CN116648258A

CN116648258A - 生产rsv f蛋白的细胞培养方法

Info

Publication number: CN116648258A
Application number: CN202180078331.5A
Authority: CN
Inventors: S·H·布林; C·A·哈林顿; M·E·雅各布斯; J·A·洛特文; B·C·穆卢库特拉; D·斯特德; M·苏米特
Original assignee: Pfizer Corp SRL
Current assignee: Pfizer Corp SRL
Priority date: 2020-10-02
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2023-08-25
Also published as: IL301624A; US20240016915A1; MX2023003893A; AU2021351946A1; WO2022070129A1; AU2021351946A9; EP4222275A1; AU2021351946B2; JP2022060169A; CA3197481A1

Abstract

本发明涉及在补料分批细胞培养中生产RSV F蛋白三聚体的方法。

Description

生产RSV F蛋白的细胞培养方法

技术领域

背景技术

呼吸道合胞病毒或RSV是一种感染肺部和呼吸道的呼吸道病毒。RSV是全世界婴儿中严重病毒性下呼吸道疾病的主要原因，并且是老年人中呼吸道疾病的重要原因。然而，没有疫苗被批准用于预防RSV感染。

RSV是副粘病毒科的成员。它的基因组由一个单链负义RNA分子组成，该分子编码11种蛋白质，包括九种结构蛋白(三种糖蛋白和六种内部蛋白)和两种非结构蛋白。结构蛋白包括三种跨膜表面糖蛋白：附着蛋白G、融合蛋白F和小的疏水性SH蛋白。RSV有两种亚型，A和B。它们的主要区别在于G糖蛋白，而F糖蛋白的序列在两种亚型之间更为保守。

成熟的F糖蛋白具有三个通用结构域：胞外结构域(ED)、跨膜结构域(TM)和胞质尾(CT)。CT含有单个棕榈酰化半胱氨酸残基。

人RSV的F糖蛋白最初从mRNA翻译为单个574个氨基酸的多肽前体(被称为“F0”或“F0前体”)，其在N末端包含信号肽序列(氨基酸1-25)。翻译后，信号肽被内质网中的信号肽酶去除。F0前体的剩余部分(即残基26-574)可以在两个多碱基位点(a.a.109/110和136/137)被细胞蛋白酶(特别是弗林蛋白酶)进一步切割，去除27个氨基酸的插入序列(命名为pep27)(氨基酸110-136)并产生两个连接的片段(命名为F1(C末端部分；氨基酸137-574)和F2(N末端部分；氨基酸26-109))。F1在其N末端包含一个疏水性融合肽和两个七肽重复区域(HRA和HRB)。HRA靠近融合肽，HRB靠近TM结构域。F1和F2片段通过两个二硫键连接在一起。没有信号肽序列的未切割的F0蛋白或F1-F2异源二聚体均可形成RSV F原聚体。三个这样的原聚体组装形成最终的RSV F蛋白复合物，它是三个原聚体的同源三聚体。

A和B亚型的F蛋白在氨基酸序列上大约90％相同。A亚型的F0前体多肽的示例序列在SEQ ID NO：1(A2毒株；GenBank GI：138251；Swiss Prot P03420)中提供，而B亚型的F0前体多肽的示例序列在SEQ ID NO：2(18537毒株；GenBank GI：138250；Swiss Prot P13843)中提供。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2都是574个氨基酸的序列。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的信号肽序列也被报道为氨基酸1-25(GenBank和UniProt)。在这两个序列中，TM结构域在大约氨基酸530至550，但替代地也有报告为525-548。胞质尾始于氨基酸548或550，终止于氨基酸574，棕榈酰化半胱氨酸残基位于氨基酸550。

针对RSV亚单位疫苗探索的主要抗原之一是F蛋白。RSV F蛋白三聚体介导病毒体膜与宿主细胞膜之间的融合并且还促进合胞体的形成。在与宿主细胞膜融合之前的病毒体中，F分子的最大群体形成棒棒糖形结构，其中TM结构域锚定在病毒包膜中[Dormitzer,P.R.,Grandi,G.,Rappuoli,R.,Nature Reviews Microbiol,10,807,2012.]。这种构象被称为融合前构象。融合前RSV F被单克隆抗体(mAb)D25、AM22和MPE8识别，不区分寡聚状态。融合前F三聚体被mAb AM14特异性识别[Gilman MS,Moin SM,Mas V等人.Characterization of aprefusion-specific antibody that recognizes aquaternary,cleavage-dependent epitope on the RSV fusion glycoprotein.PLoSPathogens,11(7),2015]。在RSV进入细胞期间，F蛋白从融合前状态(在本文中可被称为“pre-F”)通过中间扩展结构重排为融合后状态(“post-F”)。在此重排过程中，融合前分子的C末端卷曲螺旋解离成其三个组成链，其然后缠绕在球状头部周围并连接三个额外的螺旋以形成融合后的六螺旋束。如果融合前RSV F三聚体经受越来越苛刻的化学或物理条件，例如高温，它会发生结构变化。最初，存在三聚体结构的丢失(至少在分子内局部地)，然后重排为融合后形式，然后结构域变性。

为了防止病毒进入，F特异性中和抗体在病毒包膜与细胞膜融合之前可能必须结合病毒体上F的融合前构象，或者可能结合扩展的中间体。因此，F蛋白的融合前形式被认为是所需疫苗抗原的首选构象[Ngwuta,J.O.,Chen,M.,Modjarrad,K.,Joyce,M.G.,Kanekiyo,M.,Kumar,A.,Yassine,H.M.,Moin,S.M.,Killikelly,A.M.,Chuang,G.Y.,Druz,A.,Georgiev,I.S.,Rundlet,E.J.,Sastry,M.,Stewart-Jones,G.B.,Yang.Y.,Zhang,B.,Nason,M.C.,Capella,C.,Peeples,M.,Ledgerwood,J.E.,Mclellan,J.S.,Kwong,P.D.,Graham,B.S.,Science Translat.Med.,14,7,309(2015)]。使用表面活性剂例如Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛基葡糖硫苷、SDS、CHAPS、CHAPSO从膜提取或表达为胞外结构域、物理或化学应激或储存后，F糖蛋白很容易转化为融合后形式[McLellan JS,Chen M,Leung S等人.Structure of RSVfusion glycoprotein trimer bound to a pre-fusion-specific neutralizingantibody.Science 340,1113–1117(2013)；Chaiwatpongsakorn,S.,Epand,R.F.,Collins,P.L.,Epand R.M.,Peeples,M.E.,J Virol.85(8):3968-77(2011)；Yunus,A.S.,JacksonT.P.,Crisafi,K.,Burimski,I.,Kilgore,N.R.,Zoumplis,D.,Allaway,G.P.,Wild,C.T.,Salzwedel,K.Virology.2010Jan 20；396(2):226-37]。因此，融合前F作为疫苗抗原的制备仍然是一个挑战。由于中和和保护性抗体通过干扰病毒进入发挥作用，因此推测仅引发融合后特异性抗体的F抗原预期不如引发融合前特异性抗体的F抗原有效。因此，认为更需要使用包含融合前形式(或可能地扩展的中间体形式)的F蛋白免疫原的F蛋白疫苗。已提供RSV F蛋白的突变体以增加该蛋白融合前形式的稳定性(参见例如PCT申请号WO2017/109629)并且其是有前途的候选疫苗。因此，需要一种方法来生产具有所需三聚体构象并具有合适效价的这些抗原。这种过程也应该足够稳健以用于大规模使用。此外，应最小化宿主细胞蛋白(HCP)或其他杂质的量，以促进所产生的三聚体的下游加工。

发明内容

本发明涉及一种在补料分批细胞培养中产生RSV F蛋白三聚体的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)在细胞培养基中提供包含编码RSV F蛋白的基因的哺乳动物细胞以开始细胞培养，和，

(ii)在约33.0℃和35.0℃之间的温度下培养细胞，以及

(iii)通过响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖来以受限方式向细胞培养物提供葡萄糖。

在一些实施方案中，该方法包括温度变化，其中温度变化为约30.0和约32.0℃之间的较低温度，优选约31.0℃。

附图简要说明

图1A显示了生长温度对亚型A三聚体的HMMS、LMMS和RSV F蛋白的百分比的影响，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

图1B显示了生长温度对亚型B三聚体的HMMS、LMMS和RSV F蛋白的百分比的影响，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

图2A显示了生长温度对亚型A的RSV F蛋白的效价的影响，如通过RP-HPLC测量的。

图2B显示了生长温度对亚型B的RSV F蛋白的效价的影响，如通过RP-HPLC测量的。

图3A显示了生长温度对宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响，如通过酶联免疫测定在从亚型A的RSV F蛋白的生产收获的材料中测量的。

图3B显示了生长温度对宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响，如通过酶联免疫测定在从亚型B的RSV F蛋白的生产收获的材料中测量的。

图4A显示了生长温度对从亚型A的RSV F蛋白的生产收获的材料中三聚体效价(triter)的量的影响。

图4B显示了生长温度对从亚型B的RSV F蛋白的生产收获的材料中三聚体效价的量的影响。

图5A显示了生产温度对亚型A三聚体的HMMS、LMMS和RSV F蛋白的百分比的影响，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

图5B显示了生产温度对亚型B三聚体的HMMS、LMMS和RSV F蛋白的百分比的影响，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

图6A显示了生产温度对亚型A的RSV F蛋白的效价的影响，如通过RP-HPLC测量的。

图6B显示了生产温度对亚型B的RSV F蛋白的效价的影响，如通过RP-HPLC测量的。

图7A显示了生产温度对宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响，如通过酶联免疫测定在从亚型A的RSV F蛋白的生产收获的材料中测量的。

图7B显示了生产温度对宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响，如通过酶联免疫测定在从亚型B的RSV F蛋白的生产收获的材料中测量的。

图8A显示了生产温度对从亚型A的RSV F蛋白的生产收获的材料中三聚体效价的量的影响。

图8B显示了生产温度对从亚型B的RSV F蛋白的生产收获的材料中三聚体效价的量的影响。

图9A显示了温度变化的时机对亚型A三聚体的HMMS、LMMS和RSV F蛋白的百分比的影响，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

图9B显示了温度变化的时机对亚型B三聚体的HMMS、LMMS和RSV F蛋白的百分比的影响，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

图10A显示了温度变化的时机对亚型A的RSV F蛋白的效价的影响，如通过RP-HPLC测量的。

图10B显示了温度变化的时机对亚型B的RSV F蛋白的效价的影响，如通过RP-HPLC测量的。

图11A显示了温度变化的时机对宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响，如通过酶联免疫测定在从亚型A的RSV F蛋白的生产收获的材料中测量的。

图11B显示了温度变化的时机对宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响，如通过酶联免疫测定在从亚型B的RSV F蛋白的生产收获的材料中测量的。

图12A显示了温度变化的时机对从亚型A的RSV F蛋白的生产收获的材料中的三聚体效价的量的影响。

图12B显示了温度变化的时机对从亚型B的RSV F蛋白的生产收获的材料中三聚体效价的量的影响。

图13A显示了温度变化的存在对亚型A三聚体的HMMS、LMMS和RSV F蛋白的百分比的影响，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

图13B显示了温度变化的存在对亚型B三聚体的HMMS、LMMS和RSV F蛋白的百分比的影响，如通过尺寸排阻色谱法测量的。

图14A显示了温度变化的存在对亚型A的RSV F蛋白的效价的影响，如通过RP-HPLC测量的。

图14B显示了温度变化的存在对亚型B的RSV F蛋白的效价的影响，如通过RP-HPLC测量的。

图15A显示了温度变化的存在对宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响，如通过酶联免疫测定在从亚型A的RSV F蛋白的生产收获的材料中测量的。

图15B显示了温度变化的存在对宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响，如通过酶联免疫测定在从亚型B的RSV F蛋白的生产收获的材料中测量的。

图16显示了在对从亚型A的RSV F蛋白的生产收获的材料进行疏水相互作用色谱(HIC)后，从具有不同培养条件的9个生物反应器的生产运行中收获的材料的蛋白质印迹。

图17显示了在对从亚型B的RSV F蛋白的生产收获的材料进行疏水相互作用色谱(HIC)后，从具有不同培养条件的9个生物反应器的生产运行中收获的材料的蛋白质印迹。

发明详述

本发明涉及一种在补料分批细胞培养中生产RSV F蛋白三聚体的方法，所述方法包括以下步骤：

(ii)在约33.0℃和约35.0℃之间的温度下培养细胞，以及

本发明的方法特别适用于生产在免疫原性组合物中用作抗原的RSV F蛋白三聚体。本发明的方法可用于大规模(例如以至少500L或甚至至少3000L的细胞培养基体积)制造RSV F蛋白三聚体。本发明的方法提供高效价和高百分比的三聚体形式的RSV蛋白F，同时还最小化HCP或其他杂质的量，从而促进进一步的下游加工。此外，优化蛋白质加工的特定条件已被鉴定并可用于本发明的方法。

在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型A的RSV F蛋白。在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型B的RSV F蛋白。在一些实施方案中，RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白的突变体。在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型A的野生型RSV F蛋白的突变体。在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型B的野生型RSV F蛋白的突变体。在一些实施方案中，突变体展示相对于相应野生型RSV F蛋白的氨基酸序列在氨基酸序列中引入的突变，并且针对野生型RSV F蛋白或针对包含野生型F蛋白的病毒具有免疫原性。突变体中的氨基酸突变包括相对于野生型RSV F蛋白的氨基酸取代、缺失或添加。

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的RSV F蛋白是如WO2017/109629中公开的RSV蛋白突变体，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白的突变体，其中引入的氨基酸突变是野生型RSV F蛋白中的一对氨基酸残基突变为一对半胱氨酸(“工程化二硫键突变”)。引入的一对半胱氨酸残基允许在半胱氨酸残基之间形成二硫键，从而稳定蛋白质的构象或寡聚状态，例如融合前构象。此类突变的特定对的示例包括：55C和188C；155C和290C；103C和148C；以及142C和371C，例如S55C和L188C；S155C和S290C；T103C和I148C；以及L142C和N371C。

在其他实施方案中，RSV F蛋白突变体包含作为一种或多种空腔填充突变的氨基酸突变。可以替换为空腔填充的目标的氨基酸的例子包括小的脂肪族(例如Gly、Ala和Val)或小的极性氨基酸(例如Ser和Thr)和埋藏在融合前构象中但在融合后的构象中暴露于溶剂的氨基酸。替换氨基酸的实例包括大脂肪族氨基酸(Ile、Leu和Met)或大芳香族氨基酸(His、Phe、Tyr和Trp)。在一些具体实施方案中，RSV F蛋白突变体包含选自以下的空腔填充突变：

(1)将55、62、155、190或290位的S取代为I、Y、L、H或M；

(2)将54、58、189、219或397位的T取代为I、Y、L、H或M；

(3)将151位的G取代为A或H；

(4)将147或298位的A取代为I、L、H或M；

(5)将164、187、192、207、220、296、300或495位的V取代为I、Y、H；和

(6)将106位的R取代为W。

在一些特定的实施方案中，RSV F蛋白突变体包含选自以下的至少一个空腔填充突变：T54H、S190I和V296I。

在其他实施方案中，RSV F蛋白突变体包含静电突变，其降低蛋白质中在折叠结构中彼此接近的残基之间的离子排斥或增加其之间的离子吸引力。在几个实施方案中，RSV F蛋白突变体包括减少与来自RSV F三聚体的另一个原聚体的Glu487和Asp489的酸性残基的排斥性离子相互作用或增加与其的吸引性离子相互作用的静电取代。在一些具体实施方案中，RSV F蛋白突变体包含选自以下的静电突变：

(1)将82、92或487位的E取代为D、F、Q、T、S、L或H；

(2)将315、394或399位的K取代为F、M、R、S、L、I、Q或T；

(3)将392、486或489位的D取代为H、S、N、T或P；和

(4)将106或339位的R取代为F、Q、N或W。

在其他实施方案中，RSV F蛋白突变体包含选自工程化二硫键突变、空腔填充突变和静电突变的两种或更多种不同类型的突变的组合。在一些特定实施方案中，RSV F蛋白突变体包含相对于相应野生型RSV F蛋白的突变的组合，其中突变的组合选自以下：

(1)T103C、I148C、S190I和D486S的组合；

(2)T54H S55C L188C D486S的组合；

(3)T54H、T103C、I148C、S190I、V296I和D486S的组合；

(4)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I和N371C的组合；

(5)S55C、L188C和D486S的组合；

(6)T54H、S55C、L188C和S190I的组合；

(7)S55C、L188C、S190I和D486S的组合；

(8)T54H、S55C、L188C、S190I和D486S的组合；

(9)S155C、S190I、S290C和D486S的组合；

(10)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q和D489S的组合；和

(11)T54H、S155C、S190I、S290C和V296I的组合。

在一些实施方案中，RSV F蛋白属于亚型A并且包含突变T103C、I148C、S190I和D486S。

在一些实施方案中，RSV F蛋白属于亚型B并且包含突变T103C、I148C、S190I和D486S。

鉴于RSV F序列的基本保守性，本领域普通技术人员可以容易地比较不同天然RSVF序列之间的氨基酸位置，以鉴定不同RSV毒株和亚型之间相应的RSV F氨基酸位置。例如，在几乎所有已鉴定的天然RSV F0前体蛋白中，弗林蛋白酶切割位点都位于相同的氨基酸位置。因此，跨毒株和亚型的天然RSV F蛋白序列的保守性允许使用参考RSV F序列来比较RSVF蛋白中特定位置的氨基酸。出于本公开内容的目的(除非上下文另有说明)，RSV F蛋白氨基酸位置参考RSV A2毒株的全长天然F前体多肽的氨基酸序列给出；对应于GenInfo标识符GI 138251和Swiss Prot标识符P03420。

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的RSV F蛋白是如WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848和WO2018/109220中公开的RSV蛋白突变体。这些参考文献中公开的RSV F蛋白通过引用并入本文。

如本文所用，术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的一个或多个时间向培养物提供额外的成分。在一些实施方案中，这些额外的成分一起提供在补料培养基中。此类提供的成分通常包括在培养过程中已耗尽的细胞营养成分。补料分批培养通常在某一点停止，并收获培养基中的细胞和/或成分并任选纯化。在一些实施方案中，补料分批培养包括补充有补料培养基的基础培养基。

在一些实施方案中，细胞在33.0℃、33.1℃、33.2℃、33.3℃、33.4℃、33.5℃、33.6℃、33.7℃、33.8℃、33.9℃、34.0℃、34.1℃、34.2℃、34.3℃、34.4℃、34.5℃、34.6℃、34.7℃、34.8℃、34.9℃或35.0℃的温度下培养。在优选的实施方案中，细胞在34.0℃和35.0℃之间的温度下培养。在优选的实施方案中，细胞在34.5℃的温度下培养。

本发明的方法包括以受限方式向细胞提供葡萄糖的步骤，其中响应于pH升高到预定pH值以上将葡萄糖供给细胞。这种依赖于pH变化供给葡萄糖的方法也被称为HiPDOG，并且例如在WO2004/104186和Gagnon等人((2011)(Biotechnology and bioengineering108:1328-1337)中公开，它们均通过引用并入本文。

在一些实施方案中，pH传感器用于监测细胞培养物的pH。

在一些实施方案中，本发明的方法的预定pH值对应于培养物的pH设定点以上0.01至0.10的增加，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.10的增加。在一些实施方案中，预定pH值对应于培养物的pH设定点以上0.05的增加。

在一些实施方案中，细胞培养物的pH设定点在6.70和7.30之间。在一些实施方案中，细胞培养物的pH设定点在6.90和7.20之间。在一些实施方案中，细胞培养物的pH设定点在7.00和7.10之间。在一个优选的实施方案中，细胞培养物的pH设定点是7.05。

在优选的实施方案中，细胞培养物的pH设定点是7.05并且预定pH值对应于高于所述设定点以上0.05的增加。

在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段期间，细胞培养物的pH在6.70和7.30之间。在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段期间，细胞培养物的pH在6.90和7.20之间。在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段期间，pH设定点为6.95。在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段期间，pH设定点为7.07。在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段期间，pH设定点为7.01。在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段期间，pH设定点为7.20。

在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段之后，pH设定点为7.20。在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段之后，pH设定点为7.20并且pH操作范围为7.05至7.35。在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段之后，pH设定点为6.90。在一些实施方案中，在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段之后，pH设定点为6.90并且pH操作范围为6.75至7.05。

在一些实施方案中，响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖包括供给葡萄糖直到pH降低以达到培养物的pH设定点。

在一些实施方案中，葡萄糖在培养物的生长期以受限方式提供给细胞培养物。在一些实施方案中，葡萄糖以受限方式提供给细胞培养物1至6天，优选3、4或5天，更优选4或5天。

在一些实施方案中，以受限方式向细胞培养物提供葡萄糖的步骤在第0天、第1天或第2天开始。

在一些实施方案中，当以受限方式提供葡萄糖时，它作为独立补料提供，即不包含补料培养基的其他成分。

在一些实施方案中，当以受限方式提供葡萄糖时，它作为补料培养基的一部分提供。

在本文公开的方法的一些实施方案中，将温度变化为约30.0℃至约32.0℃之间的较低温度，优选约31.0℃。在一些实施方案中，温度在第3天和第7天之间(即培养的第三天和培养的第七天之间)变化为较低的温度。在一个优选的实施方案中，在第5天或第6天将温度变化为较低的温度。在一个优选的实施方案中，在停止以受限方式提供葡萄糖之后将温度变化为较低的温度。

在一些实施方案中，与其他方法(例如在高于或低于本文定义的温度或温度范围的温度下进行的方法和/或没有温度变化的方法和/或使用包含糖皮质激素的培养基的方法和/或不包括通过响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖来以受限方式向细胞培养物提供葡萄糖的步骤的方法)相比，本发明的方法导致改善的效价。效价可以通过本领域已知的任何方法来确定。在一个实施方案中，效价通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测量。

在一些实施方案中，与其他方法(例如在高于或低于本文定义的温度或温度范围的温度下进行的方法和/或没有温度变化的方法和/或使用包含糖皮质激素的培养基的方法和/或不包括通过响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖来以受限方式向细胞培养物提供葡萄糖的步骤的方法)相比，本发明的方法导致三聚体的增加的百分比和高分子量物质(HMMS)和/或低分子量物质(LMMS)的降低的百分比。三聚体、HMMS和LMMS的百分比可以通过本领域已知的任何方法来确定。在一些实施方案中，三聚体、HMMS和LMMS的百分比通过尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)测量。

在一些实施方案中，与其他方法(例如在高于或低于本文定义的温度或温度范围的温度下进行的方法和/或没有温度变化的方法和/或使用包含糖皮质激素的培养基的方法和/或不包括通过响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖来以受限方式向细胞培养物提供葡萄糖的步骤的方法)相比，本发明的方法导致增加的三聚体效价。三聚体效价值通过将三聚体的百分比(优选通过SEC-HPLC获得)乘以效价(优选通过RP-HPLC获得)来计算。三聚体效价提供了对以三聚体形式产生的蛋白质的量的估计。

在一些实施方案中，与其他方法(例如在高于或低于本文定义的温度或温度范围的温度下进行的方法和/或没有温度变化的方法和/或使用包含糖皮质激素的培养基的方法和/或不包括通过响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖来以受限方式向细胞培养物提供葡萄糖的步骤的方法)相比，本发明的方法导致减少的量的宿主细胞蛋白。HCP可以通过本领域已知的任何方法测量。在一些实施方案中，HCP通过酶联免疫测定法(ELISA)测量。

在一些实施方案中，与其他方法(例如在高于或低于本文定义的温度或温度范围的温度下进行的方法和/或没有温度变化的方法和/或使用包含糖皮质激素的培养基的方法和/或不包括通过响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖来以受限方式向细胞培养物提供葡萄糖的步骤的方法)相比，本发明的方法导致改善的量的以适合形成三聚体的形式的经加工的RSV F(A)或RSV F(B)，其可以在免疫组合物中用作抗原。可以通过本领域已知的任何方法确定合适形式的经加工的RSV F(A)或RSV F(B)的量。在一个实施方案中，这样的量通过蛋白质印迹测量，例如如实施例3中所示。

在一些实施方案中，与其他方法(例如在高于或低于本文定义的温度或温度范围的温度下进行的方法和/或没有温度变化的方法和/或使用包含糖皮质激素的培养基的方法和/或不包括通过响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖来以受限方式向细胞培养物提供葡萄糖的步骤的方法)相比，本发明的方法导致改善的效价和/或增加的三聚体百分比和降低的高分子量物质(HMMS)和/或低分子量物质(LMMS)的百分比和/或减少的量的宿主细胞蛋白。

如本文所用，术语“介质”、“细胞培养基”和“培养基”是指含有滋养生长中的哺乳动物细胞的营养物的溶液。通常，此类溶液提供对于最小生长和/或存活由细胞所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和微量元素。在一个实施方案中，培养基可包含Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val和胱氨酸和/或Cys。

这样的溶液还可以含有将生长和/或存活率增强至高于最低比率的补充成分，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(例如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、以高最终浓度存在的无机化合物(例如铁)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能源。在一些实施方案中，培养基有利地被配制至对于细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。例如，可将培养基配制至约7.1至7.3之间的pH和约1000至1300mOsm之间的最终重量克分子渗透压浓度。

可用于本发明的方法的已知基础和/或补料细胞培养基的实例包括WO2006/026445、WO2008/109410、WO2008/063892、EP2243827、WO2002/066603、WO2015/140708和WO2006/050050中公开的那些。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法中使用的补料培养基包含4至10mM Ala、30至60mM Arg、50至90mM Asn、10至30mM Asp、2至40mM Glu、2至15mM Gly、8至20mM His、25至32mM Ile、35至60mM Leu、28至60mM Lys、9至25mM Met、10至30mM Phe、15至40mM Pro、44至80mM Ser、20至45mM Thr、2至10mM Trp和20至50mM Val。

在一些实施方案中，培养基是化学成分确定的培养基，其中培养基的成分是已知和受控的。在一些实施方案中，培养基是复杂培养基，其中并非培养基的所有成分都是已知和/或受控的。

在过去的几十年里，用于哺乳动物细胞培养的化学成分确定的生长培养基得到了广泛的开发和发布。成分确定的培养基的所有成分都得到了很好的表征，因此成分确定的培养基不含复杂的添加剂，如血清或水解产物。开发早期的培养基配方是为了允许细胞生长和维持活力，而很少或根本不考虑蛋白质生产。最近，已经开发了培养基配方，其明确目的是支持高生产性重组蛋白生产细胞培养物。这种培养基优选用于本发明的方法。这样的培养基通常包含大量的营养物并且特别是氨基酸以支持细胞以高密度生长和/或维持。如果需要，技术人员可以修改这些培养基以用于本发明的方法。

并非复杂培养基的所有成分都得到了很好的表征，因此复杂培养基可能含有添加剂，例如简单和/或复杂的碳源、简单和/或复杂的氮源以及血清等。在一些实施方案中，适用于本发明的复杂培养基除了本文所述的成分确定的培养基的其他成分之外还含有添加剂，例如水解产物。

在一些实施方案中，成分确定的培养基通常包括已知的在水中的浓度的大约五十种化学实体。其中一些还包含一种或多种良好表征的蛋白质，例如胰岛素、IGF-1、转铁蛋白或BSA，但其他一些不需要蛋白质成分，因此被称为不含蛋白质的成分确定的培养基。培养基的典型化学成分可分为五大类：氨基酸、维生素、无机盐、微量元素和无法统一分类的杂项。

细胞培养基可以任选地补充有补充成分。如本文所用，术语“补充成分”是指将生长和/或存活率增强到高于最低比率的成分，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(例如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能源。在一些实施方案中，可以将补充成分添加到初始细胞培养物中。在一些实施方案中，可在细胞培养开始后添加补充成分。

通常，微量元素是指以微摩尔或更低水平包含在内的各种无机盐。例如，通常包含的微量元素是锌、硒、铜等。在一些实施方案中，铁(亚铁盐或铁盐)可以以微摩尔浓度作为微量元素包含在初始细胞培养基中。锰也经常作为二价阳离子(MnCl₂或MnSO₄)以纳摩尔至微摩尔浓度范围包含在微量元素中。许多不太常见的微量元素通常以纳摩尔浓度添加。

在一些实施方案中，本发明的方法中使用的细胞培养基不包含糖皮质激素化合物。

已知糖皮质激素化合物调节多种细胞功能，例如细胞增殖、代谢、糖基化和许多蛋白质的分泌，因此通常包含在细胞培养基中，特别是用于大规模制造过程。

用作细胞培养基成分的糖皮质激素化合物的实例包括但不限于氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、去炎松和醋酸氟氢可的松。

如以下实施例3所示，细胞培养基中糖皮质激素例如氢化可的松的存在对正确形式的RSV F蛋白的量具有不利影响。不受任何理论的束缚，这种效应可能是由于糖皮质激素化合物干扰RSV F蛋白的加工，导致收获的材料中未加工的RSV蛋白的量增加。

在一些实施方案中，用于本发明的方法的细胞培养基不包含糖皮质激素化合物。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的基础培养基不包含糖皮质激素化合物。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的补料培养基不包含糖皮质激素化合物。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的基础培养基和补料培养基不包含糖皮质激素化合物。

在一些实施方案中，本发明的方法中使用的细胞培养基不包含氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、去炎松和醋酸氟氢可的松中的任一种。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的基础培养基不包含氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、去炎松和醋酸氟氢可的松中的任一种。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的补料培养基不包含氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、去炎松和醋酸氟氢可的松中的任一种。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的基础培养基和补料培养基不包含氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、去炎松和醋酸氟氢可的松中的任一种。

在一些实施方案中，本发明的方法中使用的细胞培养基不包含氢化可的松、泼尼松龙、倍他米松和地塞米松中的任一种。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的基础培养基不包含氢化可的松、泼尼松龙、倍他米松和地塞米松中的任一种。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的补料培养基不包含氢化可的松、泼尼松龙、倍他米松和地塞米松中的任一种。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的基础培养基和补料培养基不包含氢化可的松、泼尼松龙、倍他米松和地塞米松中的任一种。

在一些实施方案中，本发明的方法中使用的细胞培养基不包含氢化可的松。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的基础培养基不包含氢化可的松。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的补料培养基不包含氢化可的松。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的基础培养基和补料培养基不包含氢化可的松。

在一些实施方案中，本发明的方法中使用的培养基是适合支持细胞培养物中的高活细胞密度(例如1×10⁶个细胞/mL、5×10⁶个细胞/mL、1×10⁷个细胞/mL、5×10⁷个细胞/mL、1×10⁸个细胞/mL或5×10⁸个细胞/mL)的培养基。在一些实施方案中，细胞培养物是CHO细胞补料分批培养物。在一些实施方案中，细胞生长至大于1×10⁶个细胞/mL、5×10⁶个细胞/mL、1×10⁷个细胞/mL、5×10⁷个细胞/mL、1×10⁸个细胞/mL或5×10⁸个细胞/mL的活细胞密度。

如本文所用，术语“活细胞密度”是指存在于给定体积的培养基中的细胞数量。可通过本领域技术人员已知的任何方法测量活细胞密度。优选地，活细胞密度使用自动细胞计数器例如Bioprofile测量。如本文所用，术语最大细胞密度是指在细胞培养过程中达到的最大细胞密度。如本文所用，术语“细胞活力”是指培养物中的细胞在给定的培养条件或实验变化组下存活的能力。本领域的普通技术人员将理解，用于确定细胞活力的许多方法中的一种包括在本发明中。例如，可以使用不穿过活细胞的膜但可以穿过死亡或垂死细胞的破裂的膜的染料(例如，台盼蓝)以确定细胞活力。

细胞培养方法

如本文所用，术语“培养物”和“细胞培养物”是指在适于细胞群的存活和/或生长的条件下悬浮在培养基中的细胞群。如本领域普通技术人员将清楚的，在一些实施方案中，如本文所用的这些术语是指包含细胞群和细胞群悬浮于其中的培养基的组合。

如本文所用，术语“补料分批培养”或“补料分批细胞培养”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的一个或多个时间向培养物提供额外的成分。这样提供的成分通常包括在培养过程中已耗尽的细胞营养成分。补料分批培养通常在某一点停止，并收获培养基中的细胞和/或成分并任选纯化。在一些实施方案中，补料分批培养包括补充有补料培养基的基础培养基。

细胞可以以实践者选择的任何方便的体积生长。例如，细胞可以在体积从几毫升到几升不等的小规模反应容器中生长。可替代地，细胞可以在至少500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15000、20000或25000升的体积或更多或介于其之间的任何体积的大规模商业生物反应器中生长。在一些实施方案中，细胞培养物的体积为至少500L。在一些实施方案中，细胞培养物的体积为至少3000L。

在一些实施方案中，细胞可以在初始生长阶段(或生长阶段)期间生长更长或更短的时间量，这取决于实践者的需要和细胞本身的要求。在一些实施方案中，细胞生长足以达到预定细胞密度的时间段。在一些实施方案中，细胞生长足以达到约1×10⁶个细胞/mL、约5×10⁶个细胞/mL、约1×10⁷个细胞/mL、约5×10⁷个细胞/mL、约1×10⁸个细胞/mL或约5×10⁸个细胞/mL的预定细胞密度的时间段。在一些实施方案中，细胞生长足以达到细胞密度的时间段，该细胞密度是如果允许不受干扰地生长细胞最终将达到的最大细胞密度的给定百分比。例如，细胞可以生长足以达到最大细胞密度的1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％的所需的活细胞密度的时间段。在一些实施方案中，细胞生长直至细胞密度每天增加不超过培养物的15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，细胞生长直至细胞密度每天增加不超过培养物的5％。

在一些实施方案中，允许细胞生长限定的时间段。例如，取决于细胞培养物的起始浓度和细胞的固有生长速率，细胞可以生长0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，优选4至10天。本发明的实施者将能够根据蛋白质生产要求和细胞自身的需要来选择初始生长阶段的持续时间。

可以在初始培养阶段搅动或摇动细胞培养物以增加氧合作用和营养物质向细胞的散布。根据本发明，本领域普通技术人员将理解在初始生长阶段控制或调节生物反应器的某些内部条件可能是有益的，包括但不限于pH、温度、氧合作用等。

根据本发明，本领域的普通技术人员将理解培养细胞的温度是温度设定点并且在细胞培养期间被控制以限制温度在设定点附近的变化。

在本发明的方法中可以使用向较低温度的温度变化。在这种情况下，本领域的普通技术人员将理解限定了较低的温度设定点并且一旦温度已经达到较低的设定点，它被控制以限制温度在所述较低的设定点附近的变化。当改变培养物的温度时，温度变化可以是相对平缓的。例如，可能需要几个小时或几天才能完成温度变化。或者，温度变化可以相对突然。例如，温度变化可以在不到几个小时内完成。鉴于适当的生产和控制设备，例如多肽或蛋白质的商业大规模生产中的标准设备，温度变化甚至可以在不到一小时内完成。

在一些实施方案中，一旦细胞培养的条件已经如上所讨论的那样改变，则对于随后的生产阶段在有利于细胞培养物的存活和生存力并且适合于以商业上足够的水平表达所需多肽或蛋白质的条件下维持细胞培养物。在一些实施方案中，细胞可维持在随后的生产阶段直至达到所需的细胞密度或生产效价。在一些实施方案中，生产阶段的持续时间为2至10天，即2、3、4、5、6、7、8、9或10天，优选4至8天，优选6天。

在一些实施方案中，生长阶段的持续时间为约6天并且生产阶段的持续时间为约6天。

在随后的生产阶段期间可以搅动或摇动细胞培养物以增加氧合作用和营养物向细胞的散布。根据本发明，本领域普通技术人员将理解，在随后的生长阶段控制或调节生物反应器的某些内部条件可能是有益的，包括但不限于pH、温度、氧合作用等。

细胞

根据本发明，可以使用对细胞培养敏感的任何哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC No：85110503)；人视网膜母细胞(PER.C6，CruCell，Leiden,The Netherlands)；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞或293，Graham等人，J.Gen Virol.,36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝癌细胞系(Hep G2)。在一些优选的实施方案中，细胞是CHO细胞。在一些优选的实施方案中，细胞是GS-CHO细胞。

蛋白质的表达

如上所述，在许多情况下，将选择或工程化细胞以产生高水平的所需产物。通常，细胞将被人工操作以产生高水平的重组蛋白，例如通过引入编码感兴趣的蛋白的基因和/或通过引入调节该基因(无论是内源性的还是引入的)的表达的遗传控制元件。

即使在被工程化以表达特定蛋白质的一种特定类型的细胞群中，也存在细胞群内的变异性，因此某些个体细胞将生长得更好，产生更多感兴趣的蛋白质。在某些实施方案中，细胞系由实践者根据经验选择以用于在选择用于培养细胞的特定条件下稳健生长。在一些实施方案中，基于细胞生长、最终细胞密度、细胞活力百分比、表达的蛋白质的效价或这些的任何组合或实践者认为重要的任何其他条件，选择被工程化以表达特定蛋白质的个体细胞用于大规模生产。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指经操纵以产生如本文所述的感兴趣的蛋白质的细胞。蛋白质可由细胞内源的基因表达，或由被引入到细胞中的异源基因表达。蛋白质可以是自然界中存在的蛋白质，或者可以可替代地具有人工选择的或工程化的序列。

表达的蛋白质的分离

一般地，通常将需要分离和/或纯化根据本发明表达的蛋白质。在某些实施方案中，表达的蛋白质被分泌到培养基中，因此可以去除细胞和其他固体(例如通过离心或过滤)作为纯化过程的第一步。

可以通过标准方法分离和纯化表达的蛋白质，包括但不限于色谱(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤、离心或差异溶解度、乙醇沉淀和/或通过用于纯化蛋白质的任何其他可用技术(参见，例如，Scopes,Protein PurificationPrinciples and Practice 2nd Edition,Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(eds.),Protein Expression:A Practical Approach,Oxford UnivPress,1999；和Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(eds.),Guide to ProteinPurification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,Vol.182),Academic Press,1997，其各自通过引用并入本文)。特别是对于免疫亲和色谱，可以通过将蛋白质结合到亲和柱来分离蛋白质，该亲和柱包含针对该蛋白质产生并固定在固定支持物上的抗体。或者，可以通过标准重组技术将亲和标签(例如流感病毒外壳序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶)附接到蛋白质上，以允许通过穿过适当的亲和柱轻松纯化。可在任何或所有阶段添加蛋白酶抑制剂，例如苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮肽素、胃酶抑素或抑肽酶，以减少或消除纯化过程中蛋白质的降解。当必须裂解细胞以分离和纯化表达的蛋白质时，蛋白酶抑制剂特别有利。

本领域的普通技术人员将理解，确切的纯化技术将取决于待纯化蛋白质的特性、表达该蛋白质的细胞的特性和/或其中生长细胞的培养基的组成而变化。

将用于表达蛋白质的基因引入宿主细胞

通常，引入细胞中的核酸分子编码期望根据本公开内容表达的蛋白质。

适用于将足以实现感兴趣的蛋白质的表达的核酸引入哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，Gething等人,Nature,293:620-625,1981；Mantei等人,Nature,281:40-46,1979；Levinson等人.EP 117,060；和EP117,058，其各自通过引用并入本文。对于哺乳动物细胞，将遗传物质导引入哺乳动物细胞的常用方法包括Graham和vander Erb的磷酸钙沉淀法(Virology,52:456-457,1978)或Hawley-Nelson的lipofectamine^TM(Gibco BRL)方法(Focus 15:73,1993)。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面已由Axel在1983年8月16日颁发的美国专利号4,399,216中描述。对于将遗传物质引入哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等人,Methods in Enzymology,1989,Keown等人,Methods in Enzymology,185:527-537,1990,和Mansour等人,Nature,336:348-352,1988。

在一些实施方案中，待引入的核酸是裸核酸分子的形式。例如，引入细胞的核酸分子可仅由编码蛋白质的核酸和必要的遗传控制元件组成。或者，编码蛋白质的核酸(包括必需的调节元件)可以包含在质粒载体中。用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质的合适载体的非限制性代表性实例包括pCDNA1；pCD，参见Okayama等人,Mol.Cell Biol.5:1136-1142,1985；pMClneo多聚-A，参见Thomas等人,Cell51:503-512,1987；杆状病毒载体，例如pAC373或pAC610；CDM8，参见Seed,B.Nature 329:840,1987；和pMT2PC，参见Kaufman等人,EMBOJ.6:187-195,1987，其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，待引入细胞的核酸分子包含在病毒载体内。例如，可以将编码蛋白质的核酸插入病毒基因组(或部分病毒基因组)中。指导蛋白质表达的调节元件可包含在插入病毒基因组的核酸中(即，连接到插入病毒基因组的基因)或可由病毒基因组本身提供。

通过形成含有DNA和磷酸钙的沉淀物，可以将裸露的DNA引入细胞。或者，也可以通过形成DNA和DEAE-葡聚糖的混合物并将混合物与细胞一起孵育，或通过将细胞和DNA在适当的缓冲液中一起孵育并将细胞置于高压电脉冲(例如，通过电穿孔)下，将裸DNA引入细胞。引入裸DNA细胞的另一种方法是将DNA与含有阳离子脂质的脂质体悬浮液混合。然后将DNA/脂质体复合物与细胞一起孵育。裸DNA也可以通过例如显微注射直接注射到细胞中。

或者，裸DNA也可以通过将DNA与偶联至细胞表面受体的配体的阳离子(例如聚赖氨酸)复合来引入细胞(参见例如Wu,G.和Wu,C.H.J.Biol.Chem.263:14621,1988；Wilson等人.J.Biol.Chem.267:963-967,1992；以及美国专利号5,166,320，其各自通过引用整体并入本文。DNA-配体复合物与受体的结合促进通过受体介导的胞吞作用来摄取DNA。

使用含有特定核酸序列(例如编码蛋白质的cDNA)的病毒载体是将核酸序列引入细胞的常用方法。用病毒载体感染细胞的优点是大部分细胞都接受核酸，这可以避免选择已经接受核酸的细胞的需要。另外，在病毒载体内编码(例如，由病毒载体中包含的cDNA编码)的分子通常在已摄取病毒载体核酸的细胞中有效表达。

有缺陷的逆转录病毒已被很好地表征用于基因治疗目的的基因转移(关于综述参见Miller,A.D.Blood 76:271,1990)。可以构建具有插入到逆转录病毒基因组中的编码感兴趣的蛋白质的核酸的重组逆转录病毒。此外，可以去除部分逆转录病毒基因组以使逆转录病毒复制有缺陷。然后将这种复制缺陷型逆转录病毒包装成病毒体，其可用于通过标准技术通过使用辅助病毒感染靶细胞。

可以对腺病毒的基因组进行操作，使得其编码和表达感兴趣的蛋白质，但在其在正常裂解病毒生命周期中的复制的能力方面是失活的。参见，例如，Berkner等人,BioTechniques 6:616,1988；Rosenfeld等人,Science 252:431-434,1991；和Rosenfeld等人,Cell 68:143-155,1992。源自腺病毒株Ad类型5dl324或其他腺病毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员已知的。重组腺病毒的优势在于它们不需要分裂细胞以成为有效的基因递送载体，并且可用于感染广泛多样的细胞类型，包括气道上皮细胞(Rosenfeld等人，1992，同上)、内皮细胞(Lemarchand等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6482-6486,1992)、肝细胞(Herz和Gerard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2812-2816,1993)和肌肉细胞(Quantin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584,1992)。此外，引入的腺病毒DNA(以及其中包含的外来DNA)不会整合到宿主细胞的基因组中，而是保持为游离基因，从而避免在引入的DNA整合到宿主基因组中的情况下由于插入诱变而可能发生的潜在问题(例如，逆转录病毒DNA)。此外，相对于其他基因递送载体，腺病毒基因组对于外来DNA的携带能力较大(多至8个千碱基)(Berkner等人，同上；Haj-Ahmand and Graham,J.Virol.57:267,1986)。目前使用的大多数复制缺陷型腺病毒载体都删除了全部或部分病毒E1和E3基因，但保留了多达80％的腺病毒遗传物质。

腺相关病毒(AAV)是一种天然存在的缺陷病毒，其需要另一种病毒(例如腺病毒或疱疹病毒)作为辅助病毒用于有效复制和生产性生命周期。(关于综述参见Muzyczka等人,Curr.Topics in Micro.and Immunol.,158:97-129,1992)。它也是可以将其DNA整合到非分裂细胞中的少数病毒之一，并表现出高频率的稳定整合(参见例如Flotte等人,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356,1992；Samulski等人,J.Virol.63:3822-3828,1989；和McLaughlin等人,J.Virol.62:1963-1973,1989)。包含AAV的少至300个碱基对的载体可以被包装并且可以整合。外源DNA的空间限制在大约4.5kb。AAV载体(例如Tratschin等人(Mol.Cell.Biol.5:3251-3260,1985)中所述的)可用于将DNA引入细胞。已使用AAV载体将多种核酸引入不同的细胞类型(参见例如Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470,1984；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081,1985；Wondisford等人,Mol.Endocrinol.2:32-39,1988；Tratschin等人,J.Virol.51:611-619,1984；和Flotte等人,J.Biol.Chem.268:3781-3790,1993)。

当用于将核酸分子引入细胞群的方法导致大部分细胞的修饰和细胞有效表达蛋白质时，可以使用修饰的细胞群而无需进一步分离或亚克隆群体中的个体细胞。也就是说，细胞群可以产生足够的蛋白质，使得不需要进一步的细胞分离，并且可以立即使用细胞群来接种细胞培养物以用于产生蛋白质。或者，可能需要从有效产生蛋白质的几个细胞或单个细胞分离和扩增同源细胞群。

编码感兴趣的蛋白质的基因可以任选地连接到一个或多个调节遗传控制元件。在某些实施方案中，遗传控制元件指导蛋白质的组成型表达。在某些实施方案中，可以使用提供编码感兴趣的蛋白质的基因的可诱导表达的遗传控制元件。可诱导的遗传控制元件(例如，可诱导的启动子)的使用允许调节细胞中蛋白质的产生。用于真核细胞的潜在有用的诱导型遗传控制元件的非限制性实例包括激素调节元件(例如，参见Mader,S.和White,J.H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607,1993),合成配体调节元件(参见，例如Spencer,D.M.等人,Science262:1019-1024,1993)和电离辐射调节元素(例如，参见Manome,Y.等人,Biochemistry 32:10607-10613,1993；Datta,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10149-10153,1992)。可以根据本发明使用本领域已知的额外的细胞特异性或其他调节系统。

根据本发明的教导，本领域的普通技术人员将能够选择并任选地适当修改引入导致细胞表达感兴趣的蛋白质的基因的方法。

免疫原性组合物

通过本文公开的方法产生的亚型A和B的RSV F蛋白可包含在用作疫苗的免疫原性组合物中。

除了免疫原性成分外，疫苗还可以包含免疫调节剂，例如佐剂。合适的佐剂的例子包括铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，例如MF59(参见例如WO90/14837)；皂苷制剂，例如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如美国专利号5,057,540；WO90/03184、WO96/11711、WO2004/004762、WO2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含有CpG-基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，例如大肠杆菌不耐热肠毒素LT、霍乱毒素CT等。还可以使用载体编码的佐剂，例如，通过使用编码C4结合蛋白(C4 bp)的寡聚化结构域与感兴趣的抗原的融合体的异源核酸(例如，Solabomi等人,2008,Infect Immun 76:3817-23)。在某些实施方案中，本文的组合物包含铝作为佐剂，例如以氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为每剂量0.05-5mg，例如0.075-1.0mg的铝含量。

实施例

重组表达亚型A(以下称为RSV F(A))或亚型B(以下称为RSV F(B))RSV F蛋白的GS-CHO克隆在120或140rpm振荡培养箱中保持在36.5℃和5％CO₂下。在种子扩增期间，分别以0.35×10⁶个细胞/mL或0.20x10⁶个细胞/mL接种培养物持续3或4天传代。所有实验的N-1种子培养物均以1L的工作体积在2L生物反应器中运行，并在具有高营养含量的培养基中以0.70x10⁶个细胞/mL传代4天。

生产实验使用葡萄糖受限补料分批工艺(以下称为HiPDOG工艺)在带有控制器的2L/>生物反应器中进行(Gagnon等人(2011)Biotechnology and bioengineering 108:1328-1337)。具体方法和参数列于后续实验部分。

在收获当天，通过离心和深层过滤澄清细胞培养液。下游处理包括超滤和渗滤1(UF/DF1)，以浓缩材料和进行缓冲液交换，然后进行捕获色谱步骤，阴离子交换色谱(AEX)柱，以结合和洗脱模式运行。抛光柱包括流通模式的陶瓷羟基磷灰石色谱(CHA)和结合和洗脱模式的疏水相互作用色谱(HIC)柱。下游过程以病毒截留过滤步骤、超滤和渗滤2(UF/DF2)以及最终过滤步骤结束。

在以下实验中，报告了效价、三聚体、高分子量物质(HMMS)、低分子量物质(LMMS)和宿主细胞蛋白(HCP)。

效价可以通过本领域已知的任何方法来确定。在以下实验中，通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测量效价。反相色谱基于极性分离分子。相对非极性的分子，包括亚型A或B的RSV F蛋白结合到柱子上，而极性分子流过柱子而不结合。通过应用从极性条件到弱极性条件的流动相梯度，结合的分子从柱子洗脱。分子按极性递减的顺序洗脱。使用220nm处的紫外(UV)吸收进行检测。效价测定是通过将样品峰面积与校准标准品的峰面积进行比较来完成的。

在本文公开的以下实验中使用以下条件：

条件	设置
		柱子类型	Agilent Zorbax,300SB-C3,150x 3.0mm,3.5μm
流动相A(MPA)	水中0.1％TFA(v/v)
		流动相B(MPB)	90％乙腈中的0.1％TFA(v/v)
柱子温度	55±5℃
		流速和运行时间	0.75mL/分钟持续20分钟
自动进样器温度	5±3℃
		注射体积	5–100μL(15μg目标负载)
检测器波长	220nm的UV

梯度条件

时间(分钟)	流速(mL/min)	％MPA	％MPB
				0	0.75	90	10
2	0.75	90	10
				2.1	0.75	65	35
12	0.75	27	73
				12.1	0.75	5	95
16	0.75	5	95
				16.1	0.75	90	10
20	0.75	90	10

三聚体、HMMS和LMMS通过尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)测量。SEC-HPLC是本领域技术人员已知的分析方法，并用于确定通过本发明的方法获得的亚型A或B样品的RSV F蛋白中高分子量物质(HMMS)、三聚体和低分子量物质(LMMS)的相对含量。SEC-HPLC通过分子的流体动力学体积分离分子。当分析物被施加到柱床的头部时，小于填料孔隙的分子可以扩散进出孔隙，而较大的分子则不会进入孔隙。结果，较大的分子更快地通过柱子，而较小的分子则更慢地通过柱子。一旦物质洗脱，它们通过280nm处的紫外吸收进行检测。低分子量物质(LMMS)是用于如通过SEC-HPLC测量的具有小于三聚体的表观分子量的所有物质的术语。它们在三聚体峰之后洗脱。高分子质量物质(HMMS)是用于如通过SEC-HPLC测量的具有大于三聚体的表观分子量的所有峰的术语。它们在三聚体峰之前洗脱并且可能包含聚集体。

HCP是通过酶联免疫测定法(ELISA)测量的，ELISA是一种定量测定法，其使用夹心型ELISA分析法测量残留的中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞蛋白(HCP)。HCP测定的主要步骤概述如下。

一组标准样品由高度富集的CHO HCP材料制备。标准样品的浓度范围为2ng/mL至256ng/mL的CHO HCP。将测试样品稀释至四种浓度的亚型A或B的RSV蛋白F。最后，在每个测定板上测试对照样品。测定板包被有针对CHO HCP的高度富集的制剂产生的多克隆抗体(抗CHO HCPP pAb)。包被完成后，将板封闭以最小化分析物和试剂的非特异性结合。封闭后，将标准品、测试样品和对照样品添加到测定板并孵育以允许这些样品中的HCP被抗CHO HCP抗体捕获。然后洗涤板以去除任何未结合的蛋白质并留下HCP-抗体复合物。为了量化每个孔中结合的HCP的量，将与生物素缀合的抗CHO HCP抗体的制剂添加到测定板中，并允许其与捕获的HCP结合。洗涤板以去除任何未结合的生物素化抗体，并添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物，其与生物素-抗CHO HCP缀合物结合。洗涤板以去除任何未结合的链霉亲和素-HRP，并将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液添加到测定板中。TMB是一种在HRP的存在下产生蓝色的底物。将测定板与TMB试剂一起孵育一段时间，以在每个孔中产生适当的信号，并通过添加硫酸来淬灭过氧化物酶反应。最后，使用合适的酶标仪在450nm处测量和记录每个孔中的吸光度。生成的信号与测定板上捕获的HCP的量成比例。标准样品孔中的信号针对标准HCP浓度作图。将该图适应四参数逻辑(4PL)拟合以生成HCP标准曲线。然后使用测试样品和外部对照样品中的信号通过吸光度信号对标准4PL函数的伪线性部分进行插值来确定这些样品中的HCP含量。

从整体生产率和下游过滤性角度来看，当效价和三聚体最大化并且HMMS、LMMS和HCP最小化时，该过程是最佳的。RP-HPLC效价测量样品中存在的RSV蛋白总量，包括聚集体和非三聚体形式的RSV蛋白。由SEC测量的三聚体提供了大约有多少RSV分子以三聚体形式存在的估计，作为存在的蛋白质总量(包括一些工艺杂质)的百分比。工艺参数(例如生长温度)的操作可能增加三聚体而负面影响效价(反之亦然)。为了证明对效价和三聚体的总体影响，报告了“三聚体效价”，它是通过将三聚体乘以效价计算得出的。三聚体效价提供了有多少蛋白质以三聚体形式产生的估计。

实施例1-温度对CHO细胞中的RSV F蛋白产生的影响

这组实验旨在评估在CHO细胞产生亚型A和亚型B的RSV F蛋白期间，变化前后的温度以及变化的时机对效价和三聚体形成的影响。

使用表1详述的条件在具有控制器的2L/>生物反应器中进行生产实验。所有条件都在分批补料工艺中运行，该工艺包括其中提供给细胞的葡萄糖的量受到限制的阶段(对于RSV F(A)从第0天至第5天和对于RSV F(B)从第0天至第4天的HipDOG)，并使用不含氢化可的松的细胞培养基。

表1.生物反应器生产工艺参数

1.1生长温度的影响

在本实验中，细胞在33℃、34.5℃或36℃的温度下生长，以评估生长温度对效价、三聚体百分比、HMMS、LMMS、三聚体效价和宿主细胞蛋白(HCP)的量的影响。结果示于表2和图1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A和4B中。

表2-生长温度的影响

对于这两种抗原，生长温度与三聚体的百分比负相关，并且与HMMS和LMMS的百分比正相关(见图1A和AB)。使用34.5℃的温度始终获得最高效价(参见图2A和2B)。34℃和35℃之间的生长温度，优选34.5℃适合最大化三聚体、效价和最小化杂质。对于这两种抗原，HCP水平与温度正相关(参见图3A和3B)。对于亚型B，最高三聚体效价是使用34.5℃的温度获得的，对于亚型A，33℃和34.5℃的三聚体效价高于36℃的三聚体效价(见图4A和4B)。

1.2生产温度的影响

在本实验中，生长温度为34.5℃，并且改变生产温度(28.5℃、31℃或34℃)以评估生产温度对效价、三聚体百分比、HMMS、LMMS、三聚体效价以及HCP的量的影响。结果示于表3和图5A、5B、6A、6B、7A、7B、8A和8B中。

表3-生产温度的影响

生产温度(温度变化后)对于两种抗原与三聚体负线性相关，并且与LMMS和HMMS正线性相关(见图5A和5B)。对于31℃的生产温度获得了最低的HCP水平和最高的三聚体效价水平(参见图7A、7B和8A和8B)。

1.3温度变化的时机的影响

在本实验中，改变温度变化的时机以评估其对效价、三聚体百分比、HMMS、LMMS、三聚体效价和HCP量的影响。结果示于表4和图9A、9B、10A、10B、11A、11B、12A和12B中。

表4-温度变化时机的影响

与在不同培养持续时间的变化相比，培养开始后144小时时温度的变化改善了三聚体的量、效价和HCP水平。对于两种抗原和除RSV F(B)的三聚体(其在使用培养开始后185.5小时时的温度变化的情况下最高)之外的所有属性都是如此。对于RSV F(A)，在144小时的温度变化时获得了最高的三聚体效价。RSV F(B)的三聚体效价水平在144和114小时时相似，均低于185.5小时时的水平。

实施例2-温度变化对CHO细胞中的RSV F蛋白产生的影响

本实验旨在评估温度变化的存在对CHO细胞产生亚型A和亚型B的RSV F蛋白的过程中的工艺性能、效价和三聚体形成的影响。

生产实验使用表5中详述的条件在带有控制器的2L/>生物反应器中进行。所有条件都在分批补料工艺中运行，该工艺包括其中提供给细胞的葡萄糖的量受到限制的阶段(对于RSV F(A)从第0天到第5天和对于RSV F(B)从第0天至第4天的HipDOG)，并使用不含氢化可的松的细胞培养基。

表5.生物反应器生产工艺参数

结果显示在表6和7以及图13A、13B、14A、14B、15A和15C中。

表6.使用和不使用温度变化的结果(平均值)。

表7.使用和不使用温度变化的结果(标准偏差)。

对于两种抗原，温度变化的存在增加三聚体水平，降低HCP，并且增加效价(参见图13A、13B、14A、14B、15A和15B)。

实施例3-糖皮质激素化合物对CHO细胞中RSV F蛋白产生的影响

本实验旨在了解糖皮质激素化合物例如氢化可的松对CHO细胞中产生的亚型A和亚型B的RSV F蛋白的效价和产品质量的影响。

在具有控制器的2L/>生物反应器中使用表8中详述的过程在含有或不含氢化可的松的细胞培养基中进行生产实验。

所有生物反应器均在34.5℃下运行，并在第6天使用生物反应器(B08)将温度变化为31℃。对于RSV F(B)从第0天至第4天和对于RSV F(A)从第0天至第5天以受限方式(Hipdog)提供葡萄糖。

表8.生物反应器生产工艺参数

如图16和17中显示的蛋白质印迹结果所示，氢化可的松对RSV F蛋白的弗林蛋白酶加工具有负面影响。蛋白质印迹允许监测经加工的RSV F(A)或RSV F(B)单体和相关物质。融合前F三聚体被mAb AM14特异性识别(Gilman MS等人,PLoS Pathogens,11(7),2015)。术语“AM14”是指WO2008/147196A2中描述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变结构域。收集结果以监测经加工的RSV F(A)或RSV F(B)单体、部分加工或未加工的F+p27或其他大小变体的加工能力和水平。含有氢化可的松的那些条件的泳道(图16中的B-07、B-04、B-03和A-01以及A-04、A-05、B-03、B-07)呈现直接在RSV条带(约60kDa)上方的模糊带，如通过AM-14抗体的结合鉴定的。模糊带的存在指示部分加工的RSV变体。

因此，有利的是在用于本发明的方法的细胞培养基中不包括氢化可的松或其他相关糖皮质激素化合物，以提高适用于(特别是以三聚体的形式)疫苗组合物的经加工的材料的量。

实施例4-HiPDOG对CHO细胞中RSV F产生的影响

融合前构象的稳定对于RSV蛋白很重要，因为融合后构象在能量上是有利的并且免疫原性较低，其中从融合前到融合后的转变是不可逆的。可以工程化亚型A和B的RSV F蛋白以稳定融合前构象的蛋白质，并且二硫键促成这种稳定性。因此，二硫键完整性可能影响所需构象的稳定性。发现RSV中的亚基间二硫键在最初的补料分批工艺中在较小程度上未配对。发现两个相应的未配对半胱氨酸被半胱氨酰部分修饰。这种修饰被测量并报告为“半胱氨酰化”，这是通过与QDa质量检测器耦合的氨基酸分析测量的。

该实验被设计用于了解HiPDOG对CHO细胞中产生的亚型A和亚型B的RSV F的半胱氨酰化水平的影响。生物反应器参数列于表9。

表9.生物反应器生产工艺参数

当使用HiPDOG对照时，对于RSV F(A)和RSV F(B)抗原，半胱氨酰化水平均降低(表10)。

表10.半胱氨酰化结果

细胞系	条件	半胱氨酰化(％)
			RSV F(A)	没有HiPDOG	7.63
RSV F(A)	有HiPDOG	3.84
			RSV F(B)	没有HiPDOG	2.08
RSV F(B)	有HiPDOG	1.38

此外，当使用HiPDOG时，对于RSV F(A)和RSV F(B)抗原，效价均得到改善(表11)。报告的效价测量是在第一个纯化步骤(超滤)之后。

表11.效价结果

细胞系	条件	超滤池效价(g/L)
			RSV F(A)	没有HiPDOG	0.70
RSV F(A)	有HiPDOG	1.80
			RSV F(B)	没有HiPDOG	1.87
RSV F(B)	有HiPDOG	3.43

实施例5-大规模制造过程

测试了本发明的方法用于大规模使用的适用性。表达亚型A或亚型B的RSV蛋白F的CHO细胞使用HiPDOG、34.5℃的生长温度和31℃的生产温度在第6天进行温度变化的情况下在12天补料分批工艺中培养。如下表12所示，本发明的方法即使在2500或12500L生物反应器中执行时也提供了有利的三聚体效价值。

表12-大规模实验的结果

原始序列列表

SEQ ID NO：1.天然RSV A2的全长F0的氨基酸序列(GenBankGI：138251；SwissProt P03420)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN

SEQ ID NO：2.天然RSV B的全长F0的氨基酸序列(18537株；GenBank GI：138250；Swiss Prot P13843)

MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV

VQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCD

NAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNS

KYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTF

SNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYY

DPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTT

NIMITTIIIVIIVVLLS

LIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK

SEQ ID NO：3：抗体AM14的重链可变结构域的氨基酸序列：

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS

SEQ ID NO：4：抗体AM14的轻链可变结构域的氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV

序列表

<110> 辉瑞大药厂

Breen, Shelby Hutchins

Harrington, Cameron Albert

Jacobs, Michaela Evelina

Lotvin, Jason Arnold

Mulukutla, Bhanu Chandra

Stead, David

Sumit, Madhuresh

<120> 生产RSV F蛋白的细胞培养方法

<130> PC072609

<140> US 63/086,702

<141> 2020-10-02

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> 人呼吸道合胞病毒

<400> 1

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 2

<211> 574

<212> PRT

<213> 人呼吸道合胞病毒

<400> 2

Met Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala

1 5 10 15

Val Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro

100 105 110

Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser

115 120 125

Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Arg Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Met Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

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Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

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Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

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340 345 350

Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly

450 455 460

Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys

565 570

<210> 3

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser His Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Ser

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Ile Val Asp Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu Leu Met

35 40 45

His Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

Claims

1.一种在补料分批细胞培养中生产RSV F蛋白三聚体的方法，所述方法包括以下步骤：

(ii)在约33.0℃和35.0℃之间的温度下培养细胞，以及

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度为约34.5℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中将温度变化为较低温度，优选在约30.0℃和约32.0℃之间。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述较低温度为约31.0℃。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中在第3天和第7天之间将温度变化为较低温度。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中在第5天或第6天将温度变化为较低温度。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用pH传感器监测细胞培养物的pH。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预定pH值对应于所述培养物的pH设定点以上0.01至0.10的增加。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预定pH值对应于所述培养物的pH设定点以上0.05的增加。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的pH设定点在6.70和7.30之间。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的pH设定点在6.90和7.20之间。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的pH设定点在7.00和7.10之间。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的pH设定点为7.05。

14.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中：

-在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段期间，pH设定点为6.95、7.01、7.05、7.07或7.20，并且，

-在以受限方式提供葡萄糖的细胞培养阶段之后，pH设定点为6.90或7.20。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中响应于pH升高到预定pH值以上而向细胞培养物供给葡萄糖包括供给葡萄糖直到pH降低以达到培养物的pH设定点。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从第1天到第6天以受限方式提供葡萄糖。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基不包含糖皮质激素化合物。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基不包含氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、去炎松和醋酸氟氢可的松中的任一种。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基不包含氢化可的松。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基是无血清的。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基不含蛋白质。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基是成分确定的。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中还向所述细胞培养物提供补料培养基。

24.根据权利要求23所述的方法，其中连续地或以多个间隔提供补料培养基。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述补料培养基不包含糖皮质激素化合物。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述补料培养基不包含氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、去炎松和醋酸氟氢可的松中的任一种。

27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基不包含氢化可的松。

28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述补料培养基是无血清的。

29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述补料培养基不含蛋白质。

30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中补料培养基是成分确定的。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中细胞培养期间的最大活细胞密度高于1×10⁶个细胞/mL。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中最大活细胞密度高于5×10⁶个细胞/mL、1×10⁷个细胞/mL、5×10⁷个细胞/mL、1×10⁸个细胞/mL或5×10⁸个细胞/mL。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基的体积为至少500L。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞培养基的体积为至少3000L。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自BALB/c小鼠骨髓瘤系、人视网膜母细胞(PER.C6)、猴肾细胞、人胚肾系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠支持细胞、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞、水牛大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝脏细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5细胞、FS4细胞或人肝癌细胞系(Hep G2)。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是GS-CHO细胞。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RSV F蛋白属于亚型A。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RSV F蛋白属于亚型B。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RSV F蛋白包含使三聚体稳定在融合前构象的突变。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RSV F蛋白包含选自以下的突变组合：

(1)T103C、I148C、S190I和D486S的组合；

(2)T54H S55C L188C D486S的组合；

(3)T54H、T103C、I148C、S190I、V296I和D486S的组合；

(4)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I和N371C的组合；

(5)S55C、L188C和D486S的组合；

(6)T54H、S55C、L188C和S190I的组合；

(7)S55C、L188C、S190I和D486S的组合；

(8)T54H、S55C、L188C、S190I和D486S的组合；

(9)S155C、S190I、S290C和D486S的组合；

(11)T54H、S155C、S190I、S290C和V296I的组合。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，还包括获得由所述细胞生产的RSV F蛋白三聚体。

43.根据权利要求41所述的方法，还包括纯化所述RSV F蛋白三聚体。

44.一种药物组合物，其包含通过根据权利要求42所述的方法获得的纯化的RSV F蛋白三聚体以及药学上可接受的承载体。