RU2678227C1 - Minimally invasive method for diagnostics of lung cancer on basis of changing copy number of mtdna hv2 locus - Google Patents
Minimally invasive method for diagnostics of lung cancer on basis of changing copy number of mtdna hv2 locus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2678227C1 RU2678227C1 RU2018107176A RU2018107176A RU2678227C1 RU 2678227 C1 RU2678227 C1 RU 2678227C1 RU 2018107176 A RU2018107176 A RU 2018107176A RU 2018107176 A RU2018107176 A RU 2018107176A RU 2678227 C1 RU2678227 C1 RU 2678227C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- copy number
- values
- lung cancer
- gapdh
- lung
- Prior art date
Links
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 title claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000001046 green dye Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 5
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 4
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 244000309464 bull Species 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012327 Endoscopic diagnosis Methods 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091012583 BCL2 Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101100520033 Dictyostelium discoideum pikC gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102100027274 Dual specificity protein phosphatase 6 Human genes 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101150071475 FDPS gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035111 Farnesyl pyrophosphate synthase Human genes 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 101001057587 Homo sapiens Dual specificity protein phosphatase 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001023007 Homo sapiens Farnesyl pyrophosphate synthase Proteins 0.000 description 1
- 101000613610 Homo sapiens Monocyte to macrophage differentiation factor Proteins 0.000 description 1
- 101000800546 Homo sapiens Transcription factor 21 Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001047681 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Lck Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 102100040849 Monocyte to macrophage differentiation factor Human genes 0.000 description 1
- -1 NANOG Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 1
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000006381 STAT1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100033121 Transcription factor 21 Human genes 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100024036 Tyrosine-protein kinase Lck Human genes 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000013276 bronchoscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007348 cell dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000020874 response to hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 208000037997 venous disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005186 women's health Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может быть использовано для малоинвазивной диагностики рака легкого.The invention relates to medicine, namely to molecular biology, oncology, and can be used for minimally invasive diagnosis of lung cancer.
В мире ежегодно регистрируется более 1 млн. 800 тыс. новых случаев заболевания раком легкого и более 1 млн. 500 тыс. смертей от данной патологии (см. World Cancer Report 2014. Chapter 1.1. World Health Organization. 2014. ISBN 9283204298).More than 1 million 800 thousand new cases of lung cancer and more than 1 million 500 thousand deaths from this pathology are registered annually in the world (see World Cancer Report 2014. Chapter 1.1. World Health Organization. 2014. ISBN 9283204298).
Столь высокий показатель смертности отчасти связан с тем, что в настоящее время проблема ранней диагностики рака легкого остается не решенной, а изученные молекулярные маркеры не показывают достоверной специфичности.Such a high mortality rate is partly due to the fact that currently the problem of early diagnosis of lung cancer remains unresolved, and the molecular markers studied do not show significant specificity.
Прогностическое значение многих из них спорно и, главным образом, отражает различия в методологии исследований, группах пациентов и интерпретациях.The prognostic value of many of them is controversial and mainly reflects differences in research methodology, patient groups and interpretations.
Прогностической ценностью обладают сигнатуры экспрессии определенных генов (например, DUSP6, MMD, STAT1, ERBB3 и LCK) хотя эти данные чрезвычайно гетерогенны (см. Кутилин Д.С., Енин Я.С., Петрусенко Н.А., Водолажский Д.И. Изменение копийности генетических локусов при малигнизации тканей легкого // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - №6.; URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25994).Signatures of the expression of certain genes (e.g., DUSP6, MMD, STAT1, ERBB3, and LCK) have predictive value, although these data are extremely heterogeneous (see Kutilin D.S., Enin Ya.S., Petrusenko N.A., Vodolazhsky D.I. Changing the copy number of genetic loci during malignancy of lung tissue // Modern problems of science and education. - 2016. - No. 6; URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25994).
Трансформация нормальных клеток в раковые связана с накоплением изменений в геноме, обеспечивающих приобретение трансформированными клетками неограниченного потенциала к пролиферации; резистентности к сигналам апоптоза; способности поддерживать ангиогенез; способности к инвазии и метастазированию.The transformation of normal cells into cancer cells is associated with the accumulation of changes in the genome that ensure that transformed cells acquire an unlimited potential for proliferation; resistance to apoptosis signals; ability to support angiogenesis; ability to invasion and metastasis.
Молекулярные изменения, ответственные за приобретение вышеуказанных свойств, могут использоваться в качестве онкомаркеров (см. Zhu C.Q., Shih W., Ling C.H., Tsao M.S. Immunohistochemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation // J. Clin. Pathol. - 2006. - V. 59 (8). - P. 790-800; см. Владимирова Л.Ю., Кит О.И., Шолохова Е.А. Роль гистологического и молекулярного анализа в выборе метода лечения немелкоклеточного рака легкого поздних стадий // Фарматека. 2012. №8 (241). С. 9-22.).The molecular changes responsible for acquiring the above properties can be used as tumor markers (see Zhu CQ, Shih W., Ling CH, Tsao MS Immunohistochemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation // J. Clin. Pathol. - 2006. - V. 59 (8). - P. 790-800; see Vladimirova L.Yu., Kit O.I., Sholokhova E.A. Role of histological and molecular analysis in choosing a method for the treatment of non-small cell lung cancer of the late stages // Farmateka. 2012. No. 8 (241). S. 9-22.).
К подобным молекулярным онкомаркерам можно отнести специфические изменения числа копий генов (см. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Гудуева Е.Н. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка // Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, №4. - С. 658-666.).Such molecular tumor markers include specific changes in the number of gene copies (see Kit O.I., Vodolazhsky D.I., Kutilin D.S., Gudueva E.N. Change in the copy number of genetic loci in gastric cancer // Molecular Biology. - 2015. - T. 49, No. 4. - S. 658-666.).
Изменение числа копий гена (copy number variation, CNV) является одним из основных механизмов изменения степени экспрессии потенциальных онкогенов и генов-супрессоров опухолей раковыми клетками. CNV - вид генетического полиморфизма, возникающий в результате несбалансированных хромосомных перестроек, приводящих к делециям и дупликациям фрагментов ДНК размером, больше, чем 50 (пар оснований) (см. Zarrei М., MacDonald J.R., Merico D., Scherer S.W. A copy number variation map of the human genome // Nature Reviews Genetics. - 2015. - V. 16 (3). - P. 172-83).Change in the number of copies of a gene (copy number variation, CNV) is one of the main mechanisms for changing the degree of expression of potential oncogenes and tumor suppressor genes of cancer cells. CNV is a type of genetic polymorphism resulting from unbalanced chromosome rearrangements leading to deletions and duplications of DNA fragments larger than 50 (base pairs) (see Zarrei M., MacDonald JR, Merico D., Scherer SW A copy number variation map of the human genome // Nature Reviews Genetics. - 2015. - V. 16 (3). - P. 172-83).
Результатом подобных несбалансированных хромосомных перестроек также может явиться снижение или повышение числа копий определенного гена и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена - белка или некодирующей РНК (см. Chen Z., Xu W.R., Qian Н., Zhu W., Bu X.F., Wang S., Yan Y.M., Mao F., Gu H.B., Cao H.L., Xu X.J. Oct4, a novel marker for human gastric cancer // J. Surg. Oncol. - 2009. - V. 99 (7). - P. 414-9.).The result of such unbalanced chromosomal rearrangements can also be a decrease or increase in the number of copies of a particular gene and, consequently, reduced or increased expression of the gene product - protein or non-coding RNA (see Chen Z., Xu WR, Qian N., Zhu W., Bu XF , Wang S., Yan YM, Mao F., Gu HB, Cao HL, Xu XJ Oct4, a novel marker for human gastric cancer // J. Surg. Oncol. - 2009 .-- V. 99 (7) .-- P . 414-9.).
CNV являются следующим уровнем в полном понимании молекулярного контекста развития опухолевого процесса. Так была изучена роль CNV в качестве фактора малигнизации тканей желудка и легкого (см. 
Было проведено исследование относительной копийности генетических локусов, ответственных за регуляцию апоптоза (ВАХ, BCL2, C-FLAR, Р53, MDM2), пролиферацию (SOX2, ОСТ4, NANOG, PIK3 и МK167), окислительное фосфорилирование (HV2) и ответ на гипоксию (HIF1A1) в образцах, содержащих опухолевые и нормальные клетки тканей легкого и выявлены генетические локусы, которые имеют высокий потенциал в качестве молекулярных маркеров для прогнозирования рака легкого (HV2, HIF1A1, Р53, MDM2). Однако этот потенциал ограничен высоким уровнем инвазивности при получении биоматериала.A study was made of the relative copy number of the genetic loci responsible for the regulation of apoptosis (CVC, BCL2, C-FLAR, P53, MDM2), proliferation (SOX2, OCT4, NANOG, PIK3 and MK167), oxidative phosphorylation (HV2) and the response to hypoxia (HIF1A1 ) in samples containing tumor and normal lung tissue cells and genetic loci were identified that have high potential as molecular markers for predicting lung cancer (HV2, HIF1A1, P53, MDM2). However, this potential is limited by the high level of invasiveness in obtaining biomaterial.
Возможное решение этой проблемы находится в переходе на исследование копийности генов во внеклеточной ДНК плазмы крови.A possible solution to this problem lies in the transition to the study of the copy number of genes in extracellular DNA of blood plasma.
К внеклеточной ДНК в организме следует относить: клеточную и митохондриальную ДНК из соматических и из опухолевых клеток, подвергающихся процессам апоптоза и некроза; ДНК из эритробластов, ядра которых энуклеируются в процессе дифференцировки в эритроциты, ДНК из лимфоцитов в процессе их апоптотической гибели после стимуляции, ДНК эмбрионов в крови матери, бактериальную и вирусную ДНК.Extracellular DNA in the body should include: cellular and mitochondrial DNA from somatic and tumor cells undergoing apoptosis and necrosis; DNA from erythroblasts, the nuclei of which are enucleated during the process of differentiation into red blood cells, DNA from lymphocytes during their apoptotic death after stimulation, DNA of embryos in the mother’s blood, bacterial and viral DNA.
При многих видах опухолей определяется повышенный уровень внеклеточной ДНК (внДНК) в периферической крови. При этом прогресс заболевания часто связан с постепенным повышением уровня внДНК. Более того, довольно часто уровень внДНК возрастает при метастазировании опухоли, по сравнению со значениями в отсутствие последних (см. Козлов В.А. Свободная внеклеточная ДНК в норме и при патологии. Медицинская иммунология. 2013, Т. 15, №5, с. 399-412).In many types of tumors, elevated levels of extracellular DNA (vDNA) in peripheral blood are determined. Moreover, the progress of the disease is often associated with a gradual increase in the level of vDNA. Moreover, quite often the level of vDNA increases with tumor metastasis, compared with values in the absence of the latter (see Kozlov V.A. Free extracellular DNA in normal and pathological conditions. Medical immunology. 2013, V. 15, No. 5, p. 399-412).
Изменение числа копий митохондриальной ДНК определяемое по копийности локуса HV2 (гипервариабельный участок с 33 по 160 нуклеотид D-петли мтДНК), отражает состояние окислительного фосфорилирования малигнизированных клеток (см. Scatena R. Mitochondria and cancer: a growing role in apoptosis, cancer cell metabolism and dedifferentiation. // Adv Exp Med Biol. - 2012. - V. 942. - P. 287-308).The change in the number of copies of mitochondrial DNA determined by the copy number of the HV2 locus (hypervariable region from 33 to 160 nucleotides of the mtDNA D-loop) reflects the state of oxidative phosphorylation of malignant cells (see Scatena R. Mitochondria and cancer: a growing role in apoptosis, cancer cell metabolism and dedifferentiation. // Adv Exp Med Biol. - 2012 .-- V. 942. - P. 287-308).
В широкомасштабном исследовании, включавшем в себя группы пациентов с раком желудка на различных стадиях и условно здоровых доноров, была показана достоверная корреляция копийности мтДНК и прогрессии заболевания (см. Liao L.M. et al. Mitochondrial DNA Copy Number and Risk of Gastric Cancer: a Report from the Shanghai Women's Health Study // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 2011, 20 (9); 1944-9).In a large-scale study, which included groups of patients with gastric cancer at various stages and conditionally healthy donors, a reliable correlation of mtDNA copy number and disease progression was shown (see Liao LM et al. Mitochondrial DNA Copy Number and Risk of Gastric Cancer: a Report from the Shanghai Women's Health Study // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 2011, 20 (9); 1944-9).
Результаты другого исследования показали, что во внДНК у 95% пациентов с аденокарциномой легкого обнаружено достоверное снижение количества копий HV2 по сравнению с внДНК условно здоровых доноров (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Чубарян А.В., Туркин И.Н., Водолажский Д.И., Николаева Н.В., Лысенко И.Б. Изменение относительной копийности генетических локусов во внеклеточной ДНК у пациентов с аденокарциномой легкого. Известия вузов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки, 2017. №3. С. 74-83).The results of another study showed that in 95% of patients with pulmonary adenocarcinoma in the cDNA, a significant decrease in the number of HV2 copies was found in comparison with cDNA of conditionally healthy donors (see Kutilin D.S., Ayrapetova T.G., Anistratov P.A., Pyltsin S.P., Leiman I.A., Chubaryan A.V., Turkin I.N., Vodolazhsky D.I., Nikolaeva N.V., Lysenko I.B. Change in the relative copy number of genetic loci in extracellular DNA in patients with lung adenocarcinoma. University proceedings. North-Caucasian region. Natural sciences. 2017. No. 3. P. 74-83).
Поэтому, в качестве маркера для прогнозирования рака легкого допустимо использование показателя относительной копийности HV2 мтДНК.Therefore, as a marker for predicting lung cancer, the relative copy number of mtDNA HV2 is acceptable.
Из патентных источников известны следующее изобретения, наиболее близкие нашему.From patent sources the following inventions are known that are closest to ours.
1. «Способ комбинированной эндоскопической диагностики рентгенонегативных синхронных центральных раков легких» (см. патент RU 2628649 С1, опубликован: 21.08.2017, Бюл. №24) Способ заключается в комбинированной эндоскопической диагностике рентгенонегативных синхронных центральных раков легкого с помощью видеобронхоскопии в узкоспектральном режиме - сине-зеленой части спектра и в аутофлюоресцентном режим1. "The method of combined endoscopic diagnosis of X-ray negative synchronous central lung cancers" (see patent RU 2628649 C1, published: 08.21.2017, Bull. No. 24) The method consists in a combined endoscopic diagnosis of X-ray negative synchronous central lung cancers using narrow-spectrum video bronchoscopy - blue-green part of the spectrum and in autofluorescence mode
При выявлении с помощью аутофлюоресценции патологических участков, включая и минимальные очаги слизистой оболочки бронхиального дерева, за злокачественную трансформацию принимают участки с выраженным сиреневым свечением на фоне зеленого свечения нормальной окружающей слизистой оболочки.If pathological sites, including minimal foci of the mucous membrane of the bronchial tree, are detected by autofluorescence, sites with a pronounced lilac glow against the green glow of the normal surrounding mucous membrane are taken for malignant transformation.
2. «Способ диагностики рака легкого» (см. патент RU 2633693 С1, опубликован: 16.10.2017, Бюл. №29) Способ предназначен для малоинвазивной диагностики рака легкого путем выявления аберрантно-метилированных маркерных генов в составе внеклеточной ДНК (внДНК) плазмы крови.2. "Method for the diagnosis of lung cancer" (see patent RU 2633693 C1, published: 10.16.2017, Bull. No. 29) The method is intended for minimally invasive diagnosis of lung cancer by detecting aberrantly methylated marker genes in the composition of extracellular DNA (vDNA) in blood plasma .
Проводят метил-специфичную-ПЦР с использованием специально подобранных праймеров и зондов для контрольного гена FDPS и аберрантно-метилированных маркерных генов RARbeta2, RASSF1A и TCF21. Далее проводят сравнительный анализ результатов ПЦР с учетом полученного Сл для выявляемых генов. Если значение Ct≤35,1 для гена FDPS и Ct≤41 для генов RARbeta2 и/или RASSF1A и/или Ct≤42,5 для гена TCF 21, то делают заключение о наличии рака легкого у пациента.Methyl-specific PCR was performed using specially selected primers and probes for the FDPS control gene and the aberrant methylated marker genes RARbeta2, RASSF1A and TCF21. Next, a comparative analysis of the results of PCR is carried out taking into account the obtained SL for detectable genes. If the value Ct≤35.1 for the FDPS gene and Ct≤41 for the RARbeta2 and / or RASSF1A and / or Ct≤42.5 genes for the TCF gene 21, then a conclusion is made about the presence of lung cancer in the patient.
3. «Способ дифференциальной диагностики злокачественных новообразований и соматических незлокачественных заболеваний» (см. патент RU 2232391 С2, опубликован: 10.07.2004, Бюл. №19).3. "A method for the differential diagnosis of malignant neoplasms and somatic non-malignant diseases" (see patent RU 2232391 C2, published: July 10, 2004, Bull. No. 19).
Способ заключается в дифференциальной диагностике злокачественных новообразований легких, злокачественных новообразований желудка, злокачественных новообразований кроветворной системы, злокачественных новообразований толстого кишечника, злокачественных новообразований кожи, злокачественных новообразований мужской мочеполовой системы, злокачественных новообразований женской мочеполовой системы, злокачественных новообразований молочной железы, злокачественных новообразований поджелудочной железы и соматических незлокачественных заболеваний по данным инфракрасных спектров поглощения сыворотки крови.The method consists in the differential diagnosis of malignant neoplasms of the lungs, malignant neoplasms of the stomach, malignant neoplasms of the hematopoietic system, malignant neoplasms of the colon, malignant neoplasms of the male urogenital system, malignant neoplasms of the female genitourinary system, malignant neoplasms of the mammary gland, malignant neoplasms of the mammary gland, malignant neoplasms non-malignant venous diseases according to infrared absorption spectra of blood serum.
4. «Аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека» (см. патент RU 2528870 С2, опубликовано: 20.09.2014, Бюл. №26) Способ направлен на выявление рака легкого с помощью аптамеров, и может быть использован в диагностике.4. "Aptamer specific for tumor tissues of the human lung" (see patent RU 2528870 C2, published: 09/20/2014, Bull. No. 26) The method is aimed at detecting lung cancer using aptamers, and can be used in diagnosis.
Аптамеры получают в результате селекции, включающей чередование раундов позитивной селекции аптамеров к измельченным опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции у онкологических больных, и негативной селекции к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей, с выявлением пула аптамеров с наибольшей аффинностью, его клонирования, секвенирования, проверки на специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого.Aptamers are obtained as a result of selection, including the alternation of rounds of positive selection of aptamers to the crushed tumor tissues of the lung of a person taken after surgery from cancer patients, and negative selection to healthy tissues of the lung and whole blood of healthy people, with the identification of the aptamer pool with the highest affinity, its cloning, sequencing, checking for specificity of binding to lung tumor cells.
Полученные аптамеры обладают высокой чувствительностью к продуктам распада опухоли и циркулирующим раковым клеткам в периферической крови больных раком легкого, что позволяет повысить эффективность диагностики рака легкого человека.The obtained aptamers are highly sensitive to the products of tumor decay and circulating cancer cells in the peripheral blood of patients with lung cancer, which improves the efficiency of the diagnosis of human lung cancer.
Однако, описанные выше способы принципиально отличаются от нашего, обладают меньшей чувствительностью или специфичностью, чем предлагаемый нами. При этом данные способы более сложны для клинической реализации, либо имеют меньшую точность из-за особенности интерпретации данных.However, the methods described above are fundamentally different from ours, have less sensitivity or specificity than what we offer. Moreover, these methods are more difficult for clinical implementation, or have less accuracy due to the interpretation of the data.
Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Малоинвазивный способ диагностики рака легкого на основании изменения копийности локуса мтДНК HV2».An analysis of patent sources (www.fips.ru) also showed the absence of valid patents and applications for a “Minimally invasive method for the diagnosis of lung cancer based on changes in the copy number of the mtDNA HV2 locus”.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для диагностики развития рака легкого.The technical result of the claimed invention is the creation of a new, simple, not expensive and accurate method with unique highly specific sequences of synthetic oligonucleotides (primers) for the diagnosis of lung cancer.
Технический результат достигается тем, что проводят определение копийности генетического локуса HV2 относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и высокспецифичных праймеров: для HV2 F - GGGAGCTCTCCATGCATTTGGTA, R - AAATAATAGGATGAGGCAGGAATC; для GAPDH F - GCTGAACGGGAAGCTCACT, R - GCAGGTTTTTCTAGACGGCAG на матрице выделенной внДНК, рассчитывают относительную копийности гена (rC) по формуле rC=2-ΔCt, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔCt=Ct(HV2) - Ct(GAPDH), и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rCHV2>16169±3423 диагностируют отсутствие злокачественных опухолей легкого, при значениях rCHV2<1756±496 у пациента диагностируют рак легкого, а при значениях rCHV2 между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.The technical result is achieved by determining the copy number of the HV2 genetic locus relative to the GAPDH reference gene by PCR-RV in the presence of EVA-Green dye and highly specific primers: for HV2 F - GGGAGCTCTCCATGCATTTGGTA, R - AAATAATAGGATGAGGCAGGAATC; for GAPDH F - GCTGAACGGGAAGCTCACT, R - GCAGGTTTTTCTAGACGGCAG isolated extracellular DNA on the matrix, calculated relative copy number of the gene (rC) of formula rC = 2 -ΔCt, where Ct - median fluorescence signals, ΔC t = C t (HV2 ) - C t (GAPDH) , and the obtained rC values are compared with the prognostic copy interval, and for rC HV2 values> 16169 ± 3423, the absence of lung malignant tumors is diagnosed, for rC HV2 values <1756 ± 496, the patient is diagnosed with lung cancer, and for rC HV2 values between the indicated intervals, the obtained The result is uncertain.
Сущность способа заключается в том, что образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 400 g при 15°С. Из плазмы крови выделяют внДНК фенол-хлороформным методом и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для локуса HV2 и гена GAPDH, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле 2-ΔCt где ΔCt=Ct(HV2) - Ct(GAPDH). Затем сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях в интервале rCHV2>16169±3423 у пациента диагностируют отсутствие злокачественных новообразований легкого (чувствительность 96%, специфичность 95%), а при значениях в интервале rCHV2<1756±496 у пациента диагностируют рак легкого (чувствительность 96%, специфичность 92%). При значениях rCHV2 между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.The essence of the method is that blood samples (10 ml of blood and 3 ml of 10 mm phosphate buffer, pH 7.5, with 0.15 M NaCl and 50 mm EDTA) are separated into plasma and the cell fraction by centrifugation for 20 minutes at 400 g at 15 ° C. VDNA is isolated from blood plasma by the phenol-chloroform method and amplification is carried out with highly specific primers for the HV2 locus and the GAPDH gene, primary data are analyzed and relative copy number (rC) is calculated by the formula 2 -ΔCt where ΔCt = Ct (HV2) - Ct (GAPDH). Then, the obtained rC values are compared with prognostic copy numbers, and for values in the rC interval HV2 > 16169 ± 3423 the patient is diagnosed with the absence of malignant neoplasms of the lung (sensitivity 96%, specificity 95%), and with values in the interval rC HV2 <1756 ± 496 the patient is diagnosed with lung cancer (sensitivity 96%, specificity 92%). For rC HV2 values between the indicated intervals, the result is considered to be undefined.
Заявленный анализ основан на определении количества копий мтДНК относительно референсного гена GAPDH во внДНК плазмы крови пациентов с риском развития рака легкого, и последующем сравнении полученных значений с интервалом копийности rCHV2 характерным для рака легкого или его отсутствия.The claimed analysis is based on determining the number of copies of mtDNA relative to the GAPDH reference gene in the blood plasma vDNA of patients at risk of developing lung cancer, and then comparing the obtained values with the copy interval rC HV2 characteristic of lung cancer or its absence.
Заявленный способ включает следующие приемы:The claimed method includes the following techniques:
- выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;- isolation of extracellular DNA from blood plasma using the phenol-chloroform extraction method;
- определение относительной копийности генетического локуса HV2 методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной внДНК;- determination of the relative copy number of the HV2 genetic locus by PCR-RV in the presence of EVA-Green dye and specific primers on the selected vDNA matrix;
- анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;- analysis of primary data using the software of the amplifier;
- расчет относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,- the calculation of the relative copy number of the gene (rC) based on the ratio of signals produced by amplitudes of the studied and reference sequences,
- сравнением rC пробы с прогностическими значениями копийности rCстандарт, определенными для больных раком легкого и условно здоровых доноров (без онкологических заболеваний).- comparing the rC sample with prognostic values of the rC standard copy number determined for patients with lung cancer and conditionally healthy donors (without cancer).
Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для локусов HV2 и GAPDH. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1) осуществлялся с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank.To implement the method, specific oligonucleotide direct and reverse primers for the HV2 and GAPDH loci have been developed. The design of specific oligonucleotide primers (Table 1) was carried out using NCBI GenBank reference sequences.
Заявленный способ осуществляется следующим образом:The claimed method is as follows:
На первом этапе образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 400 g при 15°С.At the first stage, blood samples (10 ml of blood and 3 ml of 10 mm phosphate buffer, pH 7.5, with 0.15 M NaCl and 50 mm EDTA) are separated into plasma and cell fraction by centrifugation for 20 minutes at 400 g at 15 ° FROM.
Из плазмы крови ДНК выделяют фенол-хлороформным методом в нашей модификации. К плазме крови добавляют равный объем лизирующего буфера (2% SDS и 1% меркаптоэтанол) и 20 мкл протеиназы К, инкубируют в термостате при 58°С 1 час.DNA is isolated from the blood plasma by the phenol-chloroform method in our modification. An equal volume of lysis buffer (2% SDS and 1% mercaptoethanol) and 20 μl of proteinase K are added to the blood plasma, incubated in an incubator at 58 ° C for 1 hour.
К полученному лизату добавляют равный объем щелочного фенола и хлороформа (соотношение 1:1), центрифугируют 20 минут 3000 об/мин.An equal volume of alkaline phenol and chloroform (1: 1 ratio) was added to the obtained lysate, centrifuged for 20 minutes at 3000 rpm.
После разделения фаз отбирают водную фазу в отдельную стерильную пробирку. К водной фазе добавляют равный объем 96% изопропилового спирта и раствор 5 М NaCl до концентрации 100 mM, пробирку помещают в холодильник на -20°С на 60 минут.After phase separation, the aqueous phase is taken into a separate sterile tube. An equal volume of 96% isopropyl alcohol and a solution of 5 M NaCl are added to the aqueous phase to a concentration of 100 mM, the tube is placed in a refrigerator at -20 ° C for 60 minutes.
Далее центрифугируют 15 минут при 12700 об/мин, при -10°С, декантируют супернатант, а осадок промывают 80% этиловым спиртом, центрифугированием удаляют остатки этанола, высушивают осадок в твердотельном термостате и растворяют в 10 мМ ТЕ буфере.Then it is centrifuged for 15 minutes at 12700 rpm, at -10 ° С, the supernatant is decanted, and the precipitate is washed with 80% ethanol, ethanol residues are removed by centrifugation, the precipitate is dried in a solid-state thermostat and dissolved in 10 mM TE buffer.
Концентрация полученных препаратов ДНК измеряется на флюориметре. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 0,5 нг/мкл.The concentration of the obtained DNA preparations is measured on a fluorimeter. For PCR-PB, the DNA concentration in each sample is normalized to 0.5 ng / μl.
Амплификацию проводят в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 3 нг внДНК, 0,20 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl2, 1х ПЦР-буфер, 1х краситель EvaGreen, и 0,1 е.а./мкл реакционной смеси ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, и по 600 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена или гена-мишени.Amplification is carried out in 20 μl of a PCR mixture containing 3 ng of vDNA, 0.20 mm dNTPs, 2.5 mm MgCl 2 , 1x PCR buffer, 1x EvaGreen dye, and 0.1 EA / μl DNA-reaction mixture Thermus aquaticus polymerase, and 600 nM forward and reverse primers for the reference or target genes.
Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере по следующей программе: t=95°C в течение 4 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=58°C (чтение сигнала) в течение 30 с, t=72°C в течение 30 с.Quantitative PCR-RV amplification is carried out on a thermal cycler according to the following program: t = 95 ° C for 4 min. 40 cycles: t = 95 ° C for 10 s, t = 58 ° C (read signal) for 30 s, t = 72 ° C for 30 s.
Относительная копийность локуса HV2 вычисляется следующим образом: рассчитывается Сt для целевого локуса HV2 и референсного GAPDH, далее рассчитывается величина ΔCt=Ct(HV2) - Ct(GAPDH); копийность генетического локуса относительно референсного гена (rC) рассчитывается по формуле 2-ΔCt.The relative copy number of the HV2 locus is calculated as follows: С t is calculated for the target locus HV2 and reference GAPDH, then ΔC t = C t (HV2) - C t (GAPDH) is calculated; the copy number of the genetic locus relative to the reference gene (rC) is calculated by the formula 2 -ΔCt .
Сравниваются полученные значения rC с интервалом прогностического коэффициента копийности:The obtained rC values are compared with the interval of the prognostic copy coefficient:
- при значениях rCHV2>16169±3423 диагностируют отсутствие злокачественных опухолей легкого (чувствительность 96%, специфичность 95%),- at rC HV2 values> 16169 ± 3423, the absence of malignant lung tumors is diagnosed (sensitivity 96%, specificity 95%),
- при значениях rCHV2<1756±496 у пациента диагностируют рак легкого (чувствительность 96%, специфичность 92%),- at rC HV2 values <1756 ± 496, the patient is diagnosed with lung cancer (sensitivity 96%, specificity 92%),
- при значениях rCHV2 между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.- at rC HV2 between the indicated intervals, the result is considered to be undefined.
Предлагаемым способом было осуществлено обследование 50 пациентов, у которых был диагностирован рак легких, и 30 условно здоровых доноров (без онкологических заболеваний). Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводятся следующие примеры.The proposed method was carried out examination of 50 patients who were diagnosed with lung cancer, and 30 conditionally healthy donors (without cancer). To prove the prognostic value of the proposed method, the following examples are given.
1. Группу из 30 условно-здоровых доноров в возрасте от 27 до 57 лет обследовали заявляемым способом на копийность локуса HV2 относительно GAPDH. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288) и с разрешения этического комитета ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России. У всех условно-здоровых доноров-добровольцев взяли кровь при помощи вакутейнера с антикоагулянтом. Из полученной после центрифугирования плазмы выделили внДИК, и провели анализ заявленным способом.1. A group of 30 conditionally healthy donors aged 27 to 57 years were examined by the claimed method for the copy number of the HV2 locus relative to GAPDH. The work was carried out in compliance with the principles of voluntariness and confidentiality in accordance with the “Fundamentals of the legislation of the Russian Federation on the protection of the health of citizens” (Decree of the President of the Russian Federation of 12.24.1993 No. 2288) and with the permission of the ethics committee of the Federal State Budget Scientific Research Institute of Health of the Russian Federation. All conditionally healthy volunteer donors were bled using a vakuteyner with an anticoagulant. VDIK was isolated from the plasma obtained after centrifugation, and the analysis was performed by the claimed method.
Значения rCHV2 находились в интервале от 12746 до 19592 (у 29 доноров), что соответствует показателю rCHV2 характерному для отсутствия злокачественных опухолей легкого. У 1 донора (в возрасте 50 лет) полученный результат был неопределенным (промежуточный интервал) rCHV2=3917,19. Было проведено обследование всех доноров (первичный осмотр ЧДД: 16-18 в мин; одышки нет, грудная клетка пальпаторно: безболезненна, дыхание везикулярное, хрипы отсутствуют, СКТ ОГК без патологии).The rC HV2 values were in the range from 12746 to 19592 (in 29 donors), which corresponds to the rC HV2 value characteristic of the absence of lung malignancies. In 1 donor (at the age of 50), the result was uncertain (intermediate interval) rC HV2 = 3917.19. All donors were examined (initial inspection of NPV: 16-18 per min; no shortness of breath, chest on palpation: painless, vesicular breathing, no wheezing, SKT of OGK without pathology).
2. Группу из 50 человек, первично обратившихся по поводу заболевания раком легкого, обследовали заявляемым способом на копийность локуса HV2 относительно GAPDH. Средний возраст исследуемых составил 60,1±7,3 лет, на момент выполнения исследования 48 пациентов имели верифицированный диагноз рак легкого на стадиях от T1N0M0 до T3N2M1, и 2 пациента диагноз рак легкого на стадиях T4N2M1 и T4N3M1. У всех больных взяли кровь (до хирургического вмешательства) при помощи вакутейнера и получили плазму при помощи центрифугирования, из полученной плазмы выделили внДНК (как описано в способе).2. A group of 50 people who initially applied for lung cancer were examined by the claimed method for the copy number of the HV2 locus relative to GAPDH. The average age of the subjects was 60.1 ± 7.3 years, at the time of the study, 48 patients had a verified diagnosis of lung cancer at stages T1N0M0 to T3N2M1, and 2 patients were diagnosed with lung cancer at stages T4N2M1 and T4N3M1. Blood samples were taken from all patients (before surgery) using a vacutainer and plasma was obtained by centrifugation, vDNA was isolated from the obtained plasma (as described in the method).
Значения rCHV2 находились в интервале от 1260 до 2252 (у 48 пациентов), что соответствует показателю rCHV2 характерному для рака легкого. У 1 из двух пациентов (T4N3M1) полученный результат был неопределенным (меньше прогностического минимума характерного для рака легкого) rCHV2=686,24, у 2 из двух пациентов (T4N2M1) полученный результат также был неопределенным (меньше прогностического минимума характерного для рака легкого) rCHV2=180,21.The rC HV2 values ranged from 1260 to 2252 (in 48 patients), which corresponds to the rC HV2 characteristic of lung cancer. In 1 of two patients (T4N3M1), the result was uncertain (less than the prognostic minimum characteristic of lung cancer) rC HV2 = 686.24, in 2 of two patients (T4N2M1), the result was also uncertain (less than the prognostic minimum for lung cancer) rC HV2 = 180.21.
Заявляемый способ, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданным для диагностики рака легкого, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с плазмой крови, занимает не более 5 часов.The inventive method includes the primers developed by us and is economically viable for the diagnosis of lung cancer, carried out in a standard laboratory of molecular biology (PCR), without the use of special expensive equipment; possesses high sensitivity and specificity, analysis is possible with blood plasma, takes no more than 5 hours.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018107176A RU2678227C1 (en) | 2018-02-26 | 2018-02-26 | Minimally invasive method for diagnostics of lung cancer on basis of changing copy number of mtdna hv2 locus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018107176A RU2678227C1 (en) | 2018-02-26 | 2018-02-26 | Minimally invasive method for diagnostics of lung cancer on basis of changing copy number of mtdna hv2 locus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2678227C1 true RU2678227C1 (en) | 2019-01-24 |
Family
ID=65085211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018107176A RU2678227C1 (en) | 2018-02-26 | 2018-02-26 | Minimally invasive method for diagnostics of lung cancer on basis of changing copy number of mtdna hv2 locus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2678227C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2820322C1 (en) * | 2023-08-10 | 2024-06-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства" | Method for minimally invasive diagnosis of lung cancer by fragmented circulating free dna based on machine learning methods |
-
2018
- 2018-02-26 RU RU2018107176A patent/RU2678227C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Weizhu Zhu, Mitochondrial DNA mutations in breast cancer tissue and in matched nipple aspirate fluid, Carcinogenesis, Volume 26, Issue 1, 1.01.2005, Pages 145-152. * |
| William C. Copeland, Mitochondrial DNA Alterations in Cancer, Cancer Investigation, 2002, Vol. 20, Issue 4, Pages 557-569. * |
| Кутилин Д.С., Енин Я.С., Петрусенко Н.А., Водолажский Д.И., ИЗМЕНЕНИЕ КОПИЙНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛОКУСОВ ПРИ МАЛИГНИЗАЦИИ ТКАНЕЙ ЛЕГКОГО, Современные проблемы науки и образования, 2016 г., номер 6, стр. 3-4. * |
| Кутилин Д.С., Енин Я.С., Петрусенко Н.А., Водолажский Д.И., ИЗМЕНЕНИЕ КОПИЙНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛОКУСОВ ПРИ МАЛИГНИЗАЦИИ ТКАНЕЙ ЛЕГКОГО, Современные проблемы науки и образования, 2016 г., номер 6, стр. 3-4. William C. Copeland, Mitochondrial DNA Alterations in Cancer, Cancer Investigation, 2002, Vol. 20, Issue 4, Pages 557-569. Weizhu Zhu, Mitochondrial DNA mutations in breast cancer tissue and in matched nipple aspirate fluid, Carcinogenesis, Volume 26, Issue 1, 1.01.2005, Pages 145-152. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2820322C1 (en) * | 2023-08-10 | 2024-06-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства" | Method for minimally invasive diagnosis of lung cancer by fragmented circulating free dna based on machine learning methods |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111826444B (en) | A serum/plasma tsRNA marker, probe and application related to pancreatic cancer | |
| Gao et al. | Increased integrity of circulating cell-free DNA in plasma of patients with acute leukemia | |
| ES2691404T3 (en) | Non-invasive cancer diagnosis | |
| WO2020220994A1 (en) | Microrna marker combination for diagnosing gastric cancer and diagnostic kit | |
| CN110484624B (en) | A peripheral blood-based gastric cancer biomarker and its detection method and application | |
| WO2020093040A1 (en) | Methods to diagnose and treat cancer using non-human nucleic acids | |
| WO2017054325A1 (en) | Breast cancer combined diagnosis markers and detection kit | |
| JP7531916B2 (en) | Esophageal cancer biomarkers and their uses | |
| CN108866187B (en) | Long-chain non-coding RNA marker related to lung cancer auxiliary diagnosis and application thereof | |
| WO2017072292A1 (en) | Biomarker for breast cancer | |
| JP7345860B2 (en) | Gastric cancer biomarkers and their uses | |
| RU2678227C1 (en) | Minimally invasive method for diagnostics of lung cancer on basis of changing copy number of mtdna hv2 locus | |
| CA3181473A1 (en) | Tumor detection reagent and kit | |
| CN113584169B (en) | Serum tsRNA marker and probe related to liver cancer and application of serum tsRNA marker and probe | |
| US20210189504A1 (en) | Method and kit for measurement of rna | |
| WO2021224632A1 (en) | Cancer screening test | |
| CA2700941A1 (en) | 3.4 kb mitochondrial dna deletion for use in the detection of cancer | |
| EP2220252A1 (en) | Mitochondrial dna deletion between about residues 12317-16254 for use in the detection of cancer | |
| JP2020014415A (en) | Diagnostic biomarker for cancer | |
| RU2723090C1 (en) | Diagnostic technique for predisposition to renal cell carcinoma based on pcr-rflp | |
| KR20210083100A (en) | Marker for discriminating RCC or LCC in colorectal cancer patients | |
| CN115786503B (en) | DNA methylation marker combination and kit for early screening of gastric cancer | |
| CN108866189B (en) | A kit and system for predicting susceptibility to laryngeal squamous cell carcinoma | |
| CN117187388A (en) | Application of GRIK2 gene as marker in preparation of lung cancer detection kit | |
| US20120328714A1 (en) | Early detection and treatment of lung cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200227 |