RU133932U1

RU133932U1 - DEVICE FOR READING LUMINESCENT SIGNALS FROM THE BIOCHIP SURFACE

Info

Publication number: RU133932U1
Application number: RU2013111486/28U
Authority: RU
Inventors: Александр Сергеевич Соколов; Сергей Карэнович Аслиян; Елена Владимировна Токмакова; Владимир Алексеевич Михайлов; Николай Сергеевич Осин
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2013-10-27

Abstract

Устройство для считывания люминесцентных сигналов с поверхности биочипов, содержащее оптический канал возбуждения и оптический канал измерения эмиссии люминесценции исследуемого биологического образца на поверхности биочипов, в котором оптический канал возбуждения люминесценции содержит установленные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего люминесценцию биологического образца излучения, волоконно-оптический световод, фильтр возбуждения люминесценции, конденсор, первое селективное зеркало, установленное под углом к оптической оси, и первый объектив для фокусирования возбуждающего излучения и сбора люминесценции на поверхность биочипа с исследуемым биологическим образцом, оптический канал измерения люминесценции с поверхности биочипа с исследуемым биологическим образцом содержит установленные последовательно и оптически связанные первое селективное зеркало, фильтр регистрации люминесценции, второй объектив для направления сфокусированного излучения люминесценции исследуемого биологического образца на полевую диафрагму и затем на вход фотодетектора и систему обработки измеряемых сигналов, отличающееся тем, что в оптическом канале возбуждения люминесценции на входной поверхности конденсора установлена апертурная диафрагма, фильтр возбуждения люминесценции установлен между конденсором и первым селективным зеркалом, а в оптическом канале измерения после первого селективного зеркала под углом к оптической оси установлено второе селективное зеркало.A device for reading luminescent signals from the surface of biochips, comprising an optical excitation channel and an optical channel for measuring the luminescence emission of the test biological sample on the surface of the biochips, in which the optical luminescence excitation channel comprises a radiation source that excites the luminescence of the biological sample, a fiber optic fiber, luminescence excitation filter, condenser, first selective mirror mounted by At an angle to the optical axis, and the first lens for focusing the exciting radiation and collecting luminescence onto the surface of the biochip with the biological sample under study, the optical channel for measuring luminescence from the surface of the biochip with the biological sample under study contains a first selective mirror mounted in series and optically coupled, a luminescence recording filter, and a second a lens for directing the focused luminescence radiation of the biological sample under study to the field diaphragm and then and the photodetector input and the system for processing the measured signals, characterized in that an aperture diaphragm is installed in the optical luminescence excitation channel on the input surface of the condenser, a luminescence excitation filter is installed between the condenser and the first selective mirror, and in the optical measurement channel after the first selective mirror at an angle to the optical axis mounted second selective mirror.

Description

Полезная модель относится к оптическим сканирующим устройствам, в частности к устройствам для считывания люминесцентных сигналов микрозон биологически активных веществ на поверхности дна лунок многолуночных микротитровальных сосудов.The invention relates to optical scanning devices, in particular to devices for reading luminescent signals of microzone of biologically active substances on the surface of the bottom of the wells of multi-well microtiter vessels.

Существуют оптические системы, используемые для считывания флуоресцентных сигналов с поверхности субстратов, имеющих множество реакционных микрозон - биочипов. В связи с тем, что микрозоны имеют очень малые размеры, возникает необходимость точного измерения сигналов люминесценции от микрообъектов. В настоящее время существует множество считывающих устройств, оптические схемы которых позволяют осуществлять с большой чувствительностью считывание флуоресцентных или люминесцентных сигналов с микрозон биологических веществ на поверхности микрорядов биочипов.There are optical systems used to read fluorescent signals from the surface of substrates having many reaction microzones - biochips. Due to the fact that microzones are very small, it becomes necessary to accurately measure luminescence signals from microobjects. Currently, there are many readers, the optical schemes of which make it possible to read fluorescence or luminescent signals from microzones of biological substances on the surface of microarrays with high sensitivity.

Известно устройство для сканирования биочипов (РСТ, заявка WO 01/65241, класс МПК G01N 21/64). Устройство может быть использовано для измерения сигналов флуоресценции биологических микрочипов или биочипов, выполненных на плоской поверхности. Оптическая схема устройства содержит канал возбуждения флуоресценции и канал измерения эмиссии флуоресценции исследуемого образца. Канал возбуждения содержит оптически связанные и установленные последовательно источник возбуждающего излучения, например, лазер, модулятор возбуждающего излучения, отражающее зеркало, первый объектив для направления сфокусированного возбуждающего излучения по волоконно-оптическому световоду и через сканирующую головку на микрочип. Канал измерения эмиссии флуоресценции содержит последовательно расположенные и оптически связанные сканирующую головку, волоконно-оптический световод, первый объектив, набор интерференционных фильтров эмиссии флуоресценции, ирисовую диафрагму, второй объектив и фотодетектор.A device for scanning biochips is known (PCT, application WO 01/65241, IPC class G01N 21/64). The device can be used to measure the fluorescence signals of biological microarrays or biochips made on a flat surface. The optical circuit of the device comprises a fluorescence excitation channel and a channel for measuring the fluorescence emission of the test sample. The excitation channel contains an optically coupled and sequentially installed excitation radiation source, for example, a laser, an excitation radiation modulator, a reflective mirror, a first lens for directing focused excitation radiation through an optical fiber and through a scanning head to a microchip. The fluorescence emission measuring channel contains a sequentially located and optically coupled scanning head, a fiber optic optical fiber, a first lens, a set of interference fluorescence emission filters, an iris, a second lens and a photo detector.

Известно устройство для считывания флуоресценции с биочипов (патент США №6646271, класс НКИ 250/458.1). Устройство может быть использовано для считывания флуоресценции с биочипов, биологические вещества на которых, нанесенные в виде отдельных очень плотных микрозон, мечены веществами, позволяющими проводить измерения с временным разрешением флуоресценции. Оптическая схема устройства содержит канал возбуждения и канал измерения флуоресценции исследуемого образца. Канал возбуждения флуоресценции содержит оптически связанные и установленные последовательно источник излучения, точечную диафрагму, первое отражающее зеркало, селективное зеркало, используемое для направления света на биочип, и первый объектив для освещения исследуемого образца. Канал измерения флуоресценции содержит первый объектив для сбора флуоресценции с биочипа, селективное зеркало для пропускания излучения флуоресценции с биочипа, второе отражающее зеркало, фильтр, второй объектив, точечную диафрагму и фотодетектор. В изобретении использована конфокальная оптическая система для направления возбуждающего света на образец и сбора излучения флуоресценции в одну точку на фотодетекторе. При этом свет от источника излучения и свет, попадающий на фотодетектор, оптически связаны расположением и идентичной системой объективов как на стороне освещения исследуемого образца, так и на стороне детектирования, благодаря этому фотодетектор получает информацию только из точек сканирования. В качестве флуоресцентных веществ могут быть использованы европий, СуЗ и др. Измерение флуоресценции с временным разрешением позволяет получить высокое соотношение величины сигнал/шум.A device for reading fluorescence from biochips is known (US patent No. 6646271, class NKI 250 / 458.1). The device can be used to read fluorescence from biochips, biological substances on which, deposited in the form of separate very dense microzones, are labeled with substances that allow measurements with a temporary resolution of fluorescence. The optical circuit of the device contains an excitation channel and a channel for measuring fluorescence of the test sample. The fluorescence excitation channel contains an optically coupled and sequentially installed radiation source, a point diaphragm, a first reflecting mirror, a selective mirror used to direct light to the biochip, and a first lens to illuminate the sample under study. The fluorescence measuring channel contains a first lens for collecting fluorescence from a biochip, a selective mirror for transmitting fluorescence radiation from a biochip, a second reflecting mirror, a filter, a second lens, a pinhole, and a photo detector. The invention used a confocal optical system for directing exciting light to a sample and collecting fluorescence radiation at a single point on a photodetector. In this case, the light from the radiation source and the light incident on the photodetector are optically coupled by the location and identical system of lenses both on the illumination side of the test sample and on the detection side, due to this the photodetector receives information only from the scanning points. Europium, Cy3, etc. can be used as fluorescent substances. Measurement of fluorescence with a time resolution allows one to obtain a high signal-to-noise ratio.

При измерении сигналов на дне лунок многолуночных микротитровальных сосудов указанные устройства обеспечивают малую точность измерений из-за высокого уровня вертикального положения дна лунки в микротитровальном сосуде и недостаточной глубины резкости оптической системы, используемой для возбуждения люминесценции измеряемого образца.When measuring signals at the bottom of the wells of multi-well microtiter vessels, these devices provide low measurement accuracy due to the high level of the vertical position of the bottom of the hole in the microtiter vessel and insufficient depth of field of the optical system used to excite the luminescence of the measured sample.

Известно устройство для считывания очень малых значений флуоресценции биологических образцов с чипов или микрорядов, находящихся на стеклянных или силиконовых платах, или на пористых фильтрах (заявка США №2004/0130715, класс НКИ 356/317). Устройство содержит канал возбуждения флуоресценции исследуемого образца и канал измерения эмиссии флуоресценции образца. Канал возбуждения флуоресценции содержит последовательно расположенные и оптически связанные источник излучения параллельного пучка возбуждающего света, первую точечную диафрагму, направляющий первый объектив, селективное зеркало для отражения возбуждающего света на исследуемый образец, расположенное под углом к направлению возбуждающего пучка света, второй объектив для фокусирования возбуждающего света на исследуемый образец. Канал измерения содержит оптически связанные и последовательно расположенные второй объектив для передачи излучения эмиссии флуоресценции на фотодетектор через селективное зеркало, третий объектив и вторую точечную диафрагму. Параллельный пучок возбуждающего излучения формируется первой точечной диафрагмой и через первый объектив и селективное зеркало направляется в фокус второго объектива, который направляет на исследуемый образец параллельный пучок света. Использование двух точечных диафрагм, одна из которых установлена перед объективом возбуждающего излучения, а вторая - после третьего объектива перед фотодетектором, позволяет исключить попадание на детектор излучения мешающей флуоресценции. Устройство позволяет измерять очень малые количества эмиссии флуоресценции образца, находящегося в жидкости или на твердом носителе.A device is known for reading very small fluorescence values of biological samples from chips or micro-rows located on glass or silicone boards or on porous filters (US application No. 2004/0130715, class NKI 356/317). The device comprises a fluorescence excitation channel for the test sample and a channel for measuring the fluorescence emission of the sample. The fluorescence excitation channel contains a sequentially located and optically coupled radiation source of a parallel exciting light beam, a first point diaphragm directing the first lens, a selective mirror for reflecting the exciting light to the sample under study, located at an angle to the direction of the exciting light beam, and a second lens for focusing the exciting light on test sample. The measurement channel contains an optically coupled and sequentially located second lens for transmitting fluorescence emission radiation to the photodetector through a selective mirror, a third lens and a second point aperture. A parallel beam of exciting radiation is formed by the first point diaphragm and is directed through the first lens and selective mirror into the focus of the second lens, which directs a parallel beam of light to the sample under study. The use of two point diaphragms, one of which is installed in front of the lens of the exciting radiation, and the second after the third lens in front of the photodetector, eliminates interference with the fluorescence from the radiation detector. The device allows you to measure very small amounts of fluorescence emission of a sample in a liquid or on a solid carrier.

Известна конфокальная детектирующая система для мультиплексного анализа микрорядов биологического образца (заявка США №2008/0277595, класс НКИ 250/458.1). Устройство может быть использовано для анализа образца в лунках многолуночных микротитровальных сосудов, нанесенного на поверхность дна ячейки в виде множества дискретных зон. Система содержит оптический канал возбуждения и канал измерения эмиссии флуоресценции исследуемого образца. Канал возбуждения флуоресценции содержит расположенные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего излучения, оптический мультиплексный элемент для создания множества освещающих элементов от одного источника, первый и второй объективы для направления возбуждающего света через первые сменные спектральные фильтры, селективное зеркало и третий объектив, фокусирующий излучение на исследуемый образец. Канал измерения содержит оптически связанные и установленные последовательно третий объектив для сбора и передачи эмиссии флуоресценции от образца, селективное зеркало, четвертый и пятый объективы с установленными между ними сменными спектральными фильтрами для выделения потока эмиссии от отдельной микрозоны образца, призму для раздельного направления сигналов флуоресценции через шестой объектив на фотодетектор.Known confocal detection system for multiplex analysis of microarrays of a biological sample (US application No. 2008/0277595, class NCI 250 / 458.1). The device can be used to analyze a sample in the wells of multi-well microtiter vessels deposited on the bottom surface of the cell in the form of many discrete zones. The system contains an optical excitation channel and a channel for measuring the fluorescence emission of the test sample. The fluorescence excitation channel contains sequentially and optically coupled excitation radiation source, an optical multiplex element for creating a plurality of illuminating elements from one source, first and second lenses for directing the excitation light through the first interchangeable spectral filters, a selective mirror and a third lens focusing the radiation on the sample . The measurement channel contains a third lens optically coupled and mounted in series for collecting and transmitting fluorescence emission from the sample, a selective mirror, fourth and fifth lenses with interchangeable spectral filters installed between them to isolate the emission flux from a separate microzone of the sample, a prism for separate direction of fluorescence signals through the sixth photodetector lens.

Недостатком указанных устройств является сложность конструкции и недостаточная точность измерений из-за использования импульсного лазера, обладающего нестабильностью светового потока.The disadvantage of these devices is the design complexity and lack of measurement accuracy due to the use of a pulsed laser with luminous flux instability.

Наиболее близким является портативное устройство для сканирования биочипов (патент США №6407395, класс НКИ 250/458.1). Устройство имеет небольшие размеры, простое в обслуживании, дешевое и позволяет производить сканирование биочипов с достаточной чувствительностью и широким динамическим диапазоном при наличии в микрорядах биочипов несколько сотен или менее элементов. Оптическая схема устройства содержит канал возбуждения и канал измерения флуоресценции. Канал возбуждения флуоресценции исследуемого образца содержит установленные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего флуоресценцию образца излучения, например, компактный лазер с волоконно-оптическим световодом, который направляет возбуждающее излучение через фильтр возбуждения люминесценции, конденсор и селективное зеркало на первый объектив, фокусирующий возбуждающее излучение на микроряды для последовательного сканирования всех микрозон биочипа. Канал измерения флуоресценции образца с биочипа содержит установленные последовательно и оптически связанные первый объектив, собирающий флуоресценцию образца, селективное зеркало, пропускающее излучение флуоресценции образца на второй объектив и точечную диафрагму, направляющих сфокусированное излучение флуоресценции на вход фотодетектора, в качестве которого могут быть использованы фотодиоды или миниатюрные фотоумножители. Точечная диафрагма устраняет мешающую флуоресценцию рассеяния и фона вокруг сканируемой микрозоны, благодаря чему улучшается соотношение сигнал/шум. Устройство предназначено для измерения флуоресценции с линейных рядов биочипов.The closest is a portable device for scanning biochips (US patent No. 6407395, class NCI 250 / 458.1). The device is small in size, easy to maintain, cheap, and allows scanning biochips with sufficient sensitivity and a wide dynamic range in the presence of several hundred or less elements in microarrays of biochips. The optical circuit of the device comprises an excitation channel and a fluorescence measurement channel. The fluorescence excitation channel of the test sample contains a sequentially and optically coupled source of fluorescence excitation of the sample, for example, a compact laser with a fiber optic fiber, which directs the excitation radiation through a luminescence excitation filter, a condenser and a selective mirror to the first lens focusing the excitation radiation on microorders for sequential scanning of all microzones of the biochip. The channel for measuring the fluorescence of a sample from a biochip contains a first lens mounted in series and optically coupled, collecting the fluorescence of the sample, a selective mirror that transmits the fluorescence radiation of the sample to the second lens and a pinhole, directing the focused fluorescence radiation to the input of the photodetector, which can be used as photodiodes or miniature photomultipliers. The point diaphragm eliminates the interfering fluorescence of scattering and background around the scanned microzone, thereby improving the signal-to-noise ratio. The device is designed to measure fluorescence from linear rows of biochips.

Недостатком устройства является небольшая глубина резкости оптической системы возбуждения люминесценции образца, что приводит к ухудшению чувствительности при измерении сигналов люминесценции микрозон рядов на поверхности дна лунок многолуночных микротитровальных сосудов.The disadvantage of this device is the small depth of field of the optical system for exciting the luminescence of the sample, which leads to a deterioration in sensitivity when measuring the luminescence signals of the microzone rows on the bottom surface of the holes of multi-well microtiter vessels.

Задачей является создание устройства для измерения сигналов люминесценции с поверхности биочипов, выполненных на дне лунок многолуночных микротитровальных сосудов.The objective is to create a device for measuring luminescence signals from the surface of biochips made at the bottom of the wells of multi-well microtiter vessels.

Техническим результатом, достигаемым при использовании полезной модели является улучшение соотношения сигнал/фон, снижение порогов обнаружения при качественном анализе и уменьшение ошибок при количественном анализе.The technical result achieved when using the utility model is to improve the signal / background ratio, lower detection thresholds for qualitative analysis and reduce errors in quantitative analysis.

Технический результат достигается предлагаемым техническим решением, сущность которого заключается в том, что в устройстве для считывания люминесцентных сигналов с поверхности биочипов, содержащем оптический канал возбуждения и оптический канал измерения люминесценции биологического образца на поверхности биочипов, в котором оптический канал возбуждения люминесценции содержит установленные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего люминесценцию биологического образца излучения, волоконно-оптический световод, фильтр возбуждения люминесценции, конденсор, первое селективное зеркало, установленное под углом к оптической оси, и первый объектив для фокусирования возбуждающего излучения и сбора люминесценции с поверхности биочипа с исследуемым биологическим образцом, оптический канал измерения люминесценции с поверхности биочипа с исследуемым биологическим образцом содержит первое селективное зеркало, фильтр регистрации люминесценции, второй объектив для направления сфокусированного излучения люминесценции исследуемого биологического образца на полевую диафрагму и затем на вход фотодетектора и систему обработки измеряемых сигналов, в оптическом канале возбуждения люминесценции на входной поверхности конденсора установлена апертурная диафрагма, а фильтр возбуждения люминесценции установлен между конденсором и первым селективным зеркалом, в оптическом канале измерения после первого селективного зеркала установлено второе селективное зеркало под углом к оптической оси.The technical result is achieved by the proposed technical solution, the essence of which is that in a device for reading luminescent signals from the surface of biochips containing an optical channel of excitation and an optical channel for measuring the luminescence of a biological sample on the surface of biochips, in which the optical channel of luminescence excitation contains sequentially and optically associated source of luminescence exciting biological radiation sample, fiber optic light e, a luminescence excitation filter, a condenser, a first selective mirror mounted at an angle to the optical axis, and a first lens for focusing the exciting radiation and collecting luminescence from the surface of the biochip with the biological sample under study, the optical channel for measuring luminescence from the surface of the biochip with the biological sample under study contains the first selective mirror, luminescence registration filter, second lens for directing focused luminescence radiation of the biological aperture diaphragm and then to the input of the photodetector and the system for processing the measured signals, an aperture diaphragm is installed in the optical luminescence excitation channel on the input surface of the condenser, and a luminescence excitation filter is installed between the condenser and the first selective mirror, in the optical measurement channel after the first selective mirror, a second selective mirror at an angle to the optical axis.

Из существующего уровня техники известны устройства для измерения малых значений флуоресценции, имеющие конфокальные оптические системы, используемые для возбуждения и измерения флуоресценции исследуемого образца, которые позволяют уменьшить влияние мешающей флуоресценции, улучшить соотношение сигнал/шум, т.е. повысить чувствительность измерений (патент США №6646271, заявка США №2004/0130715). В предлагаемом техническом решении по сравнению с прототипом, введены новый признак: второе селективное зеркало, установленное под углом к оптической оси канала измерения и апертурная диафрагма, и использовано иное расположение известных признаков. Апертурная диафрагма предназначена для формирования угла сбора светового пучка возбуждения люминесценции и угла сходимости светового пучка возбуждения на дне лунки многолуночного микротитровального сосуда, что позволяет улучшить равномерность освещенности в световом пятне возбуждения. Расположение фильтра возбуждения между конденсором и селективным зеркалом на участке параллельного пучка возбуждающего света позволяет использовать интерференционные фильтры высокого контраста. Второе селективное зеркало позволяет повысить спектральный контраст в канале регистрации люминесценции, что имеет большое значение при измерении сигналов сильно структурированных исследуемых образцов с неравномерным распределением сигнала люминесценции по поверхности. За счет введения новых признаков и иного их расположения увеличивается глубина резкости оптической системы возбуждения, что позволяет компенсировать нестабильность вертикальных размеров дна лунок многолуночного микротитровального сосуда и нестабильность положения дна относительно посадочной поверхности установки планшета, что приводит к снижению случайных составляющих ошибки измерения при количественном анализе. Вся совокупность признаков предлагаемой полезной модели позволяет уменьшить уровень минимального определяемого сигнала, т.е. определять более низкие концентрации искомых биологических объектов, улучшить соотношение сигнал/фон, снизить уровень систематических ошибок при количественном анализе, а значит повысить чувствительность и точность измерений. Следовательно, предлагаемая полезная модель соответствует критерию новизны.Devices for measuring small fluorescence values are known from the prior art, having confocal optical systems used to excite and measure the fluorescence of the test sample, which can reduce the effect of interfering fluorescence, improve the signal-to-noise ratio, i.e. to increase the sensitivity of measurements (US patent No. 6646271, US application No. 2004/0130715). In the proposed technical solution, in comparison with the prototype, a new feature is introduced: a second selective mirror mounted at an angle to the optical axis of the measurement channel and an aperture diaphragm, and a different arrangement of known features is used. The aperture diaphragm is designed to form the angle of collection of the light beam of the excitation of luminescence and the angle of convergence of the light beam of excitation at the bottom of the hole of a multi-well microtiter vessel, which improves the uniformity of illumination in the light spot of excitation. The location of the excitation filter between the condenser and the selective mirror in the area of the parallel exciting light beam allows the use of high contrast interference filters. The second selective mirror makes it possible to increase the spectral contrast in the luminescence recording channel, which is of great importance when measuring the signals of highly structured test samples with an uneven distribution of the luminescence signal over the surface. Due to the introduction of new features and their different location, the depth of field of the optical excitation system increases, which makes it possible to compensate for the instability of the vertical sizes of the bottom of the wells of a multi-well microtiter vessel and the instability of the bottom position relative to the landing surface of the tablet setup, which reduces the random components of the measurement error in quantitative analysis. The whole set of features of the proposed utility model allows to reduce the level of the minimum detectable signal, i.e. determine lower concentrations of the desired biological objects, improve the signal / background ratio, reduce the level of systematic errors in quantitative analysis, and therefore increase the sensitivity and accuracy of measurements. Therefore, the proposed utility model meets the criterion of novelty.

Полезная модель может быть использована в здравоохранении, медицине, биотехнологии, в лабораторной практике для проведения экспрессной индикации и идентификации патогенных микроорганизмов, гормонов, токсинов и других биологически активных веществ. Следовательно, предлагаемая полезная модель соответствует критерию промышленной применимости.The utility model can be used in healthcare, medicine, biotechnology, in laboratory practice for express indication and identification of pathogenic microorganisms, hormones, toxins and other biologically active substances. Therefore, the proposed utility model meets the criterion of industrial applicability.

На фиг. показан вариант устройства полезной модели. Устройство содержит канал возбуждения люминесценции исследуемого образца и канал регистрации люминесценции исследуемого образца. В канал возбуждения люминесценции образца входят последовательно расположенные и оптически связанные лазерный диод 1, волоконно-оптический световод 2, апертурная диафрагма 3 конденсор 4, фильтр 5 возбуждения люминесценции исследуемого образца, установленное под углом к оптической оси первое селективное зеркало 6, объектив 7 возбуждения люминесценции образца на дне 8, лунки 9 многолуночного микротитровального сосуда; канал измерения люминесценции образца содержит последовательно расположенные и оптически связанные дно 8 ячейки микротитровального сосуда 9, первый объектив 7 измерения люминесценции образца, селективное зеркало 6 и селективное зеркало 10, установленные под углом к оптической оси, набор светофильтров 11 регистрации люминесценции, второй объектив 12 регистрации люминесценции, полевая диафрагма 13, фотоумножитель (ФЭУ) 14 и блок 15 обработки измеряемых сигналов.In FIG. A variant of the utility model device is shown. The device comprises a luminescence excitation channel for the test sample and a luminescence recording channel for the test sample. The luminescence excitation channel of the sample includes sequentially located and optically coupled laser diode 1, fiber optic fiber 2, aperture diaphragm 3, capacitor 4, luminescence excitation filter 5 of the sample under study, first selective mirror 6 mounted at an angle to the optical axis, sample luminescence excitation lens 7 at bottom 8, wells 9 of a multi-well microtiter vessel; The luminescence measurement channel of the sample contains sequentially located and optically connected bottom 8 cells of the microtiter vessel 9, a first lens 7 for measuring the luminescence of the sample, a selective mirror 6 and a selective mirror 10 mounted at an angle to the optical axis, a set of light filters 11 for registering luminescence, and a second lens 12 for registering luminescence , field aperture 13, photomultiplier tube (PMT) 14 and the unit 15 for processing the measured signals.

Устройство работает следующим образом.The device operates as follows.

Световые импульсы возбуждения люминесценции с лазерного диода 1 по волоконно-оптическому световоду 2 поступают через апертурную диафрагму 3 и конденсор 4 на вход фильтра 5 возбуждения люминесценции. Основная длина волны возбуждающего лазерного излучения 375 нм. Однако кроме основного излучения в спектре присутствуют паразитные излучения с длинами волн до 800 нм с мощностью излучения на 3-4 порядка ниже мощности основного излучения. Оптический фильтр 5 возбуждения люминесценции подавляет паразитные составляющие светового потока возбуждения, делая их влияние пренебрежимо малым. С выхода фильтра 5 возбуждения люминесценции световой поток поступает на первое селективное зеркало 6, которое имеет коэффициент отражения на длине волны 375 нм не менее 90%. В области длин волн регистрации (600-690 нм) коэффициент его пропускания не менее 85%. Световой поток возбуждения, отразившись от первого селективного зеркала 6, поступает на вход первого объектива 7 возбуждения люминесценции, который формирует световое пятно возбуждения на поверхности биочипа дне лунки 8 ячейки 9 многолуночного микротитровального сосуда. Оптимальные размеры светового пятна возбуждения определяются распределением люминесцирующих объектов на поверхности микрозон биочипов и способом сканирования. Например, при шаге сканирования 50 мкм, диаметре индицируемого реагентного пятна на объекте измерения 500 мкм и минимальном расстоянии между реагентными пятнами 350-450 мкм оптимальный диаметр светового пятна возбуждения должен находиться в интервале 125-150 мкм, т.е. 2,5-3 шага сканирования. При этом значении светового пятна возбуждения обеспечивается многократное возбуждение люминесценции любой точки реагентного пятна на биочипе (исследуемого биологического образца), что особенно важно при геометрически структурированном характере объектов внутри сканируемого пятна, т.е. образцов с неравномерным распределением сигнала люминесценции по поверхности. Чем ниже концентрация определяемого вещества в реагентном пятне, тем сильнее структурирована его геометрия, при этом при низких значениях концентрации внутри реагентного пятна располагается всего несколько люминесцирующих объектов размером менее одного шага сканировая.The light pulses of luminescence excitation from the laser diode 1 through a fiber optic fiber 2 are supplied through an aperture diaphragm 3 and a condenser 4 to the input of the luminescence excitation filter 5. The main wavelength of the exciting laser radiation is 375 nm. However, in addition to the main radiation, the spectrum contains spurious emissions with wavelengths up to 800 nm with a radiation power 3-4 orders of magnitude lower than the power of the main radiation. The optical filter 5 of the excitation of luminescence suppresses the parasitic components of the luminous flux of the excitation, making their effect negligible. From the output of the luminescence excitation filter 5, the light flux enters the first selective mirror 6, which has a reflection coefficient at a wavelength of 375 nm of at least 90%. In the region of registration wavelengths (600-690 nm), its transmittance is not less than 85%. The luminous flux of the excitation, reflected from the first selective mirror 6, enters the input of the first lens 7 of the luminescence excitation, which forms the light spot of excitation on the surface of the biochip to the bottom of the hole 8 of the cell 9 of the multi-well microtiter vessel. The optimal sizes of the light spot of the excitation are determined by the distribution of luminescent objects on the surface of microzones of biochips and by the scanning method. For example, with a scanning step of 50 μm, the diameter of the indicated reagent spot at the measuring object 500 μm, and the minimum distance between the reagent spots 350-450 μm, the optimal diameter of the excitation light spot should be in the range 125-150 μm, i.e. 2.5-3 scan steps. With this value of the light spot of excitation, multiple luminescence excitation of any point of the reagent spot on the biochip (of the studied biological sample) is ensured, which is especially important for the geometrically structured nature of the objects inside the scanned spot, i.e. samples with an uneven distribution of the luminescence signal over the surface. The lower the concentration of the analyte in the reagent spot, the more strongly its geometry is structured, while at low concentration values there are only a few luminescent objects with a size of less than one scan step inside the reagent spot.

Световые импульсы возбуждения люминесценции возбуждают как регистрируемую длительную люминесценцию исследуемого образца, так и паразитную флуоресценцию окрестных областей. Световой поток люминесценции исследуемого образца имеет шаровую диаграмму направленности, при этом часть его собирается первым объективом возбуждения люминесценции и направляется через первое селективное зеркало 6 на второе селективное зеркало 10. Отраженный световой поток люминесценции поступает на вход сменных фильтров 11 регистрации люминесценции. В данном варианте предлагаемого устройства используется три фильтра регистрации для пропускания трех длин волн: 615 нм. 653 нм и 670 нм в зависимости от используемых люминесцентных меток - Pt-порфирина, хелатного комплекса Еu или Pd-порфирина. Коэффициент пропускания для всех фильтров в максимуме регистрации не менее 40%, при этом особенностью фильтров регистрации является высокий контраст основных спектров пропускания и способность подавлять отраженное от объекта измерения возбуждающее излучение и паразитную флуоресценцию. Сформированный по спектру световой поток поступает на вход второго объектива 12 регистрации люминесценции и через полевую диафрагму 13 - на вход фотоумножителя 14, с выхода которого сигнал поступает на вход системы 15 обработки измеряемых сигналов. Полевая диафрагма 13 оптически сопряжена со световым пятном возбуждения люминесценции на микрочипе на дне 8 лунки 9 многолуночного микротитровального сосуда. Диаметр диафрагмы выбирается больше сопряженного пятна возбуждения, что позволяет пропустить без потерь световой поток люминесценции из светового пятна возбуждения на дне лунки и максимально подавить световые излучения окрестных областей. Это дает возможность исключить влияние соседних микрозон с исследуемым образцом на биочипе друг на друга в несколько раз.Light pulses of luminescence excitation excite both the recorded long-term luminescence of the test sample and the spurious fluorescence of the surrounding areas. The luminescence luminous flux of the test sample has a spherical radiation pattern, with part of it being collected by the first luminescence excitation lens and sent through the first selective mirror 6 to the second selective mirror 10. The reflected luminescence flux enters the input of the replaceable luminescence recording filters 11. In this embodiment of the proposed device, three registration filters are used to transmit three wavelengths: 615 nm. 653 nm and 670 nm depending on the luminescent labels used - Pt-porphyrin, the chelate complex Eu or Pd-porphyrin. The transmittance for all filters at a maximum of recording is at least 40%, while the feature of the registration filters is the high contrast of the main transmission spectra and the ability to suppress the excitation radiation and spurious fluorescence reflected from the measurement object. The luminous flux generated by the spectrum is fed to the input of the second luminescence recording lens 12 and through the field diaphragm 13 to the input of the photomultiplier 14, from the output of which the signal is fed to the input of the system for processing the measured signals 15. Field diaphragm 13 is optically coupled to a light spot of luminescence excitation on a microchip at the bottom of 8 holes 9 of a multi-well microtiter vessel. The diameter of the diaphragm is chosen to be larger than the conjugated spot of excitation, which allows you to skip without loss the luminous flux of luminescence from the light spot of excitation at the bottom of the hole and to suppress the light radiation of the surrounding areas. This makes it possible to exclude the influence of neighboring microzones with the studied sample on the biochip on each other several times.

Claims

A device for reading luminescent signals from the surface of biochips, containing an optical excitation channel and an optical channel for measuring luminescence emission of the test biological sample on the surface of the biochips, in which the optical luminescence excitation channel contains a radiation source that excites the luminescence of the biological sample, a fiber optic fiber, luminescence excitation filter, condenser, first selective mirror mounted by At an angle to the optical axis, and the first lens for focusing the exciting radiation and collecting luminescence onto the surface of the biochip with the biological sample under study, the optical channel for measuring luminescence from the surface of the biochip with the biological sample under study contains a first selective mirror mounted in series and optically coupled, a luminescence recording filter, and a second a lens for directing the focused luminescence radiation of the biological sample under study to the field diaphragm and then and the photodetector input and the system for processing the measured signals, characterized in that an aperture diaphragm is installed in the optical luminescence excitation channel on the input surface of the condenser, a luminescence excitation filter is installed between the condenser and the first selective mirror, and in the optical measurement channel after the first selective mirror at an angle to the optical axis mounted second selective mirror.