RU2744664C1

RU2744664C1 - Method for the production of spheroids from cultured cells of the periosteum to ensure reparative osteogenesis

Info

Publication number: RU2744664C1
Application number: RU2020109215A
Authority: RU
Inventors: Алексей Вячеславович Ковалев; Михаил Михайлович Сморчков
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2021-03-12

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the field of medicine and namely to tissue engineering and regenerative medicine. Disclosed are a method of obtaining a graft based on cell spheroids and a graft for restoration of skeletal connective tissues of a person obtained by the method. The method includes the isolation of cells from the cambial layer of the periosteum of a person, their cultivation in an adhesive culture, followed by transfer to agarose wells where they merge with the formation of cell spheroids.

EFFECT: inventions provide a graft in the form of cellular spheroids from autologous cells of the periosteum of a person which have pronounced regenerative potential for the effective restoration of skeletal connective tissues, in particular articular cartilage and bone.

14 cl, 3 ex

Description

Область техникиTechnology area

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, стоматологии, пластической хирургии, травматологии и ортопедии.The invention relates to medicine, namely to tissue engineering, regenerative medicine, dentistry, plastic surgery, traumatology and orthopedics.

Уровень техникиState of the art

Формообразование – процесс образования новых органных и тканевых структур, воссоздающих заново изначальную форму любого поврежденного органа, в том числе, любого органа опорно-двигательного аппарата. Возможность такой органотипичной репаративной регенерации крайне важна для практической медицины. Восстановить утраченную краевую часть кости или хряща существенно труднее, чем внутренний дефект органа, окруженный интактными собственными скелетными тканями. Спонтанная или естественная репаративная регенерация скелетных соединительных тканей с восстановлением первоначальной формы и целостности органа при краевых дефектах, захватывающих надхрящницу или надкостницу у млекопитающих и человека крайне ограничена, отсутствуют естественные механизмы спонтанной регенерации. Formation is the process of formation of new organ and tissue structures that recreate the original form of any damaged organ, including any organ of the musculoskeletal system. The possibility of such organotypic reparative regeneration is extremely important for practical medicine. It is much more difficult to restore a lost marginal part of a bone or cartilage than an internal organ defect surrounded by intact skeletal tissues of its own. Spontaneous or natural reparative regeneration of skeletal connective tissues with restoration of the original shape and integrity of the organ in case of marginal defects that involve the perichondrium or periosteum in mammals and humans is extremely limited, there are no natural mechanisms of spontaneous regeneration.

Костнопластические материалы позволяют проявить регенерационную способность млекопитающим, но в случае краевых дефектов часто мало эффективны, особенно при большом объеме потери скелетных тканей. Регенерирующая кость с одного края хуже проникает в костнопластические материалы, а окружающие собственные соединительные ткани - лучше, соответственно собственно соединительные ткани не оставляют места регенерирующим скелетным - остеогенез нарушается. Чтобы избежать прорастания волокнистой соединительной ткани при регенерации альвеолярных отростков челюсти и восстановления утраченных периодонтальных тканей в костнопластические материалы, стимулирующие остеоиндуктивный и остеокондуктивный остеогенез, широко используют направленную тканевую регенерацию (НТР, GTR) – методику восстановления утраченной костной ткани для установки имплантатов зубов, а также при заболеваниях пародонта. В настоящее время известны разные способы направленной тканевой регенерации, но наиболее востребована и распространена мембранная. Мембрана является барьером, который размещается между костной и параоссальными тканями. Такое ее расположение способно предотвратить распространение мягких тканей между гранулами или частицами костнопластического материала и создать условия для остеогенеза. Osteoplastic materials allow mammals to demonstrate regenerative ability, but in the case of marginal defects, they are often not very effective, especially with a large amount of skeletal tissue loss. Regenerating bone from one edge penetrates into osteoplastic materials worse, and the surrounding own connective tissues - better, respectively, the connective tissues themselves do not leave space for regenerating skeletal ones - osteogenesis is disturbed. To avoid the proliferation of fibrous connective tissue during the regeneration of the alveolar processes of the jaw and the restoration of lost periodontal tissues into osteoplastic materials that stimulate osteoinductive and osteoconductive osteogenesis, directed tissue regeneration (NTR, GTR) is widely used - a technique for restoring lost bone tissue, as well as for installing implants periodontal diseases. Currently, various methods of directed tissue regeneration are known, but the most demanded and widespread is the membrane one. The membrane is a barrier that is placed between bone and paraosseous tissues. Such an arrangement can prevent the spread of soft tissues between granules or particles of osteoplastic material and create conditions for osteogenesis.

Одной из стратегий регенеративной медицины является наращивание (расширение in vitro) клеточной массы, например, клеток соединительной ткани (к этим клеткам относятся остеоциты и хондробласты) в лабораторных условиях. Однако, адгезивные клеточные культуры имеет существенный недостаток – условия культивирования существенно отличаются от живого организма, клетки начинают адаптироваться к питательной среде, газовому составу и взаимодействовать с дном культурального флакона, и происходит постепенная утрата этими клетками своей органоспецифичности.One of the strategies of regenerative medicine is to build up (expand in vitro ) cell mass, for example, connective tissue cells (these cells include osteocytes and chondroblasts) under laboratory conditions. However, adhesive cell cultures have a significant drawback - the cultivation conditions differ significantly from the living organism, the cells begin to adapt to the nutrient medium, the gas composition and interact with the bottom of the culture flask, and these cells gradually lose their organospecificity.

Не выяснено и нет общего мнения об оптимальном количестве остеоцитов или хондроцитов, необходимых для заполнения дефекта тканей опорно-двигательного аппарата. Недостатки метода двухмерные системы культур клеток 2D (two-dimensional cell culture systems) в адгезивных клеточных культурах являются: значительное изменение экспрессии генов при адаптации in vitro, генетическая и фенотипическая нестабильность клеток, изменение клеточных ответов на действие цитокинов (нарушение межклеточной передача сигналов), снижение или изменение ключевых функций, истощение потенциала к дифференцировке при пассировании, замещение клетками волокнистой соединительной ткани, доминирование клеток, рассеивание клеток и не участие в регенеративных гистогенезах при обратной трансплантации.It has not been clarified and there is no general opinion about the optimal number of osteocytes or chondrocytes required to fill the defect in the tissues of the musculoskeletal system. The disadvantages of the method of two-dimensional cell culture systems (2D cell culture systems) in adhesive cell cultures are: a significant change in gene expression during in vitro adaptation, genetic and phenotypic cell instability, a change in cellular responses to the action of cytokines (impaired intercellular signaling), a decrease in or alteration of key functions, depletion of the potential for differentiation during passage, replacement of fibrous connective tissue by cells, cell dominance, cell scattering, and not participating in regenerative histogenesis during reverse transplantation.

Изолированные и размноженные в культуре аутологичные клетки скелетных тканей не могут производить полноценный внеклеточный матрикс при реплантации и, соответственно, таким живым материалом восстановить полноценную кость или суставной хрящ становится невозможно. Autologous cells of skeletal tissues isolated and propagated in culture cannot produce a full-fledged extracellular matrix during replantation and, accordingly, it becomes impossible to restore full-fledged bone or articular cartilage with such living material.

Разработка биочернил для биопринтинга и строительных блоков для тканевой инженерии сформировали новое направление в методе клеточных культур – культивирование в трехмерных системах (3D, three-dimensional cell culture systems) – биотехнологии производства клеточных сфероидов.The development of bio-ink for bioprinting and building blocks for tissue engineering has formed a new direction in the method of cell culture - cultivation in three-dimensional systems (3D, three-dimensional cell culture systems) - biotechnology for the production of cell spheroids.

Известны технологии использования сфероидов, полученных из собственных клеток хряща, состоящих из расширенных в культуре аутологичных хондроцитов и связанных с ними внеклеточного матрикса (Spherox™ или Chondrosphere ™) форма ACI для восстановления дефектов 4–10 см², которая представлена как персонифицированная клеточная терапия дефектов гиалиновых хрящей суставов человека (Becher, C.; Laute, V.; Fickert, S. et al. Safety of three different product doses in autologous chondrocyte implantation: Results of a prospective, randomised, controlled trial. J. Orthop. Surg. Res. 2017, 12, 71).Known technologies for the use of spheroids obtained from cartilage own cells, consisting of autologous chondrocytes expanded in culture and associated extracellular matrix (Spherox ™ or Chondrosphere ™) ACI form for restoration of 4-10 cm ² defects, which is presented as a personalized cell therapy for hyaline defects cartilage of human joints (Becher, C .; Laute, V .; Fickert, S. et al. Safety of three different product doses in autologous chondrocyte implantation: Results of a prospective, randomized, controlled trial. J. Orthop. Surg. Res. 2017, 12 , 71).

Известен способ производства трехмерных живых хрящеподобных микротканей in vitro и их применения в качестве трансплантационного материала (US7887843 B2). Данный способ включает в себя получение клеточных сфероидов из культивированных хондроцитов суставного хряща в 96-ти луночных планшетах из неадгезивного пластика. A known method for the production of three-dimensional living cartilage-like micro-tissues in vitro and their use as a transplant material (US7887843 B2). This method includes obtaining cell spheroids from cultured chondrocytes of articular cartilage in 96-well plates from non-adhesive plastic.

Одним из перспективных источников клеток для регенерации скелетных хрящевых тканей являются хондроциты, полученные из хряща носа взрослого человека. Было обнаружено, что взрослые хондроциты, полученные из носового хряща взрослого человека, обладали большей способностью к выработке коллагена II и глюкозаминогликанов, чем суставные хондроциты, при длительном культивировании, также хондроциты хрящей носа обладают более высоким пролиферативным потенциалом по сравнению с хондроцитами, забранных из суставного хряща колена взрослого человека. Существенным недостатком этого способа является ограниченное количество забираемого для выделения клеток исходного материала, которое можно получить из хряща перегородки носа, не создав заметный косметический дефект, что приводит к необходимости длительного культивирования клеток для накопления нужной биомассы клеток, в процессе формирования сфероидов происходит постепенная гибель клеток, сфероиды уменьшаются в размерах (Stuart MP Matsui RAM, Santos MFS, Côrtes I et al. Successful Low-Cost Scaffold-Free Cartilage Tissue Engineering Using Human Cartilage Progenitor Cell Spheroids Formed by Micromolded Nonadhesive Hydrogel// Stem Cells Int. . - 2017 г).One of the promising sources of cells for the regeneration of skeletal cartilage tissues are chondrocytes obtained from the cartilage of the nose of an adult. It was found that adult chondrocytes obtained from the nasal cartilage of an adult had a greater ability to produce collagen II and glucosaminoglycans than articular chondrocytes, with prolonged cultivation, chondrocytes of the nasal cartilage also have a higher proliferative potential compared to chondrocytes harvested from the articular knee of an adult. A significant disadvantage of this method is the limited amount of starting material taken for cell isolation, which can be obtained from the cartilage of the nasal septum without creating a noticeable cosmetic defect, which leads to the need for long-term cultivation of cells to accumulate the required cell biomass; in the process of spheroid formation, gradual cell death occurs, spheroids decrease in size (Stuart MP Matsui RAM, Santos MFS, Côrtes I et al. Successful Low-Cost Scaffold-Free Cartilage Tissue Engineering Using Human Cartilage Progenitor Cell Spheroids Formed by Micromolded Nonadhesive Hydrogel // Stem Cells Int. - 2017) ...

Известен способ эктопического формирования кости in vivo с использованием клеток, полученных из надкостницы человека, высеянных на носителе Collagraft ™. Образование костей происходило через восемь недель, когда на носители Collagraft ™ загружали не менее одного миллиона клеток надкостницы и имплантировали подкожно мышам NMRI nu/nu. Был обнаружен костный матрикс de novo, в основном секретируемый клетками надкостницы, в непосредственной близости от гранул фосфата кальция, этот минерал инициировал «остеоиндуктивную программу». Действительно, удаление гранул фосфата кальция путем декальцификации этилендиаминтетрауксусной кислоты до посева и имплантации клеток приводило к потере образования кости. Этот способ формирования кости аналогичен модели, наблюдаемой во время физиологического внутримембранозного развития кости, и может иметь значение при исследований стратегий тканевой инженерии. Недостатком способа является большая длительность остеогенеза и неясность с интеграцией конструкции с окружающими и интактной костной тканью (Eyckmans J. et al. A clinically relevant model of osteoinduction: a process requiring calcium phosphate and BMP/Wnt signalling. J Cell Mol Med. 2010 Jun; 14(6b): 1845–1856. Published online 2009 Jun 16). There is a known method of ectopic bone formation in vivo using cells obtained from the human periosteum, seeded on the Collagraft ™ carrier. Bone formation occurred after eight weeks when at least one million periosteal cells were loaded onto Collagraft ™ vehicles and implanted subcutaneously in NMRI nu / nu mice. De novo bone matrix was found, mainly secreted by cells of the periosteum, in the immediate vicinity of calcium phosphate granules, this mineral initiated the "osteoinductive program". Indeed, removal of calcium phosphate granules by decalcification of EDTA prior to seeding and cell implantation resulted in loss of bone formation. This mode of bone formation is similar to the pattern observed during physiological intramembranous bone development and may be relevant in studies of tissue engineering strategies. The disadvantage of this method is the long duration of osteogenesis and the lack of clarity with the integration of the construct with the surrounding and intact bone tissue (Eyckmans J. et al. A clinically relevant model of osteoinduction: a process requiring calcium phosphate and BMP / Wnt signaling. J Cell Mol Med. 2010 Jun; 14 (6b): 1845-1856 Published online 2009 Jun 16).

Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является способ масштабируемого производства микросфероидов из клеток надкостницы мышей, формирование этих сфероидов происходит в дифференцировочной среде, клетки этих сфероидов дифференцируются в процессе и образуют клеточный агрегат, который назван авторами органоидом костной мозоли (каллусные органоиды). Эти органоиды по своей структуре и форме являются сфероидами, при трансплантации достигают автономии и обладают способностью запускать образование эктопических костных разрастаний in vivo за счет энхондрального остеогенеза. Органоиды каллуса в искусственных условиях самопроизвольно биоорганизуются in vitro в относительно крупные тканеинженерные ткани, способные лечить дефекты длинных костей критического размера у мышей. Восстановленная кость проявляет морфологические свойства, сходные с таковыми у голени. Эти каллусные органоиды можно рассматривать как живые «био-чернила», позволяющие производить многомодульные ткани снизу вверх со сложными геометрическими особенностями и встроенными качественными признаками (Nilsson Hall G, Mendes L., Gklava C. et al. Developmentally Engineered Callus Organoid Bioassemblies Exhibit Predictive In Vivo Long Bone Healing/ Advanced Science, (Weinh). 2020 Jan; 7(2): 1902295. Published online 2019 Dec 10. doi: 10.1002/advs.201902295 PMCID: PMC6974953).The closest analogue of the present invention is a method for the scalable production of microspheroids from the cells of the periosteum of mice, the formation of these spheroids occurs in the differentiation medium, the cells of these spheroids differentiate in the process and form a cell aggregate, which is called by the authors a callus organoid (callus organelles). These organelles are spheroids in their structure and shape; during transplantation they achieve autonomy and have the ability to trigger the formation of ectopic bone growths in vivo due to enchondral osteogenesis. Callus organoids in vitro spontaneously bioorganize in vitro into relatively large tissue-engineered tissues capable of treating critical-sized long bone defects in mice. The reconstructed bone exhibits morphological properties similar to those of the lower leg. These callus organelles can be viewed as living "bio-inks" that allow the production of multi-modular tissues from the bottom up with complex geometric features and built-in quality features (Nilsson Hall G, Mendes L., Gklava C. et al. Developmentally Engineered Callus Organoid Bioassemblies Exhibit Predictive In Vivo Long Bone Healing / Advanced Science, (Weinh). 2020 Jan; 7 (2): 1902295. Published online 2019 Dec 10.doi: 10.1002 / advs.201902295 PMCID: PMC6974953).

В этом способе были созданы клеточные микросфероиды (состоящие из 250 клеток), диаметр которых не превышал бы 150 мкм, чтобы соответствовать шкале длины, по которой могут транспортироваться диффузные сигналы, и имитировать начальное событие развития формирования ростовой пластинки (конденсация), в результате чего лишь нужны немногие сотни клеток. Во время дифференцировки клетки подвергались каскаду молекулярных и клеточных событий, которые отражают эндохондральное окостенение, позволяя им трансформироваться из клеточных сфероидов в полуавтономные структуры микротканей, каллусные органоиды, способные подвергаться органогенезу. Кроме того, сборка органоидов каллуса в более крупные тканевые структуры привела к имплантатам, содержащим активные регенеративные компоненты по всей их структуре. Надо отметить, что размер сфероидов диаметром 150 мкм крайне затрудняет работу с ними при обратной трансплантации.In this method, cellular microspheroids (consisting of 250 cells) were created, the diameter of which would not exceed 150 μm, in order to correspond to the length scale along which diffuse signals can be transported, and to simulate the initial event of the development of growth plate formation (condensation), as a result of which only few hundreds of cells are needed. During differentiation, cells underwent a cascade of molecular and cellular events that reflect endochondral ossification, allowing them to transform from cellular spheroids into semi-autonomous microtissue structures, callus organelles, capable of undergoing organogenesis. In addition, the assembly of callus organelles into larger tissue structures resulted in implants containing active regenerative components throughout their entire structure. It should be noted that the size of spheroids with a diameter of 150 μm makes it extremely difficult to work with them during reverse transplantation.

Главным недостатком способа является невозможность васкуляризация подобных живых имплантатов размером более сантиметра. Хотя хондроциты обладают устойчивостью к стрессовым условиям, обнаруженным в месте имплантации, таким как гипоксия и низкая доступность питательных веществ, ожидается, что васкуляризация будет необходимым и главным условием для выживания клеток в таких крупных имплантатах. То, что удалось продемонстрировать остеогенез на мыши in vivo, будет невозможно воспроизвести на более крупной животной модели. The main disadvantage of this method is the impossibility of vascularization of such living implants larger than a centimeter. Although chondrocytes are resistant to stress conditions found at the implantation site, such as hypoxia and low nutrient availability, vascularization is expected to be necessary and essential for cell survival in such large implants. What has been possible to demonstrate osteogenesis in mice in vivo will not be replicable in a larger animal model.

Таким образом, несмотря на имеющиеся способы восстановления скелетных соединительных тканей, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанной проблемы.Thus, despite the existing methods for the restoration of skeletal connective tissues, all of them are characterized by a number of disadvantages and limitations, therefore, there remains a need to develop and create new methods and approaches to solving this problem.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового способа получения трансплантата на основе клеточных сфероидов из клеток надкостницы для эффективного восстановления скелетных соединительных тканей, в частности, суставного хряща и кости. The objective of the present invention is to develop a new method for obtaining a transplant based on cell spheroids from periosteal cells for effective restoration of skeletal connective tissues, in particular, articular cartilage and bone.

Техническим результатом данного изобретения является разработка нового способа получение трансплантата на основе клеточных сфероидов из клеток надкостницы, обладающих выраженным регенеративным потенциалом, для эффективного восстановления скелетных соединительных тканей, в частности, суставного хряща и/или кости, важным моментом является способность таких сфероидов участвовать в развитии как костной, так и хрящевой тканей, в зависимости от состава локальной среды регенерации. Особенностью такого способа производства сфероидов в агарозных микролунках является то, что данный способ не сопровождается гибелью клеток. Жизнеспособность сфероидов оценивалась с помощью метода LIVE/DEAD^® на всех сроках культивирования сфероидов в агарозных лунках. Кроме того, способ по изобретению исключает необходимость использования дифференцирующих хондрогенных или остеогенных сред, замедляющих наращивание клеточной биомассы. Помимо этого, способ по изобретению позволяет получить трансплантат на основе сфероидов, которые не требуют дополнительной дифференцировки и готовы к трансплантации. Дополнительно, настоящее изобретение обеспечивает минимально инвазивный забор надкостницы, например, с реберного хряща субъекта, миниоперация проводится в амбулаторных условиях под местной анестезией.The technical result of this invention is the development of a new method for obtaining a transplant based on cellular spheroids from cells of the periosteum, which have a pronounced regenerative potential, for the effective restoration of skeletal connective tissues, in particular, articular cartilage and / or bone, an important point is the ability of such spheroids to participate in the development of such bone and cartilage tissue, depending on the composition of the local regeneration environment. A feature of this method for the production of spheroids in agarose microwells is that this method is not accompanied by cell death. The viability of spheroids was assessed using the LIVE / DEAD ^® method at all stages of the cultivation of spheroids in agarose wells. In addition, the method according to the invention eliminates the need to use differentiating chondrogenic or osteogenic media that slow down the growth of cell biomass. In addition, the method according to the invention makes it possible to obtain a graft based on spheroids that do not require additional differentiation and are ready for transplantation. Additionally, the present invention provides a minimally invasive harvesting of the periosteum, for example, from the costal cartilage of a subject, mini-surgery is performed on an outpatient basis under local anesthesia.

Дополнительно, способ по изобретению позволяет получить сфероиды из надкостницы быстрее и большего объема, по сравнению со сфероидами из более дифференцированных клеточных элементов скелетных тканей - остеоцитов и хондробластов. Использование трансплантата по изобретению на основе более крупных сфероидов из надкостницы облегчает их трансплантацию, а восстановление скелетных соединительных тканей происходит быстро и эффективно. Репаративная регенерация скелетных соединительных тканей происходит из камбиальных (прогениторных и стволовых) клеток надкостницы, из которых выращены клеточные сфероиды. При этом, используя трансплантат на основе сфероидов по изобретению для трансплантации, удалось получить ткань, характеризующуюся высокой степенью васкуляризации при трансплантации.Additionally, the method according to the invention makes it possible to obtain spheroids from the periosteum faster and with a larger volume, in comparison with spheroids from more differentiated cellular elements of skeletal tissues - osteocytes and chondroblasts. The use of the graft according to the invention based on larger spheroids from the periosteum facilitates their transplantation, and the restoration of skeletal connective tissues occurs quickly and efficiently. Reparative regeneration of skeletal connective tissues occurs from cambial (progenitor and stem) cells of the periosteum, from which cellular spheroids. At the same time, using a graft based on spheroids according to the invention for transplantation, it was possible to obtain a tissue characterized by a high degree of vascularization during transplantation.

Достижение указанного технического результата обеспечивается при осуществлении способа получения трансплантата на основе клеточных сфероидов для восстановления скелетных соединительных тканей, включая суставные поверхности, субъекта на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, включающий следующие этапы:Achievement of the specified technical result is ensured when implementing a method for obtaining a transplant based on cellular spheroids for the restoration of skeletal connective tissues, including articular surfaces, of a subject based on autologous cells of the subject's periosteum, including the following steps:

а) выделение клеток из камбиального слоя надкостницы субъекта; a) isolation of cells from the cambial layer of the periosteum of the subject;

б) культивирование выделенных на стадии а) клеток в адгезивной культуре в питательной культуральной среде без индукторов дифференцировки; b) culturing the cells isolated at stage a) in an adhesive culture in a nutrient culture medium without differentiation inducers;

в) перенесение клеток, полученных на стадии б) в агарозные лунки; c) transfer of cells obtained in step b) into agarose wells;

г) слияние клеток в клеточные сфероиды. d) fusion of cells into cellular spheroids.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека. В частных вариантах воплощения изобретения скелетные соединительные ткани представляют собой кость и/или хрящ, в частности суставной хрящ.In particular embodiments of the invention, the subject is a human. In particular embodiments of the invention, the skeletal connective tissue is bone and / or cartilage, in particular articular cartilage.

В частных вариантах воплощения изобретения размер клеточных сфероидов составляет 200-450 мкм. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения размер сфероидов составляет 250 мкм.In particular embodiments of the invention, the size of the cell spheroids is 200-450 μm. In some particular embodiments, the spheroids are 250 microns in size.

В частных вариантах воплощения изобретения надкостница представляет собой надкостницу собственного реберного хряща и/или кости голени субъекта. In particular embodiments of the invention, the periosteum is the periosteum of the subject's own costal cartilage and / or the calf bone.

В частных вариантах воплощения изобретения культивирование клеток на стадии б) осуществляется в течение 20-30 дней. В частных вариантах воплощения изобретения перенесение клеток на стадии в) осуществляется из расчета 5 000 - 20 000 клеток на 1 (одну) лунку агарозного планшета.In particular embodiments of the invention, the culturing of the cells in step b) is carried out for 20-30 days. In particular embodiments of the invention, the transfer of cells in step c) is carried out at the rate of 5,000 to 20,000 cells per 1 (one) well of an agarose plate.

В частных вариантах воплощения изобретения слияние клеток в клеточные сфероиды осуществляется в агарозных лунках, где они пребывают до 7 дней.In particular embodiments of the invention, the fusion of cells into cell spheroids is carried out in agarose wells, where they stay for up to 7 days.

Настоящее изобретение также относится к трансплантату для восстановления скелетных соединительных тканей, включающему клеточные сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и полученные способом по изобретению.The present invention also relates to a graft for the restoration of skeletal connective tissues, comprising cell spheroids based on autologous cells of the periosteum of a subject and obtained by the method of the invention.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека. In particular embodiments of the invention, the subject is a human.

В частных вариантах воплощения изобретения скелетные соединительные ткани представляют собой кость и/или суставной хрящ.In particular embodiments, the skeletal connective tissue is bone and / or articular cartilage.

В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает дополнительный компонент, в частности, альгинатный гель или гель на основе гиалуроновой кислоты вместе с биологически активными веществами, влияющими на клеточную дифференцировку в остеогенном или хондрогенном направлении.In particular embodiments of the invention, the graft comprises an additional component, in particular, an alginate gel or a gel based on hyaluronic acid together with biologically active substances that affect cell differentiation in the osteogenic or chondrogenic direction.

Технический результат настоящего изобретения также достигается за счет применения аутологичных клеток надкостницы субъекта для получения трансплантата в виде клеточных сфероидов.The technical result of the present invention is also achieved through the use of autologous cells of the periosteum of the subject to obtain a transplant in the form of cell spheroids.

Определение и термины Definition and terms

Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.Various terms related to the objects of the present invention are used above and also in the description and in the claims. Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used in this application have the same meaning as understood by those skilled in the art. References to techniques used in describing the present invention refer to well known techniques, including modifying these techniques and replacing them with equivalent techniques known to those skilled in the art.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».In the description of this invention, the terms "includes" and "including" are interpreted as meaning "includes, among other things". These terms are not intended to be construed as “consists only of”.

В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.In the description of this invention, the term " tissue " refers to a system of cells and non-cellular structures that have a common structure, in some cases a common origin, and specialized in performing certain functions.

Используемый в данном документе термин «дефект» относится к хрящевой или костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект скелетных соединительных тканей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы. As used herein, the term " defect " refers to cartilage or bone tissue that is absent, reduced in quantity, or otherwise damaged. A skeletal connective tissue defect can result from disease, treatment for a disease, or injury.

Термин «среда» относится к питательной культуральной среде, предназначенной для культивирования сфероидов по изобретению, к примеру среда может быть выбрана из сред с эмбриональной телячьей сывороткой или тромболизатов для культивирования клеток.The term " medium " refers to a nutrient culture medium for culturing the spheroids of the invention, for example, the medium can be selected from fetal bovine serum media or thrombolysates for cell culture.

Термин «адгезивная культура» в настоящем документе означает монослойную культуру клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться к культуральному пластику или стеклу, при наличии определенных условий эти клетки будут прикрепляться к субстрату и в норме будут делиться и распространяться таким способом. The term " adhesive culture " in this document means a monolayer culture of cells capable of attaching to culture plastic or glass through their receptors, under certain conditions, these cells will attach to the substrate and normally divide and spread in this way.

Клетки камбиального слоя надкостницы содержат скелетогенные клетки – остеобласты, преостеобласты и стволовые скелетогенные клетки.The cells of the cambial layer of the periosteum contain skeletal cells - osteoblasts, preosteoblasts, and skeletal stem cells.

Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса. Сфероиды, согласно изобретению, характеризуются размером 200-450 мкм, в частных вариантах воплощения изобретения 250 мкм.Used in this application, the term "spheroids" refers to tightly packed ball-shaped cell aggregates formed by three-dimensional cultivation. Their important property is the ability for mutual adhesion and subsequent tissue fusion, as well as for adhesion to the elements of the extracellular matrix. Spheroids, according to the invention, are characterized by a size of 200-450 microns, in particular embodiments of the invention of 250 microns.

Используемый в данной заявке термин «трансплантат» относится к сфероидам, а термин «трансплантация» — это процесс пересадки указанного трансплантата на основе сфероидов в организм субъекта, как правило, для устранения дефекта скелетных соединительных тканей.As used in this application, the term "graft" refers to spheroids, and the term "transplant" is the process of transplanting said spheroid-based graft into a subject, typically to repair a skeletal connective tissue defect.

Трансплантат по изобретению включает сфероиды из аутологичных клеток надкостницы, полученные согласно способу по изобретения, наряду с этим трансплантат опционально включает, по меньшей мере, один дополнительны компонент. Так, в частности, таким компонентом может быть альгинатный гель или гель на основе гиалуроновой кислоты (указанный гель может быть получен, в частности, способом описанным в Molly M. Stevens, Robert P. Marini et al/ In vivo engineering of organs: The bone bioreactor/ PNAS August 9, 2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102). В частности, гелеобразование может быть инициировано путем смешивания 2% (вес/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl₂ в 10 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl с использованием стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа. В состав геля может быть добавлены факторы роста (TGF-β1 и FGF-2, R & D Systems), включены в состав в концентрации 10 нг/мл. В частных вариантах, гель на основе ГК, HA (Genzyme) химически модифицировали так, чтобы он содержал альдегидные группы (HA-ALD) путем реакции с периодатом натрия и гидразидными группами (HA-ADH) путем взаимодействия с адипиновым дигидразидом. Гидрогели ГА получают смешиванием равных объемов 2% (мас./об.) водных растворов HA-ALD и HA-ADH. Сурамин (Bayer, Леверкузен, Германия) включают в количестве (0,4 моль/литр) во время гелеобразования. Кроме того, трансплантат, может содержать физиологически приемлемый носитель, который, в частности, представляет собой Ham's F12 культуральная среда, базовая, CLS. В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат может содержать комплекс NCTF® (компания LABORATOIRES FILORGA).The graft according to the invention comprises spheroids from autologous periosteal cells obtained according to the method according to the invention, and the graft optionally includes at least one additional component. So, in particular, such a component can be an alginate gel or a gel based on hyaluronic acid (this gel can be obtained, in particular, by the method described in Molly M. Stevens, Robert P. Marini et al / In vivo engineering of organs: The bone bioreactor / PNAS August 9, 2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102). In particular, gelation can be initiated by mixing 2% (w / v) sodium alginate (FMC BioPolymer) in 30 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl with an equal volume of a solution containing 75 mM CaCl ₂ in 10 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl using a sterile Y-shaped mixer. The gel cures within 1 min and has a Young's modulus of 0.17 MPa. Growth factors (TGF-β1 and FGF-2, R & D Systems) can be added to the gel, included in the composition at a concentration of 10 ng / ml. In particular variants, the HA-based gel, HA (Genzyme), was chemically modified to contain aldehyde groups (HA-ALD) by reaction with sodium periodate and hydrazide groups (HA-ADH) by interaction with adipic dihydrazide. HA hydrogels are prepared by mixing equal volumes of 2% (w / v) aqueous solutions of HA-ALD and HA-ADH. Suramin (Bayer, Leverkusen, Germany) is included in an amount (0.4 mol / liter) during gelation. In addition, the graft may contain a physiologically acceptable carrier, which, in particular, is Ham's F12 culture medium, basic, CLS. In particular embodiments, the graft may contain an NCTF® complex (LABORATOIRES FILORGA).

Подробное раскрытие изобретенияDetailed disclosure of the invention

В качестве источника клеток скелетных соединительных тканей для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используются клетки внутреннего слоя надкостницы, являющиеся для скелетных соединительных тканей камбиальной зоной, поставляющей прогениторные и стволовые клетки для физиологической и репаративной регенерации, следовательно, содержащая большее количество прогенеторных клеток. При формировании сфероидов из клеток надкостницы и их последующем росте в агарозных лунках по изобретению не происходит уменьшения их диаметра, что труднопреодолимо для более дифференцированных соединительнотканных клеток хондрогенного или остеогенного дифферона, полученных из хрящей или костей. Одним из преимуществ этой технологии —достижение плотности клеток на единицу объема, сопоставимую с плотностью клеток в органах. В силу отсутствия контакта с внешним внеклеточным матриксом и без индукторов дифференцировки в сфероидах клеточный рост не сопровождается повышением уровня дифференцировки клеток.As a source of skeletal connective tissue cells for the production of spheroids according to the present invention, cells of the inner layer of the periosteum are used, which are the cambial zone for skeletal connective tissues, supplying progenitor and stem cells for physiological and reparative regeneration, therefore, containing a greater number of progenitor cells. When spheroids are formed from periosteal cells and their subsequent growth in agarose wells according to the invention, their diameter does not decrease, which is difficult to overcome for more differentiated connective tissue cells of chondrogenic or osteogenic diferon derived from cartilage or bones. One of the advantages of this technology is the achievement of a cell density per unit volume comparable to the density of cells in organs. Due to the lack of contact with the external extracellular matrix and without differentiation inducers in the spheroids, cell growth is not accompanied by an increase in the level of cell differentiation.

Забор клеток надкостницы осуществляется малоинвазивным методом. Проводится местная анестезия кожи, подкожной клетчатки и надкостницы. Через меленький разрез, достигаем надкостницы, с помощью иглы с физиологическим раствором отделяет надкостницу от ребра, наполняем пространство между компактной костью ребра и его надкостницей, а затем аккуратно иссекаем лоскут – надкостницу. Выделение клеток из надкостницы производили путем предварительного механического выскабливания внутреннего слоя надкостницы с последующей ферментативной диссоциацией кусочков тканей этого слоя до единичных клеток.The collection of periosteal cells is carried out using a minimally invasive method. Local anesthesia of the skin, subcutaneous tissue and periosteum is performed. Through a small incision, we reach the periosteum, using a needle with saline, separates the periosteum from the rib, fill the space between the compact bone of the rib and its periosteum, and then carefully dissect the flap - the periosteum. Isolation of cells from the periosteum was performed by preliminary mechanical scraping of the inner layer of the periosteum, followed by enzymatic dissociation of tissue pieces of this layer to single cells.

Для получения первичной культуры выделенные из надкостницы клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37⁰С, 5% СО₂ (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).To obtain a primary culture, cells isolated from the periosteum are seeded in plastic flasks with a culture medium of the following composition: DMEM (or DMEM / F12) 450 ml, L-glutamine 292 mg, fetal bovine serum 50 ml, penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 μg / ml, at 100% humidity, temperature 37 ⁰ С, 5% СО ₂ (this medium and conditions are used at all stages of subsequent cultivation).

Субкультивирование монослойной культуры прогениторных клеток скелетных соединительных тканей осуществляют до третьего - четвертого пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.Subcultivation of a monolayer culture of progenitor cells of skeletal connective tissues is carried out until the third - fourth passage with a change of medium every 2-3 days.

После последнего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,4 миллионов клеток на планшет, где в лунках из культивированных клеток начинают формироваться сфероиды.After the last passage, cells are removed from plastic vials with trypsin / EDTA. The resulting cell suspension is washed from trypsin / EDTA, including using DMEM medium with 10% serum, followed by centrifugation (10 minutes at 200g) and transferred to 81-well agarose plates with a well diameter of 800 μm at a concentration of up to 1.4 million cells onto the plate, where spheroids begin to form from the cultured cells in the wells.

Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 7 суток со сменой питательной среды каждые 2-3 дня.Spheroids stay in the wells for up to 7 days with a change in the nutrient medium every 2-3 days.

Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, с диаметром не менее 1 мм². Трансплантация может производиться эндоскопически.For transplantation of spheroids, they are collected from plates and transferred to a test tube, where they settle to the bottom without additional centrifugation. Thereafter, the spheroids are placed in a syringe and transplanted to the subject into the defect area through a needle or applicator with a diameter of at least 1 mm ² . Transplantation can be done endoscopically.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Пример 1.Example 1.

Взятие надкостницы осуществляли с ребра и голени крыс, кроликов, овец, человека. Для отделения надкостницы от нижележащей кости под нее инъекционным путем вводили изотонический раствор натрия хлорида. The periosteum was taken from the ribs and tibia of rats, rabbits, sheep, and humans. To separate the periosteum from the underlying bone, isotonic sodium chloride solution was injected under it.

Выделение клеток из надкостницы производили путем выскабливания внутреннего слоя надкостницы с последующей ферментативной диссоциацией кусочков тканей.Isolation of cells from the periosteum was performed by scraping the inner layer of the periosteum, followed by enzymatic dissociation of tissue pieces.

Для получения первичной культуры выделенные клетки высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37⁰ С, 5% СО₂ (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования). Субкультивирование монослойной культуры клеток надкостницы осуществляли до четвертого пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.To obtain a primary culture, the isolated cells were seeded in plastic flasks with a culture medium of the following composition: DMEM 450 ml, L-glutamine 292 mg, fetal bovine serum 50 ml, penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 μg / ml, at 100% humidity, temperature 37 ⁰ С, 5% СО ₂ (this medium and conditions are used at all stages of subsequent cultivation). Subculturing of a monolayer culture of periosteal cells was carried out until the fourth passage with a change of medium every 2-3 days.

После четвертого пассажа клетки снимали с пластика (пластиковых флаконов) трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывали от трипсина/ЭДТА, в том числе средой ДМЕМ с 10% сывороткой и с последующим центрифугированием (10 минут при 200g), затем и переносили в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,4 млн клеток на планшет, после чего начинают формироваться сфероиды.After the fourth passage, cells were removed from plastic (plastic vials) with trypsin / EDTA. The resulting cell suspension was washed from trypsin / EDTA, including with DMEM medium with 10% serum, followed by centrifugation (10 minutes at 200g), and then transferred into 81-well agarose plates with a well diameter of 800 μm at a concentration of up to 1.4 million cells on the plate, after which spheroids begin to form.

Культивирование сфероидов производили в течение 14 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.Cultivation of spheroids was carried out for 14 days with a change of medium every 2-3 days.

В результате сфероиды из надкостницы увеличивались в размере в течение 7 дней процесса культивирования. Известно, что сфероиды, полученные из более дифференцированных клеток кости и хряща, уменьшаются в размерах внутри агарозных лунок со временем. Это связано с биологическими особенностями клеток соединительной ткани, неоптимальными условиями культивирования дифференцированных клеток, гибелью части клеток и утратой их структурных элементов. В случае осуществления способа по изобретению такого эффекта не наблюдается, что является абсолютно неожиданным для специалиста. По существу, осуществляется клеточный рост при культивировании в трехмерной структуре - 3D-культивирование, можно говорить о выращивании микротканей или сфероидов. Авторы настоящего изобретения установили, что клетки объединяются в сферу и увеличение биомассы этой конструкции происходит в течение 7 суток, потом прирост веса сфероида существенно меньше.As a result, the spheroids from the periosteum increased in size during the 7 days of the cultivation process. It is known that spheroids derived from more differentiated bone and cartilage cells decrease in size within agarose wells over time. This is due to the biological characteristics of connective tissue cells, non-optimal conditions for the cultivation of differentiated cells, the death of some cells and the loss of their structural elements. In the case of the implementation of the method according to the invention, such an effect is not observed, which is absolutely unexpected for a specialist. Essentially, cell growth is carried out during cultivation in a three-dimensional structure - 3D-cultivation, we can talk about the growth of micro-tissues or spheroids. The authors of the present invention found that the cells unite into a sphere and the increase in the biomass of this structure occurs within 7 days, then the increase in the weight of the spheroid is significantly less.

Таким образом, при выращивании (получении) сфероидов согласно способу по изобретению в агарозных лунках получают сфероиды из прогениторных клеток надкостницы, которые увеличивают свою биомассу в агарозных лунках. Thus, when growing (obtaining) spheroids according to the method according to the invention in agarose wells, spheroids are obtained from progenitor cells of the periosteum, which increase their biomass in agarose wells.

Гистологически сфероиды из надкостницы на 7 сутки культивирования содержали волокнистый внеклеточный матрикс. Указанный матрикс при трансплантации создает временную матрицу, по которой и вокруг которой происходит регенерация собственных тканей реципиента и обеспечивается возможность восстановления. Сами сфероиды в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, клетки служат источником регенерации, а из матрикса создается модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять регенерацию - дополнительно реализуется способ регенерации – регенерация по трансплантату.Histologically, spheroids from the periosteum on the 7th day of cultivation contained a fibrous extracellular matrix. During transplantation, this matrix creates a temporary matrix along which and around which the recipient's own tissues are regenerated and the possibility of recovery is provided. The spheroids themselves are further subjected to destruction and resorption, the cells serve as a source of regeneration, and a model (frame) is created from the matrix, which allows local tissues to regenerate - in addition, the regeneration method is implemented - regeneration by the graft.

Пример 2Example 2

В дефекты критических размеров лучевой кости крыс и кроликов помещали аутологичные сфероиды из надкостницы, полученные согласно данному изобретению, до полного покрытия ими зоны дефекта. В качестве контроля использованы аутологичные сфероиды из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.Autologous spheroids from the periosteum obtained according to the present invention were placed in the defects of the critical dimensions of the radius of rats and rabbits until they completely covered the zone of the defect. Autologous spheroids from multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells were used as a control.

Через 8 месяцев при гистологическом исследовании регенерата обнаружена полноценная костная ткань, причем произошла реканализация регенерата с формированием костномозговой полости. В контроле регенерация кости – замещение дефекта костной тканью отсутствовало. After 8 months, histological examination of the regenerate revealed full-fledged bone tissue, and recanalization of the regenerate occurred with the formation of a bone marrow cavity. In the control, there was no bone regeneration - there was no replacement of the defect with bone tissue.

Таким образом, обнаружено, что сфероиды из надкостницы обеспечили восстановление целостности кости, в сравнении с контрольной группой объем регенерировавшей костной ткани был больше, форма кости восстановлена в полном объеме. При этом, используя сфероиды, в частности, с применением геля с индукторами костной регенерации, по изобретению для трансплантации, удалось получить ткань, характеризующуюся высокой степенью васкуляризации. При этом индукторы дифференцировки используется только тогда, когда осуществляется трансплантация сфероидов. То есть, в частных вариантах воплощения изобретения трансплантат содержит сфероиды с гелями-носителями, несущими индукторы дифференцировки, в соотношении объемов, в частности, 1:1, а смешение сфероидов и геля осуществляется непосредственно перед пересадкой. Приживление сфероидов in vivo происходит в локальной среде регенерации.Thus, it was found that spheroids from the periosteum ensured the restoration of the integrity of the bone, in comparison with the control group, the volume of the regenerated bone tissue was greater, the shape of the bone was restored in full. At the same time, using spheroids, in particular, using a gel with inducers of bone regeneration, according to the invention for transplantation, it was possible to obtain tissue characterized by a high degree of vascularization. In this case, differentiation inducers are used only when spheroids are transplanted. That is, in particular embodiments of the invention, the graft contains spheroids with carrier gels carrying differentiation inducers in a volume ratio, in particular 1: 1, and the spheroids and gel are mixed immediately before transplantation. The engraftment of spheroids in vivo occurs in a local regeneration environment.

Пример 3.Example 3.

На животной модели (кролик, крыса) создавался в ходе операции дефект суставной поверхности хряща, захватывающий всю толщину хряща и всю субхондральную кость до губчатой кости диаметром 3 мм. В область дефекта трансплантировались сфероиды, полученные способом по изобретению, причем трансплантат также содержал гиалуроновую кислоту с индукторами хондрогенеза. На 5 суток накладывалась иммобилизирующая повязка. Через 8 месяцев на месте дефекта кости и хряща образовывалась губчатая кость с кортикальной пластинкой и гиалиново-фиброзный регенерат суставного хряща, с восстановлением конгруэнтности суставной поверхности. В контрольной группе – оставался дефект кости и суставной поверхности. При этом, индукторы дифференцировки используется только тогда, когда осуществляется трансплантация сфероидов. То есть, в частных вариантах воплощения изобретения трансплантат содержит сфероиды с гелями-носителями, несущими индукторы дифференцировки, в соотношении объемов, в частности, 1:1, а смешение сфероидов и геля осуществляется непосредственно перед пересадкой. Приживление сфероидов in vivo происходит в локальной среде регенерации.On an animal model (rabbit, rat), a defect in the articular surface of the cartilage was created during the operation, covering the entire thickness of the cartilage and the entire subchondral bone up to the cancellous bone with a diameter of 3 mm. In the area of the defect, spheroids obtained by the method according to the invention were transplanted, and the graft also contained hyaluronic acid with inducers of chondrogenesis. An immobilizing bandage was applied for 5 days. After 8 months, at the site of the bone and cartilage defect, spongy bone with a cortical plate and hyaline-fibrous regenerate of the articular cartilage were formed, with the restoration of the congruence of the articular surface. In the control group, a defect in the bone and articular surface remained. Moreover, differentiation inducers are used only when spheroids are transplanted. That is, in particular embodiments of the invention, the graft contains spheroids with carrier gels carrying differentiation inducers in a volume ratio, in particular 1: 1, and the spheroids and gel are mixed immediately before transplantation. The engraftment of spheroids in vivo occurs in a local regeneration environment.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are provided for the purpose of illustrating the present invention only and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. It should be understood that various modifications are possible without departing from the spirit of the present invention.

Claims

1. A method of obtaining a transplant based on cell spheroids for the restoration of skeletal connective tissues of a subject based on autologous cells of the subject's periosteum, comprising the following steps:

a) isolation of cells from the cambial layer of the periosteum of the subject;

b) culturing the cells isolated at stage a) in an adhesive culture in a nutrient culture medium without differentiation inducers;

c) transferring the cells obtained in step b) into agarose wells;

d) fusion of cells into cellular spheroids.

2. The method of claim 1, wherein the subject is a human.

3. The method of claim 1, wherein the periosteum is the periosteum of the subject's own costal cartilage and / or the shin bone.

4. The method of claim 1, wherein the spheroids are 200-450 microns in size.

5. The method according to claim 1, wherein the culture medium is a medium with fetal calf serum or thrombolysate for cell culture.

6. The method of claim 1, wherein the skeletal connective tissue is bone and / or articular cartilage.

7. The method according to claim 1, wherein the culturing of the cells in step b) is carried out for 20-30 days.

8. The method according to claim 1, in which the transfer of cells in stage c) is carried out at the rate of 5000-20000 cells per 1 well of an agarose plate.

9. The method of claim 1, wherein the fusion of cells into cell spheroids is carried out in agarose wells, where the cells remain for up to 7 days.

10. A graft for restoration of skeletal connective tissues of a subject, comprising cell spheroids based on autologous cells of the subject's periosteum and obtained by the method according to claim 1.

11. The graft of claim 10, wherein the subject is a human.

12. A graft according to claim 10, wherein the spheroids are 200-450 microns in size.

13. The graft according to claim 10, which further comprises an alginate gel with osteogenesis inducers or a gel based on hyaluronic acid with chondrogenesis inducers.

14. A graft according to claim 10, wherein the skeletal connective tissue is bone and / or articular cartilage.