включают инкубацию трансфицированных клеток при 37°C, при 5% CO2. В одном из вариантов осуществления культивирование проводят с использованием среды для культивирования, выбранной из: модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), содержащей 10% (vol/vol) эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), бессывороточной среды UltraCULTURETM (Lonza, каталожн. № 12-725F), или среды FreeStyleTM Expression (Thermo fisher, каталожн. № 12338 018).
В одном из вариантов осуществления способ дополнительно содержит выделение репликативно-дефектной ретровирусной векторной частицы. Например, в одном из вариантов осуществления выделение проводят посредством использования фильтра. В дополнительном варианте осуществления фильтром является мембрана с низким связыванием белков (например, 0,22 мкм мембрана с низким связыванием белков или 0,45 мкм мембрана с низким связыванием белков), например, искусственные мембраны на основе поливинилиден фторида (PVDF) или простого полиэфирсульфона (PES).
Оказавшись внутри клетки млекопитающего, нуклеиновые кислоты ретровирусов, присутствующие на векторе на основе нуклеиновой кислоты, могут интегрироваться в случайный, один локус внутри эндогенного генома. Этапу интеграции можно способствовать, как описано в настоящем документе ранее, например, с применением линеаризации и/или областей совместной гомологии. Сайты рекомбинации также можно использовать для целенаправленной рекомбинации.
Если целевые гены интегрированы в эндогенные хромосомы с селективным маркером, таким как ген устойчивости к антибиотикам, тогда способ может дополнительно содержать отбор клеток млекопитающего, в которые нуклеиновые кислоты ретровирусов успешно интегрировались.
Будучи изолированными, ретровирусные векторные частицы могут быть сконцентрированы с целью in vivo применения. Способы концентрации включают, например, ультрацентрифугирование, осаждение или анионообменную хроматографию. Ультрацентрифугирование пригодно в качестве быстрого способа концентрации ретровирусного вектора в небольшом объеме. Альтернативно, анионообменная хроматография (например, с использованием анионобменных мембранных картриджей Mustang Q) или осаждение (например, с использованием PEG 6000) особенно пригодны для обработки крупных объемов супернатантов с лентивирусным вектором.
По дополнительному аспекту изобретения, предоставлена репликативно-дефектная ретровирусная векторная частица, полученная посредством способа, определенного в настоящем документе.
Изобретение будет описано ниже в подробностях с ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Руководство по конструированию
На фигуре 1 представлена пошаговое руководство по конструированию BACpack-WTGP-277delU5 и BACpack-SYNGP-277delU5. Благодаря совместимым концам XbaI и NheI лизата, лентивирусные гены упаковки постепенно были загружены в pSmart BAC вектор. В момент добавления GagPol, были сделаны 2 конструкции, содержащие или GagPol дикого типа (WTGP), или кодон-оптимизированный GagPol, SYNGP. Им были даны обозначения BACpack-WTGP и BACpack-SYNGP, соответственно. Кассета переноса затем была загружена на обе эти конструкции и, таким образом, образовывая BACpackWTGP-277delU5 и BACpackSYNGP-277delU5.
ПРИМЕР 2: Отбор стабильного поликлонального пула
Поликлональные пулы стабильных трансфектантов получали посредством трансфицирования адгезивной линии клеток, HEK293T, с применением BACpackSYNGP-277delU5 или BACpackWTGP-277delU5. Успешные случаи интеграции были затем отобраны с применением зеоцина.
Чтобы оценить способность этих поликлональных пулов образовывать лентивирусный вектор, клетки индуцировали с применением доксициклина (I) или оставляли неиндуцированными (UI) и сравнивали с нетрансфицированными HEK293T клетками.
Результаты демонстрируют титр в трансдуцирующих единицах (TU)/мл супернатанта лентивирусного вектора, собранного при каждом трансфекционном состоянии. Из результатов титрования можно увидеть на фигуре 2, что стабильные поликлональные пулы, образованные с применением BACpackSYNGP-277delU5 или BACpackWTGP-277delU5 способны к продуцированию лентивирусного вектора при концентрациях в области 10e7 TU/мл, которая сравнима с существующей системой временной трансфекции.
Результаты подтверждают, что единый BAC вектор, содержащий все гены упаковки, необходимые для лентивирусного продуцирования, могут образовывать линии клеток, способные продуцировать лентивирусный вектор при подходящем титре.
ПРИМЕР 3: Создание стабильной трансфекции суспензионных клонов
Первичной целью создания линий клеток, продуцирующих лентивирусный вектор с использованием BAC технологии, является быстрое приложение новых достижений к платформе. Эти достижения вероятно включают модификацию специализированных линий клеток. Например, стандартной для данной отрасли практикой является повысить выход посредством продуцирования биологических продуктов в суспензии клеток, поскольку они растут до большей плотности, чем адгезивные клетки. Однако существующая система продуцирования лентивирусного вектора основана на высоких скоростях трансфекции, которые являются более трудными для достижения в суспензии клеток, чем в адгезивных HEK293T клетках. Поскольку эффективность трансфекции является менее проблематичной при образовании стабильной линии клеток вследствие отбора успешных интегрантов, BAC конструкция является идеальным решением для создания суспензионных линий клеток, продуцирующих лентивирусный вектор.
Как было продемонстрировано ранее, BAC конструкция способна создавать линии клеток, продуцирующие лентивирусный вектор, из адгезивных HEK293T клеток. Чтобы доказать гибкость BAC конструкций, стабильно трансфицированные линии клеток получали из суспензионной линии клеток HEK293 6E. HEK293 6E клетки трансфицировали с применением BAC конструкции BACpackWTGP-277delU5, затем отбираемой с применением зеоцина. За этим следовало клонирование для создания клональных линий клеток. Результаты на фигуре 3 демонстрируют GFP сигнал, созданный стабильными линиями клеток. Это указывает как на наличие устойчивости к зеоцину, так и функциональной GFP экспрессирующей кассеты в сегменте вектора для переноса.
Эти результаты позволяют предположить, что BAC конструкция способна образовывать стабильные клоны из множества линий клеток.
ПРИМЕР 4: Индукция лентивируса в суспензионных клонах
С целью подтверждения способности стабильных суспензионных клонов продуцировать лентивирусный вектор, клоны 1, 14, 15 и 16, были индуцированы с применением 2 мкг/мл доксициклина, и супернатант оценивали на предмет вирусного титра посредством трансдукции HEK293T клеток.
Результаты на фигуре 4 демонстрируют титр в трансдуцирующих единицах (TU)/мл супернатанта лентивирусного вектора, собранного от каждого клона. Результаты ясно показывают, что линии клеток, созданные посредством стабильной трансфекции суспензионной линии клеток HEK293 6E с применением BACpackWTGP-277delU5, способны к продуцированию лентивирусного вектора с выходом, сравнимым с существующей системой временной трансфекции.
ПРИМЕР 5: Титр вектора в клонах
Клоны 1 и 16, как описано на фигуре 4, пассировали в культуре и индуцировали и титровали в более поздние временные точки, чтобы определить является ли продуцирование вектора стабильным от этих высоко продуктивных клонов. Как показано на фигурах 5A и 5B, титры вектора от этих клонов действительно немного повышались между пассажем 5 и пассажем 21, возможно, вследствие повышения концентрации натрия бутирата, введенного в способ индукции.
Следует понимать, что варианты осуществления, описываемые в настоящем документе, могут быть применены ко всем аспектам изобретения. Кроме того, все публикации, включая в качестве неограничивающих примеров патенты и патентные заявки, цитированные в этом описании изобретения, включены в настоящий документ в качестве ссылки, как если бы полностью были изложены.
Claims (25)
1. Вектор на основе нуклеиновых кислот для получения стабильной пакующей ретровирус клеточной линии, где вектор на основе нуклеиновых кислот содержит не присущий млекопитающим участок начала репликации и способность удерживать по меньшей мере 25 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) ДНК и характеризуется тем, что указанный вектор на основе нуклеиновых кислот выбирают из искусственной хромосомы бактерий (BAC), искусственной хромосомы дрожжей (YAC), P1-полученной искусственной хромосомы, фосмиды или космиды, и содержит ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие:
gag и pol белки, и
env белок,
где каждая из ретровирусных последовательностей нуклеиновых кислот имеет свой собственный промотор внутри вектора на основе нуклеиновых кислот и один или множество сайтов рекомбинации для интеграции указанных последовательностей нуклеиновых кислот в эндогенную хромосому клетки-хозяина млекопитающего сайт-специфичным образом.
2. Вектор на основе нуклеиновых кислот по п. 1, который дополнительно содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют РНК геном ретровирусной векторной частицы.
3. Вектор на основе нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, который дополнительно содержит вспомогательный ген rev или аналогичный ему ген.
4. Вектор на основе нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-3, где вектором является бактериальная искусственная хромосома.
5. Способ получения стабильной пакующей ретровирус клеточной линии, содержащий:
(a) введение вектора на основе нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-4 в культуру клеток-хозяев млекопитающего; и
(b) отбор внутри культуры клетки-хозяина млекопитающего, которая имеет последовательности нуклеиновых кислот, кодируемые на векторе, интегрированном внутрь эндогенной хромосомы клетки-хозяина млекопитающего.
6. Способ по п. 5, где вектор на основе нуклеиновых кислот дополнительно содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют РНК геном ретровирусной векторной частицы.
7. Способ по п. 5 или 6, где вектор на основе нуклеиновых кислот дополнительно содержит вспомогательный ген rev или аналогичный ему ген.
8. Способ по любому из пп. 5-7, где вектор на основе нуклеиновых кислот представляет собой BAC.
9. Способ по любому из пп. 5-8, где клетка млекопитающего представляет собой HEK 293 клетку.
10. Способ по любому из пп. 5-9, где клетка млекопитающего представляет собой суспензионно адаптированную/неадгезивную клетку.
11. Пакующая ретровирус клетка, полученная посредством способа по любому из пп. 6-10, где все указанные последовательности нуклеиновых кислот расположены в одном локусе в пределах генома пакующей ретровирус клетки.
12. Способ получения репликативно-дефектной ретровирусной векторной частицы, содержащий:
(a) введение вектора на основе нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-4 в культуру клеток-хозяев млекопитающего;
(b) отбор внутри культуры клетки-хозяина млекопитающего, которая имеет последовательности нуклеиновых кислот, кодируемые на векторе, интегрированном внутрь эндогенной хромосомы клетки-хозяина млекопитающего; и
(c) дополнительное культивирование клетки-хозяина млекопитающего в условиях, при которых получают репликативно-дефектную ретровирусную векторную частицу.
13. Способ по п. 12, дополнительно содержащий выделение репликативно-дефектной ретровирусной векторной частицы.
14. Способ по любому из пп. 5-13, где ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот выделяют из ретровируса, выбранного из лентивируса, альфа-ретровируса, гамма-ретровируса или пенящего ретровируса.
15. Способ по п. 14, где ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот выделяют из лентивируса, выбранного из группы, состоящей из ВИЧ-1, ВИЧ-2, SIV, FIV, EIAV и висна.
16. Способ по п. 15, где ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот выделяют из ВИЧ-1.
17. Способ по любому из пп. 5-13, где env белок выделяют из вируса везикулярного стоматита.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1520761.6 | 2015-11-24 | ||
| GBGB1520761.6A GB201520761D0 (en) | 2015-11-24 | 2015-11-24 | Stable cell lines for retroviral production |
| GB1609303.1 | 2016-05-26 | ||
| GBGB1609303.1A GB201609303D0 (en) | 2016-05-26 | 2016-05-26 | Stable cell lines for retroviral production |
| PCT/EP2016/078336 WO2017089308A1 (en) | 2015-11-24 | 2016-11-21 | Stable cell lines for retroviral production |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018122636A RU2018122636A (ru) | 2019-12-25 |
| RU2018122636A3 RU2018122636A3 (ru) | 2020-04-02 |
| RU2752498C2 true RU2752498C2 (ru) | 2021-07-28 |
Family
ID=57354376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018122636A RU2752498C2 (ru) | 2015-11-24 | 2016-11-21 | Стабильные клеточные линии для продуцирования ретровирусов |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20170145388A1 (ru) |
| EP (2) | EP3489353B8 (ru) |
| JP (1) | JP7098521B2 (ru) |
| KR (1) | KR102091957B1 (ru) |
| CN (1) | CN108291208A (ru) |
| AU (1) | AU2016360763B2 (ru) |
| BR (1) | BR112018010635A2 (ru) |
| CA (1) | CA3006288A1 (ru) |
| DE (1) | DE102016122316A1 (ru) |
| ES (2) | ES2939617T3 (ru) |
| FR (1) | FR3044016A1 (ru) |
| GB (1) | GB2544892B (ru) |
| IL (2) | IL259254A (ru) |
| IT (1) | IT201600117326A1 (ru) |
| RU (1) | RU2752498C2 (ru) |
| SA (1) | SA518391623B1 (ru) |
| WO (1) | WO2017089308A1 (ru) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7816612B2 (en) * | 2005-12-21 | 2010-10-19 | Ishida Co., Ltd. | Rotary measuring device |
| BR112018010639A2 (pt) | 2015-11-24 | 2019-01-22 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | método de transfecção transitória para produção retroviral. |
| GB201706121D0 (en) * | 2017-04-18 | 2017-05-31 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Stable cell lines for retroviral production |
| GB201715052D0 (en) | 2017-09-19 | 2017-11-01 | Oxford Genetics Ltd | Vectors |
| EP3696272A1 (en) | 2017-12-22 | 2020-08-19 | Oxford BioMedica (UK) Limited | Retroviral vector |
| WO2021041322A1 (en) * | 2019-08-23 | 2021-03-04 | Lonza Walkersville, Inc. | Methods and constructs for production of lentiviral vector |
| CA3159482A1 (en) * | 2019-12-18 | 2021-06-24 | Lonza Walkersville, Inc. | Methods and constructs for transient production of lentiviral vector |
| GB202004371D0 (en) | 2020-03-26 | 2020-05-13 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | CAR constructs |
| GB202005096D0 (en) | 2020-04-07 | 2020-05-20 | Glaxosmithkline | Modified vectors for production of retrovirus |
| CN113528515B (zh) * | 2020-04-22 | 2023-05-05 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 基于CRISPR-Cas13a干预阻断病毒逆转录转座的技术 |
| KR20230017799A (ko) * | 2020-05-15 | 2023-02-06 | 아이벡스솔, 아이엔씨. | 세포 및 유전자 요법을 위한 안정한 바이러스 벡터 생산자 세포를 생산하기 위한 조성물 및 방법 |
| CN112430582B (zh) * | 2020-12-04 | 2022-05-03 | 北京艺妙神州医药科技有限公司 | 一种慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法 |
| AR125136A1 (es) | 2021-03-19 | 2023-06-14 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Receptores de antígenos quiméricos dirigidos a claudina-3 y métodos para tratar el cáncer |
| EP4326885A1 (en) * | 2021-04-20 | 2024-02-28 | The Regents of the University of California | Packaging cells with targeted gene knockouts that improve retroviral vector titers |
| CN120187857A (zh) * | 2023-01-10 | 2025-06-20 | 南京传奇生物科技有限公司 | 调控序列及其用途 |
| WO2024218341A1 (en) | 2023-04-19 | 2024-10-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Cytotoxicity targeting chimeras for car-t and car-nk cells |
| WO2024218345A1 (en) | 2023-04-21 | 2024-10-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Cytotoxicity targeting chimeras for antibody-drug conjugates and bispecific antibodies |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2174845C2 (ru) * | 1993-01-26 | 2001-10-20 | Америкэн Хоум Продактс Корпорэйшн | Композиции и способы доставки генетического материала |
| RU2187301C2 (ru) * | 1995-06-27 | 2002-08-20 | Бавариан Нордик А/С | Капсула для клеток, продуцирующих вирусные частицы, способ ее получения и использования |
| RU2290441C2 (ru) * | 2000-10-31 | 2006-12-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Способ генетической модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса (варианты) и его использование |
| RU2312676C2 (ru) * | 1996-07-19 | 2007-12-20 | Мериаль | Формула кошачьей вакцины |
| EP1829963A4 (en) * | 2004-11-24 | 2009-01-28 | Anaeropharma Science Inc | NEW SHUTTLE VECTOR |
| EA012723B1 (ru) * | 2002-11-25 | 2009-12-30 | Бавариан Нордик А/С | Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора ati вируса коровьей оспы, и его применение |
| RU2416646C2 (ru) * | 2004-04-28 | 2011-04-20 | Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания | Поливалентные вирусные векторы и система для их получения |
| WO2012028681A1 (en) * | 2010-09-02 | 2012-03-08 | Molmed Spa | Stable production of lentiviral vectors |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995003400A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Recombinationally targeted cloning in yeast artificial chromosomes |
| EP1179083A4 (en) * | 1999-04-22 | 2003-04-23 | Gen Hospital Corp | TRIPLE HYBRID AMPLICON VECTOR SYSTEMS FOR THE PRODUCTION OF RETROVIRUS PACKING CELL LINES |
| US6677155B1 (en) * | 1999-04-22 | 2004-01-13 | The General Hospital Corporation | Triple hybrid amplicon vector systems to generate retroviral packaging lines |
| WO2000066758A1 (en) * | 1999-04-29 | 2000-11-09 | Aarhus University | Expression of heterologous genes from an ires translational cassette in retroviral vectors |
| AU2001265187A1 (en) * | 2000-05-30 | 2001-12-11 | Baylor College Of Medicine | Chimeric viral vectors for gene therapy |
| US6689601B2 (en) | 2000-09-01 | 2004-02-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High growth methanotropic bacterial strain |
| DE10111433A1 (de) * | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Bundesrepublik Deutschland Let | Replikationskompetente molekulare Klone von porcinem endogenem Retrovirus der Klasse A und Klasse B,abgeleitet von Schweine- und humanen Zellen |
| AU2002310275B2 (en) | 2001-05-30 | 2006-08-31 | Glaxo Group Limited | Chromosome-based platforms |
| US6835568B2 (en) * | 2001-10-30 | 2004-12-28 | Virxsys Corporation | Regulated nucleic acid expression system |
| EP2348119B1 (en) * | 2002-02-01 | 2017-04-26 | Oxford BioMedica (UK) Limited | Multicistronic lentiviral vector |
| EP1652932A1 (en) * | 2004-11-02 | 2006-05-03 | GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH | Method for the generation of virus producing cell lines and cell lines |
| GB0702695D0 (en) * | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Production of vectors |
| WO2010131747A1 (ja) * | 2009-05-15 | 2010-11-18 | 国立大学法人 東京大学 | ウイルス産生細胞 |
| US9273324B2 (en) * | 2010-12-05 | 2016-03-01 | Andrew S. Belmont | Recombinant gene expression |
| WO2012170431A2 (en) * | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Bluebird Bio, Inc. | Improved geneswitch systems |
| FR2979919B1 (fr) * | 2011-09-12 | 2015-12-11 | Centre Nat Rech Scient | Genomes lentiviraux chimeriques non-integratifs comme vaccins innovants contre vih-1 |
| GB201202516D0 (en) * | 2012-02-13 | 2012-03-28 | Ucl Business Plc | Materials and methods relating to packaging cell lines |
| EP2895611A4 (en) * | 2012-09-14 | 2016-04-27 | Univ California | LENTIVIRAL VECTORS FOR STEM CELL GENE THERAPY OF SICKEN LEMENIA |
| JP6419706B2 (ja) * | 2012-10-25 | 2018-11-07 | トカジェン インコーポレーテッド | ミニプロモーターカセットを含むレトロウイルスベクター |
| US11078464B2 (en) * | 2013-08-30 | 2021-08-03 | Amgen Inc. | High titer recombinant AAV vector production in adherent and suspension cells |
| GB2538324A (en) | 2015-05-15 | 2016-11-16 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Packaging cell line for retroviral production |
| GB2538321A (en) | 2015-05-15 | 2016-11-16 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Artificial chromosome for retroviral production |
| PL3351851T3 (pl) * | 2015-09-01 | 2020-05-18 | Signify Holding B.V. | Urządzenie oświetleniowe z anteną łączności bezprzewodowej |
| BR112018010639A2 (pt) * | 2015-11-24 | 2019-01-22 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | método de transfecção transitória para produção retroviral. |
-
2016
- 2016-11-21 RU RU2018122636A patent/RU2752498C2/ru active
- 2016-11-21 CN CN201680068650.7A patent/CN108291208A/zh active Pending
- 2016-11-21 JP JP2018526799A patent/JP7098521B2/ja active Active
- 2016-11-21 BR BR112018010635A patent/BR112018010635A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-11-21 KR KR1020187014237A patent/KR102091957B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2016-11-21 EP EP19151187.2A patent/EP3489353B8/en active Active
- 2016-11-21 AU AU2016360763A patent/AU2016360763B2/en not_active Ceased
- 2016-11-21 US US15/356,830 patent/US20170145388A1/en not_active Abandoned
- 2016-11-21 IT IT102016000117326A patent/IT201600117326A1/it unknown
- 2016-11-21 ES ES16798512T patent/ES2939617T3/es active Active
- 2016-11-21 DE DE102016122316.6A patent/DE102016122316A1/de not_active Withdrawn
- 2016-11-21 GB GB1619643.8A patent/GB2544892B/en active Active
- 2016-11-21 FR FR1661255A patent/FR3044016A1/fr active Pending
- 2016-11-21 EP EP16798512.6A patent/EP3380604B1/en active Active
- 2016-11-21 ES ES19151187T patent/ES2959326T3/es active Active
- 2016-11-21 CA CA3006288A patent/CA3006288A1/en active Pending
- 2016-11-21 WO PCT/EP2016/078336 patent/WO2017089308A1/en active Application Filing
-
2018
- 2018-05-09 IL IL259254A patent/IL259254A/en unknown
- 2018-05-20 SA SA518391623A patent/SA518391623B1/ar unknown
- 2018-07-13 US US16/034,517 patent/US20180320147A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-12-18 US US16/718,791 patent/US20200123505A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-04-23 IL IL282603A patent/IL282603B/en unknown
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2174845C2 (ru) * | 1993-01-26 | 2001-10-20 | Америкэн Хоум Продактс Корпорэйшн | Композиции и способы доставки генетического материала |
| RU2187301C2 (ru) * | 1995-06-27 | 2002-08-20 | Бавариан Нордик А/С | Капсула для клеток, продуцирующих вирусные частицы, способ ее получения и использования |
| RU2312676C2 (ru) * | 1996-07-19 | 2007-12-20 | Мериаль | Формула кошачьей вакцины |
| RU2290441C2 (ru) * | 2000-10-31 | 2006-12-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Способ генетической модификации интересующего эндогенного гена или хромосомного локуса (варианты) и его использование |
| EA012723B1 (ru) * | 2002-11-25 | 2009-12-30 | Бавариан Нордик А/С | Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора ati вируса коровьей оспы, и его применение |
| RU2416646C2 (ru) * | 2004-04-28 | 2011-04-20 | Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания | Поливалентные вирусные векторы и система для их получения |
| EP1829963A4 (en) * | 2004-11-24 | 2009-01-28 | Anaeropharma Science Inc | NEW SHUTTLE VECTOR |
| WO2012028681A1 (en) * | 2010-09-02 | 2012-03-08 | Molmed Spa | Stable production of lentiviral vectors |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2752498C2 (ru) | Стабильные клеточные линии для продуцирования ретровирусов | |
| US10450574B2 (en) | Transient transfection method for retroviral production | |
| US11795474B2 (en) | Stable cell lines for retroviral production | |
| GB2538321A (en) | Artificial chromosome for retroviral production | |
| GB2538324A (en) | Packaging cell line for retroviral production | |
| GB2544891A (en) | Transient transfection method for retroviral production |