RU2697273C1 - Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы - Google Patents
Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2697273C1 RU2697273C1 RU2019105063A RU2019105063A RU2697273C1 RU 2697273 C1 RU2697273 C1 RU 2697273C1 RU 2019105063 A RU2019105063 A RU 2019105063A RU 2019105063 A RU2019105063 A RU 2019105063A RU 2697273 C1 RU2697273 C1 RU 2697273C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- fsh
- rhfsh
- human
- follicle
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 title abstract description 29
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 title abstract description 29
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 title abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 23
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 235000020939 nutritional additive Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 97
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 21
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 11
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- 108010006578 follitropin alfa Proteins 0.000 description 9
- 229940057854 gonal f Drugs 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 7
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 6
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 101000862396 Homo sapiens Follicle-stimulating hormone receptor Proteins 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102100027627 Follicle-stimulating hormone receptor Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 108700010903 cytomegalovirus proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000008175 FSH Receptors Human genes 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010000732 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Proteins 0.000 description 2
- 102000002287 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Human genes 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000013262 cAMP assay Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000018343 Follicle stimulating hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001038874 Homo sapiens Glycoprotein hormones alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000035824 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960005210 follitropin alfa Drugs 0.000 description 1
- 108010081934 follitropin beta Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000046113 human FSHR Human genes 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- -1 two weeks later Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (рчФСГ). Сконструированы плазмидные экспрессионные векторы pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta, содержащие кодонно-оптимизированные гены альфа- и бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека соответственно. Указанными векторами трансформируют клетки СНО с получением клеточной линии CHO-FSH 91 - продуцента рчФСГ, которую используют в способе получения рчФСГ. Изобретение позволяет увеличить продукцию ФСГ человека для его использования в медицинских целях. 4 н.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 7 пр.
Description
Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для получения рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона.
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) представляет собой белок, состоящий из двух субъединиц - альфа (содержит 92 аминокислотных остатка) и бета (содержит 111 аминокислотных остатков), которые синтезируются в одной клетке, после чего подвергаются гликозилированию, протеолитическому удалению сигнальных пептидов, объединению в зрелый функционально активный белок и секреции. В ФСГ человека альфа- и бета-субъединица подвергаются N-гликозилированию по остаткам аспарагина в позициях альфа-52, альфа-78, бета-7, бета-24. При этом наблюдаются высокая степень гликозилирования ФСГ (до 35% углеводов в весовом соотношении) и гетерогенность гликозилирования, определяемая широким спектром углеводных структур, которые могут содержать би-, три- и тетра-разветвленные гликаны. Различия в гликозилировании влияют на биологическую активность, молекулярную массу и заряд молекул ФСГ [Mulders J.W. et al. Prediction of the in vivo Biological Activity of Human Recombinant Follicle Stimulating Hormone Using Quantitative Isoelectric Focusing // Biologicals, 1997, 25(3): 269-281; Horsman G. et al. A biological, immunological and physico-chemical comparison of the current clinical batches of the recombinant FSH preparations Gonal-F and Puregon // Hum Reprod., 2000, 15(9): 1898-1902; патенты RU 2502798 и RU 2560596].
ФСГ применяется в медицинской практике для лечения бесплодия и репродуктивных нарушений у пациентов женского и мужского пола.
Рекомбинантный человеческий фолликулостимулирующий гормон (рчФСГ) производят путем культивирования клеток яичников китайского хомячка (СНО), стабильно трансфицированных плазмидными векторами, кодирующими альфа- и бета-субъединицу данного белка. При этом некоторые из известных клеточных линий - продуцентов ФСГ были получены путем трансфекции клеток двумя плазмидными векторами, один из которых кодирует альфа-субъединицу, а другой - бета-субъединицу ФСГ [US 5240832, US 7939296, RU 2502798], другие клеточные линии были получены с помощью трансфекции клеток СНО одним плазмидным вектором, кодирующим как альфа-, так и бета-субъединицу ФСГ (US 2006223144, RU 2537268).
В US 7939296 раскрыто получение клеточной линии на основе клеток СНО-K1, трансфицированных плазмидными векторами, кодирующими альфа- и бета-субъединицу ФСГ. После селекции и адаптации к росту в бессывороточной среде, клетки данной линии за 7 суток суспензионного культивирования достигали плотности 1⋅107 клеток/мл, обеспечивая накопление 8-10 мкг/мл ФСГ человека в кондиционированной среде.
В RU 2502798 раскрыто получение клеточной линии huFSHIK, адаптированной к суспензионному росту к бессывороточной среде, которая обеспечивает накопление рчФСГ в культуральной жидкости в концентрации до 7 мкг/мл, удельная продуктивность клеточной линии составляет 1,5 мкг/106 клеток в день, или 1,5 пг на клетку в день.
В ЕА 022993 раскрыто получение плазмидной ДНК, содержащей оптимизированные последовательности кДНК, кодирующие альфа- и бета-субъединицу ФСГ человека, которую использовали для временной экспрессии рекомбинантного ФСГ человека, что не позволяет производить данный белок в промышленных масштабах.
В RU 2560596 раскрыто получение линии клеток C-P1.3-FSH-G4, продуцирующих рчФСГ человека. Клетки данной линии при суспензионном культивировании в бессывороточной среде обладают удельной продуктивностью более 10 пг ФСГ/клетка/день, что позволяет получать до 36,5 мкг/мл ФСГ в кондиционированной культуральной среде при концентрации клеток 1,55⋅106/мл.
Для удовлетворения растущих потребностей практической медицины в препаратах ФСГ требуется постоянное повышение продуктивности клеточных линий - продуцентов ФСГ человека.
Задачей, на решение которой направлена заявленная группа изобретений, является создание способа получения рекомбинантного человеческого ФСГ с высоким выходом, обеспечивающим содержание в культуральной жидкости не менее 75 мкг/мл рчФСГ.
Поставленная задача решается путем создания пары новых совместимых плазмидных экспрессионных векторов pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta, несущих гены альфа- и бета-субъединицы фолликуло-стимулирующего гормона соответственно, создание стабильной и высокопродуктивной клеточной линии CHO-FSH 91 на их основе и способа ее культивирования. Заявленная клеточная линия при культивировании в условиях, раскрываемых в заявленном способе, продуцирует в культуральную среду не менее 75 мкг/мл рчФСГ.
Технический результат заключается в высокой продуктивности клеточной линии CHO-FSH 91, превышающей продуктивность известных клеточных линий более чем в два раза при культивировании заявленным способом. Заявленная линия стабильно секретирует ФСГ в бессывороточную культуральную среду на протяжении не менее 20 пассажей в неселективных условиях культивирования. Перечисленные свойства делают ее экономически выгодной для широкого применения в биофармацевтическом производстве.
Технический результат достигается тем, что клетки линии CHO-FSH 91, трансфицированные плазмидами pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta, несущими гены альфа- и бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона соответственно, культивируют при следующих условиях. Клетки линии CHO-FSH 91 в концентрации 0,5⋅106-0,7⋅106 кл/мл помещают в среду, содержащую 5% гидролизата растительного белка, и выдерживают при 37°С, 5% CO2 и перемешивании в течение 4-х суток. После этого температуру понижают до 32°С, ежедневно вносят в культуральную среду 3% питательной добавки Cell Boost®7a и 0,3% питательной добавки Cell Boost®7b и выдерживают клетки при 32°С, 5% СО2 и перемешивании, ежедневно проверяя жизнеспособность клеток. Когда доля жизнеспособных клеток в культуре снижается до 85%, клетки удаляют, а культуральную жидкость используют для выделения рчФСГ.
Заявленная клеточная линия CHO-FSH 91 при культивировании в стандартных условиях позволяет получить 6 пг рчФСГ на клетку в сутки. Культивирование при 37°С в присутствии 5% гидролизата растительного белка в течение 4 суток позволяет максимально быстро увеличить клеточную массу. Дальнейшее культивирование при 32°С приводит к снижению темпа роста клеточной культуры, что позволяет увеличить время поддержания культуры клеток, активно продуцирующих целевой белок, и отдалить достижение клеточной культурой стадии отмирания. Добавление в культуральную среду 3% питательной добавки Cell Boost®7a и 0,3% питательной добавки Cell Boost®7b дополнительно приводит к увеличению продуктивности клеток линии CHO-FSH 91. Культивирование клеток заявленной линии до тех пор, пока доля жизнеспособных клеток составляет не менее 85% от общего числа клеток, позволяет повысить качество целевого белка, поскольку с уменьшением жизнеспособности клеток увеличивается гетерогенность синтезируемого ими белка и количество его изоформ. Таким образом, описанная в заявленном способе последовательность операций культивирования клеточной линии CHO-FSH 91, выбранные режимы и вещества, используемые при этом, обеспечивают решение поставленной задачи.
Линия клеток CHO-FSH 91 характеризуется следующими признаками:
Линия клеток яичников китайского хомячка Cricetulus griseus CHO-FSH 91 - продуцент рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека.
Родословная клеточной линии. Родительская клеточная линия СНО К-1, адаптированная к суспензионному росту. Котрансфекция плазмидами pTVK4p-FSHalpha, pTVK4n-FSHbeta с последующим последовательным отбором стабильного высокопродуктивного клона на селективной среде, содержащей антибиотики пуромицин и генетицин (G-418).
Культуральные свойства. Суспензионное культивирование в пробирках, колбах Эрленмейера на орбитальном шейкере с частотой вращения 130-180 об/мин, либо в биореакторе (ферментере), при температуре 37°С и 5% CO2. Посевная доза 0,5⋅106-0,7⋅106 клеток/мл, пересев каждые 3-4 суток. Время удвоения 18-20 часов.
Стандартные условия выращивания. Среда CDM4 СНО (HyClone, США) с добавлением 4 мМ аланилглутамина, 1 г/л сурфактанта Pluronic-F68 (Sigma, США), 2,2 г/л гидрокарбоната натрия, 10 мкг/мл пуромицина, 200 мкг/мл антибиотика G-418, 37°С, 5% CO2.
Характеристика культивирования в организме животного. Культивирование в организме животного не применяется.
Характеристики полезного вещества, продуцируемого линией. Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека. Оценка с помощью иммуноферментного анализа, электрофореза в полиакриламидном геле, капиллярного изоэлектрического фокусирования, биологического теста на клеточной линии CHO-FSHR 11, экспрессирующей рецептор к фолликулостимулирующему гормону человека.
Характеристика биосинтеза полезных продуктов. Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека секретируется в культуральную среду в количестве около 6 пг на клетку в сутки. Стабильность культивирования - не менее 40 пассажей в среде с 10 мкг/мл пуромицина и 200 мкг/мл G-418 и не менее 20 пассажей в среде без селекционного давления.
Способ криоконсервирования. 45% свежей среды CDM4 СНО, 45% кондиционированной среды, 10% DMSO, 3⋅106-5⋅106 клеток/мл, заморозка до -70°С со скоростью 1°С/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта 90% (окраска трипановым синим).
Группа изобретений иллюстрируется следующими графическими материалами:
На Фиг. 1 представлена карта плазмиды pTVK4p-FSHalpha, где:
CMV - промотор предранних белков цитомегаловируса;
FSH alpha - кодонно оптимизированный ген альфа-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека;
TK polyA - сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;
SV40 - промотор ранних белков вируса SV40;
Puro - ген устойчивости к пуромицину;
SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;
pUC ori - точка начала репликации;
b-lactamase - ген бактериального фермента бета-лактамазы;
regulatory element - регуляторный элемент UCOE, усиливающий экспрессию целевого гена.
На Фиг. 2 представлена карта плазмиды pTVK4n-FSHbeta, где:
CMV - промотор предранних белков цитомегаловируса;
FSH beta - кодонно оптимизированный ген бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека;
TK polyA - сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;
SV40 - промотор ранних белков вируса SV40;
Neo - ген устойчивости к неомицину;
SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;
pUC ori - точка начала репликации;
b-lactamase - ген бактериального фермента бета-лактамазы;
regulatory element - регуляторный элемент UCOE, усиливающий экспрессию целевого гена.
На Фиг. 3 представлены клоны, обладающие наибольшей волюметрической продуктивностью, после первого этапа селекции. КЖ - культуральная жидкость, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.
На Фиг. 4 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 37°С, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.
На Фиг. 5 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 32°С, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.
На Фиг. 6 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 32°С с питательными добавками, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.
На Фиг. 7 представлен электрофорез в ПААГ рекомбинантного ФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91, до и после обработки нейраминидазой, восстанавливающие условия.
М - маркеры молекулярного веса, кДа;
ФСГ - необработанный белок;
ФСГ+НА - белок, обработанный нейраминидазой;
НА - нейраминидаза
На Фиг. 8 представлено капиллярное изоэлектрическое фокусирование рчФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91. Указаны значения pI главных изоформ рчФСГ.
На Фиг. 9 представлено сравнение биологической активности рчФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91, и коммерческого препарата рчФСГ «Гонал-Ф».
Группа изобретений поясняется следующими примерами:
Пример 1. Дизайн, синтез и сборка генетических конструкций.
Известные последовательности кДНК, кодирующих альфа- и бета-цепи рекомбинантного ФСГ человека, были проанализированы с помощью программных средств IDT (https://eu.idtdna.com/CodonOpt). В последовательности кДНК альфа-субъединицы ФСГ человека был обнаружен 71 кодон, редко встречающийся в генах китайского хомячка Cricetulus griseus, данные кодоны были заменены на часто встречающиеся в генах китайского хомячка синонимические кодоны, для чего потребовалось заменить 80 нуклеотидов. В кДНК бета-субъединицы было обнаружено 7 кодонов, редко встречающихся в генах китайского хомячка С. griseus, которые также были заменены на синонимические кодоны, часто встречающиеся в генах китайского хомячка. Полученные оптимизированные последовательности кДНК альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека представлены в SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2 соответственно. Оптимизированные последовательности к ДНК альфа- и бета-субъединицы были синтезированы методом автоматизированного химического синтеза, при этом к этим последовательностям были добавлены последовательности Kozak (5'-gccacc-3') перед стартовыми кодонами, а также стоп-кодоны и фланкирующие сайты рестрикции: на 3'-конце кДНК - BglII, на 5'-конце кДНК - NotI.
Полученные фрагменты ДНК были вставлены в предварительно рестрицированные по этим сайтам плазмидные векторы серии pTVK4, которые содержат следующие элементы:
- промотор предранних белков цитомегаловируса (CMV promoter);
- сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК ТК поли(А) (TK polyA);
- гены селекции в эукариотических клетках, транскрипция которых обеспечивается локальными промоторами (ген устойчивости к пуромицину (р) в плазмидном векторе pTVK4p и ген устойчивости к неомицину (n) в плазмидном векторе pTVK4n).
- точку начала репликации pUC ori
- ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину;
- элемент UCOE из генома мыши длиной 2990 нуклеотидов, обеспечивающий повышенную частоту интеграции плазмидного вектора в транскрипционно активные сайты хроматина. Интеграция в транскрипционно активные сайты хроматина, в свою очередь, приводит к высокому уровню продукции и повышенной стабильности продукции целевого белка, кодируемого плазмидным вектором [Betts Z, Dickson A.J. Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOEs) effect on transgene position and expression stability in CHO cells following methotrexate (MTX) amplification. Biotechnol J. 2016; 11(4): 554-641].
В результате были получены плазмидные векторы:
pTVK4p-FSHalpha (Фиг. 1)
pTVK4n-FSHbeta (Фиг. 2)
В этих плазмидных векторах кДНК, кодирующие соответствующие цепи ФСГ человека, находятся между промотором CMV и сайтом терминации транскрипции и полиаденилирования ТК поли(А). Отсутствие ошибок в синтезе генов и сборке плазмидных векторов было подтверждено секвенированием.
Пример 2. Получение высокопродуктивной линии культивируемых клеток - продуцента ФСГ человека
Родительская линия клеток яичников китайского хомячка СНО-К1 была ранее адаптирована к суспензионному росту в бессывороточных средах по описанной методике (Sinacore M.S., Drapeau D., Adamson S.R. Adaptation of mammalian cells to growth in serum-free media. Mol Biotechnol, 2000; 15(3): 249-257). Альтернативно можно использовать коммерчески доступные суспензионные культуры СНО-К1. Клетки культивировали в 50-миллилитровых пробирках в среде CDM4CHO (HyClone, США), содержащей 4 мм аланилглутамина, 1 г/л Pluronic-F68 (Sigma, США), 2,2 г/л бикарбоната натрия (ПанЭко, Россия) при температуре 37°С и 5% CO2. Перемешивание осуществляли с помощью орбитального шейкера с частотой вращения 180 об/мин.
Для трансфекции использовали клетки на третий день культивирования после третьего пассажа с жизнеспособностью не ниже, чем 95%. Клетки подсчитывали в камере Горяева, жизнеспособность культур оценивали по исключению трипанового синего. Клетки центрифугировали при 100 g в течение 1 мин. Супернатант удаляли, клетки ресуспензировали в среде DMEM-F12 (HyClone, США) и переносили в лунки 24-луночного планшета (Corning, США) из расчета 3⋅105 клеток на лунку. Готовили растворы плазмидных векторов pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta в среде DMEM-F12 в концентрации 50 мкг/мл. Для трансфекции клеток в одной лунке в каждую лунку помещали по 10 мкл раствора каждого плазмидного вектора. Трансфекцию осуществляли с помощью реагента Turbofect (Thermo Fisher, США) по инструкции изготовителя.
Через два дня после трансфекции клетки рассевали в плотности 0,7⋅106 кл/мл в среду CDM4CHO (HyClone, США), содержащую 10 мкг/мл пуромицина и 200 мкг/мл генетицина G-418 (селективная среда). В работе использовали антибиотик генетицин (G-418), который является аналогом неомицина, имеет сходный механизм действия и используется для селекции эукариотических клеток, трансфицированных плазмидными экспрессионными векторами, содержащими ген устойчивости к неомицину. Далее клетки адаптировали к селективным условиям, пересевая их каждые три дня. Концентрацию клеток подсчитывали в камере Горяева. Жизнеспособность культур оценивали по исключению красителя трипанового синего. После перевода на селективную среду в течение первых трех пассажей жизнеспособность клеток снизилась до 11,4%, затем начала повышаться и на шестом пассаже достигла 100%. Из полученного стабильного пула клеток, экспрессирующих рчФСГ, отбирали отдельные клоны с использованием метода лимитирующих разведений. Для этого клеточную суспензию в концентрации 5-10 клеток/мл переносили в лунки 96-луночного планшета в объеме 200 мкл в селективной среде, через две недели отбирали образцы культуральной жидкости (КЖ) из тех лунок, в которых было отмечено по одному клону. Через 14 суток было отобрано 12 клонов, концентрацию рчФСГ в культуральной жидкости для каждого клона определяли с помощью набора «Гонадотропин-ИФА ФСГ» (АлкорБио, Россия) (Фиг. 3).
Клоны, обладающие наибольшей продукцией белка, переносили в 48-луночные планшеты, содержащие по 500 мкл селективной среды. На третьи сутки культивирования отбирали образцы культуральной жидкости из каждой лунки и вновь выбирали клоны с наибольшей продукцией белка. Отобранные клоны переносили в 5 мл селективной среды в 50-миллилитровые пробирки и продолжали культивирование. Через 3 суток 4 клона с наибольшей продуктивностью и жизнеспособностью выше 90% переносили в 5 мл питательной среды CDM4CHO, не содержавшей антибиотиков, и культивировали в течение 6 суток, после чего определяли жизнеспособность клеток и продукцию рчФСГ (Таблица 1). На основании полученных результатов был отобран клон 91, названный CHO-FSH 91, обеспечивающий накопление в культуральной жидкости 10,8 мг/л рекомбинантного ФСГ человека на шестые сутки культивирования при концентрации клеток 6,2⋅106 кл/мл и жизнеспособности не менее 94,2%.
Пример 3. Оптимизация способа культивирования клона клеток СНО-FSH 91.
Стабильный клон клеток CHO-FSH 91, полученный в примере 2, использовали для дальнейшей оптимизации процесса культивирования с целью повышения продукции клетками рчФСГ. Клетки культивировали в 50-миллитровых пробирках в среде CDM4CHO без антибиотиков с 5% гидролизата растительного белка CD Hydrolysate Fusion (Sigma, США) при температуре 37°С и скорости вращения шейкера 180 об/мин. Начальная плотность культуры составляла 0,5⋅106-0,7⋅106 кл/мл. Ежедневно, начиная с 4 суток, отбирали аликвоты для оценки концентрации рчФСГ, содержания и жизнеспособности клеток.
Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение девяти суток. За это время концентрация рчФСГ в культуральной жидкости достигала 13 мкг/мл (Фиг. 4). Уменьшение количества клеток после 6 суток культивирования было связано с агрегацией части клеток.
Для увеличения времени культивирования и количества синтезированного белка, начиная с 4 суток, температуру культивирования снижали до 32°С, в результате чего концентрация рчФСГ в культуральной жидкости повысилась и на 12-й день составила 30 мкг/мл (Фиг. 5). Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение 12 суток. Ежедневное, начиная с 4 суток культивирования, внесение питательных добавок (HyClone, США): Cell Boost®7a (3% объема питательной среды) и Cell Boost®7b (0,3% объема питательной среды) позволило достигнуть концентрации рчФСГ в культуральной жидкости на 12-й день культивирования равной 75 мкг/мл (Фиг. 6). Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение 12 суток. Уменьшение количества клеток после 8 суток культивирования было связано с агрегацией части клеток.
Клетки клона CHO-FSH 91, выращенные при температуре 37°С, криоконсервировали и поместили в клеточный банк ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» под названием «Клеточная линия CHO-FSH 91 - продуцент рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека»
Пример 4. Очистка рекомбинантного ФСГ человека
Культивирование клеток линии CHO-FSH 91 при температуре 32°С проводили в 8 колбах объемом 500 мл каждая, содержавших по 100 мл питательной среды, при начальной плотности культуры 0,5⋅106 кл/мл в условиях, описанных в примере 3. После 12 суток культивирования было получено 800 мл культуральной жидкости.
Культуральную жидкость осветляли путем последовательной фильтрации через фильтры с размером пор 0,8 мкм и 0,2 мкм (Sartorius, Германия). Далее рекомбинантный ФСГ человека очищали из осветленной культуральной жидкости следующим образом:
Этап I. Концентрирование и замена буферного раствора методом тангенциальной фильтрации на мембране Sartocon Slice 50, (Sartorius, Германия) с размером пор 10 кДа, материал мембраны Hydrostat. Скорость циркуляции ретентата составила 50 мл/мин, скорость трансмембранного потока составила 4 мл/мин. В результате объем культуральной жидкости уменьшили до 160 мл с заменой буфера на 20 мМ трис-гидрохлорид, рН 7,5.
Этап 2. Анионообменная хроматография на колонке HiPrep 16/10 Q-Sepharose FF 16×100 мм (GE-Healthcare, США), уравновешенной 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5. После промывки колонки связавшийся материал элюировали 100 мл элюирующего буфера (100 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,5). Было получено 40 мл элюата.
Этап 3. Гидрофобная хроматография на колонке HiTrap Phenyl HP (GE-Healthcare, США) объемом 1 мл. Элюат, полученный после проведения этапа 2, смешивали с буфером для разведения (3,6 М аммония сульфат, 20 мМ трис гидрохлорид, рН 7,5) в соотношении 1:1 и наносили на колонку, уравновешенную 1,8 М (NH4)2SO4, 20 мМ трис-HCl, рН 7,5. После нанесения и промывки колонки проводили элюцию линейным градиентом 1,8 М - 0 М (NH4)2SO4 в 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, объем градиента 20 мл. Собирали фракции, элюированные в диапазоне проводимости от 150 до 80 мСм/см. Объем собранных фракций составил 12 мл.
Этап 4. Замена буферного раствора путем гель-фильтрации на колонке BioScale Mini Bio-Gel Р6 (Bio-Rad, США) объемом 50 мл. Колонку уравновешивали 100 мл фосфатного буфера (10 мМ натрия фосфат, рН 6,8) и вносили в нее материал, полученный на этапе 3. Элюировали 10 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6,8. Объем фракций, включающих в себя целевой белок, составил 20 мл.
Этап 5. Хроматография на колонке с гидроксиапатитом. Хроматографию проводили на колонке Foresight СНТ Type I (Bio-Rad, США) объемом 1 мл. Колонку уравновешивали стартовым буфером (20 мМ натрия фосфат, рН 6,8), после чего вносили материал, полученный на этапе 4. Промывали колонку 5 мл стартового буфера и собирали белок, прошедший через колонку при нанесении и промывке с оптической плотностью на длине волны 280 нм более 25 mAU. Объем фракции, содержащей очищенный ФСГ, составил 23 мл.
Этап 6. Диализ. Диализ белка проводили против раствора, содержащего 137 мМ хлорида натрия, 2,7 мМ хлорида калия, 10 мМ гидрофосфата калия, 1,75 мМ дигидрофосфата калия, с рН 7,3 в диализном мешке MFPI CelluSep RC Т2 с пределом отсечения 6-8 кДа. Степень чистоты белка определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Табл. 2). Выход очищенного рчФСГ составил 50,5%. Баланс процесса очистки рчФСГ представлен в Таблице 2.
Пример 5. Обработка нейраминидазой и электрофорез белка в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Полученный в примере 4 белок обрабатывали ферментом нейраминидазой (NEB, США), отщепляющей концевые остатки сиаловой кислоты, по методике производителя. Затем осуществляли электрофорез нативного и обработанного ферментом рчФСГ в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) на установке Mini-PROTEAN II TETRA CELL (Bio-Rad, США). В качестве маркеров молекулярной массы использовали Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific, США). Перед нанесением на гель образцы белка прогревали при температуре 70°С в течение 10 минут в растворе, содержащем 0,05% бромфенолового синего, 2% SDS, 10% глицерина, 0,0625 М трис-HCl (рН 6,8), 400 мМ β-меркаптоэтанола. Электрофорез белков проводили при напряжении 180 V в течение 1 часа. После промывки геля в дистиллированной воде проводили окрашивание раствором Optiblot Blue Gel Stain (Abcam, США) в течение 15 минут. Затем производили трехкратную отмывку геля в дистиллированной воде в течение 10 минут.
На электрофореграмме обнаруживались полосы, соответствующие альфа- и бета-субъединице гетеродимера рчФСГ (Фиг. 7). Увеличение молекулярной массы белка на электрофорезе в ПААГ по сравнению с теоретически рассчитанной связано с наличием гликанов в составе гликопротеина. Гидрофильные гликаны уменьшают гидрофобные взаимодействия между белком и додецилсульфатом натрия (ДСН), препятствуя связыванию белка с ДСН, в результате чего кажущаяся молекулярная масса белка увеличивается [Stoyanov A.V. The proteome revisited: theory and practice of all relevant electrophoretic steps. 2001. Elsevier]. В случае необработанного нейраминидазой рчФСГ молекулярная масса альфа- и бета- субъединиц находилась в диапазоне 32-36 кДа, в случае обработанного нейраминидазой - 28-32 кДа. Такое снижение молекулярной массы субъединиц согласуется с данными о молекулярной массе рчФСГ, полученными в работе Heum K., Kim S.C., Seo K.S., Lee S.H., Kim W.B., Lee K.C. Purification and characterization of recombinant human follicle stimulating hormone produced by Chinese hamster ovary cells // J Microbiol Biotechnol., 2005, 15(2):395-402.
Пример 6. Определение изоэлектрической точки рчФСГ методом капиллярного изоэлектрического фокусирования.
РчФСГ, полученный в примере 4, был сконцентрирован с помощью ультрафильтрационных спин-колонок Amicon Ultra-0.5 («Merck Millipore», Германия) до конечной концентрации 10 мг/мл по инструкции производителя.
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (кИЭФ) проводили в капилляре длиной 45 см и внутренним диаметром 50 мкм, в 3 М мочевине с амфолитами «Pharmalyte 3-10» («GE-Healthare», США), с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105М» («Люмэкс», Россия).
Обработку данных проводили в программе «Эльфоран» («Люмэкс», Россия). Расчет изоэлектрических точек белковых фракций осуществляли по уравнению, полученному методом линейной регрессии по пептидным маркерам с известными значениями pI.
Результаты, представленные на Фиг. 8, показывают, что очищенный рчФСГ состоит из фракций, pI которых располагаются в диапазоне от 3,83 до 5,01, что соответствует диапазону значений pI для изоформ биологически активного рчФСГ [US 7939296; Driebergen R., Baer G. Quantification of follicle stimulating hormone (follitropin alfa): is in vivo bioassay still relevant in the recombinant age? // Curr Med Res Opin., 2003, 19(1):41-46; Mulders J.W., Derksen M., Swolfs A., Maris F. Prediction of the in vivo biological activity of human recombinant follicle stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing // Biologicals, 1997, 25(3):269-281].
Пример 7. Оценка биологической активности рчФСГ, продуцируемого линией культивируемых клеток CHO-FSH 91.
Для определения биологической активности рчФСГ, полученного в примере 4, использовали методику, основанную на определении концентрации циклического АМФ в клетках, экспрессирующих FSHR - рецептор ФСГ (RU 2193599; Minegishi Т., Igarashi S., Nakamura K., Nakamura М., Tano М., Shinozaki Н., Miyamoto K., Ibuki Y. Functional expression of the recombinant human FSH receptor // J Endocrinol., 1994, 141(2): 369-375).
Линия клеток CHO-FSHR 11 была получена трансфекцией клеток линии CHOdhƒr-, дефицитных по гену дегидрофолатредуктазы, вектором, содержащим последовательность FSHR - рецептора фолликулостимулирующего гормона, и отбором наиболее хорошо растущего клона, экспрессирующего FSHR. Альтернативно можно использовать любую клеточную культуру, экспрессирующую рецептор ФСГ. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12 (HyClone, США), содержащей 10% сыворотки (HyClone, США). За день до проведения эксперимента клетки засевали в лунки 24-луночного планшета (Jet Biofil, Китай) в 1 мл ростовой среды в плотности 4⋅105 кл/мл. Через сутки кондиционированную среду в лунках заменяли на 950 мкл среды DMEM/F12 без сыворотки, содержащей 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma, США) в конечной концентрации 0,1 мМ. Планшет инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°С в течение 15 минут, после чего к клеткам добавляли образцы рчФСГ. Активность полученного в примере 4 рчФСГ сравнивали с активностью препарата «Гонал-Ф» (Merck Serono, Италия). Образец рчФСГ, полученного в примере 4, и препарат Гонал-Ф разводили средой DMEM/F12 без сыворотки до концентрации 17 нг/мл, что составляет 0,23 МЕ/мл для препарата Гонал-Ф. Далее готовили 4 последовательных разведения образца рчФСГ и препарата Гонал-Ф с шагом 1:3. Затем полученные разведения вносили в лунки планшета с подготовленными клетками CHO-FSHR 11 по 50 мкл на каждую лунку, после чего проводили инкубацию планшета в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 30 минут. Среду удаляли, промывали лунки планшета фосфатно-солевым буфером и вносили по 200 мкл однократного лизирующего буфера Cell Lysis Buffer 5 из набора Parameter cAMP Assay kit (R&D Systems, США), Концентрацию цАМФ в полученных лизатах определяли с помощью набора Parameter cAMP Assay kit (R&D Systems, США). Затем строили график зависимости концентрации цАМФ в лизатах от концентрации образцов рчФСГ. Результаты, представленные на Фиг. 9, показывают, что препарат Гонал-Ф и рчФСГ, полученный в примере 4, одинаково стимулируют продукцию цАМФ клетками CHO-FSHR 11 в исследованном диапазоне концентрации, при этом 50% повышение уровня цАМФ наступает при одинаковой концентрации рчФСГ и Гонал-Ф, равной 4 нг/мл, что указывает на одинаковую активность сравниваемых препаратов.
Claims (4)
1. Плазмидный экспрессионный вектор pTVK4p-FSHalpha, карта которого приведена на Фиг. 1, содержащий кодонно-оптимизированный ген альфа-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека с последовательностью по SEQ ID No: 1.
2. Плазмидный экспрессионный вектор pTVK4n-FSHbeta, карта которого приведена на Фиг. 2, содержащий кодонно-оптимизированный ген бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека с последовательностью по SEQ ID No: 2.
3. Линия - продуцент рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, представляющая собой линию культивируемых клеток CHO-FSH 91, содержащих векторы по пп. 1 и 2.
4. Способ получения рекомбинантного человеческого ФСГ, включающий в себя культивирование клеток линии - продуцента, отличающийся тем, что клетки линии по п. 3 в концентрации 0,5⋅106-0,7⋅106 кл/мл помещают в культуральную среду, содержащую 5% гидролизата растительного белка, и выдерживают при 37°С, 5% СО2 и перемешивании в течение 4-х суток, после чего температуру культивирования понижают до 32°С и ежедневно внося в культуральную среду 3% питательной добавки Cell Boost®7a и 0,3% питательной добавки Cell Boost®7b, выдерживают клетки при 32°С, 5% CO2 и перемешивании до тех пор, пока жизнеспособность клеток не ниже 85%, после чего клетки удаляют, а культуральную жидкость используют для выделения и очистки рчФСГ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019105063A RU2697273C1 (ru) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019105063A RU2697273C1 (ru) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2697273C1 true RU2697273C1 (ru) | 2019-08-13 |
Family
ID=67640315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019105063A RU2697273C1 (ru) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2697273C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU209043U1 (ru) * | 2021-08-25 | 2022-01-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Астраханский государственный технический университет, ФГБОУ ВО "АГТУ" | Устройство для выделения и очистки нуклеиновых кислот и/или макромолекул из биологического образца |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2502798C2 (ru) * | 2012-02-22 | 2013-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Фармако Биотех" | КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ huFSHIK, СЕКРЕТИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ФСГ |
| RU2560596C2 (ru) * | 2013-09-24 | 2015-08-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АйВиФарма" (ООО "АйВиФарма") | Плазмида для экспрессии в клетках сно рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (фсг) человека, плазмида для экспрессии в клетках сно бета-субъединицы рекомбинантного фсг человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фсг человека и способ получения указанного гормона |
-
2019
- 2019-02-22 RU RU2019105063A patent/RU2697273C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2502798C2 (ru) * | 2012-02-22 | 2013-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Фармако Биотех" | КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ huFSHIK, СЕКРЕТИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ФСГ |
| RU2560596C2 (ru) * | 2013-09-24 | 2015-08-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АйВиФарма" (ООО "АйВиФарма") | Плазмида для экспрессии в клетках сно рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (фсг) человека, плазмида для экспрессии в клетках сно бета-субъединицы рекомбинантного фсг человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фсг человека и способ получения указанного гормона |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KIM D.-J. et al., Highly expressed recombinant human follicle-stimulating hormone from Chinese hamster ovary cells grown in serum-free medium and its effect on induction of folliculogenesis and ovulation, Fertil and Steril., 2010, v.93, n.8, p.2652-2660. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU209043U1 (ru) * | 2021-08-25 | 2022-01-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Астраханский государственный технический университет, ФГБОУ ВО "АГТУ" | Устройство для выделения и очистки нуклеиновых кислот и/или макромолекул из биологического образца |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Howles | Genetic engineering of human FSH (Gonal-F®) | |
| JP5076084B2 (ja) | 組み換えタンパク質の大量生産のための新規ベクターおよび発現細胞株と、これを用いた組み換えタンパク質の生産方法 | |
| RU2495131C2 (ru) | Способ получения рекомбинантного инсулина гларгина | |
| Lee et al. | Increased production of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in plant suspension cultures | |
| JP5432117B2 (ja) | 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ） | |
| KR101229995B1 (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| JP4293908B2 (ja) | 組換えヒトエリスロポエチンのクロマトグラフィー精製 | |
| EP2808341B1 (en) | Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells | |
| US20090029907A1 (en) | Recombinant Method for Production of an Erythropoiesis Stimulating Protein | |
| EP3277807B1 (en) | Eukaryotic expression vectors comprising regulatory elements of the globin gene clusters | |
| RU2697273C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы | |
| EP1141366B1 (en) | Transfectacons comprising calcium phosphate and a nucleic acid | |
| WO2019184372A1 (zh) | 高效表达重组人神经生长因子的基因组合 | |
| RU2555533C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухоли-альфа человека, линия экуариотических клеток-продуцент химерного антитела и способ получения химерного антитела | |
| RU2656142C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-ht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IGA1 | |
| KR100595864B1 (ko) | 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 균주 및 이를 이용한ｌｋ8 단백질의 생산방법 | |
| RU2502798C2 (ru) | КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ huFSHIK, СЕКРЕТИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ФСГ | |
| CN116648258A (zh) | 生产rsv f蛋白的细胞培养方法 | |
| WO1991005052A1 (en) | Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae | |
| KR102680148B1 (ko) | Cho 세포 유래 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 | |
| CN112442504B (zh) | 一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法 | |
| RU2671477C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA2m1F16-ht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IGA2m1 | |
| CN108424459A (zh) | 人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| Joshi et al. | Recombinant protein expression in mammalian cells | |
| RU2664184C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IgA1 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210223 |