RU2672378C1 - Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР - Google Patents
Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР Download PDFInfo
- Publication number
- RU2672378C1 RU2672378C1 RU2017123790A RU2017123790A RU2672378C1 RU 2672378 C1 RU2672378 C1 RU 2672378C1 RU 2017123790 A RU2017123790 A RU 2017123790A RU 2017123790 A RU2017123790 A RU 2017123790A RU 2672378 C1 RU2672378 C1 RU 2672378C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- buffer
- pcr
- precipitate
- followed
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 title description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims abstract description 14
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims abstract description 9
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 5
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- WGXZDYPGLJYBJW-UHFFFAOYSA-N chloroform;propan-2-ol Chemical compound CC(C)O.ClC(Cl)Cl WGXZDYPGLJYBJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000209120 Cenchrus Species 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001507939 Cormus domestica Species 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 244000067505 Xanthium strumarium Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к методу выделения ДНК из растений, пригодному для постановки ПЦР. Осуществляют гомогенизацию исследуемого образца в нелизирующем экстрагирующем буфере, содержащем ТЕ-буфер и поливинилпирролидон (ПВП). Далее проводят первичный лизис с использованием TRITON Х-10. Ресуспендируют осадок в ТЕ-буфере с ПВП с последующим центрифугированием. Удаляют супернатант. Этап повторяют 2-3 раза. Затем к осадку добавляют лизирующий раствор, содержащий GuSCN, DTT, EDTA, TRIS-HCI, перемешивают и добавляют протеиназу К и/или РНКазу А. Далее проводят экстракцию хлороформом и концентрирование ДНК изопропанолом. После осаждения ДНК осадок промывают двукратно, сначала 70% этанолом, а затем ацетоном. Высушивают и элюируют ДНК в ТЕ-буфере. Чистота выделенной ДНК, свободной от ингибиторов ПЦР, относительно белка А260/А280 составляет 2,0±0,09. Изобретение позволяет получить раствор ДНК высокого качества и высокой концентрации преимущественно ядерного генома, пригодный для лабораторных исследований, в том числе проведения ПЦР. 4 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно, к методам выделения ДНК из растений. Может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для выделения ДНК из растений с преимущественно высоким содержанием неповрежденной ядерной ДНК с целью последующей ПЦР-амплификации специфического участка изолированной ДНК.
Известные способы
1) Способ выделения НК с использованием сорбента[1]. Принцип метода заключается в обработке биологического материла хаотропными агентами - высококонцентрированными растворами в присутствии суспензии силики (двуокись кремния). Хаотропный агент растворяет клетки и вирусные частицы, приводя к высвобождению нуклеиновых кислот в раствор, которые под действием того же хаотропного агента избирательно сорбируются на поверхности силики. Лизирующий раствор включает в себя 140М GuSCN, 0.1М Tris-HCl, 20% 0.2М EDTA, 16.2М Triton Х-100. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с ДНК осаждаются, а супернатант с ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высоко очищенного препарата ДНК, который состоит из 140М GuSCN и 0.1М Tris-HCl с последующей сушкой. Элюция НК осуществляется в ТЕ-буфере и в дальнейшем используют в ПЦР.
К недостаткам данного метода можно отнести высокую стоимость сорбента и ограниченный количественный выход НК в связи с ограничением активной площади сорбирующего вещества. А так же наличие большого количества внеядерного генома и поврежденных НК.
2) Следующий способ [2] заключается в том, что смесь, из предварительно замороженных и растертых 200 мг навески листьев и 700 мкл буфера для экстракции (2% СТАВ, 1.4 М NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris HCl), тщательно перемешивают и инкубируют при 65°C в течение 10 минут. Далее добавляют 220 мкл ацетата калия и помещают пробирку на лед на 20 минут. Центрифугируют пробу в течение 3 минут при скорости 10000 об/мин. Перенести супернатант в чистую пробирку. К супернатанту необходимо добавить равный объем изопропанола, перемешать и центрифугировать 10 минут при 10000 об/мин для осаждения ДНК. Далее полученный осадок ДНК промывается 70% этанолом, растворяется в 200 мкл буфера ТЕ. Для депротеинизации образца внести в пробирку с раствором ДНК равный объем смеси фенол-хлороформа, хорошо перемешать встряхиванием и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку, не захватывая интерфазу. Повторить ту же процедуру со смесью хлороформ - изоамиловый спирт. Отобрать водную фазу с ДНК в чистую пробирку. Высадить ДНК в 2,5 объемами холодного 96% этанола, предварительно прилив к образцу 1/10 объема 3М ацетата K или Na. Проба центрифугируется в течение 10 мин на максимальной скорости. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом. Высушить осадок ДНК и растворить в 50 мкл буфера ТЕ.
Недостатками данного способа является проведение депротеинизации образца после осаждения НК, в связи, с чем в выделении НК присутствует большое количество ингибиторов ПЦР, а так же наличие большого количества внеядерного генома и поврежденных НК.
3) Известен способ [3] выделения НК в молекулярной биологии для селективного выделения двунитевой ДНК, однонитевой ДНК или РНК. Лизис производится в растворе (0,2н. NaOH, 1% SDS, 50 мМ Трис-HCl; 10 мМ ЭДТА, 20 мкг/мл РНазы А).Нуклеиновую кислоту сорбируют на аэросиле (А-300) при нужной концентрации хаотропного агента путем добавления к пробе аэросила до конечной концентрации 0,3-0,6%, смесь инкубируют 1-2 мин, аэросил с сорбированной НК осаждают центрифугированием, промывают 80%-ным изопропанолом. ДНК элюируют водой или буфером с низким содержанием солей. В присутствии высоких концентраций хаотропных агентов сорбирует двунитевую ДНК, а при низких - РНК и однонитевую ДНК. Способ позволяет осуществить селективное выделение двунитевой ДНК и однонитевой ДНК или РНК.
К недостаткам данного способа можно отнести высокую стоимость сорбента и ограниченный количественный выход НК в связи с ограничением активной площади сорбирующего вещества. А так же наличие большого количества внеядерного генома и поврежденных НК
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ выделения нуклеиновых кислот с использованием метода [4] выделения ДНК из растительных тканей с использованием лизирующего буфера, последующей очисткой смесью хлороформа и изоамилового спирта и осаждением изопропанолом. 100 мг фрагмента растения лизируют в 400 мкл лизирующего раствора (2% СТАВ, 1.4М NaCI, 20 мМ EDTA, 100 мМ TrisHCI), после добавления 10 мкл РНКазы инкубируют при 65°C в течение 60 мин. После этого проводят двукратную промывку лизата 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (92:8) с промежуточным центрифугированием и переносом супернатанта в чистую пробирку. Осаждение ДНК проводят в присутствии 350 мкл изопропанола, центрифугирование и удаление супернатанта. Осадок ДНК промывают 400 мкл 70% этанола, сушат в течение 60 мин при комнатной температуре. Элюцию проводят в 50 мкл ТЕ-буфера.
Недостатками данного метода является неудовлетворительная активность лизирующего буферного раствора, наличие большого количества внеядерного генома и поврежденных НК. Чистота НК полученных данным методом слабо удовлетворительная.
Проанализировав существующие способы выявлено, что проблема в данной области состоит в том, что отсутствуют способы, позволяющие увеличить выход качественной неповрежденной ядерной ДНК с повышенной чистотой относительно ингибиторов ПЦР
Технический результат изобретения выражается в повышении концентрации цельного ядерного генома и чистоты, относительно ингибиторов ПЦР, и достигается тем, что исследуемый образец гомогенизируют в экстрагирующем буфере, содержащий РVР(поливинилпирролидон), и проводят первичный лизис с использованием TRITON Х-100. Избавляются от супернатанта. Далее проводят лизис с использованием лизирующего раствора состоящего из GuSCN, DTT, EDTA, TRIS-HCl и 15 мкл протеиназы К. Далее проводят хлороформовую экстракцию. Концентрирование НК осуществляют изопропанолом. промывают полученный осадок в 70% этаноле с последующей промывкой ацетоном. Далее высушивают осадок и элюируют в ТЕ-буфере.
Существенными признаками, характеризующими изобретение в отличии от прототипа является использование этапа концентрирования неповрежденных ядер с помощью использования неионного детергента TRITON Х-100 который разрушает клеточные мембраны, но не разрушает ядра клеток и избавления от поврежденных ядер, ДНК и внеядерных частиц (митохондрии, пластиды, рибосомы). Использование фермента протеиназы К и/или РНКазы А, проведение стадии депротеинизации в целях повышения чистоты выделяемых НК.
Предложенный способ поясняется гельэлектрофоретическим разделением растворов НК, выполненных разными лизирующими растворами на разных растительных материалах
На фиг. 1 представлен электрофорез выделения НК растения Xanthium strumarium.
На фиг. 2 представлен электрофорез выделения НК растений рода Cenchrus.
На фиг. 3 - электрофорез продуктов ПЦР с универсальной парой праймеров на пластидную ДНК растений рода Cenchrus.
На фиг. 4 - электрофорез продуктов ПЦР со слабоспецифичной парой праймеров на ядерный геном растений рода Cenchrus.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1. Выделение ДНК и РНК из растительного материала:
1. Навеску свежего растительного материала 150-200 мг гомогенизируют в фарфоровой ступке пестиком с добавлением 1000-1500 мкл экстрагирующего буфера (ТЕ-буфер) с 1%PVP и переносят 1000 мкл в микропробирку объемом 1,5 мл. Добавляют 250 мкл 25% TRITON Х-100 Тщательно встряхивают на вортексе и термостатируют 1 час при 60°C. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут с последующим удалением супернатанта не задевая верхний осадочный слой (темного цвета).
2. Ресуспендируют осадок в 1000 мкл ТЕ-буфера с 1% PVP с последующим центрифугированием при 5000 об/мин 5 минут. Супернатант удаляют. Данный этап повторяют 2-3 раза.
3. К осадку добавляют 500-700 мкл лизирующего раствора (4М GuSCN, 0.05М DTT, 5% 0.5М EDTA, 6% 1М TRIS-HCl) и 15 мкл протеиназы К (2 мг/мл). Интенсивно перемешивают на вортексе и термостатируют при 50-60°C в течении часа, периодически перемешивая.
4. Пробирки охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют при 13000 об/мин 5 минут. Переносят максимальный объем супернатанта в новую пробирку не задевая осадок.
5. К супернатанту добавляют равный объем хлороформа и периодически интенсивно встряхивают на вортексе в течении 5-10 минут с последующим центрифугированием при 13000 об/мин 10 минут. Переносят верхний водный слой в новую пробирку не задевая слой хлороформа.
6. К супернатанту добавляют равный объем изопропилового спирта либо 96% этиловый спирт в соотношении 1/2,5, тщательно встряхивают и центрифугируют при 13000 об/мин 5-10 минут. Перед центрифугированием рекомендуется вымораживание образца 20-30 минут при -20°C для повышения выхода НК.
7. Далее избавляются от супернатанта и промывают встряхиванием осадок 70% этанолом в объеме 500 мкл с последующим центрифугированием при 13000 об/мин 5 минут. Удаляют супернатант и промывают встряхиванием осадок ацетоном в объеме 400 мкл с последующим центрифугированием при 13000 об/мин 5 минут. Удаляют супернатант.
8. Осадок сушат в открытых пробирках при 37°C в течении 15-20 минут до полного испарения ацетона.
9. Элюируют НК в 100-150 мкл ТЕ-буфера с нагреванием до 60°C в течении 5 минут.
10. Хранят образцы при -20°C
Пример 2 - выделение ДНК из растительного материала
Выделение ДНК производят идентично примеру 1, за исключением пункта №3. В данном случае, после пункта №2, к осадку добавляют 500-700 мкл лизирующего раствора (4М GuSCN, 0.05М DTT, 5% 0.5М EDTA, 6% 1М TRIS-HCl) и 5-8 мкл РНКазы А (10 мг/мл) Интенсивно перемешивают на вортексе и термостатируют сначала 30 минут при 40°C затем 30 минут при 55°C периодически перемешивая. Затем добавляют 15 мкл протеиназы К (2 мг/мл) и термостатируют 1 час при 60°C периодически перемешивая. Далее все идентично пунктам примера 1.
Для определения качества выделения НК использовались оптические методы. Чистота относительно белка А260/А280 составляет 2,0±0,09 что считается очень чистым выделением НК свободным от ингибиторов ПЦР. Для подтверждения вышеизложенного была проведена ПЦР с универсальной парой праймеров на пластидную ДНК trnH2 / psbAF (DNA barcode) [Sang et al., 1997 and Tate, 2002]. Результат (фиг. 3) подтвердил наличие достаточного количества пластидной ДНК для исследовательских целей
Для подтверждения повышенного содержания ядерного генома была проведена слабоспецифичная реакция ПЦР на ядерный геном парой праймеров FvSTE.s5* (NCBI probe) на которой видно (фиг.4) различие результатов ПЦР амплификации
Данный метод позволяет получить раствор НК высокого качества и высокой концентрации преимущественно ядерного генома, пригодный для лабораторных исследований, в том числе проведения ПЦР. Прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования, и особой подготовки персонала лаборатории (за исключением классической техники безопасности при работе с токсичными легколетучими веществами, такими как хлороформ).
1. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids / R. BOOM [and others] // JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. - 1990. - Vol. 28, No. 3. - p. 495-503
2. Amani Abdel-Latif. Comparison of three genomic DNA extraction methods to obtain high DNA quality from maize / Amani Abdel-Latif, Gamal Osman // Plant Methods (2017)
3. Патент РФ №2119954, кл. C12N 15/10, C07H 21/00, C07H 21/02, C07H 21/04, опубл. 10.10.1998
4. Doyle J.J. and J.L. Doyle. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. // Phytochemical Bulletin, 1987. - T. 19. - P. 11-15
Claims (1)
- Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР, включающий гомогенизацию исследуемого образца, с использованием детергента с последующей хлороформо-изопропанол экстракцией, промывкой 70% спиртом, высушиванием и элюцией в ТЕ-буфере, отличающийся тем, что гомогенизацию исследуемого образца ведут в нелизирующем экстрагирующем буфере, содержащем ТЕ-буфер и поливинилпирролидон (ПВП), с последующим проведением первичного лизиса с использованием TRITON Х-100, после которого ресуспендируют осадок в ТЕ-буфере с ПВП с последующим центрифугированием, супернатант удаляют, этап повторяют 2-3 раза, затем к осадку добавляют лизирующий раствор, содержащий GuSCN, DTT, EDTA, TRIS-HCI, перемешивают и добавляют протеиназу К и/или РНКазу А, далее проводят экстракцию хлороформом, концентрирование ДНК изопропанолом, после осаждения ДНК осадок промывают двукратно, сначала 70% этанолом, а затем ацетоном.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123790A RU2672378C1 (ru) | 2017-07-06 | 2017-07-06 | Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123790A RU2672378C1 (ru) | 2017-07-06 | 2017-07-06 | Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2672378C1 true RU2672378C1 (ru) | 2018-11-14 |
Family
ID=64328000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017123790A RU2672378C1 (ru) | 2017-07-06 | 2017-07-06 | Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2672378C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114657255A (zh) * | 2020-12-23 | 2022-06-24 | 广东一方制药有限公司 | 用于蕲蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2241004C2 (ru) * | 1998-12-04 | 2004-11-27 | Инвитек Гмбх | Композиция и способ для выделения нуклеиновых кислот из комплексных материалов с применением антихаотропной соли |
| WO2016183292A1 (en) * | 2015-05-14 | 2016-11-17 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples |
-
2017
- 2017-07-06 RU RU2017123790A patent/RU2672378C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2241004C2 (ru) * | 1998-12-04 | 2004-11-27 | Инвитек Гмбх | Композиция и способ для выделения нуклеиновых кислот из комплексных материалов с применением антихаотропной соли |
| WO2016183292A1 (en) * | 2015-05-14 | 2016-11-17 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples |
Non-Patent Citations (5)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114657255A (zh) * | 2020-12-23 | 2022-06-24 | 广东一方制药有限公司 | 用于蕲蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4480622B2 (ja) | 核酸精製用組成物及び方法 | |
| RU2241004C2 (ru) | Композиция и способ для выделения нуклеиновых кислот из комплексных материалов с применением антихаотропной соли | |
| Richards et al. | Preparation of genomic DNA from plant tissue | |
| JP3761573B2 (ja) | 極度に少量でかつ非常に強く汚染された非常に種々の出発物質から核酸を単離および精製する一般的方法 | |
| JP5390772B2 (ja) | 核酸を安定化試薬から精製するための組成物および方法 | |
| ES2616569T3 (es) | Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos en el que los ácidos nucleicos se inmovilizan a alta temperatura sobre una matriz | |
| US7888006B2 (en) | Method for isolating DNA from biological samples | |
| WO2007100934A2 (en) | Methods and compositions for the rapid isolation of small rna molecules | |
| JP2011152142A (ja) | 精製ｒｎａの単離試薬及び方法 | |
| EP3135769A1 (en) | Kits and methods for extracting rna | |
| Maurya et al. | Evaluation of salt-out method for the isolation of DNA from whole blood: a pathological approach of DNA based diagnosis | |
| Tüzmen et al. | Techniques for nucleic acid engineering: The foundation of gene manipulation | |
| EP2010672B1 (de) | Formulierungen und verfahren zur isolierung von nukleinsäuren aus beliebigen komplexen ausgangsmaterialien und nachfolgende komplexe genanalytik | |
| RU2672378C1 (ru) | Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР | |
| Mary et al. | The isolation of genomic DNA from blackcurrant (Ribes nigrum L.) | |
| DE4422044A1 (de) | Verfahren zur Isolierung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren | |
| Dowhan | Purification and concentration of nucleic acids | |
| CN114703173A (zh) | 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 | |
| RU2807254C1 (ru) | Универсальный способ выделения ДНК и лизирующая смесь для его осуществления | |
| Fitriyani et al. | Optimization of DNA Isolation Dried Leaf Samples of Endangered Plants Dipterocarpus cinereus | |
| H. Dowhan | Purification and concentration of nucleic acids | |
| US20230130159A1 (en) | Rapid purification of high quality nucleic acids from biological samples | |
| KR101620481B1 (ko) | 미세조류로부터 ｄｎａ를 효율적으로 추출하는 방법 | |
| Li et al. | DNA Purification | |
| Chattopadhyay et al. | Purification of quality DNA from citrus plant using iron oxide nanoparticle as solid based support |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200707 |