RU2718907C1

RU2718907C1 - Biomaterial based on cell-free matrix produced by human mesenchymal stromal cells, method for preparing thereof and method of using thereof to stimulate regenerative processes

Info

Publication number: RU2718907C1
Application number: RU2018143484A
Authority: RU
Inventors: Всеволод Арсеньевич Ткачук; Жанна Алексеевна Акопян; Анастасия Юрьевна Ефименко; Ольга Александровна Григорьева; Павел Игоревич Макаревич; Петр Петрович Нимирицкий; Екатерина Сергеевна Новоселецкая
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-04-15

Abstract

FIELD: chemistry; medicine; biotechnology.SUBSTANCE: group of inventions relates to biochemistry, biomedicine and biotechnology and includes a biomaterial based on a cell-free matrix produced by human mesenchymal stromal cells (MSC), a method for production thereof, as well as methods of stimulating regenerative processes with the help of the obtained biomaterial, namely stimulation of differentiation and maintenance of proliferation and viability of undifferentiated human MSC, which are key participants of regeneration of various tissues after injury.EFFECT: group of inventions can be used to produce medicinal agents and biomaterials for stimulating regeneration of tissues after injury, including for reconstructive surgery, soft tissue repair, in traumatology and orthopaedics.9 cl, 10 dwg, 7 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и может быть использовано для получения биоматериалов для стимуляции регенерации тканей после повреждения, в том числе для реконструктивной хирургии, восстановления мягких тканей, в травматологии и ортопедии.The invention relates to medicine and pharmacology and can be used to obtain biomaterials to stimulate tissue regeneration after damage, including for reconstructive surgery, soft tissue repair, in traumatology and orthopedics.

Уровень техникиState of the art

Из уровня техники известен способ получения децеллюляризированного внеклеточного матрикса (дВКМ), производимого мезенхимными стромальными клетками (МСК) костного мозга человека (US 2014023723 А1). При этом ВКМ получают при культивировании МСК костного мозга с добавлением 50 мг/мл аскорбат-2-фосфата, а децеллюляризацию проводят с помощью 0.5% Triton Х-100 в 20 мМ гидроксиде аммония (NH4OH), после чего скребком собирают дВКМ, стерилизуют в 0.02 N уксусной кислоте и разбивают на частицы ультразвуком. Показано, что полученный дВКМ обладает стимулирующим эффектом в остеогенной дифференцировке. Однако следует отметить, что дВКМ, полученный данным способом, содержит остатки уксусной кислоты, являющиеся потенциально опасным агентом при терапевтическом применении.The prior art method for producing decellularized extracellular matrix (dVKM) produced by mesenchymal stromal cells (MSCs) of human bone marrow (US 2014023723 A1). In this case, ECM is obtained by culturing bone marrow MSCs with the addition of 50 mg / ml ascorbate-2-phosphate, and decellularization is carried out using 0.5% Triton X-100 in 20 mM ammonium hydroxide (NH4OH), after which DCCM is collected with a scraper, sterilized at 0.02 N acetic acid and is broken up into particles by ultrasound. It was shown that the obtained DVKM has a stimulating effect in osteogenic differentiation. However, it should be noted that the DVKM obtained by this method contains acetic acid residues, which are a potentially dangerous agent in therapeutic use.

Также из уровня техники известен способ получения дВКМ, производимого МСК костного мозга человека (CHEN X.D. et al., Extracellular matrix made by bone marrow cells facilitates expansion of marrow-derived mesenchymal progenitor cells and prevents their differentiation into osteoblasts, Journal of bone and mineral research, 2007, T. 22, №. 12 (C. 1944)). При этом дВКМ получают при культивировании МСК костного мозга с добавлением 50 мкМ аскорбиновой кислоты, а децеллюляризацию проводят с помощью 0.5% Triton Х-100 в 20 мМ гидроксиде аммония (NH4OH) в течение 5 минут при 37°С, а также с последующей инкубацией с 100 Е/мл ДНКазы I в течение 1 ч при 37°С. Показано, что полученный дВКМ обладает стимулирующим эффектом образования колоний фибробластов, остеобластов и адипоцитов. Однако для дВКМ, полученного данным способом, не приведены данные об эффективности такого метода децеллюляризации по количеству остаточной ДНК и не проведена оценка иммуногенности полученного материала.Also known from the prior art is a method for producing dVKM produced by human bone marrow MSCs (CHEN XD et al., Extracellular matrix made by bone marrow cells facilitates expansion of marrow-derived mesenchymal progenitor cells and prevents their differentiation into osteoblasts, Journal of bone and mineral research 2007, T. 22, No. 12 (C. 1944)). In this case, dVKM is obtained by culturing bone marrow MSCs with the addition of 50 μM ascorbic acid, and decellularization is carried out using 0.5% Triton X-100 in 20 mM ammonium hydroxide (NH4OH) for 5 minutes at 37 ° C, as well as followed by incubation with 100 U / ml DNase I for 1 h at 37 ° C. It was shown that the obtained DVKM has a stimulating effect of the formation of colonies of fibroblasts, osteoblasts and adipocytes. However, for dVKM obtained by this method, data on the effectiveness of such a method of decellularization by the amount of residual DNA are not given, and the immunogenicity of the obtained material was not evaluated.

Из уровня техники известен способ получения дВКМ, производимого мезенхимными прогениторными клетками, полученных из эмбриональных телец (US 2013230601 А1). При этом децеллюляризацию проводят с помощью гипертонического раствора 50 мМ Tris-Hcl, 1 мМ NaCl, 10 мМ EDTA путем инкубирования в течение ночи, с последующей отмывкой фосфатным буфером (PBS) и обработкой 1% Triton Х-100 в течение 1-2 часов при комнатной температуре, затем повторением отмывок PBS, и затем инкубированием с 1 мг/мл ДНКазой I в течение 1 часа при 37°С. Показано, что полученный дВКМ обладает стимулирующим эффектом в регенерации. Однако следует отметить, что дВКМ, полученный данным способом, включает стадию получения и использования эмбриональных или индуцированных плюрипотентных клеток, использование которых связано с риском нежелательных онкогенных эффектов, которые для указанного метода не отслеживали.The prior art method for producing dVKM produced by mesenchymal progenitor cells obtained from embryonic bodies (US 2013230601 A1). In this case, the decellularization is carried out using a hypertonic solution of 50 mm Tris-Hcl, 1 mm NaCl, 10 mm EDTA by incubation overnight, followed by washing with phosphate buffer (PBS) and treatment with 1% Triton X-100 for 1-2 hours at room temperature, then by repeated washing with PBS, and then incubation with 1 mg / ml DNase I for 1 hour at 37 ° C. It was shown that the obtained DCM has a stimulating effect in regeneration. However, it should be noted that dVKM obtained by this method includes the stage of obtaining and using embryonic or induced pluripotent cells, the use of which is associated with the risk of undesirable oncogenic effects that were not monitored for this method.

Из уровня техники известен способ получения дВКМ, производимого МСК пуповины человека (CN 104800891 А). При этом ВКМ получают при культивировании МСК с добавлением 100-200 мкМ аскорбиновой кислоты, а децеллюляризацию проводят с помощью 0.5-5% Triton Х-100 в 10-40 мМ гидроксиде аммония (NH4OH). Показано, что полученный дВКМ обладает антиоксидантным эффектом, который возможно применить в регенеративной медицине. Однако, следует отметить, что в экспериментальных данных данного документа не показано, что дВКМ, полученный данным способом, имеет стимулирующий эффект на какую-либо дифференцировку клеток человека.The prior art method for producing dVKM produced by MSCs of the human umbilical cord (CN 104800891 A). In this case, VKM is obtained by culturing MSCs with the addition of 100-200 μM ascorbic acid, and decellularization is carried out using 0.5-5% Triton X-100 in 10-40 mm ammonium hydroxide (NH4OH). It is shown that the obtained DVKM has an antioxidant effect, which can be used in regenerative medicine. However, it should be noted that the experimental data of this document did not show that the DCM obtained by this method has a stimulating effect on any differentiation of human cells.

В указанных выше изобретениях для получения дВКМ использованы МСК костного мозга, МСК, дифференцированных из эмбриональных телец или плюрипотентных клеток, а также МСК пуповины. Однако более предпочтительным источником с точки зрения доступности получения в достаточном для производства дВКМ количестве является жировая ткань. Кроме того, МСК жировой ткани обладают более выраженными паракринными эффектами, в частности, в отношении стимуляции роста кровеносных сосудов и нервов по сравнению, например, с МСК костного мозга, что определяет преимущества их использования для получения дВКМ для стимуляции регенеративных процессов.In the above inventions, bone marrow MSCs, MSCs differentiated from embryonic bodies or pluripotent cells, as well as umbilical cord MSCs were used to obtain dVKM. However, adipose tissue is a more preferable source from the point of view of the availability of production in sufficient quantities for the production of DVKM. In addition, adipose tissue MSCs have more pronounced paracrine effects, in particular, with respect to stimulating the growth of blood vessels and nerves, as compared with, for example, bone marrow MSCs, which determines the advantages of using them to obtain DCM for stimulating regenerative processes.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ децеллюляризации клеточных пластов МСК жировой ткани человека (НИМИРИЦКИЙ П.П. и др., Клеточные пласты из мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека и получение препаратов внеклеточного матрикса методом децеллюляризации, Технологии живых систем, 2016, Т. 13, №. 6 (С. 4-13)). Указанный способ децеллюляризации клеточных пластов МСК человека предполагает получение препаратов ВКМ и включает следующие стадии: 1) добавление к части пластам аскорбиновой кислоты в концентрации 50 мкг/мл, 2) предварительное снятие клеточного пласта с промывкой фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с рН=7,4, и инкубацией в растворе Версена либо в 0,025% растворе Трипсина/ЭДТА, с последующей промывкой ФСБ, 3) обработку пласта различными детергентами, 4) инкубирование образцов с ДНКазой I в концентрации 20 ЕД на лунку непосредственно в лунках культурального планшета в течение 12 часов при 37°С в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl рН=7,4, 2,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ CaCl₂. Однако в описании данного изобретения не раскрыта морфология полученного дВКМ на микроуровне и таким образом не подтверждено сохранение и наличие в полученном дВКМ матриксных внеклеточных везикул, не проведена адекватная оценка эффективности децеллюляризации по уровню остаточной ДНК, не представлены способы применения полученного материала, в том числе для стимуляции регенеративных процессов. Таким образом, в описанном изобретении не представлено данных, подтверждающих наличие фармакологических свойств дВКМ.Closest to the claimed solution is a method of decellularization of cell layers of MSCs of human adipose tissue (NIMIRITSKI P.P. et al., Cellular layers of mesenchymal stromal cells of human adipose tissue and the preparation of extracellular matrix by the method of decellularization, Living Systems Technologies, 2016, T. 13 , No. 6 (S. 4-13)). The indicated method for the decellularization of human MSC cell layers involves preparation of VKM preparations and includes the following stages: 1) adding ascorbic acid to a part of the layers at a concentration of 50 μg / ml, 2) preliminary removal of the cell layer with washing with phosphate-buffered saline (FSB) with pH = 7 , 4, and incubation in Versen's solution or in a 0.025% Trypsin / EDTA solution, followed by washing with FSB, 3) treatment of the formation with various detergents, 4) incubation of samples with DNase I at a concentration of 20 PIECES per well directly in the culture wells tablet for 12 hours at 37 ° C in a buffer containing 10 mm Tris-HCl pH = 7.4, 2.5 mm MgCl ₂ , 0.5 mm CaCl ₂ . However, the description of the present invention does not disclose the morphology of the obtained DCMC at the micro level and thus does not confirm the preservation and presence of matrix extracellular vesicles in the obtained DCMC, does not adequately assess the effectiveness of decellularization by the level of residual DNA, does not present methods of using the obtained material, including for stimulation regenerative processes. Thus, the described invention does not provide data confirming the presence of pharmacological properties of DCM.

Раскрытие изобретенияDisclosure of Invention

Технической проблемой является создание биоматериала для стимуляции регенерации поврежденных тканей, обладающего комплексным воздействием на различные этапы раневого процесса.The technical problem is the creation of biomaterial to stimulate the regeneration of damaged tissues, which has a complex effect on the various stages of the wound process.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение биоматериала, эффективно стимулирующего регенерацию тканей за счет формирования сбалансированного микроокружения на основе различных биологически активных молекул и белков ВКМ, секретируемого мезенхимными стволовыми/стромальными клетками (МСК) человека в клеточном пласте, не содержащей ксеногенных компонентов. Эффективность средства обеспечивается за счет подобранного способа/протокола децеллюляризации клеточного пласта, обеспечивающего эффективную децеллюляризацию и низкие иммуногенные свойства биоматериала и одновременно сохранение ВКМ и его ключевых компонентов, необходимых для реализации регенеративного действия МСК, наличие которых изучают с помощью иммуногистохимического анализа, а также сканирующей электронной микроскопией (СЭМ), а именно фибриллярного коллагена I типа, гликопротеинов - ламинина и фибронектина, а также матриксных внеклеточных везикул.The technical result to which the claimed invention is directed is to obtain a biomaterial that effectively stimulates tissue regeneration by forming a balanced microenvironment based on various biologically active molecules and VKM proteins secreted by human mesenchymal stem / stromal cells (MSCs) in a xenogenic cell layer components. The effectiveness of the drug is ensured by the selected method / protocol for the decellularization of the cell layer, which ensures effective decellularization and low immunogenic properties of the biomaterial and at the same time preserves the ECM and its key components necessary for the regenerative action of MSCs, the presence of which is studied using immunohistochemical analysis, as well as scanning electron microscopy (SEM), namely type I fibrillar collagen, glycoproteins - laminin and fibronectin, as well as matrix x extracellular vesicles.

Поставленная задача решается тем, что способ получения биоматериала для регенерации тканей включает культивирование мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ) человека в течение двух недель для формирования клеточного пласта, содержащего ВКМ, отбор среды культивирования, эффективное удаление из клеточного пласта клеток с помощью децеллюляризации разными типами детергентов, отмывку от остатков клеток и детергента раствором Хенкса, инкубацию дВКМ с ДНКазой I типа и отмывкой раствором Хенкса для получения биоматериала, содержащего компоненты ВКМ МСК человека, включающие коллаген I типа, фибронектин, ламинин и матриксные везикулы, определяемые методом иммуногистохимии и СЭМ. При этом МСК ЖТ наращивают и культивируют до получения клеточного пласта в специфической среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимных клеток человека (AdvanceSTEM Cell Culture Media, содержащей 9-11 об. % добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement, HyClone, USA), но для получения ВКМ клеточный пласт кратковременно (3-10 мин) децеллюляризируют, после чего тщательно отмывают от компонентов среды, остатков клеток и детергента раствором Хэнкса (фирмы ПанЭко или аналогичным), и помещают в раствор рекомбинантной ДНКазы I человека, лишенный ксеногенных продуктов, а именно среду роста, в качестве последней используют DMEM с низким содержанием глюкозы (Gibco, USA) или другую базальную среду роста, либо буфер, содержащий ионы кальция, магния или марганца, для поддержания ферментативной активности ДНКазы I, с последующей отмывкой раствором Хенкса.The problem is solved in that the method of producing biomaterial for tissue regeneration involves cultivating human mesenchymal stromal adipose tissue (adipose tissue MSCs) for two weeks to form a cell layer containing VKM, selecting a culture medium, and effectively removing cells from the cell layer using decellularization of different types of detergents, washing from cell and detergent residues with Hanks solution, incubating dKKM with type I DNase and washing with Hanks solution to obtain biomaterial, content aschego components VCR human MSCs, including collagen type I, fibronectin, laminin and matrix vesicles determined by immunohistochemistry and SEM. At the same time, adrenal MSCs are expanded and cultured to obtain a cell layer in a specific medium that supports the growth of undifferentiated human mesenchymal cells (AdvanceSTEM Cell Culture Media containing 9-11 vol.% AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement, HyClone, USA), but to obtain ECM, the cell layer is briefly (3-10 min) decellularized, then thoroughly washed from the components of the medium, cell debris and detergent with a Hanks solution (PanEco or similar), and placed in a recombinant human DNase I solution devoid of xenogenic of products, namely, growth medium, DMEM with a low glucose content (Gibco, USA) or another basal growth medium, or a buffer containing calcium, magnesium, or manganese ions, is used as the latter to maintain the enzymatic activity of DNase I, followed by washing with Hanks solution .

Культивирование МСК ЖТ может быть осуществлено в культуральных планшетах, флаконах, чашках Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке с плотностью 50-60*10³см² в среде роста в объеме 0,1-0,2 мл/см² в условиях CO₂ инкубатора при 37±1°С, 5%-ом содержании СО₂ и относительной влажности ≥95% в течение 3-14±1 дней. Удаление среды культивирования и последующая децеллюляризация может быть реализована с помощью растворов ионных и цвиттер-ионных детергентов (Дезоксихолат натрия и 3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний-]-1-пропансульфонат (CHAPS), соответственно) в фосфатном буфере рН=7,4, например, при температуре 25±2°С в течение 3-10 минут. Отмывку дВКМ от компонентов среды культивирования, остатков клеток (клеточного дебриса) и детергента осуществляют 2-5 раз посредством раствора Хенкса, при этом для получения стерильного продукта осуществляют микрофильтрацию используемых растворов через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Далее, проводят инкубирование в растворе ДНКазы I в базальной среде или среде для культивирования без сыворотки, или буфере, содержащем ионы кальция, магния или марганца, при 37°С в течение 30-120 минут. После чего, проводят отмывку раствором Хенкса 2-3 раза.Cultivation of MSCs of VT can be carried out in culture plates, vials, Petri dishes (Corning or the like), while the cells are grown on a flat substrate with a density of 50-60 * 10 ³ cm ² in a growth medium in a volume of 0.1-0.2 ml / cm ² under the conditions of a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° С, 5% content of СО ₂ and relative humidity ≥95% for 3-14 ± 1 days. The removal of the culture medium and subsequent decellularization can be realized using solutions of ionic and zwitterionic detergents (sodium deoxycholate and 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonium -] - 1-propanesulfonate (CHAPS), respectively) in phosphate buffer pH = 7, 4, for example, at a temperature of 25 ± 2 ° C for 3-10 minutes. The washing of dVKM from the components of the culture medium, cell debris (cell debris) and detergent is carried out 2-5 times using Hanks solution, while microfiltration of the solutions used is carried out through filters with a pore diameter of 0.22 μm to obtain a sterile product. Next, incubation is carried out in a solution of DNase I in basal or serum-free culture medium, or in a buffer containing calcium, magnesium or manganese ions, at 37 ° C for 30-120 minutes. After that, they are washed with Hanks solution 2-3 times.

Таким образом, технический результат достигается за счет того, что биоматериал для регенерации тканей получают с помощью децеллюляризации клеточных пластов МСК человека в растворах, лишенных животных компонентов, с потенциально безопасным для клинического применения составом, обеспечивающих эффективную децеллюляризацию и сохранение ВКМ, содержащего биологически активные факторы, секретируемые клетками вокруг себя и удерживающиеся в структуре ВКМ, отмывке дВКМ с помощью раствора Хенкса, удаление остаточной ДНК из дВКМ, с последующей отмывкой. Полученный биоматериал в стерильном физиологическом растворе можно использовать отдельно или как компонент других материалов тканевой инженерии при комбинировании с биосовместимыми носителями для стимуляции регенерации тканей после повреждения.Thus, the technical result is achieved due to the fact that the biomaterial for tissue regeneration is obtained by the decellularization of the cell layers of human MSCs in solutions devoid of animal components, with a potentially safe composition for clinical use, which ensure effective decellularization and preservation of ECM containing biologically active factors, secreted by the cells around them and retained in the structure of the ECM, washing dVKM with Hanks solution, removing residual DNA from dVKM, followed by by washing. The obtained biomaterial in sterile physiological saline can be used separately or as a component of other tissue engineering materials when combined with biocompatible carriers to stimulate tissue regeneration after damage.

Эффективность разрабатываемого биоматериала предполагает наличие целого комплекса воздействий, направленных на стимулирование пролиферации и миграции специализированных клеток, участвующих в процессах репарации и регенерации, таких как эндотелиальные клетки, фибробласты и др., регуляцию процессов воспаления и, наконец, восстановление клеточного состава в месте повреждения с помощью дифференцировки стволовых и прогениторных клеток. При этом необходимость восстановления микроокружения и клеточного состава в зоне регенерации поврежденной ткани является актуальной задачей. Использование биоматериала на основе бесклеточного матрикса, производимого МСК человека, позволит обеспечить комплексное решение проблем, возникающих при регенерации тканей после повреждения. Предполагается, что ускоренное заживление различных повреждений, в том числе за счет стимуляции дифференцировки, может быть осуществлено с помощью ВКМ, содержащего комбинацию биологически активных компонентов, секретированных МСК человека. Данное решение позволяет получить оптимальный бесклеточный биоматериал, содержащий различные биологически активные компоненты, секретированные клетками человека - т.е. прошедшие необходимые модификации и способствующие дифференцировке стволовых и прогениторных клеток, ангиогенезу и нейрогенезу. При этом биоматериал по данному изобретению не содержит ксеногенных и бактериальных фрагментов, а также обеспечивает сбалансированный эффект секретируемых клетками продуктов за счет воссоздания утраченного микроокружения клеток.The effectiveness of the developed biomaterial implies the presence of a whole complex of effects aimed at stimulating the proliferation and migration of specialized cells involved in the repair and regeneration processes, such as endothelial cells, fibroblasts, etc., regulation of inflammation and, finally, restoration of the cellular composition at the site of damage using differentiation of stem and progenitor cells. In this case, the need to restore the microenvironment and cellular composition in the regeneration zone of damaged tissue is an urgent task. The use of biomaterial based on the cell-free matrix produced by human MSCs will provide a comprehensive solution to the problems that arise during tissue regeneration after damage. It is assumed that accelerated healing of various injuries, including due to the stimulation of differentiation, can be carried out using VKM containing a combination of biologically active components secreted by human MSCs. This solution allows to obtain an optimal cell-free biomaterial containing various biologically active components secreted by human cells - i.e. past necessary modifications and contributing to the differentiation of stem and progenitor cells, angiogenesis and neurogenesis. Moreover, the biomaterial according to this invention does not contain xenogenic and bacterial fragments, and also provides a balanced effect of products secreted by the cells due to the restoration of the lost microenvironment of cells.

Для получения клеточных пластов нами использованы МСК человека, отвечающие за репарацию и регенерацию тканей и органов как в норме, так и при повреждениях. Одним из наиболее богатых источников МСК у человека является жировая ткань. МСК могут быть легко выделены в результате ферментативной обработки образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Культивирование изолированных МСК жировой ткани приводит к получению относительно гомогенной популяции мультипотентных стромальных фибробластоподобных клеток.To obtain cell layers, we used human MSCs, which are responsible for the repair and regeneration of tissues and organs both in normal and in case of damage. One of the richest sources of MSCs in humans is adipose tissue. MSCs can be easily isolated as a result of enzymatic treatment of adipose tissue samples obtained as a result of cosmetic liposuction or during surgical removal of body fat. The cultivation of isolated MSCs of adipose tissue results in a relatively homogeneous population of multipotent stromal fibroblast-like cells.

В заявляемом изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному из уровня техники способу (см. Пример 1), так и в виде коммерческих препаратов МСК, имеющих сертификат качества и предназначенных, в том числе, для клинического применения, например, такие как продукт АТСС (АТСС^® PCS-500-011), представляющий собой МСК человека, выделенные из липоаспирата, культивированные до 2 пассажа и подвергнутые криоконсервации, или аналогичные.In the claimed invention can be used MSCs obtained independently by any method known from the prior art (see Example 1), and in the form of commercial preparations of MSCs with a quality certificate and intended, including, for clinical use, for example, such as ATCC product (ATCC ^® PCS-500-011), which is a human MSC isolated from lipoaspirate, cultured up to 2 passages and subjected to cryopreservation, or similar.

Ранее нами был подробно изучен состав секретома МСК жировой ткани человека и показано, что ключевыми группами секретируемых этими клетками белков являются компоненты ВКМ и факторы, участвующие в стимуляции ангиогенеза и нейрогенеза. Кроме того, мы показали, что в секретоме МСК содержатся внеклеточные везикулы, которые опосредуют многие регенеративные эффекты этих клеток.Earlier, we studied in detail the composition of the secretion of MSCs in human adipose tissue and showed that the key groups of proteins secreted by these cells are VKM components and factors involved in the stimulation of angiogenesis and neurogenesis. In addition, we showed that the secretion of MSCs contains extracellular vesicles that mediate many of the regenerative effects of these cells.

Для реализации данного изобретения используется специализированная среда, поддерживающая рост и функциональные свойства недифференцированных МСК человека и их культивирование в виде клеточных пластов для повышенной продукции компонентов ВКМ: AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) с добавлением раствора антибиотиков Penicillin-Streptomycin (HyClone, USA) и добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), которые берут при следующем соотношении компонентов, об. %:To implement this invention, a specialized medium is used that supports the growth and functional properties of undifferentiated human MSCs and their cultivation in the form of cell layers for increased production of VKM components: AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) with the addition of Penicillin-Streptomycin antibiotic solution (HyClone, USA) and additives to the growth medium AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), which are taken in the following ratio of components, vol. %:

AdvanceSTEM Cell Culture Media - 89-91;AdvanceSTEM Cell Culture Media - 89-91;

Раствор антибиотиков Penicillin-Streptomycin - 0,95-1,05;Penicillin-Streptomycin antibiotic solution - 0.95-1.05;

Добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement - 9,5-10,5.AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement - 9.5-10.5.

МСК выделяют из подкожной жировой ткани человека и культивируют в приготовленной по указанной выше схеме среде роста до 4-5 пассажа. Также возможно использование линейных иммортализованных МСК.MSCs are isolated from the subcutaneous adipose tissue of a person and cultivated in a growth medium prepared according to the above scheme up to 4-5 passage. It is also possible to use linear immortalized MSCs.

Отличительной особенностью изобретения является непосредственная и кратковременная децеллюляризация клеточных пластов из МСК после удаления культуральной среды, что дополнительно может способствовать эффективному удалению потенциально токсичных и иммуногенных компонентов биоматериала, а также обеспечивать сохранение биологически активных компонентов ВКМ, включающих, по меньшей мере, белки внеклеточного матрикса и матриксные внеклеточные везикулы. Помимо прочего, использование для отмывки наиболее физиологичного раствора Хенкса способствует дополнительному сохранению нативных конформаций биологически активных компонентов в составе ВКМ. Кроме того, отличительной особенностью данного изобретения является использование рекомбинатной человеческой ДНКазы I, что дополнительно позволяет исключить наличие ксеногенных продуктов в составе полученного по данному изобретению биоматериала.A distinctive feature of the invention is the direct and short-term decellularization of cell layers from MSCs after removal of the culture medium, which can further contribute to the effective removal of potentially toxic and immunogenic components of the biomaterial, as well as to ensure the preservation of biologically active components of ECM, including at least extracellular matrix and matrix proteins extracellular vesicles. Among other things, the use of the most physiological Hanks solution for washing helps to further preserve the native conformations of biologically active components in the composition of VKM. In addition, a distinctive feature of this invention is the use of recombinant human DNase I, which further eliminates the presence of xenogenic products in the composition obtained according to this invention biomaterial.

Отличительной технической особенностью изобретения является возможность его использования для поддержания пролиферации и выживаемости МСК человека, а также стимуляции дифференцировки этих клеток в адипогенном и остеогенном направлениях при культивировании на полученном в результате реализации изобретения биоматериале.A distinctive technical feature of the invention is the possibility of its use to maintain the proliferation and survival of human MSCs, as well as to stimulate the differentiation of these cells in the adipogenic and osteogenic directions during cultivation on the resulting biomaterial.

В результате осуществления данного изобретения получают биоматериал на основе бесклеточного матрикса, производимого МСК человека, который может быть использован как лекарственное средство (препарат) или биоматериал для стимуляции регенерации тканей.As a result of the implementation of this invention receive biomaterial based on cell-free matrix produced by human MSC, which can be used as a medicine (preparation) or biomaterial to stimulate tissue regeneration.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Изобретение поясняется чертежами, где на фигурах представлены:The invention is illustrated by drawings, where the figures show:

Фигура 1. Примеры полученных биоматериалов: клеточный пласт (Фиг. 1А, 1С) и биоматериалы на основе бесклеточного матрикса МСК жировой ткани человека (Фиг. 1В, 1D, 1Е).Figure 1. Examples of the obtained biomaterials: cell layer (Fig. 1A, 1C) and biomaterials based on the cell-free matrix of MSCs of human adipose tissue (Fig. 1B, 1D, 1E).

Фигура 2. Диаграмма, отражающая эффективность индукции апоптоза с помощью ротенона в суспезии клеток (Фиг. 2С) и в клеточном пласте (Фиг. 2D). Данные проточной цитометрии суспензии клеток, предварительно обработанной ротеноном, меченной с помощью Аннексина V (Рис. 2А) и 7-AAD (Рис. 2 В). Эффективность апоптоза в клеточных пластах с использованием ротенона показана на диаграмме (Рис. 2D).Figure 2. Diagram showing the effectiveness of the induction of apoptosis using rotenone in a suspension of cells (Fig. 2C) and in the cell reservoir (Fig. 2D). Flow cytometry data of a cell suspension pretreated with rotenone labeled with Annexin V (Fig. 2A) and 7-AAD (Fig. 2 B). The effectiveness of apoptosis in cell layers using rotenone is shown in the diagram (Fig. 2D).

Фигура 3. Эффективность децеллюляризации была оценена по мечению DAPI (Фиг. 3А, 3В) и по остаточной ДНК, представленной на диаграмме в процентах от исходного содержания ДНК в клеточном пласте (см. Фиг. 3С). Использование всех протоколов позволило эффективно удалить ДНК (80-90 процентов эффективности). При этом при децеллюляризации дезоксихолатом натрия эффективность удаления ДНК была лучше, но стоит отметить, что количество остаточного матрикса в биоматериале было меньше (Фиг. 1D).Figure 3. The efficiency of decellularization was evaluated by DAPI labeling (Fig. 3A, 3B) and the residual DNA shown in the diagram as a percentage of the initial DNA content in the cell layer (see Fig. 3C). The use of all protocols allowed the effective removal of DNA (80-90 percent efficiency). Moreover, during decellularization with sodium deoxycholate, the DNA removal efficiency was better, but it is worth noting that the amount of residual matrix in the biomaterial was less (Fig. 1D).

Фигура 4. На фотографиях показано сохранение во всех образцах полученного биоматериала белков ВКМ, а именно коллагена I типа, фибронектина, ламинина, что было оценено с помощью иммуногистохимического анализа.Figure 4. The photographs show the preservation in all samples of the obtained biomaterial proteins VKM, namely type I collagen, fibronectin, laminin, which was evaluated using immunohistochemical analysis.

Фигура 5. Микроструктура полученных биоматериалов. При децеллюляризации клеточного пласта с помощью дезоксихолата натрия ВКМ был существенно разрушен и имел сетчатую структуру (Фиг. 1D, 5С). При децеллюляризации с помощью CHAPS ВКМ сохранялся лучше (Фиг. 5B, 5G). Предварительная инкубация клеточных пластов с ротеноном также влияла на сохранение остатков клеток.Figure 5. The microstructure of the obtained biomaterials. During cell formation decellularization with sodium deoxycholate, VKM was significantly destroyed and had a mesh structure (Fig. 1D, 5C). With decellularization using CHAPS, the VKM was better preserved (Fig. 5B, 5G). Pre-incubation of cell layers with rotenone also influenced the conservation of cell debris.

Фигура 6. Микроструктура биоматериалов с разным временем обработки клеточных пластов детергентом CHAPS (от 3 до 10 минут). В результате обработки CHAPS в течение 3 минут наблюдали высокую эффективность децеллюляризации (Фиг. 3) и получили плотный объемный массив сохраненного ВКМ с отдельно выделяющимися везикулярными структурами, или матриксными везикулами (Фиг. 6А, 6С)Figure 6. The microstructure of biomaterials with different processing times of cell layers with CHAPS detergent (from 3 to 10 minutes). As a result of the CHAPS treatment, a high decellularization efficiency was observed for 3 minutes (Fig. 3) and a dense volume array of stored ECM with separately distinguished vesicular structures or matrix vesicles was obtained (Fig. 6A, 6C)

Фигура 7. Репрезентативные микрофотографии, отражающие результаты прижизненного анализа в системе Incucyte. Показано, что МСК адгезируют на поверхности образцов дВКМ и пролиферируют в течение всего срока эксперимента. На диаграмме (Фиг. 7С) представлены результаты количественной оценки пролиферации с использованием МТТ-теста, демонстрирующие различия в поддержании пролиферации клеток между образцами. Так, клетки больше пролиферировали на биоматериале, полученном с помощью обработки клеточных пластов CHAPS с ДНКазой I.Figure 7. Representative microphotographs reflecting the results of intravital analysis in the Incucyte system. It was shown that MSCs adhere to the surface of dVKM samples and proliferate over the entire duration of the experiment. The diagram (Fig. 7C) shows the results of quantification of proliferation using the MTT test, showing differences in maintaining cell proliferation between samples. So, the cells proliferated more on the biomaterial obtained by treating the cell layers of CHAPS with DNase I.

Фигура 8. Профайл цитокинов, продуцируемых клетками промоноцитарной линии человека (ТНР-1) после культивирования на пластике и на дВКМ. На диаграмме представлены уровни секреции IL-6 (Фиг. 8А) и МСР-1 (Фиг. 8В) моноцитами/макрофагами человека, в том числе под воздействием форболового эфира (РМА), измеренные с помощью иммуноферментного анализа.Figure 8. Profile of cytokines produced by cells of the human promonocytic line (THP-1) after cultivation on plastic and on DCM. The diagram shows the levels of secretion of IL-6 (Fig. 8A) and MCP-1 (Fig. 8B) by human monocytes / macrophages, including under the influence of phorbol ester (PMA), measured by enzyme-linked immunosorbent assay.

Фигура 9. Результаты теста на колониеобразование (CFU-теста) после 14 дней культивирования показали, что МСК ЖТ образуют колонии на пластике и на биоматериале. При этом площадь образованных колоний была значительно больше при культивировании МСК на дВКМ.Figure 9. The results of the colony formation test (CFU test) after 14 days of cultivation showed that VT MSCs form colonies on plastic and on biomaterial. At the same time, the area of the formed colonies was significantly larger during the cultivation of MSCs on the DCM.

Фигура 10. Для оценки влияния полученного биоматериала на дифференцировку в остеогенном и адипогенном направлениях иммортализованные МСК и первично выделенные МСК жировой ткани культивировали в течение 10-ти дней на пластике или на дВКМ в индукционных средах роста. дВКМ значительно ускорял остеогенную дифференцировку клеток по сравнению с дифференцировкой клеток на пластике. Наибольшая разница проявлялась на 10-й день, когда для клеток, культивируемых на пластике, наблюдали только первые признаки дифференцировки, в то время как клетки, культивированные на дВКМ, почти полностью дифференцировались в остеогенном направлении. Адипогенная дифференцировка первичных МСК была так же более выраженной при культивировании клеток на дВКМ по сравнению с пластиком.Figure 10. To assess the effect of the obtained biomaterial on differentiation in the osteogenic and adipogenic directions, immortalized MSCs and primarily isolated MSCs of adipose tissue were cultured for 10 days on plastic or on DVCM in induction growth media. DVKM significantly accelerated the osteogenic differentiation of cells compared with the differentiation of cells on plastic. The greatest difference was manifested on the 10th day, when for cells cultured on plastic, only the first signs of differentiation were observed, while cells cultured on dKKM almost completely differentiated in the osteogenic direction. Adipogenic differentiation of primary MSCs was also more pronounced when cells were cultured on DCM as compared to plastic.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Ниже представлено подробное описание изобретения на примерах конкретного выполнения, которые демонстрируют практическую осуществимость изобретения, но не ограничивают возможность осуществления изобретения с помощью иных средств и методов.Below is a detailed description of the invention by examples of specific performance, which demonstrate the practical feasibility of the invention, but do not limit the possibility of carrying out the invention using other means and methods.

Пример 1. Культивирование МСК жировой ткани человека.Example 1. The cultivation of MSC in human adipose tissue.

МСК выделяют из подкожного жирового отложения здоровых доноров обоих полов. Клетки выделяют из материала, полученного при проведении малого хирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций. Хирургический материал (15 г жировой ткани, взятой из околопупочной области или другой области локализации подкожного жира) помещают в одноразовую пробирку с буфером HBSS (HyClone) содержащим 5-ти кратную концентрацию антибиотика 500 ед/мл (HyClone).MSCs are isolated from subcutaneous fat deposits of healthy donors of both sexes. Cells are isolated from material obtained during minor surgery under local anesthesia or during routine surgical operations. Surgical material (15 g of adipose tissue taken from the umbilical region or another area of localization of subcutaneous fat) is placed in a single-use tube with HBSS buffer (HyClone) containing a 5-fold antibiotic concentration of 500 units / ml (HyClone).

В стерильных условиях культурального бокса биоптат фрагментируют до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергают его ферментативной обработке в растворе, содержащем среду AdvanceSTEM™ (HyClone) /500 ед/мл антибиотика (HyClone), 200 ед/мл коллагеназы I типа и диспазы (40 ед/ml) (Worthington Biochemical) (соотношение объема ферментов и жира должно быть 1:1:1), при 37°С в течение 30-45 минут при постоянном помешивании. По окончании инкубации к образцу добавляют равный объем среды с сывороткой и фильтруют через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD). Профильтрованную суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 200 g, после чего супернатант полностью удаляют. Осадок клеток подвергают обработке буфером для лизиса эритроцитов (BD) до покраснения раствора, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 200 g. Супернатант полностью удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в среде роста МСК. Для культивирования мезенхимных клеток используют среду AdvanceSTEM™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) в сочетании с добавлением 10 об. % раствора добавок AdvanceSTEM™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) и 100 ед/мл антибиотика (HyClone). Эта среда была разработана фирмой-производителем (HyClone) для культивирования недифференцированных МСК, в частности клеток, происходящих из жировой ткани, без добавления сыворотки (http://www.thermo.com).Under sterile conditions of the culture box, the biopsy is fragmented to a homogeneous mass using sterile instruments, and then subjected to enzymatic treatment in a solution containing AdvanceSTEM ™ medium (HyClone) / 500 u / ml antibiotic (HyClone), 200 u / ml type I collagenase and dispase (40 units / ml) (Worthington Biochemical) (the ratio of the volume of enzymes and fat should be 1: 1: 1), at 37 ° C for 30-45 minutes with constant stirring. At the end of the incubation, an equal volume of serum medium is added to the sample and filtered through nylon membranes with a pore size of 100 μm (BD). The filtered suspension is centrifuged for 5 min at 200 g, after which the supernatant is completely removed. The cell pellet is subjected to treatment with erythrocyte lysis buffer (BD) until the solution is reddened, and then centrifuged for 5 min at 200 g. The supernatant is completely removed, and the precipitated cells are resuspended in MSC growth medium. AdvanceSTEM ™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) in combination with the addition of 10 vol. % AdvanceSTEM ™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) and 100 units / ml antibiotic (HyClone). This medium was developed by the manufacturer (HyClone) for the cultivation of undifferentiated MSCs, in particular cells derived from adipose tissue, without the addition of serum (http://www.thermo.com).

Линию иммортализованных мезенхимных стромальных клеток (МСК), выделенных из жировой ткани человека (ASC52telo, АТСС®) использовали для сборки клеточных пластов и получения ВКМ. МСК культивировали в среде роста AdvanceSTEM™ (HyClone, USA) с добавлением 10 об. % Mesenchymal Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), 1 об. % раствора антибиотика/антимикотика (HyClone, USA), 1 об. % GlutaMAX-1 (Gibco, USA) в атмосфере 5% CO2 при 37°C.A line of immortalized mesenchymal stromal cells (MSCs) isolated from human adipose tissue (ASC52telo, ATCC®) was used to assemble cell layers and obtain ECM. MSCs were cultured in AdvanceSTEM ™ growth medium (HyClone, USA) with the addition of 10 vol. % Mesenchymal Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), 1 vol. % solution of antibiotic / antimycotic (HyClone, USA), 1 vol. % GlutaMAX-1 (Gibco, USA) in an atmosphere of 5% CO2 at 37 ° C.

Для получения ВКМ из клеточных пластов МСК высаживали на культуральный пластик в количестве 50,000 клеток/мл и культивировали в течение 14-ти дней.To obtain VKM from cell layers, MSCs were planted on a culture plastic in an amount of 50,000 cells / ml and cultured for 14 days.

Пример 2. Получение биоматериала на основе бесклеточного матрикса, производимого МСК жировой ткани человека.Example 2. Obtaining biomaterial based on cell-free matrix produced by MSCs of human adipose tissue.

Для получения ВКМ или бесклеточного матрикса из клеточных пластов МСК удаляли среду для культивирования. Затем клеточные пласты были обработаны одним из детергентов: 0,5-1 масс. % 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) (Sigma, Germany), 0,1-0,5 масс. % дезоксихолат натрия (Sigma, Germany), растворенные в фосфатном буфере (PBS) (Панэко, Россия) в количестве 250-300 мкл на 1 кв.см, клеточного пласта в течение разных временных интервалов (от 3 до 10 минут) при комнатной температуре, после чего промывали 2-5 раз стерильным раствором Хенкса (HBSS) (Панэко, Россия), и инкубировали с ДНКазой I (50 Е/мл, SciStore, Россия) в количестве 125-150 мкл раствора на 1 кв.см, клеточного пласта в течение 30-120 мин при 37°С. Все представленные концентрации использованных реагентов и сроки инкубации были исследованы в пограничных и средних значениях указанных интервалов, для которых была показана их сравнимая эффектность для получения дВКМ. Кроме того, в качестве нового подхода к децеллюляризации в протокол был включен индуктор апоптоза - ротенон. За 24 часа до обработки детергентами к некоторым образцам добавляли 500 нМ ротенона (Sigma, Germany) в среду культивирования из расчета 250-300 мкл раствора в среде на 1 кв. см, клеточного пласта и затем проводили децеллюляризацию, как описано выше. Для подготовки полученного биоматериала к культивированию клеток дВКМ промывали 2-3 раза стерильным раствором Хенкса (HBSS) (Панэко, Россия).To obtain VKM or cell-free matrix from the cell layers of MSCs, the culture medium was removed. Then the cell layers were treated with one of the detergents: 0.5-1 mass. % 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) (Sigma, Germany), 0.1-0.5 wt. % sodium deoxycholate (Sigma, Germany), dissolved in phosphate buffer (PBS) (Paneko, Russia) in an amount of 250-300 μl per 1 cm2, cell layer for different time intervals (from 3 to 10 minutes) at room temperature and then washed 2-5 times with Hanks sterile solution (HBSS) (Paneko, Russia), and incubated with DNase I (50 U / ml, SciStore, Russia) in an amount of 125-150 μl of solution per 1 cm2 of cell layer for 30-120 minutes at 37 ° C. All the presented concentrations of the reagents used and the incubation time were studied at the borderline and average values of the indicated intervals, for which they were shown to be comparable in their effectiveness for obtaining dVKM. In addition, an apoptosis inducer, rotenone, was included in the protocol as a new approach to decellularization. 24 hours before the detergent treatment, 500 nM rotenone (Sigma, Germany) was added to some samples to the culture medium at the rate of 250-300 μl of the solution in the medium per 1 sq. M. cm, the cell layer and then decellularization was performed as described above. To prepare the obtained biomaterial for cell cultivation, the DCMCs were washed 2-3 times with Hanks sterile solution (HBSS) (Paneko, Russia).

Влияние индуктора апоптоза на клетки в суспензии исследовали на проточном цитометре с помощью мечения клеток в состоянии апоптоза посредством Annexin V (Invitrogen, США) и мертвых клеток посредством 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)(BioLegend, США), а также в составе клеточного пласта исследовали с помощью оценки количества аденозин трифосфата с использованием ATPlite 1 step kit (PerkinElmer, США).The effect of the apoptosis inducer on the cells in suspension was studied on a flow cytometer by labeling cells in the state of apoptosis with Annexin V (Invitrogen, USA) and dead cells with 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) (BioLegend, USA), as well as in the composition of the cell the formation was investigated by assessing the amount of adenosine triphosphate using the ATPlite 1 step kit (PerkinElmer, USA).

Так как не предполагается снятие перед децеллюляризацией клеточного пласта с поверхности культуральной емкости и обработка его дополнительными агентами, после децеллюляризации его можно снять с поверхности подручными инструментами (пинцет, или пластиковый носик, или пластиковый стерильный скребок) и нанести на фармацевтически приемлемый носитель. Полученный биоматериал возможно высушить при 25±2°С или с использованием лиофильной сушки и использовать как покрытие для культивирования клеток, сохранив биологически активные вещества. Хранение необходимо осуществлять при -80±2°С с предварительной регидратацией перед последующим использованием.Since it is not intended to remove the cell layer from the surface of the culture reservoir before decellularization and treat it with additional agents, after decellularization it can be removed from the surface with improvised tools (tweezers, or a plastic nose, or a plastic sterile scraper) and applied to a pharmaceutically acceptable carrier. The obtained biomaterial can be dried at 25 ± 2 ° C or using freeze drying and used as a coating for cell culture, preserving biologically active substances. Storage must be carried out at -80 ± 2 ° C with pre-rehydration before subsequent use.

Пример 3. Оценка эффективности децеллюляризации полученного биоматериала на основе бесклеточного матрикса, производимого МСК жировой ткани человека.Example 3. Evaluation of the effectiveness of decellularization of the obtained biomaterial based on the cell-free matrix produced by MSCs of human adipose tissue.

Эффективность децеллюляризации оценивали по количеству остаточной ДНК, которую измеряли с помощью набора PicoGreen assay kit (Life Technologies, USA) согласно инструкции производителя. Образцы дВКМ лизировали в 500 мкл тризола в течение 10 мин при комнатной температуре. Лизаты разводили в 50 раз раствором буфера ТЕ. 100 мкл лизата помещали в 96-ти луночный планшет со 100 мкл красителя PicoGreen. Планшет инкубировали в темноте в течение 10 минут и затем измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре The 2104 EnVision® Multilabel Plate Readers (PerkinElmer, США).The efficiency of decellularization was evaluated by the amount of residual DNA, which was measured using a PicoGreen assay kit (Life Technologies, USA) according to the manufacturer's instructions. DVCM samples were lysed in 500 μl of trizole for 10 min at room temperature. Lysates were diluted 50 times with TE buffer solution. 100 μl of the lysate was placed in a 96-well plate with 100 μl of PicoGreen dye. The plate was incubated in the dark for 10 minutes and then absorbance was measured on a The 2104 EnVision® Multilabel Plate Readers plate spectrophotometer (PerkinElmer, USA).

Пример 4. Изучение морфологии и биологически активных компонентов полученного биоматериала.Example 4. The study of the morphology and biologically active components of the obtained biomaterial.

Для подготовки к исследованию методом сканирующей электронной микроскопии (далее - СЭМ) образцы дВКМ фиксировали в 10 об. % нейтральном формалине, после чего отмывали в дистиллированной воде и обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, смеси спирт-ацетон и далее чистом ацетоне. Далее использовали метод сушки в критической точке с помощью аппарата Quorum K350 (Quorum gala instrument gmbh, Германия). Подготовленные таким образом образцы монтировали на специальный алюминиевый столик токопроводящим углеродным клеем, напыляли золотом или платино-паладиевым сплавом в напылительной установке Quorum Q150TS (Quorum gala instrument gmbh, Германия) и просматривали в сканирующем электронном микроскопе S 3400N (Hitachi, Япония).To prepare for the study by scanning electron microscopy (hereinafter - SEM), dVKM samples were fixed at 10 vol. % neutral formalin, then washed in distilled water and dehydrated in alcohols of an ascending concentration, a mixture of alcohol-acetone and then pure acetone. Next, the drying method at the critical point was used using the Quorum K350 apparatus (Quorum gala instrument gmbh, Germany). The samples prepared in this way were mounted on a special aluminum table with conductive carbon glue, sprayed with gold or a platinum-paladium alloy in a Quorum Q150TS spraying device (Quorum gala instrument gmbh, Germany) and examined with a S 3400N scanning electron microscope (Hitachi, Japan).

Сохранение белков ВКМ исследовали с помощью иммуногистохимического анализа с применением антител против коллагена I типа, фибронектина и ламинина. дВКМ фиксировали в 4 масс. % параформальдегиде (Panreac, Испания) в течение 30 мин, затем инкубировали в 0,2 об. % растворе Triton X100 (Sigma, США) в течение 10 мин. Далее для блокировки неспецифического связывания антител образцы дВКМ инкубировали в растворе, содержащем 1 масс. % бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, Germany) и 10 об. % нормальной сыворотки козла (Abcam, Великобритания) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем, образцы инкубировали с первичными поликлональными антителами кролика к коллагену I типа, фибронектину и ламинину (Abcam, Великобритания) в растворе с 1 масс. % БСА при +4°С в течение ночи. В качестве вторых антител использовали флуоресцентно меченые антитела козла против IgG кролика (Invitrogen, США). Ядра клеток метили DAPI (DAKO, США). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM6000B, оборудованного камерой Leica DFC 360FX camera (Leica Microsystems GmbH, Германия).Conservation of VKM proteins was investigated using immunohistochemical analysis using antibodies against type I collagen, fibronectin and laminin. dVKM recorded in 4 mass. % paraformaldehyde (Panreac, Spain) for 30 min, then incubated in 0.2 vol. % solution of Triton X100 (Sigma, USA) for 10 min. Further, to block nonspecific binding of antibodies, dVKM samples were incubated in a solution containing 1 mass. % bovine serum albumin (BSA) (Sigma, Germany) and 10 vol. % normal goat serum (Abcam, UK) for 1 h at room temperature. Then, the samples were incubated with rabbit primary polyclonal antibodies to type I collagen, fibronectin and laminin (Abcam, UK) in a solution with 1 mass. % BSA at + 4 ° C during the night. Fluorescently labeled goat anti-rabbit IgG antibodies were used as second antibodies (Invitrogen, USA). Cell nuclei were labeled with DAPI (DAKO, USA). The preparations were analyzed using a Leica DM6000B fluorescence microscope equipped with a Leica DFC 360FX camera (Leica Microsystems GmbH, Germany).

Пример 5. Изучение иммуногенности и влияния полученного биоматериала на дифференцировку моноцитов в макрофаги.Example 5. The study of the immunogenicity and the effect of the obtained biomaterial on the differentiation of monocytes into macrophages.

Линию промоноцитарных клеток человека (ТНР-1) культивировали в среде RPMI1640 (Gibco, USA) с добавлением 10 об. % эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco, USA), 1 об. % раствора антибиотика/антимикотика (HyClone, USA), 1 об .% GlutaMAX-1 (Gibco, USA), 1 об. % HEPES (Gibco, USA) и 0,0001 об. % β-меркаптоэтанола (Sigma, USA) в атмосфере 5% CO2 при 37°С.The human promonocytic cell line (THP-1) was cultured in RPMI1640 medium (Gibco, USA) with the addition of 10 vol. % fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA), 1 vol. % solution of antibiotic / antimycotic (HyClone, USA), 1 vol.% GlutaMAX-1 (Gibco, USA), 1 vol. % HEPES (Gibco, USA) and 0.0001 vol. % β-mercaptoethanol (Sigma, USA) in an atmosphere of 5% CO2 at 37 ° C.

Для оценки иммуногенности оценивали способность дВКМ влиять на спонтанную и индуцированную дифференцировку макрофагов. Для этого промоноциты линии ТНР-1 в количестве 500,000 клеток/мл добавляли в 12-ти луночный планшет на пластик или дВКМ. В качестве индуктора макрофагальной дифференцировки добавляли форболовый эфир (форбол-12-миристат-13-ацетат, ФМА, FMA) (Sigma, США) в концентрации 50 нг/мл. Культивировали клетки в течение 7 суток, после чего собирали кондиционированную среду, центрифугировали ее при 300 g 10 минут. В супернатанте анализировали концентрацию IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, МСР-1 с помощью наборов для иммуноферментного анализа (R&D, США), согласно инструкции производителя. Оптическую плотность образцов измеряли на длинах волн 450 нм и 525 нм на планшетном спектрофотометре The 2104 EnVision® Multilabel Plate Readers (PerkinElmer, США).To assess the immunogenicity, the ability of dVKM to influence spontaneous and induced macrophage differentiation was evaluated. For this, THP-1 line promonocytes in the amount of 500,000 cells / ml were added to a 12-well plate on plastic or DCM. Forbol ether (phorbol-12-myristate-13-acetate, FMA, FMA) (Sigma, USA) was added as an inducer of macrophage differentiation (Sigma, USA) at a concentration of 50 ng / ml. Cells were cultured for 7 days, after which the conditioned medium was collected, centrifuged at 300 g for 10 minutes. The concentration of IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, MCP-1 was analyzed in the supernatant using enzyme-linked immunosorbent assay kits (R&D, USA), according to the manufacturer's instructions. The optical density of the samples was measured at wavelengths of 450 nm and 525 nm on a The 2104 EnVision® Multilabel Plate Readers flatbed spectrophotometer (PerkinElmer, USA).

Пример 6. Определение эффективности стимуляции пролиферации и образования колоний МСК человека при культивировании на биоматериале на основе дВКМ.Example 6. Determining the effectiveness of stimulating the proliferation and colony formation of human MSCs when cultured on biomaterial based on DCM.

МСК ЖТ человека были высажены в 12-ти луночный планшет, покрытый дВКМ, в количестве 15000/мл. Затем планшеты помещали в систему IncuCyte® ZOOM Live Cell Analysis System (Essen Bioscience, США) и осуществляли цейтраферную съемку каждые 4 часа в течение 4-х дней.MSCs of human gastrointestinal tract were plated in a 12-well plate coated with dVKM in the amount of 15000 / ml. Then the tablets were placed in the IncuCyte® ZOOM Live Cell Analysis System (Essen Bioscience, USA) and time-lapse recording was performed every 4 hours for 4 days.

Для оценки пролиферации МСК ЖТ человека высаживали на культуральный пластик, покрытый дВКМ, в количестве 15000/мл, и культивировали в течение 4-х дней. Пролиферацию оценивали методом МТТ (Paneco, Russia) на 1 и 4 день. Показания считывали на планшетном спектрофотометре The 2104 EnVision® Multilabel Plate Readers (PerkinElmer, США).To assess the proliferation of MSCs, human VTs were planted on culture plastic coated with dVKM in an amount of 15000 / ml and cultured for 4 days. Proliferation was evaluated by the MTT method (Paneco, Russia) on days 1 and 4. The readings were read on a The 2104 EnVision® Multilabel Plate Readers plate spectrophotometer (PerkinElmer, USA).

Для определения свойства дВКМ поддерживать образование колоний проводили CFU-тест. МСК высаживали на 6-ти луночный планшет, покрытый дВКМ, в количестве 70 клеток/мл. Клетки культивировали в течение 2-х недель, затем фиксировали раствором 4 масс. % параформальдегида и окрашивали кристаллическим фиолетовым (Sigma, USA) в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего оценивали число и средний размер колоний в каждой лунке.To determine the ability of dVKM to maintain colony formation, a CFU test was performed. MSCs were plated on a 6 well plate coated with dVKM in an amount of 70 cells / ml. Cells were cultured for 2 weeks, then fixed with a solution of 4 mass. % paraformaldehyde and stained with crystal violet (Sigma, USA) for 30 min at room temperature, after which the number and average colony size in each well were estimated.

С учетом полученных результатов биоматериал может быть использован для поддержания пролиферации и выживаемости стволовых и прогениторных клеток при введении в поврежденные ткани. Полученные при культивировании на дВКМ клетки могут быть использованы по отдельности (после открепления от биоматериала) или вместе с биоматериалом для клеточной терапии с целью стимуляции эндогенной регенерации тканей после повреждения.Based on the results obtained, the biomaterial can be used to maintain the proliferation and survival of stem and progenitor cells when introduced into damaged tissues. The cells obtained by culturing on a DCMC can be used individually (after detachment from the biomaterial) or together with the biomaterial for cell therapy in order to stimulate endogenous tissue regeneration after damage.

Пример 7. Оценка влияния биоматериала на основе дВКМ на дифференцировку МСК человека в остеогенном и адипогенном направленияхExample 7. Evaluation of the effect of biomaterial based on DVKM on the differentiation of human MSCs in osteogenic and adipogenic directions

Дифференцировку МСК ЖТ человека в остеогенном и адипогенном направлении i проводили с использованием наборов StemPro™ Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco, США) и StemPro™ Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco, США), соответственно, согласно инструкциям производителя.Differentiation of human MSCs of human gastrointestinal tract in the osteogenic and adipogenic direction i was performed using the StemPro ™ Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco, USA) and the StemPro ™ Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco, USA), respectively, according to the manufacturer's instructions.

Первичные или линейные МСК были высажены в 12-ти луночные планшеты, покрытые дВКМ, или на пластик в количестве 15,000 клеток/мл, культивированы в течение 48 ч в полной среде роста. Через 48 ч среда была сменена на дифференцировочную, смена среды на свежую производилась каждые 3 дня. Клетки культивировали в течение 10 дней, после чего образцы фиксировали раствором 4 масс. % параформальдегида в течение 30 мин. Для качественной оценки дифференцировки окрашивали клетки раствором ализаринового красного из набора The Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis Kit (Chemicon, США) для остеогенной дифференцировки и раствором Oil Red О из набора Mesenchymal Stem Cell Adipogenesis Kit (Chemicon, США) для адипогенной дифференцировки, согласно инструкциям производителя.Primary or linear MSCs were plated in 12-well plates coated with DCM or on plastic in an amount of 15,000 cells / ml, cultured for 48 h in a complete growth medium. After 48 h, the medium was changed to differentiating, the medium was changed to fresh every 3 days. Cells were cultured for 10 days, after which the samples were fixed with a solution of 4 mass. % paraformaldehyde for 30 minutes For a qualitative assessment of differentiation, cells were stained with alizarin red solution from The Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis Kit (Chemicon, USA) for osteogenic differentiation and Oil Red O solution from Mesenchymal Stem Cell Adipogenesis Kit (Chemicon, USA) for adipogenic differentiation, according to the manufacturer's instructions.

С учетом полученных результатов биоматериал может быть использован для стимуляции остеогенеза или адипогенеза в соответствующих тканях. Полученные при культивировании и индукции дифференцировки в нужном направлении на дВКМ клетки могут быть использованы по отдельности (после открепления от биоматериала) или вместе с биоматериалом для замещения утраченных при повреждении участков костной или жировой тканей.Based on the results obtained, the biomaterial can be used to stimulate osteogenesis or adipogenesis in the corresponding tissues. Cells obtained by cultivation and induction of differentiation in the desired direction on dVKM can be used individually (after detachment from the biomaterial) or together with the biomaterial to replace the bone or adipose tissue sites lost due to damage.

Claims

1. Biomaterial based on acellular matrix produced by human mesenchymal stromal cells (MSCs) for stimulating regenerative processes, characterized in that it includes structural extracellular matrix proteins (ECM), type I and IV collagen, fibronectin and laminin, as well as anchored in dVKM extracellular vesicles ranging in size from 0.5 to 5 microns, containing not more than 10-18% residual DNA compared to the cell layer and not possessing immunogenic properties.

2. A method of obtaining a biomaterial according to claim 1, comprising the following stages:

a) seeding and cultivation of human MSCs using a nutrient medium until the formation of the cell layer and the accumulation of extracellular matrix (ECM) produced by cells;

b) the removal of the nutrient medium and the decellularization of the cell layer by processing it for 3-10 minutes with a detergent selected from the group comprising 0.1-0.5 mass. % sodium deoxycholate, 0.5-1% of the mass. % 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonium -] - 1-propanesulfonate (CHAPS), in the amount of 250-300 μl of solution per 1 square. cm cell stratum;

c) washing the decellularized VKM (dVKM) with Hanks solution 2-5 times, and incubating with DNase I 50 U / ml in an amount of 125-150 μl of the solution per 1 sq. cm of the cell layer for 30-120 minutes, followed by washing with a Hanks dVKM solution to obtain biomaterial based on a cell-free matrix.

3. The method according to p. 2, characterized in that before the decellularization obtained in stage a), the cell layer is further incubated using a growth medium containing an apoptosis inducer.

4. The method according to p. 3, characterized in that the apoptosis inducer is selected from the group of electron transfer blockers in the respiratory chain of mitochondria.

5. The method according to p. 3, characterized in that as an inducer of apoptosis used rotenone 500 nm in an amount of 250-300 μl of solution per 1 square. cm cell layer.

6. A method of stimulating regenerative processes using the biomaterial according to claim 1, obtained by the method according to claim 2, by replacing the areas of human bone or adipose tissue lost due to damage, characterized in that it includes the following stages: a) plating MSC cells on the biomaterial according to p. 1 in a nutrient medium and building up until the cells form a monolayer, b) replacing the nutrient medium with an induction medium for differentiation, where the induction medium for differentiation is selected from the group comprising an environment for osteogenic or adipogenic differentiation, c) cultivation for 5-21 days, d) introduction into the damaged area of the obtained biomaterial with or without cells detached from the biomaterial.

7. The method according to claim 6, characterized in that an osteogenic growth medium containing at least dexamethasone 10 ^-8 M, β-glycerol-2-phosphate 10 mM, 2-phospho-L is selected as an induction medium for differentiation Ascorbic acid 0.2 mM.

8. The method according to p. 6, characterized in that an adipogenic growth medium containing at least dexamethasone 10 ^-6 M, insulin 10 μM, indomethacin 200 μM, 3-isobutyl-1-methylxanthine is selected as the induction medium for differentiation 0.5 mM.

9. A method of stimulating the regenerative processes of tissues after damage by increasing the proliferation and viability of human stem and progenitor cells using the biomaterial according to claim 1, obtained by the method according to claim 2, characterized in that it involves plating the human MSCs on the biomaterial according to claim 1 in nutrient medium followed by cultivation for 1-7 days, followed by the use of expanded cells separately after detachment from the biomaterial or together with the biomaterial to stimulate endogenous regeneration ation tissues after injury.