RU2679605C2 - Biological microchips fluorimetric analyzer - Google Patents
Biological microchips fluorimetric analyzer Download PDFInfo
- Publication number
- RU2679605C2 RU2679605C2 RU2016148663A RU2016148663A RU2679605C2 RU 2679605 C2 RU2679605 C2 RU 2679605C2 RU 2016148663 A RU2016148663 A RU 2016148663A RU 2016148663 A RU2016148663 A RU 2016148663A RU 2679605 C2 RU2679605 C2 RU 2679605C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biochip
- cells
- fluorescence
- dye
- analyzer
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims abstract description 117
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 74
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 24
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 21
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 5
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 claims 1
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 14
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 11
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 abstract description 11
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 abstract description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 16
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- LOPCOKFMJOYXHI-UHFFFAOYSA-N Cy7 dye Chemical compound C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2CC(C=CC=CC=CC=C3N(C4=CC=C(C=C4C3)S(O)(=O)=O)CC)=[N+](CCCCCC(O)=O)C2=C1 LOPCOKFMJOYXHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000005338 frosted glass Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 238000000492 total internal reflection fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000001454 recorded image Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Предлагаемое изобретение относится к молекулярной биологии, биофизике, биохимии, биоорганической химии, биотехнологии и фармакологии, в частности, к количественной люминесцентной микроскопии, применяемой в приборах, предназначенных для регистрации взаимодействий между биологическими молекулами, помеченными красителем, флуоресцирующим в видимой или инфракрасной (ИК) области спектра, и молекулярными зондами, иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа (биочипа). В результате взаимодействия флуоресцентно меченных молекул анализируемого вещества с зондами соответствующие ячейки начинают флуоресцировать при возбуждении светом в определенной длине волны. Разработанное устройство представляет собой анализатор изображений биочипов и предназначено для измерения интенсивности флуоресценции ячеек биочипа. Анализатор позволяет проводить измерения в трех длинах волн от 380 нм до 850 нм при возбуждении флуоресценции расфокусированным лазерным излучением и содержит устройство подавления спеклов, возникающих вследствие интерференции когерентного света на подложке биочипа. Применение предлагаемого анализатора позволяет определять относительные количества флуоресцирующих красителей в ячейках биочипа с точностью до 10%. Увеличение диапазона измеряемых величин интенсивности флуоресценции достигается путем регистрации серии изображений биочипа на ПЗС камеру с различными экспозициями.The present invention relates to molecular biology, biophysics, biochemistry, bioorganic chemistry, biotechnology and pharmacology, in particular, to quantitative luminescent microscopy used in devices designed to record interactions between biological molecules labeled with a dye that fluoresces in the visible or infrared (IR) region spectrum, and molecular probes immobilized in the cells of a biological microchip (biochip). As a result of the interaction of fluorescently labeled molecules of the analyte with the probes, the corresponding cells begin to fluoresce when excited by light at a specific wavelength. The developed device is a biochip image analyzer and is intended to measure the fluorescence intensity of biochip cells. The analyzer allows measurements at three wavelengths from 380 nm to 850 nm upon excitation of fluorescence by defocused laser radiation and contains a device for suppressing speckles arising from interference of coherent light on a biochip substrate. The use of the proposed analyzer allows you to determine the relative amount of fluorescent dyes in the cells of the biochip with an accuracy of 10%. An increase in the range of measured values of fluorescence intensity is achieved by recording a series of images of the biochip on a CCD camera with different exposures.
Уровень техникиState of the art
Биологическим микрочипом или биочипом называется матрица микроячеек, регулярно расположенных на плоской подложке (Venkatasubbarao S. 2004. Microarrays-status and prospects. Trends Biotechnol. 22: 630-637). Размер ячеек и расстояние между ними могут варьироваться от нескольких микрон до сотен микрон. В каждой ячейке биочипа иммобилизованы молекулы одного типа (молекулярные зонды), способные с высокой степенью специфичности связывать определенные биомолекулы исследуемого раствора, нанесенного на поверхность биочипа. Биочипы используются для выявления специфических последовательностей ДНК, включая экспрессию генов, нуклеотидные инверсии, замены и вставки, а также для иммунологических анализов (Roger Bumgarner. 2013. DNA microarrays: Types, Applications and their future. Curr Protoc Mol Biol. Jan; 0 22: Unit-22.1).A biological microchip or biochip is a matrix of microcells regularly located on a flat substrate (Venkatasubbarao S. 2004. Microarrays-status and prospects. Trends Biotechnol. 22: 630-637). The cell size and the distance between them can vary from a few microns to hundreds of microns. In each cell of the biochip, molecules of the same type (molecular probes) are immobilized, capable of binding to a high degree of specificity certain biomolecules of the test solution deposited on the surface of the biochip. Biochips are used to detect specific DNA sequences, including gene expression, nucleotide inversions, substitutions and insertions, and for immunological analyzes (Roger Bumgarner. 2013. DNA microarrays: Types, Applications and their future. Curr Protoc Mol Biol. Jan; 0 22: Unit-22.1).
Биомолекулы исследуемого раствора, предварительно помеченные флуоресцирующим красителем, связываются с различными молекулярными зондами с большим или меньшим сродством, что приводит к разной степени свечения ячеек биочипа. По интенсивности свечения ячеек биочипа судят об эффективности образования соответствующих комплексов (Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович В.М., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е. и Заседателев А.С. 2004. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы. Молекулярная биология, 38: 5-16; Miller, М. В., & Tang, Y.-W. 2009. «Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology.». Clinical Microbiology Reviews 22(4): 611-633). В зависимости от природы флуорохрома и типа ячеек биочипа используют различные способы возбуждения и регистрации флуоресценции (Simultaneous measurement of gene expression and genomic abnormalities using nucleic acid microarrays. US patent 6251601 B1, 1999; Method and system for detecting fluorescence from microarray disk US patent 7794661 B2, 2010; Fluorescence enhanced microarray biochip based on micro/nano periodic structures and method for preparing same. China patent CN 102901715 A).Biomolecules of the test solution, pre-labeled with a fluorescent dye, bind to various molecular probes with greater or lesser affinity, which leads to different degrees of luminescence of the biochip cells. By the intensity of the luminescence of the biochip cells, the formation efficiency of the corresponding complexes is judged (Kolchinsky AM, Gryadunov D.A., Lysov Yu.P., Mikhailovich V.M., Nasedkina T.V., Turygin A.Yu., Rubina A.Yu. , Barsky V.E. and Zasedatelev A.S. 2004. Microchips based on three-dimensional gel cells: history and prospects, Molecular Biology, 38: 5-16; Miller, M.V., & Tang, Y.-W. 2009 . "Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology.". Clinical Microbiology Reviews 22 (4): 611-633). Depending on the nature of the fluorochrome and the type of biochip cells, various methods of excitation and registration of fluorescence are used (Simultaneous measurement of gene expression and genomic abnormalities using nucleic acid microarrays. US patent 6251601 B1, 1999; Method and system for detecting fluorescence from microarray disk US patent 7794661 B2 , 2010; Fluorescence enhanced microarray biochip based on micro / nano periodic structures and method for preparing the same. China patent CN 102901715 A).
Приборы для регистрации результатов анализов, проводящихся с помощью биологических микрочипов, выпускаются многими фирмами и различаются по способу получения и анализа изображений (George Cortese. Microarray readers. Pushing the envelope. The Scientist, 2001, Vol. 15, стр. 24).Devices for recording the results of analyzes carried out using biological microarrays are manufactured by many companies and differ in the method of obtaining and analyzing images (George Cortese. Microarray readers. Pushing the envelope. The Scientist, 2001, Vol. 15, p. 24).
Наиболее часто для получения изображений биологических микрочипов и анализа этих изображений используются приборы, основанные на сканировании биологических объектов лазерным лучом в сочетании с конфокальной оптикой (Optical systems for microarray scanning US patent 7706419 B26 2005; Method and apparatus for scanned beam microarray assay US 20070081163 A1, 2007; Biological microarray line scanning method and system US 7791013 B2). В значительной степени это связано с тем, что наиболее широко используются биологические микрочипы, в которых зонды нанесены в виде мономолекулярного слоя на поверхности подложки, образуя двумерные (2D) ячейки. Интенсивность флуоресценции 2D ячеек сравнительно слабая, и для регистрации сигналов таких микрочипов требуется высокочувствительный детектор света (Fodor (1997) "Genes, Chips and the Human Genome." FASEB Journal 11:A879). В некоторых работах описано сканирование объекта модулированным по яркости тонким лазерным лучом (US patent 6329661).Most often, devices based on laser scanning of biological objects in combination with confocal optics are used to obtain images of biological microarrays and optical images (Optical systems for microarray scanning US patent 7706419 B26 2005; Method and apparatus for scanned beam microarray assay US 20070081163 A1, 2007; Biological microarray line scanning method and system US 7791013 B2). To a large extent, this is due to the fact that biological microarrays are most widely used, in which the probes are applied as a monomolecular layer on the surface of the substrate, forming two-dimensional (2D) cells. The fluorescence intensity of 2D cells is relatively weak, and the detection of signals from such microarrays requires a highly sensitive light detector (Fodor (1997) "Genes, Chips and the Human Genome." FASEB Journal 11: A879). Some studies have described scanning an object with a brightness-modulated thin laser beam (US patent 6329661).
В приборах для анализа биочипов, содержащих 2D ячейки, тонкий луч лазерного излучения последовательно возбуждает флуоресценцию разных участков поверхности биочипа, которые регистрируются приемником света, и затем, в результате компьютерной обработки, воссоздается полное изображение флуоресцирующих ячеек. Применение системы конфокальности, при которой в плоскости изображения биочипа располагается диафрагма, соответствующая по размеру диаметру возбуждающего лазерного луча, позволяет добиться высокой чувствительности и обнаруживать по флуоресценции даже единичные флуоресцирующие молекулы (Dietrich Wilhelm Karl Lueerssen Apparatus for imaging single molecules/ Patent application WO 2008032096 A2). Конфокальное лазерное сканирование применяется не только для анализа биочипов, но и для высокочувствительного анализа многих других объектов, расположенных на плоской не флуоресцирующей подложке. Общим ограничением подобного подхода является необходимость поточечного сканирования объекта тонким лазерным лучом, что приводит к увеличению времени регистрации и уменьшению производительности прибора. Кроме того, сканирование и конфокальная регистрация осуществляются с помощью прецизионных механических устройств, что приводит к удорожанию приборов.In devices for the analysis of biochips containing 2D cells, a thin laser beam sequentially excites fluorescence of different parts of the biochip surface, which are detected by the light receiver, and then, as a result of computer processing, a complete image of the fluorescent cells is recreated. The use of a confocal system in which a diaphragm corresponding in size to the diameter of the exciting laser beam is located in the biochip image plane allows one to achieve high sensitivity and detect even single fluorescent molecules by fluorescence (Dietrich Wilhelm Karl Lueerssen Apparatus for imaging single molecules / Patent application WO 2008032096 A2) . Confocal laser scanning is used not only for biochip analysis, but also for highly sensitive analysis of many other objects located on a flat, non-fluorescent substrate. A common limitation of this approach is the need for point-to-point scanning of an object with a thin laser beam, which leads to an increase in the recording time and a decrease in the productivity of the device. In addition, scanning and confocal recording are carried out using precision mechanical devices, which leads to an increase in the cost of instruments.
В некоторых приборах для возбуждения флуоресценции ячеек биочипа при сканировании изображения используют мощные пульсирующие лампы. Так, в патенте US 6377346 описано устройство, включающее несколько источников света и вращающееся зеркало. В качестве источников света в этом патенте указаны пульс-лампы, а вращающееся зеркало служит для переключения источников света. В описанной оптической схеме происходят очень большие потери света: при мощности источников возбуждающего излучения около 50W приемником света должна быть охлаждаемая ПЗС камера. Данное устройство не предназначено для подавления спеклов и для увеличения диапазона измеряемых величин.In some devices, powerful pulsed lamps are used to excite the fluorescence of the biochip cells when scanning the image. So, in the patent US 6377346 describes a device that includes several light sources and a rotating mirror. Pulse lamps are indicated as light sources in this patent, and a rotating mirror is used to switch light sources. In the described optical scheme, very large losses of light occur: when the power of the sources of exciting radiation is about 50W, the light receiver must be a cooled CCD camera. This device is not intended to suppress speckles and to increase the range of measured values.
Для некоторых специальных типов микрочипов, в которых все ячейки расположены вдоль одной прямой, описан прибор, основанный на использовании для возбуждения флуоресценции модулированного по яркости лазерного луча, диаметр которого совпадает с диаметром ячеек микрочипа (A biochip scanner device WO 2001065241 A1, 2001). Этот подход непригоден для измерения флуоресценции стандартных микрочипов, в которых ячейки расположены на подложке в виде серии параллельных рядов.For some special types of microchips in which all cells are located along one straight line, a device is described based on the use of a laser beam modulated by brightness to excite fluorescence, the diameter of which coincides with the cell diameter of the microchip (A biochip scanner device WO 2001065241 A1, 2001). This approach is unsuitable for measuring the fluorescence of standard microarrays in which the cells are arranged on a substrate in the form of a series of parallel rows.
Наряду с лазерными анализаторами, для визуального наблюдения и цифровой регистрации изображений флуоресцирующих биологических объектов используют люминесцентные микроскопы - приборы, в которых излучение от источника света возбуждает флуоресценцию большого участка объекта, при этом изображение анализируемого объекта в свете его люминесценции анализируется либо визуально, либо регистрируется с помощью приемника света (фотопленки, ПЗС или КМОП камеры). Достоинствами такого типа приборов является возможность одновременного получения изображения в свете флуоресценции всех участков поля зрения прибора, и высокая производительность, позволяющая анализировать сотни образцов за рабочую смену. Размер флуоресцирующего участка в этих приборах определяется увеличением микроскопа и может варьировать от десятков квадратных микрон до десятков квадратных миллиметров. При этом визуализируется и измеряется тотальная интенсивность флуоресценции участков объекта по всей его глубине, в отличие от послойной регистрации флуоресценции, осуществляемой с помощью конфокального сканирования. Благодаря отмеченным особенностям люминесцентных микроскопов, их использование оказывается предпочтительным при работе с трехмерными ячейками биочипов, в которых флуоресцентная метка распределена по всему объему ячейки.Along with laser analyzers, for visual observation and digital recording of images of fluorescent biological objects, luminescent microscopes are used - devices in which radiation from a light source excites fluorescence of a large part of the object, while the image of the analyzed object in the light of its luminescence is analyzed either visually or recorded using light receiver (film, CCD or CMOS camera). The advantages of this type of device are the ability to simultaneously obtain an image in the light of fluorescence of all areas of the field of view of the device, and high performance, allowing you to analyze hundreds of samples per shift. The size of the fluorescent portion in these instruments is determined by the magnification of the microscope and can vary from tens of square microns to tens of square millimeters. In this case, the total fluorescence intensity of the object sections along its entire depth is visualized and measured, in contrast to the layer-by-layer fluorescence recording carried out by means of confocal scanning. Due to the noted features of luminescent microscopes, their use is preferable when working with three-dimensional cells of biochips in which a fluorescent label is distributed throughout the cell volume.
В патенте US 20050110998 описано устройство получения изображений биочипов в свете их флуоресценции. Источником возбуждающего излучения в данном устройстве является широкополосная лампа, которая не дает когерентного излучения и, соответственно, не дает спеклов. Оптическая схема устройства предназначена для увеличения равномерности интенсивности освещенности поля зрения, в котором находится биочип. Недостатками такого устройства является бесполезный расход энергии, излучаемой широкополосной лампой, необходимость использования интерференционных фильтров в ходе мощного возбуждающего излучения, приводящее к их быстрому выгоранию, сложность оптической и электронной схем, что все вместе ограничивает применимость данного устройства только научными исследованиями.US 20050110998 describes a device for acquiring biochip images in the light of their fluorescence. The source of exciting radiation in this device is a wide-band lamp, which does not produce coherent radiation and, accordingly, does not give speckles. The optical scheme of the device is designed to increase the uniformity of the intensity of illumination of the field of view in which the biochip is located. The disadvantages of such a device are the useless consumption of energy emitted by a broadband lamp, the need to use interference filters during powerful exciting radiation, leading to their rapid burnout, the complexity of the optical and electronic circuits, which together limits the applicability of this device only to scientific research.
Для флуоресцентного анализа объектов, расположенных на предметных стеклах, ведущие фирмы, выпускающие микроскопы (Nikon, Leitz, etc.), применяют для возбуждения флуоресценции объектов освещение лазерными лучами, введенными в торец предметного стекла, так называемая Total Internal Reflection Fluorescence или TIRF микроскопия (Axelrod, D. 1981. "Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence". The Journal of Cell Biology. 89 141-145). При таком способе освещения лазерные лучи распространяются по толще предметного стекла, подчиняясь закону полного внутреннего отражения, и возбуждают флуоресценцию объектов, находящихся на поверхности этого стекла. В местах неоднородностей подложки происходит возбуждение флуоресценции находящихся на ее поверхности ячеек микрочипа. Основным недостатком данного метода является то, что он пригоден только для определенного типа подложек, а именно, для прозрачных стеклянных или пластиковых предметных стекол. При использовании приборов, основанных на этом принципе, следует учитывать также наличие паразитного свечения вследствие нарушения полного внутреннего отражения возбуждающего света в местах неоднородностей прозрачной поверхности подложки (царапины, вкрапления примесей, соринки). Этот подход не нашел применения для количественного анализа биочипов ввиду высоких требований, предъявляемых к качеству и геометрии подложки биочипа.For fluorescence analysis of objects located on glass slides, leading companies producing microscopes (Nikon, Leitz, etc.) use the so-called Total Internal Reflection Fluorescence or TIRF microscopy (laser Axelrod) to excite fluorescence of objects with laser beams inserted into the end of the glass. , D. 1981. "Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence." The Journal of Cell Biology. 89 141-145). With this method of illumination, laser beams propagate through the thickness of the glass slide, obeying the law of total internal reflection, and excite the fluorescence of objects located on the surface of this glass. In places of substrate heterogeneity, fluorescence of microchip cells located on its surface is excited. The main disadvantage of this method is that it is suitable only for a certain type of substrate, namely, for transparent glass or plastic slides. When using devices based on this principle, one should also take into account the presence of spurious glow due to a violation of the total internal reflection of the exciting light in the areas of inhomogeneities of the transparent surface of the substrate (scratches, impurities, impurities). This approach has not found application for the quantitative analysis of biochips due to the high requirements for the quality and geometry of the substrate of the biochip.
Для количественного анализа флуоресценции ячеек микрочипов, расположенных на непрозрачных подложках, применяют также стандартную широкопольную люминесцентную микроскопию (Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике Д.А. Грядунов, Д.В. Зименков, В.М. Михайлович, Т.В. Наседкина, Е.И. Дементьева, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, В.Е. Барский, А.С. Заседателев. Медицинский алфавит. Лаборатория 3, 2009, стр. 10-14. Биофизические методы для анализа биологических микрочипов, применение широкопольной цифровой люминесцентной микроскопии. В.Е. Барский, Е.Е. Егоров, Э.Я. Крейндлин, Ю.П. Лысов, С.В. Паньков, Д.А. Юрасов, Р.А. Юрасов, А.С. Заседателев, Биофизика, 2012, том 57, вып. 3, с. 522-527). В таких приборах для возбуждения флуоресценции применяется либо освещение мощными светодиодами, либо расфокусированными лазерными лучами.For the quantitative analysis of the fluorescence of microarray cells located on opaque substrates, standard wide-field luminescent microscopy is also used (Hydrogel biochip technology and its application in medical laboratory diagnostics D.A. Gryadunov, D.V. Zimenkov, V.M. Mikhailovich, T.V. Nasedkina, EI Dementieva, AY Rubin, SV Pankov, VE Barsky, AS Zasedatelev, Medical Alphabet,
В современных стандартных люминесцентных микроскопах, часто используется комбинация мощных светодиодов и соответствующих интерференционных фильтров для выделения спектральных областей возбуждения и флуоресценции - так называемые возбуждающие и запирающие фильтры (см. каталоги люминесцентных микроскопов фирм Leitz, Nikon, Olimpus, Zeiss, и каталоги фильтров фирм Semrock, Omega Opticals и др.). Поскольку светодиоды не являются точечными источниками света, и пучок света от них является сильно неравномерным в поперечном сечении, в микроскопии применяют различные устройства для достижения равномерности освещения анализируемого поля зрения. Так, в микроскопах фирмы Olimpus для равномерного освещения поля зрения микроскопа используют золь-гелевый жгут (Laurie J., Bagnall С.М. et al. 1992, Colloidal suspensions for the preparation of ceramics by a freeze casting route // Journal of Non-Crystalline Solids - vol. 147-148, pp. 320-325). При освещении одного торца жгута мощным светом, даже при большой неравномерности яркости в поперечном сечении, на выходе наблюдается равномерно светящийся торец, который проецируется на объект с помощью светоделительного кубика и интерференционных возбуждающих фильтров. К сожалению, такое устройство недолговечно, раствор геля портится со временем и требует периодической замены.In modern standard luminescent microscopes, a combination of high-power LEDs and corresponding interference filters is often used to highlight the spectral regions of excitation and fluorescence - the so-called excitation and blocking filters (see catalogs of luminescent microscopes from Leitz, Nikon, Olimpus, Zeiss, and filter catalogs from Semrock, Omega Opticals et al.). Since LEDs are not point sources of light, and the light beam from them is very uneven in cross section, various devices are used in microscopy to achieve uniform illumination of the analyzed field of view. So, in Olimpus microscopes, a sol-gel tourniquet is used to uniformly illuminate the field of view of the microscope (Laurie J., Bagnall S.M. et al. 1992, Colloidal suspensions for the preparation of ceramics by a freeze casting route // Journal of Non- Crystalline Solids - vol. 147-148, pp. 320-325). When illuminating one end of the bundle with powerful light, even with a large unevenness of brightness in the cross section, a uniformly luminous end face is observed at the output, which is projected onto the object using a beam splitting cube and interference excitation filters. Unfortunately, such a device is short-lived, the gel solution deteriorates with time and requires periodic replacement.
Вместе с тем, для анализа изображений флуоресцирующих объектов, в частности, трехмерных биологических микрочипов, применяют широкопольную люминесцентную микроскопию в сочетании с точечными источниками света - лазерными светодиодами. Поскольку биочипы, как правило, занимают относительно большую площадь подложки, для измерения интенсивности флуоресценции отдельных ячеек, расположенных на значительном расстоянии друг от друга, не подходят стандартные объективы для микроскопии, в этих приборах применяют пару высокоапертурных фотографических объективов. (Биофизические методы для анализа биологических микрочипов, применение широкопольной цифровой люминесцентной микроскопии. В.Е. Барский, Е.Е. Егоров, Э.Я. Крейндлин, Ю.П. Лысов, С.В. Паньков, Д.А. Юрасов, Р.А. Юрасов, А.С. Заседателев, Биофизика, 2012, том 57, вып. 3, с. 522-527). В этом случае возбуждение флуоресценции объектов, расположенных в поле зрения микроскопа, производится лазерными лучами, освещающими все анализируемое поле зрения микрокопа, а детектором изображения служит ПЗС камера. Анализаторы биочипов, основанные на таком принципе, обладают достаточной чувствительностью для регистрации флуоресценции трехмерных гелевых ячеек, содержащих флуорохром, и высокой производительностью, что существенно в клинической диагностике при проведении серийных однотипных анализов. (D. Gryadunov, V. Mikhailovich, S. Lapa, N. Roudinskii, M. Donnikov, S. Pan'kov, O. Markova, A. Kuz'min, L. Chemousova, O. Skotnikova, A. Moroz, A. Zasedatelev and A. Mirzabekov. 2005 Evaluation of hybridization on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis). В отличие от лазерных сканаторов такие анализаторы биочипов одновременно регистрируют интенсивность флуоресценции всех ячеек биочипа, находящихся в поле зрения прибора, что позволяет в случае необходимости следить за кинетикой процессов, проходящих в разных ячейках (UV fluorescence of tryptophan residues effectively measures protein binding to nucleic acid fragments immobilized in gel elements of microarrays. O. Zasedateleva, V. Vasiliskov, S. Surzhikov, A. Sazykin, L. Putlyaeva, A. Schwarz, D. Kuprash, A. Rubina, V. Barsky and A. Zasedatelev Biotechnol. J. 2014, 9). Высокая скорость получения изображения позволяет регистрировать за рабочую смену результаты сотен анализов (Clinical microbiology and infection. Vol 11: p. 531-539. И.М. Сон, A.M. Мороз, CA. Стерликов, Е.И. Скачкова, Е.Ю. Носова, К.Ю. Галкина, М.А. Краснова, А.А. Букатина. Руководство по выявлению микобактерий туберкулеза и определению лекарственной чувствительности с использованием биологических микрочипов». Москва, РИО ЦНИИОИЗ, 2009, 56 с.). Подобные приборы нашли применение для регистрации результатов некоторых типов анализов, проводимых с помощью биочипов, в ячейках которых иммобилизованы фрагменты ДНК.At the same time, for the analysis of images of fluorescent objects, in particular, three-dimensional biological microarrays, wide-field luminescent microscopy is used in combination with point light sources - laser LEDs. Since biochips, as a rule, occupy a relatively large area of the substrate, standard microscopic lenses are not suitable for measuring the fluorescence intensity of individual cells located at a considerable distance from each other; a couple of high-aperture photographic lenses are used in these devices. (Biophysical methods for the analysis of biological microarrays, the use of wide-field digital luminescent microscopy. V.E. Barsky, E.E. Egorov, E.Ya. Kreindlin, Yu.P. Lysov, S.V. Pankov, D.A. Yurasov, R.A. Yurasov, A.S. Zasedatelev, Biophysics, 2012, Volume 57,
Особенностью освещения лазерными лучами является когерентность излучения. Когерентное излучение лазера приводит к эффекту интерференции на освещаемом объекте, выражающемуся в появлении так называемых спеклов - участков с большей и меньшей интенсивностью освещения (М. Франсон, Оптика спеклов, пер. с франц. М., 1980; Laser speckle and related phenomena, Ed. by J.C. Dainty, 2 ed. 1984). Наличие спеклов не влияет на результаты измерений, проводящихся путем сканирования объекта узким лазерным лучом, в то же время, при использовании анализатора биочипов, в котором для возбуждения флуоресценции применяют расфокусированное лазерное излучение, спеклы, неизбежно возникающие на подложке, понижают точность получаемых результатов. Именно этим объясняется недостаточно широкое применение анализаторов, в которых используется возбуждение флуоресценции всего поля зрения расфокусированным лазерным лучом, поскольку разница в освещенности светлых и темных участков поля зрения, вызванная наличием спеклов, может составлять 50% и более (Laser speckle and related phenomena, ed. By J.C. Dainty, 2 ed., 1984).A feature of laser light illumination is the coherence of radiation. Coherent laser radiation leads to the effect of interference on the illuminated object, expressed in the appearance of so-called speckles - areas with higher and lower illumination intensities (M. Franson, Speckle Optics, trans. From French M., 1980; Laser speckle and related phenomena, Ed . by JC Dainty, 2 ed. 1984). The presence of speckles does not affect the results of measurements carried out by scanning the object with a narrow laser beam, while using a biochip analyzer, in which defocused laser radiation is used to excite fluorescence, speckles that inevitably arise on the substrate reduce the accuracy of the results. This explains the insufficiently widespread use of analyzers that use the excitation of fluorescence of the entire field of view with a defocused laser beam, since the difference in illumination of light and dark portions of the field of view due to the presence of speckles can be 50% or more (Laser speckle and related phenomena, ed. By JC Dainty, 2 ed., 1984).
Одним из способов уменьшения выраженности спеклов является применение волоконно-оптических осветителей с различающейся длиной индивидуальных волокон (D.S. Mehta, D.N. Naik, R.K. Singh, and M. Takeda, Applied Optics 51, 1894, 2012). Благодаря различию в длине пути лазерных лучей в разных волокнах, свет на выходе из волоконно-оптического жгута имеет разную фазу. Изменение соотношения длин оптических волокон формирует на объекте разную степень выраженности спеклов (Т. Tsuji, Т. Asakura, and Н. Fujii, Opt. Quant. Electron. 16, 197, 1984). Чем длиннее волоконно-оптический жгут, чем больше в нем волокон, и, чем больше разница длин индивидуальных волокон, тем менее выражены будут спеклы. Хорошее подавление спеклов достигается при длинах волоконно-оптического жгута существенно больше 20 м. Однако жгут такого размера имеет довольно большие размеры и не может быть применен в портативных устройствах. Другим способом подавления спеклов является применение жидкокристаллических фильтров с постоянно изменяющейся структурой кристалла (http://www.optotune.com/products/laser-speckle-reducers). Свет, проходя через такую структуру, частично теряет когерентность, что приводит к уменьшению выраженности спеклов. Однако коэффициент подавления спеклов в таких устройствах обычно невелик и позволяет понизить флуктуации освещенности только до 50% по полю зрения.One way to reduce speckle severity is to use fiber optic illuminators with varying lengths of individual fibers (D.S. Mehta, D.N. Naik, R.K. Singh, and M. Takeda, Applied Optics 51, 1894, 2012). Due to the difference in the path length of the laser beams in different fibers, the light at the exit from the fiber optic bundle has a different phase. A change in the ratio of the lengths of optical fibers forms a different degree of speckle severity on the object (T. Tsuji, T. Asakura, and N. Fujii, Opt. Quant. Electron. 16, 197, 1984). The longer the fiber optic bundle, the more fibers in it, and the greater the difference in lengths of individual fibers, the less pronounced speckles will be. Good speckle suppression is achieved when the length of the fiber optic bundle is significantly greater than 20 m. However, the bundle of this size is quite large and cannot be used in portable devices. Another way to suppress speckles is to use liquid crystal filters with a constantly changing crystal structure (http://www.optotune.com/products/laser-speckle-reducers). Light passing through such a structure partially loses coherence, which leads to a decrease in the severity of speckles. However, the speckle suppression coefficient in such devices is usually small and allows one to reduce illumination fluctuations by only 50% in the field of view.
В работе Squire и Basyiaens (Journal of Microscopy, 1999, V. 193, pp. 36-49) описан способ подавления спеклов, основанный на вращении матового стекла. Когерентный свет рассеивается на матовом стекле, причем постоянное вращение стекла обеспечивает эффективное «размазывание» спеклов, практические полное подавление их. Недостатком этого метода являются сильные потери света на матовом стекле, что заставляет авторов применять довольно мощный газовый лазер (мощностью до 1 Вт) и высокочувствительную охлаждаемую ПЗС камеру.Squire and Basyiaens (Journal of Microscopy, 1999, V. 193, pp. 36-49) describe a speckle suppression method based on the rotation of frosted glass. Coherent light is scattered on the frosted glass, and the constant rotation of the glass provides effective “smearing” of speckles, practical complete suppression of them. The disadvantage of this method is the strong loss of light on the frosted glass, which forces the authors to use a rather powerful gas laser (with a power of up to 1 W) and a highly sensitive cooled CCD camera.
В американском патенте US patent 6329661 описано устройство в котором анализ биочипов производится путем возбуждения флуоресценции тонким, модулированным по интенсивности лазерным источником и воссоздания изображения по результатам сканирования. Приемником возбуждающего излучения служит фотодиод или фотоумножитель. Действительно, при сканировании объекта малым зондом спеклы меньше влияют на точность измерения, однако при этом возникают другие трудности: необходимость использования высокоточных механических деталей, сложная электрическая схема, увеличение времени получения изображения, невозможность одновременного наблюдения за процессами, происходящими в разных ячейках биочипа.In US patent US patent 6329661 describes a device in which the analysis of biochips is performed by excitation of fluorescence with a thin, intensity-modulated laser source and the reconstruction of the image from the scan results. The excitation radiation receiver is a photodiode or photomultiplier. Indeed, when scanning an object with a small probe, speckles less affect the measurement accuracy, but other difficulties arise: the need to use high-precision mechanical parts, a complicated electrical circuit, an increase in the time it takes to get an image, and the impossibility of simultaneously observing processes occurring in different cells of the biochip.
В нашей недавней работе, посвященной сравнению способов подавления спеклов в анализаторах биочипов, основанных на принципе широкопольной люминесцентной микроскопии (Биофизика, 2015, том 60, вып. 6, с. 1198-1202), для подавления спеклов использовали комбинацию кольцевого волоконно-оптического осветителя и устройства для механического перемещения торцов оптических волокон, идущих к лазеру. Кольцевой осветитель обеспечивал равномерное освещение поля зрения прибора, а торцы волокон волоконно-оптического осветителя, направленные к лазерному диоду, подвергали возвратно-поступательному перемещению с помощью вибратора. В результате такого перемещения, на конце пучка волокон, идущих к лазеру, возникает постоянно меняющаяся картина спеклов. По мере увеличения амплитуды перемещения волокон, спеклы становятся менее выраженными. Аналогичный способ подавления спеклов был предложен в работе Kwakwa et. al. (J. Biophotonics, 2016, No. 9, 948-957). Недостатком устройства, основанного на таком принципе, способа является необходимость механического перемещения оптических волокон, что уменьшает их срок службы и меняет светопропускание.In our recent work on the comparison of speckle suppression methods in biochip analyzers based on the principle of wide-field fluorescence microscopy (Biophysics, 2015, Volume 60,
Еще одним ограничением анализаторов биочипов, основанных на принципе широкопольной люминесцентной микроскопии, является невысокий диапазон измеряемых яркостей объекта, что связано с размером индивидуальных пикселей и/или разрядностью АЦП, применяемых в детекторах изображения (ПЗС или КМОП камера). Это ограничение существенно в тех случаях, когда необходимо анализировать с высокой точностью объекты, различающиеся по яркости на несколько порядков. При анализе двумерных чипов с помощью метода сканирования детектором света является фотоумножитель с диапазоном измерения яркостей, достигающим нескольких порядков (см., например, продукцию фирмы Hamamatsu).Another limitation of biochip analyzers based on the principle of wide-field fluorescence microscopy is the low range of measured brightness of an object, which is associated with the size of individual pixels and / or the resolution of ADCs used in image detectors (CCD or CMOS camera). This limitation is significant in cases when it is necessary to analyze objects with high accuracy that differ in brightness by several orders of magnitude. When analyzing two-dimensional chips using the scanning method, the light detector is a photomultiplier with a brightness measurement range reaching several orders of magnitude (see, for example, Hamamatsu products).
В цифровой фотографии, используют светочувствительные матрицы с высоким разрешением и малым размером пикселя и, соответственно, с малым диапазоном регистрируемых яркостей. В связи с этим, в фотографии способ получения изображения объектов, резко различающихся по своей яркости, реализуется с помощью метода, называемого HDR (High Dynamic Range), позволяющего автоматически или вручную получать изображение объекта при разных заранее выбранных экспозициях, и затем «склеивать» полученные кадры (http://www.stuckincustoms.com/hdr-photography). Этот метод широко применяется при фотографировании контрастных объектов и позволяет уменьшить общий контраст получаемых снимков, либо наоборот увеличить контраст некоторых участков снимка. В его стандартном применении в широкопольной микроскопии метод не используется для получения точных количественных данных о яркости участков поля зрения, различающихся по интенсивности флуоресценции содержащихся в них красителей в сотни раз, что необходимо при анализе биочипов.In digital photography, light-sensitive matrices with high resolution and small pixel size and, accordingly, with a small range of recorded brightness are used. In this regard, in photography, the method of obtaining images of objects that differ sharply in brightness is implemented using a method called HDR (High Dynamic Range), which allows you to automatically or manually obtain an image of an object at different pre-selected exposures, and then “glue” the resulting frames (http://www.stuckincustoms.com/hdr-photography). This method is widely used when photographing contrasting objects and allows you to reduce the overall contrast of the resulting images, or vice versa to increase the contrast of some parts of the image. In its standard application in wide-field microscopy, the method is not used to obtain accurate quantitative data on the brightness of areas of the visual field, which differ in the fluorescence intensity of the dyes contained in them hundreds of times, which is necessary when analyzing biochips.
При решении ряда задач часто возникает необходимость параллельного анализа взаимодействий различных соединений с молекулярными зондами, иммобилизованными в ячейках биочипов. В этом случае каждое анализируемое соединение связывают с красителем, спектральные характеристики которого отличаются от таковых, применяемых для других соединений, а измерения проводят в условиях, специфичных для каждого применяемого красителя. При этом возникает возможность количественного анализа связывания какого-либо соединения, помеченного красителем, с зондами, иммобилизованными в ячейках биочипа, исключая влияние других соединений, помеченных другими красителями.In solving a number of problems, the need often arises for a parallel analysis of the interactions of various compounds with molecular probes immobilized in biochip cells. In this case, each test compound is associated with a dye whose spectral characteristics differ from those used for other compounds, and measurements are carried out under conditions specific to each dye used. In this case, it becomes possible to quantify the binding of a compound labeled with a dye with probes immobilized in the cells of the biochip, excluding the influence of other compounds labeled with other dyes.
В широкопольной флуоресцентной микроскопии такой подход реализуется с помощью специальных устройств (сменных опак-иллюминаторов), позволяющих перестраивать спектральные диапазоны возбуждения и регистрации флуоресценции. Имеющиеся в настоящее время цифровые люминесцентные анализаторы биочипов, основанные на принципе широкопольной цифровой люминесцентной микроскопии, пригодны для визуального или полуколичественного анализа различных флуоресцирующих биологических объектов, в том числе для предварительного просмотра отдельных ячеек биологических микрочипов. Однако сочетание апертуры и поля зрения стандартных объективов не позволяет использовать стандартные микроскопы для анализа флуоресцирующих красителей, содержащихся в ячейках биологических микрочипов, занимающих площадь в десятки квадратных миллиметров (см. каталоги микроскопов фирм Nikon, Zeiss, Olympus и др.).In wide-field fluorescence microscopy, this approach is implemented using special devices (interchangeable opaque portholes) that allow one to rearrange the spectral ranges of excitation and registration of fluorescence. Currently available digital luminescent biochip analyzers based on the principle of wide-field digital luminescent microscopy are suitable for visual or semi-quantitative analysis of various fluorescent biological objects, including for previewing individual cells of biological microarrays. However, the combination of the aperture and field of view of standard lenses does not allow the use of standard microscopes for the analysis of fluorescent dyes contained in cells of biological microarrays covering an area of tens of square millimeters (see catalogs of microscopes from Nikon, Zeiss, Olympus, etc.).
Описаны примеры использования двухволновых анализаторов биочипов, позволяющих параллельно количественно определять содержание в ячейках биочипа двух соединений, содержащих два разных красителя, например, с красителями типа Су3 и Су5 (Биофизика, 2015, том 60, вып. 6, с. 1198-1202). Вместе с тем, представляется целесообразным одновременное использование нескольких красителей для анализа связывания большего количества соединений с ячейками биочипа, однако многоволновые высокопроизводительные анализаторы биочипов в литературе не описаны.Examples of the use of two-wave biochip analyzers are described that make it possible to simultaneously quantitatively determine the content in the biochip cells of two compounds containing two different dyes, for example, with dyes such as Su3 and Su5 (Biophysics, 2015, Volume 60,
Таким образом, имеющиеся в настоящее время анализаторы биочипов, основанные на принципе широкопольной люминесцентной микроскопии, пригодны для визуального или полуколичественного анализа биочипов. Однако их точность, диапазон измеряемых интенсивностей свечения, а также возможность применения не более двух оптически независимых красителей оказываются недостаточными для решения ряда задач анализа флуоресценции ячеек биочипа.Thus, currently available biochip analyzers based on the principle of wide-field fluorescence microscopy are suitable for visual or semi-quantitative analysis of biochips. However, their accuracy, the range of measured luminescence intensities, and the possibility of using no more than two optically independent dyes are insufficient to solve a number of problems in the analysis of fluorescence of biochip cells.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Целью настоящего изобретения является создание анализатора биологических микрочипов (биочипов), основанного на принципе широкопольной цифровой люминисцентной микроскопии, позволяющего измерять интенсивности флуоресценции ячеек биочипа в трех длинах волн от 380 нм до 850 нм с точностью до 10% за счет эффективного подавления спеклов, содержащего волоконно-оптический жгут и вращающееся зеркало, установленные между источником излучения и матрицей ячеек биочипа, причем, зеркало установлено таким образом, чтобы при его вращении в пределах одного оборота расстояние от торца волоконно-оптического жгута до поверхности зеркала постоянно менялось, и обладающих возможностью не менее десятикратного увеличения линейного диапазона измеряемых величин по сравнению с линейным диапазоном матрицы детектора изображения.The aim of the present invention is to provide a biological microarray analyzer (biochips) based on the principle of wide field digital luminescent microscopy, which allows measuring the fluorescence intensities of biochip cells in three wavelengths from 380 nm to 850 nm with an accuracy of 10% due to the effective suppression of speckles containing fiber an optical harness and a rotating mirror installed between the radiation source and the matrix of cells of the biochip, moreover, the mirror is installed in such a way that when it rotates within one turnover of the distance from the end of the fiber optic harness to the mirror surface are constantly changing, and the possibility of having at least a tenfold increase in the linear range of the measured value compared with the linear range of the matrix image detector.
Краткое описание Фигур и ТаблицBrief Description of Figures and Tables
Фиг. 1. Принципиальная схема конструкции анализатора биочипов. На схеме показаны три осветителя для разных спектральных диапазонов, лазерный диод одного из осветителей, держатель микрочипа, верхний объектив для сбора изображения, устройство перефокусировки при смене спектрального диапазона, ПЗС камера.FIG. 1. Schematic diagram of the design of the biochip analyzer. The diagram shows three illuminators for different spectral ranges, a laser diode of one of the illuminators, a microchip holder, an upper lens for image collection, a refocusing device when changing the spectral range, a CCD camera.
Фиг. 2. Схема устройства для подавления спеклов при освещении биочипов лазерным лучом, расфокусированным с помощью волоконно-оптического жгута в сочетании с вращающимся зеркалом.FIG. 2. Scheme of a device for suppressing speckles when illuminating biochips with a laser beam defocused using a fiber optic bundle in combination with a rotating mirror.
Фиг. 3. Эффективность подавления спеклов, регистрируемых в спектральном диапазоне 710±20 нм при облучении желатиновой поверхности фотопленки, окрашенной красителем Cy5, расфокусированным лазерным светом с длиной волны 655 нм.FIG. 3. The efficiency of suppressing speckles recorded in the spectral range of 710 ± 20 nm upon irradiation of the gelatinous surface of a film stained with Cy5 dye by defocused laser light with a wavelength of 655 nm.
А - изображение при прямом освещении расфокусированным лазерным лучом (спеклы приводят к локальным вариациям освещенности, существенно понижающим точность измерений);A - image under direct illumination with a defocused laser beam (speckles lead to local variations in illumination, significantly reducing the accuracy of measurements);
Б - изображение, полученное при использовании устройства для подавления спеклов, представленного на Фиг. 1 и 2;B is an image obtained using the speckle suppression device shown in FIG. 1 and 2;
Область, заключенная внутри пунктирных линий на Фиг. А и Б, показывает полосу, ширина которой соответствует диаметру одной ячейки биочипа.The region enclosed by the dotted lines in FIG. A and B, shows a strip whose width corresponds to the diameter of one cell of the biochip.
В и Г - распределение интенсивности флуоресценции участка поверхности фотопленки, вдоль полосы, заключенной между пунктирными линиями на Фиг. А и Б.B and D are the distribution of the fluorescence intensity of a portion of the surface of the film along the strip enclosed between the dashed lines in FIG. A and B.
Фиг. 4. А - схема биочипа, содержащего ряды ячеек с уменьшающимися концентрациями красителей Су3, Су5, Су7 и номера рядов ячеек; Б, В, Г -изображения флуоресцирующего биочипа при регистрации в условиях, специфичных для каждого красителя, а именно, для: Су3 λexc=532 нм, λem=607±35 нм; для Су5 λexc=655 нм, λem=710±20 нм; и для Су7 λexc=760 нм, λem=807±35 нм. В таблице представлены концентрации красителей Су3, Су5, Су7 (в молях) в соответствующих ячейках биочипа.FIG. 4. A is a diagram of a biochip containing rows of cells with decreasing concentrations of dyes Su3, Su5, Su7 and number of rows of cells; B, C, D images of a fluorescent biochip upon registration under conditions specific to each dye, namely, for: Cu3 λ exc = 532 nm, λ em = 607 ± 35 nm; for Cy5, λ exc = 655 nm, λ em = 710 ± 20 nm; and for Su7, λ exc = 760 nm, λ em = 807 ± 35 nm. The table shows the concentrations of dyes Su3, Su5, Su7 (in moles) in the corresponding cells of the biochip.
Фиг. 5. Кривая 1. - Зависимость величины сигналов ПЗС камеры при регистрации изображения участка флуоресцирующего красного стекла (КС-10) от времени экспозиции при разной интенсивности возбуждающего света. Кривые 2 и 3 получены в результате уменьшения интенсивности флуоресценции стекла соответственно в 2 и 4 раза с помощью нейтральных фильтров, вводимых между источником возбуждающего излучения и объектом и пропускающих, соответственно, 50% и 25% возбуждающего излучения.FIG. 5.
Фиг. 6. Интенсивности флуоресценции ячеек биочипа, содержащих краситель Су5, при разных временах экспозиции. Изображение биочипа представлено на Фиг. 4Г, цифровые данные об интенсивности флуоресценции ячеек даны в Табл. 1.FIG. 6. Fluorescence intensities of biochip cells containing Su5 dye at different exposure times. An image of the biochip is shown in FIG. 4G, digital data on the fluorescence intensity of the cells are given in Table. one.
По оси абсцисс номер ячейки и концентрация красителя в ней. По оси ординат - средние интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек. Значения концентраций по оси абсцисс и интенсивностей флуоресценции по оси ординат отложены в логарифмическом масштабе. Пунктирными линиями показаны границы линейного диапазона ПЗС камеры (D1) и линейного диапазона значений интенсивности флуоресценции, регистрируемых при разных экспозициях (D2). Среднюю интенсивность флуоресценции (ИФ) данной ячейки выражали в виде суммы сигналов от всех пикселей, покрывающих данную ячейку, деленную на число этих пикселей. Светлые столбики представляют результат регистрации интенсивности флуоресценции для ячеек №1-5 при экспозиции 250 мсек; для ячеек №6 и 7 при экспозиции 1000 мсек; и для ячеек №8 и 9 при экспозиции 4000 мсек. Темные столбики представляют результат пересчета измерений согласно предложенному алгоритму: значения для ячеек №1-5 умножены на 16; ячеек №6,7 умножены на 4; а ячеек №8,9 умножены на 1.The abscissa axis is the cell number and the dye concentration in it. The ordinates show the average fluorescence intensities of the corresponding cells. The values of the concentrations along the abscissa axis and the fluorescence intensities along the ordinate axis are plotted on a logarithmic scale. The dashed lines show the boundaries of the linear range of the CCD camera (D1) and the linear range of fluorescence intensities recorded at different exposures (D2). The average fluorescence intensity (IF) of a given cell was expressed as the sum of the signals from all the pixels covering this cell divided by the number of these pixels. The light bars represent the result of recording the fluorescence intensity for cells No. 1-5 at an exposure of 250 ms; for cells No. 6 and 7 with an exposure of 1000 ms; and for cells No. 8 and 9 with an exposure of 4000 ms. Dark bars represent the result of recalculation of measurements according to the proposed algorithm: values for cells No. 1-5 are multiplied by 16; cells number 6.7
Фиг. 7. Изображения биочипа в условиях возбуждения и регистрации флуоресценции, в диапазонах длин волн, специфичных для Су5 (А) и Су7 (Б). В - Схема биочипа. Биочип содержит индивидуальные красители Су5 (левый угол), Су7 (правый угол) и их смеси в разных концентрациях. Концентрации красителей даны в Таблице на Фиг. 7; верхние значения показывают концентрацию Су5, нижние - концентрацию Су7.FIG. 7. Images of the biochip under the conditions of excitation and registration of fluorescence, in the wavelength ranges specific for Cy5 (A) and Cy7 (B). B - Biochip scheme. The biochip contains individual dyes Su5 (left corner), Su7 (right corner) and their mixtures in different concentrations. Dye concentrations are given in the Table in FIG. 7; upper values indicate the concentration of Cy5, lower values indicate the concentration of Cy7.
Таблица 1. Значения концентраций красителя в ячейках биочипа, показанного на Рис. 4 В и графически представленного на Фиг. 6. Представлены значения интенсивности флуоресценции (ИФ) для ячеек №1-5 при экспозиции 250 мсек; для ячеек №6 и 7 при экспозиции 1000 мсек; и ячеек №8 и 9 при экспозиции 4000 мсек. Жирным шрифтом показаны пересчитанные значения согласно разработанному алгоритму (объяснение в тексте). Для сравнения представлены значения ИФ, вычисленной из разведений красителя.Table 1. Dye concentrations in the biochip cells shown in Fig. 4B and graphically represented in FIG. 6. The values of fluorescence intensity (IF) for cells No. 1-5 at an exposure of 250 ms are presented; for cells No. 6 and 7 with an exposure of 1000 ms; and cells No. 8 and 9 at an exposure of 4000 ms. In bold, the converted values are shown according to the developed algorithm (explanation in the text). For comparison, the IF values calculated from the dilutions of the dye are presented.
Таблица 2. Значения интенсивностей флуоресценции красителей Су5 и Су7 в ячейках биочипа, показанного на Рис. 7 А и Б, при возбуждении и измерении флуоресценции в соответствующих длинах волн, а также значения коэффициентов, используемых для вычисления концентраций этих красителей в ячейках R1, R2, №1, 2, 3, показанных на схеме Фиг. 7 ВTable 2. Fluorescence intensities of the dyes Su5 and Su7 in the cells of the biochip shown in Fig. 7 A and B, when exciting and measuring fluorescence at the corresponding wavelengths, as well as the values of the coefficients used to calculate the concentrations of these dyes in cells R1, R2, No. 1, 2, 3, shown in the diagram of FIG. 7 V
Таблица 3. Концентрации красителей Су5 и Су7 в ячейках биочипа, изображения которого показаны на Фиг. 7Table 3. Concentrations of dyes Su5 and Su7 in the cells of the biochip, the images of which are shown in FIG. 7
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Принципиальная схема прибораSchematic diagram of the device
Предлагаемый флуориметрический анализатор содержит лазерные источники возбуждающего излучения, фильтры для выделения флуоресценции ячеек биочипов, оптическую систему для проецирования изображения биочипов на светочувствительную матрицу детектора, волоконно-оптический жгут с перепутанными волокнами, вращающееся зеркало для распределения возбуждающего излучения в анализируемом поле зрения прибора. Принципиальная схема анализатора показана на Фиг. 1.The proposed fluorimetric analyzer contains laser sources of exciting radiation, filters for highlighting the fluorescence of biochip cells, an optical system for projecting biochip images onto a photosensitive detector matrix, a fiber optic bundle with entangled fibers, a rotating mirror for distributing exciting radiation in the analyzed field of view of the device. A schematic diagram of the analyzer is shown in FIG. one.
Флуоресценция биочипа возбуждается с помощью одного из трех осветителей - лазерных диодов, излучающих когерентный монохроматический свет. В качестве примера применены лазерные диоды с длинами волн 532 нм, 655 нм и 760 нм. Эти длины волн используются для возбуждения флуоресценции часто применяемых цианиновых красителей Су3, Су5, Су7, их аналогов, а также красителей со сходными спектральными характеристиками, которые выпускаются разными фирмами.Biochip fluorescence is excited using one of three illuminators - laser diodes emitting coherent monochromatic light. As an example, laser diodes with wavelengths of 532 nm, 655 nm and 760 nm were used. These wavelengths are used to excite fluorescence of commonly used cyanine dyes Su3, Su5, Su7, their analogues, as well as dyes with similar spectral characteristics, which are produced by different companies.
Изображение биочипа в свете его флуоресценции собирается оптической системой, состоящей из двух фотографических объективов, расположенных навстречу друг другу, и направляется на матрицу приемника изображения. В качестве детектора изображения использовали ПЗС камеру фирмы Видеоскан (www.Videoscan.ru) с матрицей SONY ICX285, 2/3".The image of the biochip in the light of its fluorescence is collected by an optical system consisting of two photographic lenses located towards each other, and sent to the image pickup matrix. A Videoscan CCD camera (www.Videoscan.ru) with a SONY ICX285, 2/3 "sensor was used as an image detector.
Перед матрицей находится сочлененный с устройством перефокусировки блок переключения запирающих фильтров, выделяющих флуоресцентное излучение и отсекающих возбуждающий свет. Объективы для получения фотографического изображения, использованные в приборе (Nikon 50×1,4), рассчитаны на сохранение фокусировки в диапазоне длин волн, которые воспринимаются глазом, однако при переходе в ИК область требуется перефокусировка оптической системы. В качестве запирающих фильтров перед ПЗС камерой были выбраны фильтры фирмы Semrock со следующими спектральными характеристиками: 607±35 нм для красителя Су3, 710±20 нм для красителя Су5 и 807±35 нм для красителя Су7. Принципиальная схема описанной оптической системы при использовании соответствующих лазерных источников излучения и фильтров пригодна для работы в любых трех длинах волн от 380 нм до 850 нм.In front of the matrix there is a switching unit for locking filters coupled to the refocusing device, emitting fluorescent radiation and cutting off the exciting light. The lenses for obtaining a photographic image used in the device (Nikon 50 × 1.4) are designed to maintain focus in the wavelength range that is perceived by the eye, but when moving to the infrared region, refocusing of the optical system is required. Semrock filters with the following spectral characteristics: 607 ± 35 nm for Cu3 dye, 710 ± 20 nm for Cy5 dye, and 807 ± 35 nm for Cy7 dye were chosen as locking filters in front of the CCD camera. The schematic diagram of the described optical system using appropriate laser radiation sources and filters is suitable for operation at any three wavelengths from 380 nm to 850 nm.
Измерения интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа при использовании предлагаемого устройства осуществляется следующим способом. Включается источник возбуждающего излучения (лазер соответствующей длины волны), который освещает поле зрения прибора, в котором находится исследуемый биочип. В соответствии с выбранным лазерным излучением устанавливается фильтр для выделения флуоресценции ячеек биочипа. Выбирается экспозиция, при которой производится регистрация изображения биочипа в свете его флуоресценции, и при этой экспозиции производится регистрация изображения. С помощью стандартных компьютерных программ осуществляется измерение интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа на зарегистрированном изображении.Measurement of the fluorescence intensities of the biochip cells when using the proposed device is carried out in the following way. The source of exciting radiation (a laser of the appropriate wavelength) is turned on, which illuminates the field of view of the device in which the biochip under study is located. In accordance with the selected laser radiation, a filter is installed to highlight the fluorescence of the biochip cells. The exposure is selected at which the image of the biochip is recorded in the light of its fluorescence, and at this exposure, the image is recorded. Using standard computer programs, the fluorescence intensities of the biochip cells in the recorded image are measured.
Устройство для подавления спекловSpeckle suppressor
Подавление спеклов лазерного излучения достигается с помощью устройства, схема которого представлена на Фиг. 2.The suppression of speckles of laser radiation is achieved using a device whose circuit is shown in FIG. 2.
Свет от лазерного диода попадает на торец волоконно-оптического жгута с перепутанными волокнами, при этом на другом торце жгута распределение яркости в плоскости, перпендикулярной направлению луча, становится более однородным по сравнению с таковым на входе жгута. Более высокая однородность достигается благодаря тому, что волокна внутри жгута перепутаны, и неравномерности яркости лазерного луча в поперечном сечении, имеющиеся на входе жгута, распределяются в виде случайной мозаики на его выходе. Кроме того, равномерность освещенности повышается благодаря частичной потере когерентности лучей, идущих внутри жгута по волокнам, имеющим разную длину оптического пути. Далее, луч направляется на вращающееся зеркало, установленное таким образом, чтобы при его вращении расстояние от выходного торца волоконно-оптического жгута до поверхности зеркала постоянно менялось. При вращении зеркала отраженный луч описывает эллипс в плоскости биочипа. При этом происходит «размазывание» спеклов в плоскости объекта, и интенсивность освещения, усредненная по времени регистрации, становится еще более равномерной.The light from the laser diode hits the end of the fiber optic bundle with entangled fibers, while at the other end of the bundle, the brightness distribution in the plane perpendicular to the beam direction becomes more uniform compared to that at the input of the bundle. Higher uniformity is achieved due to the fact that the fibers inside the bundle are entangled, and the uneven brightness of the laser beam in cross section present at the input of the bundle is distributed in the form of a random mosaic at its output. In addition, the uniformity of illumination is increased due to the partial loss of coherence of the rays traveling inside the bundle along fibers having different optical path lengths. Further, the beam is directed to a rotating mirror, installed in such a way that when it is rotating, the distance from the output end of the fiber optic bundle to the mirror surface is constantly changing. When the mirror rotates, the reflected beam describes an ellipse in the plane of the biochip. In this case, “smearing” of speckles takes place in the plane of the object, and the illumination intensity averaged over the recording time becomes even more uniform.
На Фиг. 3 представлены изображения желатиновой поверхности мелкозернистой фотопленки, окрашенной красителем Су5, в свете флуоресценции, полученные при прямом освещении расфокусированным лазерным лучом с длиной волны 655 нм, а также при использовании устройства подавления спеклов, показанного на Фиг. 1 и Фиг. 2.In FIG. 3 shows images of the gelatin surface of a fine-grained film stained with Cy5 dye in the light of fluorescence obtained under direct illumination with a defocused laser beam with a wavelength of 655 nm, as well as using the speckle suppression device shown in FIG. 1 and FIG. 2.
Эффективность подавления спеклов при использовании прибора для анализа биочипов можно оценить следующим образом. Обозначим интенсивность флуоресценции площадки, размеры которой соответствуют размеру ячейки биочипа, как F. Характеристикой неоднородности освещенности из-за наличия спеклов может служить разброс интенсивности флуоресценции по полю зрения. Тогда относительный разброс освещенности по полю зрения (σ) можно определить следующим образом.The effectiveness of speckle suppression when using the device for the analysis of biochips can be estimated as follows. Let us denote the fluorescence intensity of the site, the sizes of which correspond to the size of the biochip cell, as F. A characteristic of the inhomogeneity of illumination due to the presence of speckles can be a spread of fluorescence intensity over the field of view. Then the relative scatter of illumination over the field of view (σ) can be determined as follows.
σ=(Fmax-Fmin)/(Fmax+Fmin)σ = (F max -F min ) / (F max + F min )
где Fmax и Fmin - соответственно максимальное и минимальное значения интенсивности флуоресценции выбранной площадки при всех ее расположениях в поле зрения.where F max and F min - respectively, the maximum and minimum values of the fluorescence intensity of the selected site for all its locations in the field of view.
Для оценки влияния спеклов на точность измерения интенсивности флуоресценции ячеек биочипа на изображении фотопленки, равномерно окрашенной красителем Су5, была выделена область, ширина которой соответствует диаметру ячейки биочипа (100 μ), а длина - нескольким миллиметрам, и по длине этой области определен разброс величины суммарного сигнала от пикселей, покрывающих площадь, занимаемую ячейкой биочипа. Анализ полученных результатов до и после подавления спеклов показывает, что разброс относительных величин интенсивностей флуоресценции при освещении фотопленки расфокусированным лазерным лучом без подавления спеклов (σ0) (Фиг. 3 А, В) равен σ0=0.06, а после подавления спеклов σ=0.007 (Фиг. 3 В, Г). Отсюда можно сделать вывод о том, что при измерениях интенсивности флуоресценции ячеек биочипа диаметром 100 μ разброс в освещенности поля зрения площади, занимаемой одной ячейкой и вызванный влиянием спеклов, не превышает 1%.To assess the effect of speckles on the accuracy of measuring the fluorescence intensity of biochip cells, a region was selected on the image of the film uniformly stained with Su5 dye, the width of which corresponds to the diameter of the biochip cell (100 μ), and the length is several millimeters, and the total signal from pixels covering the area occupied by the biochip cell. An analysis of the results obtained before and after speckle suppression shows that the spread in the relative values of fluorescence intensities when the film is illuminated with a defocused laser beam without speckle suppression (σ 0 ) (Fig. 3 A, B) is σ 0 = 0.06, and after speckle suppression, σ = 0.007 (Fig. 3 B, D). From this we can conclude that, when measuring the fluorescence intensity of biochip cells with a diameter of 100 μ, the spread in the illumination of the field of view of the area occupied by one cell and caused by the influence of speckles does not exceed 1%.
Работа в трех длинах волнWork at three wavelengths
На Фиг. 4 показана схема биочипа, содержащего ячейки с уменьшающимися концентрациями красителей Су3, Су5, Су7 (А) и таблица с концентрациями этих красителей в соответствующих ячейках биочипа в молях. На этом же рисунке представлены флуоресцентные изображения этого биочипа (Б, В, Г) при регистрации в условиях, специфичных для каждого красителя, а именно: для Су3 λexc=532 нм, λem=607±35 нм; для Су5 λexc=655 нм, λem=710±20 нм; для Су7 λexc=760 нм, λem=807±35 нм.In FIG. 4 shows a diagram of a biochip containing cells with decreasing concentrations of the dyes Su3, Su5, Su7 (A) and a table with the concentrations of these dyes in the corresponding cells of the biochip in moles. The same figure shows the fluorescence images of this biochip (B, C, D) during registration under conditions specific to each dye, namely: for Si3 λ exc = 532 nm, λ em = 607 ± 35 nm; for Cy5, λ exc = 655 nm, λ em = 710 ± 20 nm; for Su7, λ exc = 760 nm, λ em = 807 ± 35 nm.
По изображениям биочипа, видно, что при выбранных нами условиях возбуждения и регистрации флуоресценции красители Су3 и Су5 могут анализироваться в смеси независимо друг от друга. В то же время, краситель Су7 обладает заметной флуоресценцией при возбуждении и регистрации в диапазонах длин волн, специфичных для красителя Су5. Количественный анализ смеси красителей с перекрывающимися спектральными характеристиками обсуждается далее в разделе «Анализ смесей красителей в одной ячейке».From the biochip images, it can be seen that under the conditions of excitation and registration of fluorescence chosen by us, the dyes Su3 and Su5 can be analyzed in a mixture independently of each other. At the same time, Cy7 dye exhibits noticeable fluorescence upon excitation and recording in the wavelength ranges specific for Cy5 dye. Quantitative analysis of a mixture of dyes with overlapping spectral characteristics is discussed further in the section “Analysis of dye mixtures in one cell”.
Увеличение диапазона измеряемых интенсивностей флуоресценцииIncrease in the range of measured fluorescence intensities
На Фиг. 5 на кривой 1 показаны результаты регистрации интенсивности флуоресценции (в условных единицах) участка красного стекла (КС-10), соответствующего по размеру одной ячейке биочипа при разных временах экспозиции (приведено среднее значение, получаемое от одного пикселя ПЗС камеры). Возбуждение флуоресценции и измерения интенсивности флуоресценции осуществляли при условиях, специфичных для красителя Су5. Кривая 2 была получена при ослаблении интенсивности возбуждающего света в 2 раза (введение в ход лучей от лазера нейтрального фильтра с пропусканием 50%), а кривая 3 - при ослаблении в 4 раза (введение в ход лучей от лазера нейтрального фильтра с пропусканием 25%).In FIG. 5 on
Данные, представленные на Фиг. 5, подтверждают линейную зависимость сигналов пикселей ПЗС камеры от длительности экспозиции при регистрации интенсивности флуоресценции до 2700 у.е. Заявленный паспортный диапазон использованной в приборе ПЗС камеры составляет 12 бит, однако при значениях сигналов более 2700 у.е. наблюдается систематическое отклонение от линейности, связанное с приближением к максимальной емкости пикселей ПЗС камеры. Шумы ПЗС камеры составляют примерно ±20 у.е., следовательно, можно полагать, что реальный линейный диапазон камеры находятся в пределах от 60 у.е. (три значения шума) до 2700 у.е.The data presented in FIG. 5, confirm the linear dependence of the pixel signals of the CCD camera on the exposure time when recording fluorescence intensity up to 2700 cu The claimed passport range of the camera used in the CCD device is 12 bits, however, with signal values of more than 2700 cu a systematic deviation from linearity is observed, associated with approaching the maximum pixel capacitance of the CCD camera. The noise of the CCD camera is approximately ± 20 cu, therefore, it can be assumed that the real linear range of the camera is in the range of 60 cu (three values of noise) up to 2700 cu
В линейном диапазоне одинаковые значения регистрируемых сигналов наблюдаются при времени экспозиции в 2 раза большем для второй кривой по сравнению с первой и в 4 раза большем для третьей кривой. Представленные результаты подтверждают, что получаемые значения сигналов в диапазоне до 2700 у.е. являются количественной характеристикой суммарной интенсивности флуоресценции, которая линейно зависит как от длительности экспозиции, так и концентрации красителя в ячейке.In the linear range, the same values of the detected signals are observed at an
Концентрации различных флуоресцентно-меченных соединений, входящих в состав смесей, анализируемых с помощью биочипов, могут различаться на порядки величин. Вследствие этого, во многих случаях при использовании одной экспозиции в изображении биочипа могут оказаться как слишком слабо светящиеся, так и слишком ярко светящиеся ячейки. При этом значения сигналов от пикселей, покрывающих данные ячейки, могут выйти за пределы линейного диапазона детектора изображения (в данном случае, пикселей ПЗС камеры). Локализация сигналов в зоне линейного диапазона детектора изображения может быть достигнута уменьшением времени экспозиции для сильно светящихся ячеек, и, наоборот, увеличением - для слабо светящихся. Это реализуется с помощью разработанного алгоритма нормализации всех сигналов к тем, которые были получены при максимальной выдержке. Согласно разработанному алгоритму нормализация проводится умножением сигналов на коэффициент, равный частному от деления максимальной экспозиции на ту, которая использовалась для регистрации соответствующих ячеек.The concentrations of various fluorescently-labeled compounds that make up the mixtures analyzed using biochips can vary by orders of magnitude. As a result of this, in many cases, when using the same exposure, the biochip image may contain either too weakly glowing or too brightly glowing cells. In this case, the values of the signals from the pixels covering the cell data may go beyond the linear range of the image detector (in this case, the pixels of the CCD camera). Localization of signals in the linear range of the image detector can be achieved by reducing the exposure time for highly luminous cells, and, conversely, by increasing it for weakly luminous cells. This is implemented using the developed algorithm for normalizing all signals to those that were obtained at maximum shutter speed. According to the developed algorithm, normalization is carried out by multiplying the signals by a factor equal to the quotient of dividing the maximum exposure by the one used to register the corresponding cells.
На Фиг. 6 и в Табл. 1 в графическом и табличном виде представлены результаты регистрации интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа, показанного на Фиг. 4Г. При малых временах экспозициях сигналы от ярко светящихся ячеек оказываются в линейном диапазоне ПЗС камеры, а сигналы от слабо светящихся ячеек превышают шумы камеры примерно в 2,5 раза. При увеличении времени экспозиции сигналы от слабо светящихся ячеек заметно отличаются от шумов камеры, однако сигналы от сильно светящихся ячеек выходят за линейную область детектора изображения.In FIG. 6 and Tab. 1 in a graphical and tabular form presents the results of recording the fluorescence intensities of the cells of the biochip shown in FIG. 4G. At short exposure times, the signals from brightly luminous cells appear in the linear range of the CCD camera, and the signals from weakly luminous cells exceed the camera noise by about 2.5 times. With an increase in the exposure time, signals from dimly luminous cells noticeably differ from camera noise, however, signals from strongly luminous cells go beyond the linear region of the image detector.
Согласно предложенному алгоритму, для увеличения линейного диапазона регистрации были получены изображения ячеек биочипа при экспозициях 250 мсек (ячейки №1-5), 1000 мсек (ячейки №6, 7) и 4000 мсек (ячейки №8, 9). В дальнейших расчетах использовали значения средней интенсивности флуоресценции индивидуальных ячеек, получаемые путем деления значений сигналов всех пикселей, покрывающих данную ячейку, на число этих пикселей. В случае если ячейка содержит только один краситель и измерения были проведены в линейном диапазоне ПЗС камеры, получаемая величина пропорциональна концентрации этого красителя в ячейке. Полученные значения представлены на Фиг. 6. белыми столбцами. Затем, согласно алгоритму нормализации, интенсивности флуоресценции, полученные при экспозиции 250 мсек, были умножены на шестнадцать, при экспозиции 1000 мсек - на четыре, а при экспозиции 4000 мсек - на единицу. Эти значения представлены темными столбцами. Как можно видеть, применение данного алгоритма позволяет расширить область линейного диапазона регистрируемых интенсивностей флуоресценции. Так, для случая, представленного на Фиг. 4Г линейный диапазон регистрации интенсивностей флуоресценции был расширен в 16 раз.According to the proposed algorithm, to increase the linear detection range, images of biochip cells were obtained at exposures of 250 ms (cells No. 1-5), 1000 ms (cells No. 6, 7) and 4000 ms (cells No. 8, 9). In further calculations, we used the values of the average fluorescence intensity of individual cells, obtained by dividing the signal values of all the pixels covering this cell by the number of these pixels. If the cell contains only one dye and the measurements were carried out in the linear range of the CCD camera, the resulting value is proportional to the concentration of this dye in the cell. The obtained values are presented in FIG. 6. white columns. Then, according to the normalization algorithm, the fluorescence intensities obtained at an exposure of 250 ms were multiplied by sixteen, at an exposure of 1000 ms - by four, and at an exposure of 4000 ms - by one. These values are represented by dark columns. As you can see, the application of this algorithm allows you to expand the linear range of the recorded fluorescence intensities. So, for the case shown in FIG. The 4G linear range of registration of fluorescence intensities was expanded 16 times.
При изготовлении биочипов количество красителя в ячейке зависит не только от его концентрации в наносимом растворе, но также и от размеров ячеек, точность нанесения которых составляет 10%. Поэтому даже соседние ячейки с одной и той же концентрацией красителя могут различаться по количеству красителя на 10%, а, следовательно, отклонения от линейности рассчитанных значений интенсивности флуоресценции в Табл. 1 (см. две нижних строки) отражают суммарную точность прибора и точность изготовления биочипов.In the manufacture of biochips, the amount of dye in the cell depends not only on its concentration in the applied solution, but also on the size of the cells, the accuracy of which is 10%. Therefore, even neighboring cells with the same dye concentration can differ by 10% in the amount of dye, and, consequently, deviations from the linearity of the calculated values of the fluorescence intensity in Table. 1 (see the bottom two lines) reflect the total accuracy of the device and the accuracy of manufacturing biochips.
Описанная схема увеличения линейного диапазона с помощью регистрации сигналов с разным временем экспозиции применима при работе с любыми детекторами изображения типа ПЗС или КМОП, независимо от того, каков исходный линейный диапазон выбранного устройства.The described scheme of increasing the linear range by recording signals with different exposure times is applicable when working with any image detectors such as CCD or CMOS, regardless of what the initial linear range of the selected device is.
Анализ смесей красителей в ячейках биочипаAnalysis of dye mixtures in biochip cells
При проведении количественных измерений с биологическими молекулами, меченными двумя красителями, спектры возбуждения и флуоресценции которых находятся в разных оптических диапазонах (например, с красителями типа Су3 и Су5), интенсивность флуоресценции ячейки при специфическом возбуждении одного красителя не зависит от концентрации второго красителя, и количество каждого из красителей в ячейке, содержащей их смесь, определяется независимо. Для этого в матрицу ячеек биочипа вводят дополнительно вспомогательные реперные ячейки, каждая из которых содержит только один из красителей в известной концентрации. При этом объем ячеек биочипа задается одинаковым, а небольшие случайные вариации этих объемов будут приводить к определенной погрешности в определении концентраций красителей.When conducting quantitative measurements with biological molecules labeled with two dyes, the excitation and fluorescence spectra of which are in different optical ranges (for example, with dyes of the type Su3 and Su5), the fluorescence intensity of the cell upon specific excitation of one dye does not depend on the concentration of the second dye, and the amount each of the dyes in the cell containing their mixture is determined independently. For this, additional auxiliary reference cells are introduced into the matrix of biochip cells, each of which contains only one of the dyes in a known concentration. In this case, the volume of the biochip cells is set the same, and small random variations of these volumes will lead to a certain error in the determination of dye concentrations.
При проведении количественных измерений с двумя красителями с пересекающимися спектрами возбуждения и/или флуоресценции (например, Су5 и Су7), может возникнуть необходимость в определении концентраций каждого из этих красителей в ячейках, содержащих их смесь. В этом случае биочип должен иметь две вспомогательные реперные ячейки R1 и R2, в каждой из которых содержится только по одному красителю, соответственно Су5 и Су7, в известных концентрациях 
с помощью которых интенсивности флуоресценции любой j-ой ячейки в условиях, специфичных для анализа флуоресценции Су5 
где 
Решение этой системы уравнений относительно 
Аналогичным образом можно рассчитывать концентрации смесей трех меченных красителями биологических молекул в ячейках биочипа.Similarly, one can calculate the concentrations of mixtures of three dye-labeled biological molecules in the biochip cells.
На Фиг. 7А и 7Б представлены изображения биочипа, с ячейками, содержащими красители Cy5 и Cy7, соответственно, при возбуждении и регистрации флуоресценции в условиях, специфичных для этих красителей. Левая ячейка биочипа (реперная ячейка, обозначенная на Фиг. 7В, как R1) содержит только краситель Cy5, правая ячейка биочипа (реперная ячейка, обозначенная, как R2) - только краситель Cy7. В трех остальных ячейках (обозначены, как 1, 2 и 3) содержатся смеси этих красителей в разных соотношениях. Концентрации красителей в ячейках показаны в таблице на Фиг. 7, верхние значения показывают концентрацию Cy5, нижние - концентрацию Cy7.In FIG. 7A and 7B show images of a biochip with cells containing Cy5 and Cy7 dyes, respectively, upon excitation and registration of fluorescence under conditions specific to these dyes. The left biochip cell (reference cell, designated as R1 in Fig. 7B) contains only Cy5 dye, the right biochip cell (reference cell, designated as R2) contains only Cy7 dye. The remaining three cells (designated as 1, 2 and 3) contain mixtures of these dyes in different ratios. Cell dye concentrations are shown in the table of FIG. 7, the upper values show the concentration of Cy5, the lower values show the concentration of Cy7.
При расчетах концентраций красителей в ячейках, содержащих их смеси, использовали значения интенсивности флуоресценции двух реперных ячеек, содержащих индивидуальные красители Cy5 и Cy7 соответственно, а также трех ячеек среднего столбца, содержащих разные соотношения этих красителей. При этом были получены результаты, представленные в Табл. 2. На основании вычисленных коэффициентов пересчета (нижняя строка таблицы 2) были рассчитаны величины концентраций красителей Cy5 и Cy7 в ячейках со смесями красителей. Полученные данные приведены в Табл. 4. Видно, что эти значения достаточно хорошо согласуются с концентрациями красителя при нанесении. Наблюдаемые различия (завышение на 3-5% вычисленной концентрации по сравнению с заданной при нанесении) объясняются ошибками в объеме ячеек при изготовлении биочипа.When calculating the dye concentrations in the cells containing their mixtures, we used the fluorescence intensities of two reference cells containing individual dyes Cy5 and Cy7, respectively, as well as three middle-column cells containing different ratios of these dyes. In this case, the results presented in Table. 2. Based on the calculated conversion factors (bottom row of Table 2), the concentrations of Cy5 and Cy7 dyes in cells with dye mixtures were calculated. The data obtained are given in Table. 4. It can be seen that these values are in good agreement with the dye concentrations during application. The observed differences (an overestimation of 3-5% of the calculated concentration compared to the set when applied) are explained by errors in the volume of cells in the manufacture of the biochip.
Аналогично можно решить задачу определения концентраций 3-х красителей с пересекающимися спектральными характеристиками в любой ячейке биочипа. Для этого чип должен содержать 3 реперные ячейки, в каждой из которых содержится только по одному красителю в известной концентрации. Далее следует измерить интенсивность флуоресценции во всех ячейках в условиях длин волн, специфичных для измерения флуоресценции каждого из красителей, а затем произвести расчеты с использованием трех линейных уравнений с тремя неизвестными.Similarly, we can solve the problem of determining the concentrations of 3 dyes with intersecting spectral characteristics in any cell of the biochip. For this, the chip must contain 3 reference cells, each of which contains only one dye in a known concentration. Next, one should measure the fluorescence intensity in all cells under conditions of wavelengths specific for measuring the fluorescence of each of the dyes, and then make calculations using three linear equations with three unknowns.
Таким образом, разработанный анализатор позволяет а) эффективно подавлять спеклы, возникающие при возбуждении флуоресценции биочипов расфокусированным когерентным лазерным излучением, б) увеличить линейный диапазон регистрируемых сигналов при использовании детектора изображения на базе ПЗС или КМОП матрицы, в) получать изображения флуоресцирующих ячеек биочипов в трех длинах волн от 380 до 850 нм.Thus, the developed analyzer allows a) to effectively suppress speckles arising from the excitation of biochip fluorescence by defocused coherent laser radiation, b) to increase the linear range of the recorded signals when using an image detector based on a CCD or CMOS matrix, c) to obtain images of fluorescence cells of biochips in three lengths waves from 380 to 850 nm.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016148663A RU2679605C2 (en) | 2016-12-12 | 2016-12-12 | Biological microchips fluorimetric analyzer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016148663A RU2679605C2 (en) | 2016-12-12 | 2016-12-12 | Biological microchips fluorimetric analyzer |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016148663A RU2016148663A (en) | 2018-06-13 |
| RU2016148663A3 RU2016148663A3 (en) | 2018-06-13 |
| RU2679605C2 true RU2679605C2 (en) | 2019-02-12 |
Family
ID=62619338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016148663A RU2679605C2 (en) | 2016-12-12 | 2016-12-12 | Biological microchips fluorimetric analyzer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2679605C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU218148U1 (en) * | 2022-12-07 | 2023-05-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Псковский государственный университет" | Fluorometer |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6329661B1 (en) * | 2000-02-29 | 2001-12-11 | The University Of Chicago | Biochip scanner device |
| US6377346B1 (en) * | 1998-09-17 | 2002-04-23 | Wallac Oy | Sample imaging device |
| US20050110998A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-05-26 | Lin Yan R. | Biochip detection system |
| RU2510959C2 (en) * | 2010-02-03 | 2014-04-10 | Учреждение Российской Академии Наук Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Ран (Имб Ран) | Device for analysing luminescent biological microchips |
-
2016
- 2016-12-12 RU RU2016148663A patent/RU2679605C2/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6377346B1 (en) * | 1998-09-17 | 2002-04-23 | Wallac Oy | Sample imaging device |
| US6329661B1 (en) * | 2000-02-29 | 2001-12-11 | The University Of Chicago | Biochip scanner device |
| US20050110998A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-05-26 | Lin Yan R. | Biochip detection system |
| RU2510959C2 (en) * | 2010-02-03 | 2014-04-10 | Учреждение Российской Академии Наук Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Ран (Имб Ран) | Device for analysing luminescent biological microchips |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KWAKWA K. et al. easySTORM: a robust, lower-cost approach to localization and TIRF microscopy // J. Biophotonics, 12.03.2016, V.9, pp.948-957. * |
| SQUIRE A. et al. Three dimensional image restoration in fluorescence lifetime imaging microscopy // Journal of Microscopy, 1999, V.193, pp.36-49. * |
| SQUIRE A. et al. Three dimensional image restoration in fluorescence lifetime imaging microscopy // Journal of Microscopy, 1999, V.193, pp.36-49. KWAKWA K. et al. easySTORM: a robust, lower-cost approach to localization and TIRF microscopy // J. Biophotonics, 12.03.2016, V.9, pp.948-957. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU218148U1 (en) * | 2022-12-07 | 2023-05-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Псковский государственный университет" | Fluorometer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016148663A (en) | 2018-06-13 |
| RU2016148663A3 (en) | 2018-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8884211B2 (en) | Confocal imaging methods and apparatus | |
| EP1983331B1 (en) | Optical system for reading a biochip | |
| CN106461540B (en) | System and method for automated imaging of chromophore-labeled samples | |
| US6654119B1 (en) | Scanning spectrophotometer for high throughput fluroescence detection | |
| US7791013B2 (en) | Biological microarray line scanning method and system | |
| US8192686B2 (en) | Apparatus for and method of measuring bio-chips using uniform total internal reflection illumination | |
| US20100151474A1 (en) | Multifunctional Device For Diagnostics and Method For Testing Biological Objects | |
| Lysov et al. | Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression | |
| Kozma et al. | A novel handheld fluorescent microarray reader for point-of-care diagnostic | |
| US7994485B2 (en) | Apparatus and method for fluorescence measurements using spatially structured illumination | |
| KR100500610B1 (en) | Fluorescent microscope and method for measurement using the same | |
| RU2510959C2 (en) | Device for analysing luminescent biological microchips | |
| US8964183B2 (en) | Systems and methods for screening of biological samples | |
| Lehr et al. | Modeling and experimental verification of the performance of TIRF-sensing systems for oligonucleotide microarrays based on bulk and integrated optical planar waveguides | |
| JP2022552743A (en) | virtual reference | |
| RU2679605C2 (en) | Biological microchips fluorimetric analyzer | |
| Kurzbuch et al. | A biochip reader using super critical angle fluorescence | |
| US20230221178A1 (en) | Apparatus and a method for fluorescence imaging | |
| WO2020161384A1 (en) | Method of analyzing samples, analyzing device and computer program | |
| JP2011002398A (en) | Spectroscopic imaging device | |
| RU133932U1 (en) | DEVICE FOR READING LUMINESCENT SIGNALS FROM THE BIOCHIP SURFACE | |
| Glasenapp et al. | Biochip reader with dynamic holographic excitation and hyperspectral fluorescence detection | |
| KR20110137474A (en) | Diagnostic device for biochip | |
| Bae et al. | Fluorescence microscope using total internal reflection |