RU2619898C1 - Способ консервации биологических материалов - Google Patents
Способ консервации биологических материалов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2619898C1 RU2619898C1 RU2016110713A RU2016110713A RU2619898C1 RU 2619898 C1 RU2619898 C1 RU 2619898C1 RU 2016110713 A RU2016110713 A RU 2016110713A RU 2016110713 A RU2016110713 A RU 2016110713A RU 2619898 C1 RU2619898 C1 RU 2619898C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- carrier
- biological
- immobilization
- preservative solution
- sucrose
- Prior art date
Links
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title abstract description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 22
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 20
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 2-[[bis(carboxymethyl)amino]methyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 claims description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 15
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 12
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 10
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012052 hydrophilic carrier Substances 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N anhydrous guanidine Natural products NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000004555 blood preservation Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способу консервирования биологических материалов. Способ консервации биологических материалов включает иммобилизацию их на сухом носителе с последующим высушиванием. В качестве носителя для иммобилизации используют крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал, который предварительно, перед иммобилизацией на него биологического материала, пропитывают консервирующим раствором, содержащим 0,7 М сахарозу, 1.5 М Tris-HCl с рН 7,4 и 0,5 М этилендиаминтетрауксусную кислоту. Способ обеспечивает повышение сохранности диагностически и биологически значимых свойств биологического материала в течение длительного времени и расширение арсенала средств консервации биологических материалов, используемых в дальнейшем для проведения лабораторного анализа. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способу консервации биологических материалов (кровь, моча, мазки-соскобы, суспензии растений, фитопатогены и т.п.), используемых в дальнейшем для проведения лабораторного анализа.
Известные способы консервации и транспортировки биологических материалов требуют либо замораживания в жидком азоте суспензии биологического материала со смесью соединений стабилизирующей композиции в водном растворе с получением твердых замороженных частиц, гранул, капель или нитей, либо заключения биологического материала в неагрессивную капсулу из металла, либо нанесения его на абсорбирующий бумажный лист, имеющий множество выборок зон, каждая выборка зоны имеет перфорацию, проходящую, по существу, по всему его периметру, так, чтобы препятствовать перетеканию капиллярного жидкого образца, из одной зоны в другую (RU 2573324, 20.01.2016; US 5516487, 14.05.1996; RU 2228617, 20.05.2004; WO 9957264, 11.11.1999). Однако ни одна из технологий консервации не давала в достаточной мере решения проблемы долгосрочной консервации биологического материала с сохранением их биологически и диагностически значимых свойств. На данный момент является актуальным создание простого способа для сохранения диагностически и биологически значимых свойств биологического материала в течение длительного времени.
Известен способ консервации биологических материалов путем сушки без замораживания с помощью стабилизирующей смеси веществ, включающей, по меньшей мере, два компонента: одно из группы, включающей моносахариды, дисахариды и цвиттерион с полярным остатком, второе вещество стабилизирующей смеси является цвиттерионом с неполярным остатком и представляет собой сложный эфир ацетилфенилаланина, аланин, цистеин, глицин, лейцин, метионин, триптофан, валин, саркозин. Стабилизированные биологические материалы обладают устойчивостью в процессе хранения при комнатной температуре и используются для диагностических и терапевтических целей (RU 2191003, 20.10.2002). Однако указанный способ сложен в исполнении и использовании.
Известен способ консервации биологических материалов, обеспечивающий сохранность нуклеиновых кислот путем получения лизата смешиванием биологического материала с консервирующим раствором, содержащим соединение гуанидина в количестве, достаточном для существенно полной денатурации содержащихся в образце нуклеаз, а также с компонентами, препятствующими деградации нуклеиновых кислот, а именно с восстановителем белковых S-S-связей в количестве, обеспечивающем существенно полное восстановление S-S-связей в белках лизата, с сильным детергентом, не образующим нерастворимого соединения с гуанидином, в количестве, достаточном для формирования мицелл в лизате, по крайней мере, с одним комплексоном ионов двух- и трехвалентных металлов в количестве, обеспечивающем его молярную концентрацию в лизате, заведомо более высокую, чем ожидаемая максимальная молярная концентрация ионов двух- и трехвалентных металлов, и буфером, поддерживающим значение рН лизата в диапазоне от 6 до 8. Способ обеспечивает сохранность нуклеиновых кислот при длительном хранении образцов в не замороженном состоянии (RU 2322058, 20.04.2008). Недостатками способа являются также его сложность выполнения и невысокая длительность хранения биологического материала, которая была прослежена только в течение 3, 7 и 14 суток.
В качестве ближайшего аналога нами рассмотрен способ консервации биологических материалов путем иммобилизации их на сухом носителе с последующим высушиванием. В соответствии с данным способом человеческий генетический образец или генетические образцы человека сохраняются в процессе домашнего самостоятельного хранения (US 5856102, 05.01.1999). Однако авторами не показана сохранность биологически значимых свойств образцов и длительность их хранения.
Сущность изобретения
Технический результат заключается в повышении сохранности диагностически и биологически значимых свойств биологического материала в течение длительного времени и расширении арсенала средств консервации биологических материалов, используемых в дальнейшем для проведения лабораторного анализа.
Технический результат достигается тем, что консервация биологических материалов включает иммобилизацию их на сухом носителе с последующим высушиванием, при этом в качестве носителя для иммобилизации используют крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал, который предварительно, перед иммобилизацией на него биологического материала, пропитывают консервирующим раствором, содержащим 0,7 М сахарозу, 1.5 М Tris HCl с рН 7,4 и 0,5 М этилендиаминтетрауксусную кислоту.
Сухой носитель пропитывают консервирующим раствором.
При этом консервирующий раствор сохраняет постоянство концентрации водородных ионов, с сохранением постоянного значения рН.
Кроме того, высушивание проводят в условиях, не допускающих разложение консервирующего раствора.
Восстановление высушенного биоматериала осуществляют путем его смыва водой или растворителем.
Пропитывание крупнопористого химически нейтрального гидрофильного материала носителя консервирующим раствором осуществляют до полного его пропитывания.
Кроме того, в способе консервация биологических материалов для предотвращения процесса гемолиза и сохранения гипобиоза растений консервирующий раствор содержит 0.7 М сахарозу. При этом он, пропитывая сухой носитель, позволяет длительно сохранять материал от растений и фитопатогенов.
Осуществление способа поясняются следующими примерами.
Пример 1
Перед нанесением реагента на крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал носителя готовят консервирующий раствор с определенной концентрацией. Предварительно готовили консервирующий раствор путем смешивания сахарозы, буфера Tris HCl и этилендиаминтетрауксусной кислоты. При этом 10 мл консервирующего раствора содержали в себе Tris - 1,5 М, рН подводили HCl до рН 7,4, сахарозы - 0,7 М, к ним добавляли 2 мл 0,5 М EDTA (рН 7,4).
Сухой носитель шириной 1 см и длиной 2.5 см, встроенный в картонный конверт, опускали в емкость с консервирующим раствором, содержащим 0,7 М сахарозу, 1.5 М Tris HCl (рН 7,4) и 2 мл 0,5 М EDTA и выдерживали в течение двух часов. Затем носитель высушивали в течение 1,5 часов при комнатной температуре.
На высушенный крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал носителя вносили 100-150 мкл крови, то есть до полного впитывания, и высушивали не менее 1.5 часов при комнатной температуре от 15° до 25°С.
Затем картонный конверт вместе с осушителем (гидрогелем) упаковали в зип-пакет, и хранили в бытовом холодильнике с температурой 2-5°С в течение не менее пяти лет до основного назначения (исследования методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментным анализом (ИФА)).
Для исследования биоматериалов, хранившихся на носителе, методами ПЦР и ИФА проводили восстановление их в жидкую форму. Для этого с использованием ножниц аккуратно разрезали носитель на три части, помещали их в 1,5 мл пробирку, содержащую 300 мкл дистиллированной воды. Пробирку оставляли при комнатной температуре на 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. Затем центрифугировали пробирку, отбирали надосадочную жидкость и переносили ее в чистую пробирку. Полученную жидкую пробу использовали в дальнейшей работе.
С использованием коммерческого набора реагентов для выделения ДНК/РНК из различных материалов производства ООО «БИОКОМ» проводили выделения ДНК и РНК микроорганизмов как с образцов с мембраны, так и из жидких образцов крови, отобранных с 3% раствором EDTA. ПЦР проводили согласно протоколу к наборам для амплификации, производства ООО «БИОКОМ». ИФА проводили с использованием коммерческого иммуноферментного набора реагентов IDEXX (США), определяли титры антител в крови животных к сальмонеллезу в нативных, так и в высушенных на носителе образцах. Результаты ПЦР анализа показаны на фиг. 1, где треки: 1-3 - выделенная ДНК Toxoplasma gondii из жидких образов крови, 4-6 - выделенная ДНК Toxoplasma gondii из сухих образцов крови, нанесенных на мембраны, пропитанные раствором, содержащим 0,7 М сахарозу, 1.5 M Tris HCl (рН 7,4) и 0,5 М EDTA. Для всех исследованных образцов полученные результаты в ИФА по определению антител с сухих мембран и нативных образцов коррелируют, что свидетельствует о стабильности консервированных сухих образцов.
Пример 2
В исследование брали листья картофеля и томата, пораженные X вирусом картофеля (PVX-Грибы), S вирусом картофеля (PVS-тля), M вирусом картофеля (PVM-тля), К вирусом томатов (TVK), L вирусом томатов (TVL). Из пораженных листьев картофеля и томатов отжимали сок. Предварительно готовили консервирующий раствор путем смешивания сахарозы, буфера Tris HCl и этилендиаминтетрауксусной кислоты. При этом 10 мл консервирующего раствора содержали в себе Tris - 1,5 М, рН подводили HCl до рН 7,4, сахарозы - 0,7 М, к ним добавляли 2 мл 0,5 М EDTA (рН 7,4).
Сухой носитель шириной 1 см и длиной 2.5 см, встроенный в картонный конверт, опускали в емкость с консервирующим раствором на 10 секунд до его полного пропитывания. Носитель высушивали в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Иммобилизацию проводили путем внесения на высушенный крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал носителя 100-150 мкл сока растений с фитопатогенами. После чего носитель с нанесенным на него соком растений с фитопатогенами, заключенный в бумажный картон, высушивали в течение 1,5 часов при комнатной температуре от 15° до 25°С. Затем картонный конверт вместе с осушителем упаковали в зип-пакет и хранили в бытовом холодильнике с температурой 2-5°С в течение 5 лет до основного назначения (исследования проводили методами ПЦР и ИФА).
Для исследования фитопатогенов, хранившихся на носителе методами ПЦР и ИФА, проводили восстановление их в жидкую форму. Для этого с использованием ножниц аккуратно разрезали носитель на три части, помещали их в 1,5 мл пробирку, содержащую 300 мкл дистиллированной воды. Пробирку оставляли при комнатной температуре на 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. Затем центрифугировали пробирку, отбирали надосадочную жидкость и переносили ее в чистую пробирку. Полученную жидкую пробу использовали в дальнейшей работе.
С использованием коммерческого набора реагентов для выделения ДНК/РНК из различных материалов производства ООО «БИОКОМ» проводили выделения ДНК картофеля и томатов. Далее проводили постановку полимеразной цепной реакции согласно протоколу к набору реагентов «PlantV-ПЦР-ядро», производства ООО «БИОКОМ». С использованием набора реагентов «ИММУНОТЕСТ-ХВК», производства ООО «БИОКОМ» определяли Х-вирус картофеля в нативных и в высушенных на носителе образцах. Работу проводили согласно инструкции по применению к набору «ИММУНОТЕСТ-ХВК». Результаты работы показали, что ДНК картофеля и томатов выявлялись из всех образцов как нативных, так и с сухого носителя. Результаты ИФА представлены в табл. 1
Таким образом, полученные результаты показывают, что данный способ консервации применим к растениям и фитопатогенам и сохраняет биологические и диагностические свойства исследуемого материала.
Пример 3
Проведено исследование сохранности биологических свойств лактобактерий, изолированных от пациенток в урогенитальных мазках. При этом предварительно готовили консервирующий раствор путем смешивания сахарозы, буфера Tris HCl и этилендиаминтетрауксусной кислоты. При этом 10 мл консервирующего раствора содержали в себе Tris - 1,5 М, рН подводили HCl до рН 7,4, сахарозы - 0,7 М, к ним добавляли 2 мл 0,5 М EDTA (рН 7,4). Сухой носитель шириной 1 см и длиной 2.5 см, встроенный в картонный конверт, опускали в емкость с раствором, содержащим 0,7 М сахарозу, 1.5 М Tris Hcl (рН 7,4) и 0,5 М EDTA, и выдерживали 10 секунд до полного его пропитывания. Носитель высушивали в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Иммобилизацию проводили путем внесения на высушенный крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал носителя урогенитальные смывы до полного заполнения пространства материала.
Затем картонный конверт вместе с осушителем упаковали в зип-пакет и хранили в бытовом холодильнике с температурой 2-5°С в течение 5 лет до основного назначения (микробиологического исследования). Отрезанный кусочек носителя с сухим образцом помещали в пробирку, в которую добавляли воду для растворения сухого образца. Пробирку оставляли в штативе при комнатной температуре в течение 10 мин и периодически встряхивали на вортексе. Затем центрифугировали в течение 40 секунд при 10 тысячах об/мин. Полученную суспензию переносили в чистую пробирку и использовали при микробиологическом исследовании материала. При этом количество жизнеспособных лактобактерий варьировало в различных пределах. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Количество жизнеспособных клеток в культурах лактобактерий, хранившихся на сухом носителе, предварительно пропитанном консервирующим раствором.
Полученные результаты показывают, что данный способ консервации позволяет сохранять биологические свойства материалов, нанесенных на сухую мембрану.
Пример 4
Из листьев картофеля, томатов отжимали сок, который наносили в количестве 100-150 мкл на крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал носителя, предварительно пропитанный консервирующим раствором, содержащим 0,7 М сахарозу, 1.5 М Tris HCl с рН 7,4 в конечной концентрации с добавлением к ним 2 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты, и высушенный при комнатной температуре. После нанесения биологического материала носитель высушивали в течение 1,5 часов при комнатной температуре от 15° до 25°С. Затем картонный конверт с носителем биоматериала вместе с осушителем упаковали в зип-пакет и хранили в бытовом холодильнике с температурой 2-5°С в течение 5 лет. Для исследования биоматериалов растений, хранившихся на носителе методами ПЦР и ИФА, проводили восстановление их в жидкую форму. Для этого с использованием ножниц аккуратно разрезали носитель на три части, помещали их в 1,5 мл пробирку, содержащую 300 мкл дистиллированной воды. Пробирку оставляли при комнатной температуре на 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. Затем центрифугировали пробирку, отбирали надосадочную жидкость и переносили ее в чистую пробирку. Полученную жидкую пробу использовали в дальнейшей работе. С использованием коммерческого набора реагентов для выделения ДНК/РНК из различных материалов производства ООО «БИОКОМ» проводили выделения ДНК картофеля и томатов. Далее проводили постановку полимеразной цепной реакции согласно протоколу к набору реагентов «Plant-ПЦР-ядро», производства ООО «БИОКОМ». Все исследованные биологические образцы из листьев картофеля и томатов, нанесенные на носитель, с последующем высушиванием, показали положительный результат при обнаружении ДНК. Результаты идентичны исследованию биологических образцов листьев картофеля и томатов из свежеполученной нативной суспензии (сок растений). Таким образом, изотонический консервирующий раствор для тканей растений обязательно должен содержать сахарозу. Экспериментальные данные показывают, что 0.7 М сахароза, используемая для консервации крови, достаточна и для длительной консервации биоматериала растений (сока).
Концентрации реагентов консервирующего раствора подобраны таким образом, чтобы сохранялась постоянная концентрация водородных ионов, то есть значение рН смеси в растворе сохранялось в значениях 7,4, так как его изменение ниже 7,4 приводит к защелачиванию, а выше 7,4 - к окислению биоматериала и соответственно к разрушению его клеток. А использование концентрации сахарозы в консервирующем растворе (0,7 М) обеспечивало длительное сохранение клеток биологического материала без повреждения, На примере 5 и 6 показано, что концентрация реагентов консервирующего раствора обеспечивает постоянство концентрации водородных ионов и длительное сохранение биологических и диагностических свойств клеток биоматериала.
Пример 5
Крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал, пропитанный консервирующим раствором, содержащим 0,7 М сахарозу, 1.5 М Tris HCl с рН 7,4 в конечной концентрации и с добавлением 2 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и иммобилизованными на него каплями крови и высушенными при комнатной температуре, еженедельно проверяли на значение рН. Для этого полоску лакмусовой бумажки смачивали дистиллированной водой, после чего ее клали непосредственно на носитель с сухими пятнами крови. По степени изменения окраски судили о реакции. Значение рН было стабильным (7.4) на протяжение всего периода исследования.
Пример 6
Консервирующие растворы, в состав которых входила сахароза 0,02 М, 0,2 М сахароза, 1.5 М Tris Hcl (рН 7,4) и 0,5 М EDTA (экспериментальные растворы), позволяли достаточно длительно сохранять эритроциты без гемолиза, но оказались непригодными при процессе восстановления сухих образцов в жидкую форму, т.е. образовывали трудноразбиваемый осадок. Восстановленная жидкая форма сухих образцов крови имеет консистенцию, подходящую для любых методов выделения нуклеиновый кислоты, то есть как на сорбенте, так и при спиртовым осаждении, а особенно для автоматизированных систем выделения, где консистенция образца имеет большое значение. И она была возможна только в результате хранения крови при довольно большой концентрации сахарозы в растворе (0,7 М). Также эффективным было совместное применение буфера (1,5 М Tris-HCl (рН 7,4) и с 2 мл 0,5 М ЭДТА) с сахарозой для сухого носителя. Концентрация ЭДТА (2 мл 0,5 М к 10 мл буфера) - стандартная концентрация используемая в буферных системах. А вот концентрация Tris HCl (1,5 М) подобрана экспериментальным путем, так как в процессе исследования было выявлено, что более низкая его концентрация (1 М, 0,5 М, 0,2 М) приводила к окислению проб, а большая (2 М, 2,5 М) к защелачиванию.
Таким образом, заявленный способ консервации биологических материалов обеспечивает повышение сохранности диагностически и биологически значимых свойств биологического материала в течение длительного времени за счет нанесения его на крупнопористый химически нейтральный гидрофильный носитель, пропитанный консервирующим раствором, способствующим предотвращению деградации клеток, за счет сохранения постоянства концентрации водородных ионов и постоянного значения рН, а также защитного действия, предотвращающего процесс гемолиза и сохраняющего гипобиоз растений.
Claims (6)
1. Способ консервации биологических материалов, включающий иммобилизацию их на сухом носителе с последующим высушиванием, отличающийся тем, что в качестве носителя для иммобилизации используют крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал, который предварительно, перед иммобилизацией на него биологического материала, пропитывают консервирующим раствором, содержащим 0,7 М сахарозу, 1.5 М Tris-HCl с рН 7,4 и 0,5 М этилендиаминтетрауксусную кислоту.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сухой носитель пропитывают консервирующим раствором.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что консервирующий раствор сохраняет постоянство концентрации водородных ионов, с сохранением постоянного значения рН.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что высушивание проводят в условиях, не допускающих разложение консервирующего раствора.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что восстановление высушенного биоматериала осуществляют путем его смыва водой или растворителем.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пропитывание крупнопористого химически нейтрального гидрофильного материала носителя консервирующим раствором осуществляют до полного его пропитывания.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016110713A RU2619898C1 (ru) | 2016-03-24 | 2016-03-24 | Способ консервации биологических материалов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016110713A RU2619898C1 (ru) | 2016-03-24 | 2016-03-24 | Способ консервации биологических материалов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2619898C1 true RU2619898C1 (ru) | 2017-05-19 |
Family
ID=58715748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016110713A RU2619898C1 (ru) | 2016-03-24 | 2016-03-24 | Способ консервации биологических материалов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2619898C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2703058C2 (ru) * | 2017-12-08 | 2019-10-15 | Владимир Артурович Хачумов | Способ хранения ДНК-содержащего растительного материала в широком диапазоне температур |
| WO2020242970A1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | East Carolina University | Preservation using sugars |
| CN114480129A (zh) * | 2022-01-13 | 2022-05-13 | 力因精准医疗产品（上海）有限公司 | 一种人粪便保存液及使用方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5516487A (en) * | 1994-06-22 | 1996-05-14 | Isolab, Inc. | Absorbent paper for liquid sampling and impregnated paper calibrators and controls |
| US5856102A (en) * | 1997-02-26 | 1999-01-05 | Bierke-Nelson; Diane Lynn | Home/self-storage to improve DNA banking |
| US20040171139A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-09-02 | Belcher Angela M. | Fabricated biofilm storage device |
| RU2322058C2 (ru) * | 2005-12-13 | 2008-04-20 | Институт белка Российской академии наук | Способ консервации биологических образцов, обеспечивающий сохранность нуклеиновых кислот |
| RU2567145C1 (ru) * | 2014-04-14 | 2015-11-10 | Игорь Валериевич Корниенко | Композиция для хранения днк-содержащих препаратов или днк (варианты) и ее применение |
| RU2573324C2 (ru) * | 2010-08-13 | 2016-01-20 | Эдванст Байоньютришн Корпорейшн | Стабилизирующая композиция для сухого хранения биологических материалов (варианты) |
-
2016
- 2016-03-24 RU RU2016110713A patent/RU2619898C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5516487A (en) * | 1994-06-22 | 1996-05-14 | Isolab, Inc. | Absorbent paper for liquid sampling and impregnated paper calibrators and controls |
| US5856102A (en) * | 1997-02-26 | 1999-01-05 | Bierke-Nelson; Diane Lynn | Home/self-storage to improve DNA banking |
| US20040171139A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-09-02 | Belcher Angela M. | Fabricated biofilm storage device |
| RU2322058C2 (ru) * | 2005-12-13 | 2008-04-20 | Институт белка Российской академии наук | Способ консервации биологических образцов, обеспечивающий сохранность нуклеиновых кислот |
| RU2573324C2 (ru) * | 2010-08-13 | 2016-01-20 | Эдванст Байоньютришн Корпорейшн | Стабилизирующая композиция для сухого хранения биологических материалов (варианты) |
| RU2567145C1 (ru) * | 2014-04-14 | 2015-11-10 | Игорь Валериевич Корниенко | Композиция для хранения днк-содержащих препаратов или днк (варианты) и ее применение |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2703058C2 (ru) * | 2017-12-08 | 2019-10-15 | Владимир Артурович Хачумов | Способ хранения ДНК-содержащего растительного материала в широком диапазоне температур |
| WO2020242970A1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | East Carolina University | Preservation using sugars |
| CN114480129A (zh) * | 2022-01-13 | 2022-05-13 | 力因精准医疗产品（上海）有限公司 | 一种人粪便保存液及使用方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7330325B2 (ja) | サンプルの収集、安定化、および保存のためのシステム、方法およびデバイス | |
| US7748283B2 (en) | Controlled transfer biological sample collection devices and methods of using such devices | |
| CN102947082B (zh) | 生物材料的稳定化的化学脱水 | |
| US10625242B2 (en) | Substrates and methods for collection, stabilization and elution of biomolecules | |
| CN105392900A (zh) | 收集和扩增循环核酸的方法和装置 | |
| JP2010536377A (ja) | 固体支持体上の核酸の安定化 | |
| RU2619898C1 (ru) | Способ консервации биологических материалов | |
| AU2018203078A1 (en) | Substrates and methods for collection, stabilization and elution of biomolecules | |
| Euler et al. | Noradrenaline release from isolated nerve granules | |
| JP2011236237A (ja) | 回収可能な形式での安定なタンパク質保管および安定な核酸保管 | |
| CA2354379A1 (en) | Method for isolating dna from biological materials | |
| JP4869258B2 (ja) | 細胞を透過処理して安定化する試薬及びその使用方法 | |
| CN204369906U (zh) | 一种提取及保存核酸的试剂盒 | |
| CN103890176A (zh) | 制备生物材料的方法 | |
| WO2012113907A2 (en) | Paper support and method of recovering biological material therefrom | |
| Gordiyenko et al. | Erythrocyte membrane permeability for a series of diols | |
| US20150118683A1 (en) | Substrates and associated methods for elution of nucleic acids | |
| CN113999840B (zh) | 一种核酸样本保存液及其使用方法和应用 | |
| RU2020108520A (ru) | Способ и состав для стабилизации нуклеиновых кислот, свободных от клеток, и клеток | |
| RU2624241C1 (ru) | Твердофазный носитель для иммобилизации и/или хранения биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты | |
| US20040038356A1 (en) | Step-wise process to recover or eliminate biological substances by flotation from underlayered colloidal medium | |
| WO2021173983A1 (en) | Capillary assisted vitrification processes and materials for preservation of biological samples |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180325 |