RU2597085C2 - Имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины и способ его получения (варианты) - Google Patents
Имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины и способ его получения (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2597085C2 RU2597085C2 RU2013147902/05A RU2013147902A RU2597085C2 RU 2597085 C2 RU2597085 C2 RU 2597085C2 RU 2013147902/05 A RU2013147902/05 A RU 2013147902/05A RU 2013147902 A RU2013147902 A RU 2013147902A RU 2597085 C2 RU2597085 C2 RU 2597085C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagen
- matrix material
- solution
- type
- gel
- Prior art date
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims abstract description 66
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 62
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims abstract description 52
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims abstract description 52
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims abstract description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 43
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 42
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 38
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 37
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000032050 esterification Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 12
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 44
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims description 13
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 claims description 8
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 47
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 239000004020 conductor Substances 0.000 abstract description 8
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 2
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 abstract 2
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 abstract 2
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 abstract 2
- 238000006266 etherification reaction Methods 0.000 abstract 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 34
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 33
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 30
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 25
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 17
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 17
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 16
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 13
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 12
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 8
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 7
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 6
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 6
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 6
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 6
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 6
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 6
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 238000013538 segmental resection Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 4
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000501 collagen implant Substances 0.000 description 4
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 210000004394 hip joint Anatomy 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 4
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 4
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 4
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 4
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 4
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 238000001317 epifluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical group C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M Alexa Fluor 546 Chemical compound [H+].[Na+].CC1CC(C)(C)NC(C(=C2OC3=C(C4=NC(C)(C)CC(C)C4=CC3=3)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=C1C=C2C=3C(C(=C(Cl)C=1Cl)C(O)=O)=C(Cl)C=1SCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical class NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 2
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020852 Hypertonia Diseases 0.000 description 2
- -1 M - macrophages Substances 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 2
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035771 neuroregeneration Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 210000004767 rumen Anatomy 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 2
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 206010061431 Glial scar Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010033892 Paraplegia Diseases 0.000 description 1
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000020339 Spinal injury Diseases 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000014306 Trophic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000000544 articulatio talocruralis Anatomy 0.000 description 1
- 230000003140 astrocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N ceftriaxone Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NC(=O)C(=O)NN1C VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N 0.000 description 1
- 229960004755 ceftriaxone Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000011382 collagen catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000630 fibrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000002684 laminectomy Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003137 locomotive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006742 locomotor activity Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007433 nerve pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 230000003018 neuroregenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920001562 poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide) Polymers 0.000 description 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000001260 vocal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретения относятся к медицине, в частности к новому матриксному материалу для тканевой биоинженерии и регенеративной медицины и способам его получения. Матриксный материал разработан на основе растительного полисахарида - пектина со степенью этерификации не более 50% и белков внутриклеточного матрикса - коллагенов I и IV типов, который содержит указанные компоненты в следующих концентрациях: 0,5 - 2,0 вес.%, 0,1 - 1,5 вес.% и 0,01 - 0,5 вес.% соответственно. Способ получения имплантируемого матриксного материала для регенеративной медицины в форме гидрогеля заключается в смешивании при температуре не выше 5°С уксуснокислого раствора коллагена I типа до конечной концентрации 0,1-1,5 вес.% с раствором коллагена IV типа до конечной концентрации 0,01-0,1 вес.%, затем полученную смесь смешивают с предварительно приготовленным инициатором гелеобразования, включающим раствор хлорида кальция в концентрации, обеспечивающей процесс гелеобразования, нетоксичную буферную систему в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси, и раствор хлорида натрия до физиологической концентрации; после чего вводят раствор пектина со степенью этерификации не выше 50% до конечной концентрации 0,5-2,0 вес.% и формируют гель путем повышения температуры смеси до физиологической. Также изобретение относится к способу получения имплантируемого матриксного материала для регенеративной медицины в форме гидрогеля, который заключается в смешивании при температуре не выше 5оС уксуснокислого раствора коллагена I типа до конечной концентрации 0,1-1,5 вес.% с раствором коллагена IV типа до конечной концентрации 0,01-0,1 вес.%, затем полученную смесь нейтрализуют, стабилизируют нетоксичной буферной системой и добавляют хлорид натрия до физиологической концентрации, после чего прибавляют раствор пектина со степенью этерификации не выше 50% до конечной концентрации 0,5 - 2,0 вес.%, получая жидкую композицию, из которой формируют гель. Изобретение позволяет получить биосовместимые имплантируемые материалы, обладающие низкой скоростью биодеградации и способностью стимулировать регенеративный процесс, в частности восстановление нервных проводников после травмы мозга. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил.
Description
Изобретения относятся к медицине, в частности к новому матриксному материалу для тканевой биоинженерии и регенеративной медицины и способам его получения. Основной областью применения материала является реконструктивная терапия травм нервной системы и патологий, сопровождающихся нейродегенерацией. Материал может также применяться и для реконструктивной терапии повреждений других органов и тканей.
Аналогами настоящего изобретения являются различные биосовместимые полимерные материалы, предназначенные для тканевой инженерии и реконструктивной терапии. Среди аналогов могут быть рассмотрены изобретения, защищенные патентами РФ №2188206, МПК C07K 14/78, C07K 1/36, A61K 38/39, A61P 9/08, опубл. 2002 г., №2249462, МПК A61K 38/39, A61K 35/12, опубл. 2005 г., №2321597, МПК С08В 37/00, С08L 5/00, A61K 31/715, A61K 31/724, опубл. 2008 г.
Некоторые из перечисленных изобретений основаны на создании биосовместимого матрикса на основе компонентов, представленных исключительно различными формами коллагенов - ключевых белков внеклеточного матрикса (патенты №2188206 и №2249462). Такие материалы несмотря на продемонстрированные репарационные свойства имеют ряд существенных недостатков. Одним из недостатков материалов на основе коллагенов разных типов является их высокая скорость биодеградации в организме. В техническом решении, защищенном патентом РФ №2249462, заявлено, что полученный гетерогенный матрикс из препаратов коллагена двух классов позвоночных животных, представленный в виде двухфазной полимерной системы (твердые сферы в растворе денатурированного коллагена) согласно описанию изобретения обладает регулируемой скоростью деградации в организме. Однако ни в описании технического решения, ни в примерах, приведенных авторами изобретения, не указано, каким образом была решена известная проблема быстрой биодеградации имплантируемых коллагенов. Авторами изобретения также не продемонстрированы результаты экспериментов, позволяющих оценить скорость биодеградации данного материала. Ни в описании патента, ни в научных публикациях авторов изобретения, находящихся в открытом доступе, не указано об использовании методических подходов, позволяющих оценить скорость биодеградации коллагенов в области имплантации. В то время как из известных технических решений, описанных в научной литературе, скорость деградации коллагенов удается снизить посредством введения ковалентных сшивок между цепями полимера, а также введением коллагенов в сочетании с медленно деградирующими полимерами (такими как альгинат, хитозан, агароза). Данные способы являются единственными из описанных в научной и технической литературе. Другим недостатком материалов на основе коллагенов является отсутствие способности ограничивать формирование глиомезодермального рубца и цист с плотной оболочкой, которые возникают при естественном репарационном процессе после травматического повреждения мозга за счет миграции и адгезии клеток нейроглии и соединительной ткани. Данный недостаток коллагеновых материалов связан с высокими адгезионными свойствами в отношении клеток нейроглии и соединительной ткани. Структуры формирующегося рубца хотя и способствуют восстановлению целостности мозга, тем не менее формируют непреодолимый барьер для роста и регенерации отростков нервных клеток.
Известны матриксные гелевые материалы на основе гиалуроновой кислоты - углевода, формирующего аморфное вещество внеклеточного матрикса животных. Такие гели поддерживают жизнеспособность и аксональный рост нейронов дорзального ганглия цыпленка (Horn E.M., Beaumont M., Shu X.Z. et al. Influence of cross-linked hyaluronic acid hydrogels on neurite outgrowth and recovery from spinal cord injury //Journal of Neurosurgery-Spine. 2007. V. 6. P. 133-140).
Однако имплантация данных гиалуроновых гелей в область травмы спинного мозга крыс не способствует регенерации последнего. Внедрение гиалуронового геля в область повреждения коры головного мозга крысы ингибирует формирование глиального шрама, позволяет обеспечить миграцию клеток внутрь геля, но не поддерживает аксональный рост (Cui F.Z., Tian W.M., Hou S.P., et al. Hyaluronic acid hydrogel immobilized with RGD peptides for brain tissue engineering //Journal of Material Science: Materials in Medicine. 2006. Vol.17. P. 1393-1401). Этого недостатка лишены те же гели, но модифицированные с помощью иммобилизованных RGD-пептидов. В такие гели проникают не только различные клетки, но и активно прорастают регенерирующие аксоны.
Таким образом, без введения дополнительных компонентов или химической модификации, гиалуронат не способствует регенерации нервной системы. Другим ее недостатком, также как и других природных материалов животного происхождения, является быстрая биодеградация. Гели, состоящие только из гиалуроновой кислоты, полностью деградируют при подкожной имплантации уже через 2 недели (Hahn M.S., Teply B.A., Stevens M.M. et al. Collagen composite hydrogels for vocal fold lamina propria restoration //Biomaterials. 2006. Vol.27. P. 1104-1109).
Известны матриксы на основе альгинатов - полисахаридов, получаемые из бурых водорослей. Полимеры альгиновой кислоты легко образуют высокогидрофильные, иммунологически инертные и биосовместимые гели при добавлении к ним ионов кальция. Эти гели в отличие от гелей на основе гиалуроновой кислоты биодеградируют медленно в организме млекопитающих, однако при их имплантации в область травмы мозга они не обеспечивают рост аксонов и, соответственно, регенерацию нервных путей. Для придания таким материалам нейрорегенеративных свойств из гелей получают пористые губки, путем лиофильного высушивания материала (Suzuki K., Suzuki Y., Ohnishi K. et al. Regeneration of transected spinal cord in young adult rats using freeze-dried alginate gel //Neuroreport. 1999. Vol.10. P. 2891-2894). Только в таком виде материал на основе альгината стимулировал рост аксонов в поврежденном спинном мозге крыс, однако исследователям не удалось достигнуть существенного нейрорепаративного эффекта, который бы позволил значительно восстановить двигательную активность животных, регистрируемую по стандартной шкале оценки восстановления двигательной активности. Другим недостатком альгинатов является их низкие скорости набухания и растворения, что затрудняет их применение при процедурах получения матриксных материалов.
Наиболее близким техническим решением по количеству существенных признаков является имплантируемая пористая матрица для регенеративной медицины, формируемая из биологически совместимого полимера или полимерной смеси, в частности для этого используют растительные полисахариды и белки внеклеточного матрикса. Формирование матрицы ведут путем уплотнения частиц полимера и частиц хлорида натрия с использованием прессования. Затем из прессованного полимера удаляют частицы хлорида натрия растворением. В одном из вариантов матрицы после удаления из нее хлорида натрия поверхность покрывают белками внеклеточного матрикса, в том числе коллагенами I и IV типов (п. РФ №2392287, МПК С08J 9/26, A61L 27/56, опубл. 2010 г.).
К недостаткам данной матрицы следует отнести:
- она не предназначена для использования в качестве консолидирующего матрикса для реконструктивной и регенеративной терапии травм мозга, поскольку не препятствует формированию плотного глиомезодермального рубца и цист с плотной оболочкой в области травматического повреждения мозга;
- высокую пористость матрицы, которая обеспечивает после имплантации быстрое проникновение в ее структуру клеток, обладающих высокой миграционной и ремоделирующей матрикс способностью, что является нежелательным, поскольку приводит к высокой скорости биодеградации имплантата, который разрушается до момента прохождения медленных процессов восстановления поврежденных тканей, наблюдаемых при нейрорегенерации;
- механические свойства жесткого пористого матрикса хуже имитируют естественный внеклеточный матрикс мягких тканей по сравнению с таковым, представляющим собой гидрогель;
- имплантирование матрикса возможно только путем сложной хирургической операции, затрагивающей неповрежденные участки тела, поскольку необходимы процедуры диссекции тканей для получения открытого операционного поля;
- сложность способа приготовления матрикса, особенно в случаях получения композиционного матрикса, поскольку предусматривает процедуры прессования, циклы промывки растворителем и нанесения на подготовленные пористые поверхности других компонентов композиции, в связи с чем невозможно инъекционное низко травматическое введение материала и формирование матрикса непосредственно в участке имплантации.
Задачей настоящей группы изобретений является создание нового матриксного материала для регенеративной медицины, предназначенного, в частности, для реконструктивной терапии травм мозга, который обеспечивает регенерацию нервных проводников, обладает низкой скоростью биодеградации в организме млекопитающих, сопоставимой со скоростью регенерации, и способного ограничивать формирование плотных рубцов и крупных цист в очаге ремоделирования тканей.
Поставленная задача решается созданием нового имплантируемого матриксного материала для регенеративной медицины, на основе биосовместимой полимерной смеси из растительного полисахарида и белков внеклеточного матрикса коллагенов I и IV типов, в которой согласно изобретению в качестве растительного полисахарида используют пектин со степенью этерификации не более 50%, причем конечные концентрации компонентов в матриксном материале находятся в диапазоне, вес. %:
пектин со степенью этерификации не более 50% - 0,5-2,0,
коллаген I типа - 0,1-1,5,
коллаген IV типа - 0,01-0,5.
Кроме традиционных препаратов коллагена IV в имплантируемом матриксном материале также используют препарат его NCl-гексамеров.
Использование пектина со степенью этерификации не более 50% позволяет получать стабильные матриксы в форме гидрогелей, легко имплантируемые в области травматических повреждений, которые способны эффективно заселяться клетками регенерирующего участка и стимулировать регенерацию нервных проводников. Применение пектина в композиции с белками внеклеточного матрикса придает материалу низкую скорость биодеградации в организме и препятствует формированию плотных рубцов, поскольку уменьшает в составе композиции с белками их адгезионные свойства и таргетинг клеток, за счет которых формируются плотные структуры рубцов. Использование пектина со степенью этерификации не более 50% позволяет сформировать упорядоченные матриксные структуры типа «egg-box», в которые могут быть вовлечены и обратимо иммобилизованы за счет электростатических взаимодействий другие компоненты материала. Применение пектина со степенью этерификации, превышающей 50%, не обеспечивает формирование стабильных гидрогелей.
Введение пектина в концентрации ниже 0,5% не позволяет получать стабильные гидрогели, пригодные для создания имплантируемого матриксного материала, а превышение концентрации пектина более 2,0% в составе материала приводит к образованию плотного матрикса с большим модулем упругости, что не обеспечивает эффективное проникновение клеток и их отростков, необходимое для регенерации тканей.
Введение в состав материала коллагена I типа в количестве 0,1-1,5% способствует достижению заявленного технического результата, при этом использование концентраций менее 0,1% не обеспечивает материал необходимыми адгезионными свойствами, что не способствует росту нервных проводников и не обеспечивает эффективную регенерацию. Кроме того, снижение концентрации ниже указанного значения не придает имплантируемому материалу стабильность. Превышение концентрации коллагена I типа более 1,5% в составе композиции так же, как и в случае с пектином, приводит к формированию плотного матрикса с большим модулем упругости, что не обеспечивает эффективное проникновение клеток и их отростков, необходимое для регенерации тканей.
Использование в составе имплантируемого матриксного материала коллагена IV типа в конечных концентрациях 0,01-0,5% обеспечивает реализацию регенераторного потенциала клеток, приближает состав композиционного матрикса к таковому в развивающихся эмбриональных структурах, для которых характерны активная миграция клеток вдоль путей, маркированных коллагеном данного типа, что стимулирует, в частности, регенерацию нервных проводников. Снижение концентрации ниже 0,01% не является эффективным стимулом для роста отростков клеток, а превышение концентрации более 0,5% подавляет их рост.
Применение в составе имплантируемого матриксного материала коллагена IV типа в форме препарата его NC1-гексамеров, повышает эффективность применения коллагена IV типа как матриксного компонента, стимулирующего миграцию клеток и рост их отростков.
Заявленный технический результат достигается также способами получения имплантируемого матриксного материала.
Заявленный имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины в форме гидрогеля получают смешиванием при температуре не выше 5оС уксуснокислого раствора коллагена I типа до его конечной концентрации в матриксном материале 0,1-1,5% с раствором коллагена IV типа до его конечной концентрации в матриксном материале 0,01-0,5%. Затем полученную смесь смешивают с предварительно приготовленным инициатором гелеобразования, включающим раствор хлорида кальция в концентрации, обеспечивающей процесс гелеобразования, нетоксичную буферную систему в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси, и раствор хлорида натрия до физиологической концентрации; после чего в полученную смесь вводят раствор пектина со степенью этерификации не выше 50% до конечной концентрации 0,5-2,0% и формируют гель путем повышения температуры смеси до физиологической.
Последовательность процедур смешения компонентов является принципиально важной, поскольку именно это обеспечивает достижение заявленного результата. Отклонение от данной схемы, в частности смешивание уксуснокислого раствора коллагена I типа непосредственно с раствором пектина, вызывает выпадение в осадок обоих компонентов, что не приводит к формированию матриксного материала в форме гидрогеля. А первичное смешивание раствора пектина с инициатором гелеобразования приводит к быстрому формированию геля и невозможности введения в его состав белков внеклеточного матрикса, что не позволяет получить композиционный материал.
Смешивание уксуснокислого раствора коллагена I типа до его конечной концентрации в матриксном материале 0,1-1,5% с раствором коллагена IV типа до его конечной концентрации в матриксном материале 0,01-0,1%, с последующим введением в полученную смесь предварительно приготовленного инициатора гелеобразования, при температуре выше 5оС приводит к быстрому формированию белкового геля, что не позволяет включить в его состав пектин.
Использование в составе инициатора гелеобразования хлорида кальция, который в конечной концентрации в матриксном материале составляет 1-10 мМ, обеспечивает процесс гелеобразования и позволяет сформировать упорядоченные матриксные структуры типа «egg-box», которые образуют гелевый матрикс посредством ассоциации молекул пектина с низкой степенью этерификации. Введение в состав инициатора гелеобразования нетоксичной буферной системы в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси коллагенов, приводит к формированию гелей за счет ассоциации молекул коллагенов.
В качестве нетоксичной буферной системы в способе могут быть использованы, в частности, NaOH-N-2-гидроксиэтипиперазин-N′-этансульфоновая кислота (HEPES), NaOH-N-2-гидроксиэтилпиперазин-N′-3-пропансульфоновая кислота (EPPS).
Введение хлорида натрия в состав инициатора необходимо для создания физиологических условий, изотонических по отношению к клеткам млекопитающих.
Формирование гидрогелей стимулируется повышением температуры до физиологических значений, характерных для организма млекопитающего.
Лиофильное высушивание сформированного матриксного материала в форме гидрогеля позволяет получить пористый матриксный материал в форме губки, что способствует расширению области его применения, поскольку такой матрикс обеспечивает большую скорость заселения клетками, их ускоренную миграцию внутрь материала, что может являться преимуществом при создании биоискусственных аналогов тканей в лабораторных условиях.
Заявленный технический результат достигается также вторым способом получения имплантируемого матриксного материала для регенеративной медицины в форме гидрогеля, заключающегося в смешивании при температуре не выше 5оС уксуснокислого раствора коллагена I типа до конечной концентрации 0,1-1,5% с раствором коллагена IV типа до конечной концентрации 0,01-0,1%. Затем в смесь белков внеклеточного матрикса добавляют хлорид натрия до физиологической концентрации и нетоксичную буферную систему в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси. После нейтрализации к смеси добавляют раствор пектина со степенью этерификации не выше 50% до конечной концентрации 0,5-2,0% и только после этого формируют гель.
Смешивание белков внеклеточного матрикса с хлоридом натрия до физиологической концентрации и с нетоксичной буферной системой в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси, позволяет затем ввести раствор пектина и получить жидкую композицию, которую в последующем формируют в гелевый матрикс различными способами.
В одном из вариантов формирование геля проводят путем наслаивания на поверхность жидкой композиции раствора инициатора гелеобразования, включающего хлорид кальция в концентрации, обеспечивающей процесс гелеобразования, нетоксичную буферную систему, поддерживающую нейтральный рН и хлорид натрия до физиологической концентрации в матриксном материале, с последующим повышением температуры до физиологической.
Это позволяет получать имплантируемые матриксные материалы различной геометрии, поскольку предварительно подготовленную жидкую композицию можно поместить в различные сосуды, сформировать ровные поверхности и только затем выполнить процедуру формирования геля путем создания условий для гелеобразования. Это важно как при проведении научных исследований биосовместимых материалов, так и для создания имплантатов различной формы и назначения.
В другом варианте формирование геля производят путем введения жидкой композиции непосредственно в область имплантации в организм реципиента. Наличие свободных ионов кальция в жидкой среде организма и температура близкая к 37оС обеспечивают условия формирования геля непосредственно в области имплантации. Это позволяет отказаться от диссекции тканей для получения открытого операционного поля и избрать менее травматичный способ введения имплантируемой конструкции путем инъекции.
Примеры осуществления изобретений.
Для приготовления материала используют стерильные компоненты.
Пример 1.
Предварительно готовят инициатор гелеобразования путем смешивания 4 мкл 10М NaOH, 300 мкл 1M HEPES (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 300 мкл 5M NaCl, 60 мкл 1M CaCl2, 2,736 мл деионизованной воды
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях смешивают при температуре 0оС 1,1 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 4,5 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 0,5 мл раствора коллагена IV типа в виде NC1-гексамеров концентрацией 1 мг/мл и 3,4 мл инициатора гелеобразования. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 3% со степенью этерификации 30%, тщательно перемешивают и проводят формирование геля в термостате при температуре 37оС. Полученный матриксный материал представляет собой прозрачный гель, который содержит 1,5% пектина со степенью этерификации 30%, 0,5% коллагена I типа, 0,05% коллагена IV типа.
Пример 2.
Предварительно готовят инициатор гелеобразования путем смешивания 9 мкл 10М NaOH, 300 мкл 1M HEPES (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 300 мкл 5M NaCl, 100 мкл 1M CaCl2, 1,691 мл деионизованной воды.
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях смешивают при температуре 5оС 2,5 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 6 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 0,1 мл раствора коллагена IV типа концентрацией 1 мг/мл и 2,4 мл инициатора гелеобразования. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 4% со степенью этерификации 50%, тщательно перемешивают и проводят формирование геля в термостате при температуре 37оС. Полученный матриксный материал представляет собой прозрачный гель, содержащий 2% пектина со степенью этерификации 50%, 1,5% коллагена I типа, 0,01% коллагена IV типа.
Пример 3.
Предварительно готовят инициатор гелеобразования путем смешивания 4 мкл 10М NaOH, 300 мкл 1M EPPS (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 300 мкл 5M NaCl, 40 мкл 1M CaCl2, 1,356 мл деионизованной воды.
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях смешивают при температуре 5оС 1 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 1 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 2 мл раствора коллагена IV типа концентрацией 2,5 мг/мл и 2,0 мл инициатора гелеобразования. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 1% со степенью этерификации 10%, тщательно перемешивают и проводят формирование геля в термостате при температуре 37оС. Полученный матриксный материал представляет собой прозрачный гель, содержащий 0,5% пектина со степенью этерификации 10%, 0,1% коллагена I типа, 0,5% коллагена IV типа.
Пример 4.
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях в чашке Петри смешивают при температуре 0оС 1,1 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 4,5 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 0,5 мл раствора коллагена IV типа в виде NC1-гексамеров концентрацией 1 мг/мл. К полученной смеси прибавляют 300 мкл 1M HEPES (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 4 мкл 10М NaOH, 300 мкл 5M NaCl, 2,796 мл деионизованной воды. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 3% со степенью этерификации 30%, тщательно перемешивают. На поверхность полученной жидкой композиции аккуратно наслаивают равный объем раствора, содержащего 12 мМ хлорид кальция, 150 мМ NaCl, 50 мМ HEPES (рН 7,4), затем проводят формирование геля в термостате при температуре 37оС. Полученный матриксный материал сформированный в виде пласта геля с гладкими ровными поверхностями содержит 1,5% пектина со степенью этерификации 30%, 0,5% коллагена I типа, 0,05% коллагена IV типа.
Пример 5.
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях смешивают при температуре 5оС 1 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 1 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 2 мл раствора коллагена IV типа концентрацией 2,5 мг/мл и нейтрализуют, добавляя к полученной смеси 300 мкл 1М HEPES (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 4 мкл 10М NaOH, 300 мкл 5М NaCl, 1,396 мл деионизованной воды. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 3% со степенью этерификации 30%, тщательно перемешивают и заполняют полученной жидкой композицией шприц. После чего жидкую композицию вводят крысам путем выполнения инъекции в область имплантации. Через 1 и 10 суток после имплантации животных выводили из эксперимента путем декапитации. Образцы тканей, из области имплантации, исследовали на наличие сформированного матриксного материала. Исследования показали, что как при подкожной имплантации, так и в случае имплантации в область травматического повреждения спинного мозга введенная жидкая композиция формировала матриксный материал, представляющий собой гель. При исследовании гистологических срезов данных образцов на сроке 10 суток после имплантации наблюдали фрагменты имплантированного матриксного материала, содержащие клеточные элементы.
Пример 6. Матриксный материал получают согласно примеру 2, затем проводят его лиофильное высушивание. В результате чего в сформированном геле образуются поры, а сам готовый продукт представляет собой биополимерную губку.
Для доказательства функциональной работоспособности заявленных изобретений проводили следующие эксперименты. Результаты экспериментов демонстрируются фигурами 1-8.
На фиг. 1. представлены результаты культивирования нейральных стволовых клеток фетального мозга крыс на различных подложках, где: фиг. 1А - на полистироле, фиг. 1Б - на пектине, фиг. 1В - на матриксном (заявляемом) материале в форме гидрогеля.
На фиг. 2. представлена морфология имплантатов на основе пектинового гидрогеля (фиг. 2А и фиг. 2Б), заявляемого матриксного материала (фиг. 2В и фиг. 2Г), коллагена (фиг. 2Д и 2Е) на препаратах-срезах через 10 дней после подкожной имплантации крысам. На фиг. 2 использованы следующие обозначения: КГ - коллагеновая губка, КМ - композиционный матриксный материал, М - макрофаги, ФК - фиброзная капсула, С - сосуды.
На фиг. 3. представлена морфология имплантатов на основе пектинового (фиг. 3А, фиг. 3Б), заявляемого матриксного материала (фиг. 3В, фиг. 3Г, фиг. 3Д, фиг. 3Е) на сроках 1 месяц после подкожной имплантации (фиг. 3А, фиг. 3В, фиг. 3Г), 3 месяца после имплантации (фиг. 3Б, фиг. 3Д, фиг. 3Е). На фиг. 3 использованы следующие обозначения: КМ - композиционный матриксный материал, М - мышцы, ФК - фиброзная капсула. Двойная стрелка на фиг. 3Б обозначает область имплантации.
На фиг. 4. представлены изображения спинного мозга крыс на магниторезонансных томограммах через 4 дня после острой спинальной травмы и имплантации коллагеновой губки (фиг. 4А) и заявляемого матриксного материала (фиг 4Б).
На фиг. 5. представлены изображения покадровой видеосъемки различных групп экспериментальных животных в процессе движения, где: фиг 5А - из контрольной группы, фиг. 5Б - из группы «Пектиновый гель» и фиг. 5В - из группы «Матриксный материал» на 60 день после спинальной сегментэктомии.
На фиг. 6. представлен внешний вид задних конечностей крыс из контрольной группы (фиг. 6А), группы «Пектиновый гель» (фиг. 6Б) и группы «Матриксный материал» (фиг. 6В) на 60 день после сегментэктомии спинного мозга.
На фиг. 7. представлено гистологическое строение спинного мозга крыс из экспериментальной группы «Матриксный материал» через 3 месяца после операции. Окраска гематоксилином и эозином (фиг. 7А, фиг. 7Г); иммуногистохимическое выявление β-III-тубулина, вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 546 (фиг. 7Б, фиг. 7В). Изображения получены методом светлого поля (фиг. 7А, фиг. 7Г), эпифлуоресцентной микроскопии (фиг. 7Б) и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (фиг. 7В - слитое изображение, полученное в проходящем свете и отраженном свете). Фиг. 7А - общий вид; фиг. 7Б - область, обозначенная прямоугольником на фиг. 7А; фиг. 7В - область рубца, стрелками указаны отростки нервных клеток, прорастающие в гель; фиг. 7Г - макрофаги в области рубца, где: М - макрофаги; НС - нейрональные структуры.
На фиг. 8. представлено гистологическое строение спинного мозга крыс из контрольной группы через 3 месяца после операции. Фиг. 8А - общий вид, окраска гематоксилином и эозином; фиг. 8Б, фиг. 8В - область, обозначенная прямоугольником на фиг. 8А; фиг. 8Б - иммуногистохимическое выявление β-III-тубулина (вторичные антитела, конъюгированные с Alexa 546); фиг. 8В - окраска ядер DAPI. Изображения получены методом светлого поля (фиг. 8А), эпифлуоресцентной микроскопии (фиг. 8Б, фиг. 8В). Где: НВ - нервные волокна, СК - стенка капсулы.
Для оценки биосовместимости материалов in vitro проводили культивирование нейральных стволовых клеток фетального мозга крыс с использованием в качестве матриксной подложки образцов, полученных по примеру 1. В качестве контроля клетки наносили на дно лунок планшета из полистирола или инкубировали на поверхности геля, сформированного из раствора пектина. Результаты культивирования нейральных стволовых клеток представлены на Фиг. 1. На Фиг. 1А представлен результат культивирования клеток на полистироле, где были обнаружены отдельные клетки униполярной, биполярной и триангулярной формы с короткими отростками, однако большинство клеток сохраняли сферическую форму, а значительная часть клеток формировала типичные конгломераты клеток - нейросферы. В культуре нейральных клеток на поверхности гидрогеля, сформированного из раствора пектина (Фиг. 1Б), практически не наблюдали рассеянных отростчатых клеток, вместе с тем, как и в предшествующем случае, для данного образца было отмечено формирование плотных нейросфер с редким высеванием клеток по периферии; формирование отростков и выраженных признаков дифференцировки не было отмечено для клеток, культивированных на данном материале. В культуре нейральных стволовых клеток на поверхности матриксного материала в форме гидрогеля (Фиг. 1 В) наблюдали формирование типичных нейросфер, однако характер распластывания клеток на периферии нейросфер на поверхности субстрата и морфология отростков значительно отличались от таковых контрольных культур. Так, в культуре нейральных клеток на матриксном материале наблюдали формирование длинных отростков, простирающихся на значительные расстояния от границ нейросфер. Жизнеспособность клеток во всех трех культурах достоверно не отличалась. Это доказывает, что полученный матриксный материал способен поддерживать жизнеспособные культуры клеток, не является токсичным и обеспечивает формирование длинных отростков нервных проводников.
В другом эксперименте проверяли скорость биодеградации материалов. Для этой цели из образцов, полученных по примеру 4, с помощью специального пробойника высекали диски диаметром 0,5 см, которые имплантировали подкожно крысам. В эксперименте использовали 36 белых крыс-самок линии Wistar массой около 250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария. Животных вводили в наркоз внутримышечным введением смеси золетила (2 мг/кг) и ксилазина (4 мг/кг). На спине выстригали шерсть и обрабатывали операционное поле раствором йода на 70% спирте. Разрезали кожу парамедиально и тупым рассечением делали карманы. В каждый карман помещали по одному имплантату. Каждому животному имплантировали 4 диска. В качестве контроля одной группе животных имплантировали диски, сформированные из пектина, а другой группе проводили имплантацию стерильной коллагеновой губки. Кожу ушивали шелком. Рану повторно обрабатывали спиртовым раствором и тетрациклином. Сразу после операции и в последующие три дня вводили подкожно профилактическую дозу антибиотика (цефтриаксон 40 мгк/г).
Животных выводили из эксперимента на сроках 10 дней, 1 месяц, 3 месяца глубоким эфирным наркозом. Извлекали имплантаты, фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере, в течение суток. Образцы отмывали фосфатным буфером и переводили в абсолютный этанол через серию водных растворов этанола. Заливали в парафин по стандартной методике. Изготавливали поперечные срезы толщиной 5 мкм. Окрашивали гематоксилином-эозином для выявления общей морфологии.
В течение всего срока эксперимента не было отмечено ухудшения состояния животных. Ни одно животное не погибло. В области имплантации не наблюдали макроскопических признаков воспаления - покраснения, отека.
Через 10 дней после имплантации были выявлены существенные различия в морфологии имплантатов из пектина и заявляемого матриксного материала. Пектиновый матрикс в значительной степени деградировал. В него проникли клетки, сформировали новую ткань, окружавшую островки еще недеградировавшего матрикса (Фиг. 2А, 2Б). Имплантат окружала капсула толщиной 99±18 мкм, состоявшая из фибробластов и синтезируемых ими коллагеновых волокон (Фиг. 2А). В этом слое фибробластов выявлялись многочисленные сосуды. Они являлись источником макрофагов, заселявших имплантат (Фиг. 2Б).
Разработанный матриксный материал деградировал в гораздо меньшей степени через 10 дней после имплантации (Фиг. 2В). В области имплантации сохранялась значительная часть имплантированного материала. Отчетливо выделялась центральная часть имплантата, не заселенная клетками. На периферии происходила активная инфильтрация имплантата клетками, в первую очередь фибробластами. Клетки заселяли имплантат не хаотично, а проникали в него друг за другом, образуя цепочки клеток, параллельные краю имплантата. Имплантат окружала рыхлая фиброзная капсула толщиной 104±10 мкм. Наблюдалась активная васкуляризация не только соединительной ткани, окружающей имплантат, но и самого матрикса (Фиг. 2Г). Через 10 дней после имплантации наблюдали процесс инфильтрации коллагенового имплантата нейтрофилами, макрофагами и фибробластами. При этом этот процесс шел неравномерно. В одних случаях (28%) в раннем периоде после имплантации коллагеновый имплантат был обильно инфильтрован клетками (фиг. 2Д), в других случаях (72%) не наблюдали значительной инфильтрации материала клетками, фрагмент коллагенового имплантата был окружен плотной фиброзной капсулой толщиной 48±12 мкм (фиг. 2Е). Через 1 месяц фрагменты коллагенового имплантата уже не выявлялись в области имплантации.
В области имплантации пектинового и разработанного матриксного материала клетки, ответственные за воспалительную реакцию, были немногочисленны. Выявлялись единичные лимфоциты, нейтрофилы не выявлялись. Очевидно, воспалительная реакция на собственно процесс имплантации к этому сроку уже завершилась. Имплантированные матриксы являлись иммуногически инертными и не вызывали существенной воспалительной реакции.
Через 1 месяц после имплантации пектиновый матрикс был в значительной степени резорбирован и замещен собственными тканями реципиента. На данном сроке наблюдали преобразование ткани, сформированной в области имплантации. Ткань приобретала сетчатый вид (Фиг. ЗА). Ячейки этой сетки местами сливались в полости, выстланные веретеновидными узкими клетками - фиброцитами. Внутри полостей присутствовали отростчатые клетки со слабоокрашенной цитоплазмой, округлым или овальным ядром - фибробласты. Фиброзная капсула уменьшилась, ее толщина составляла 32±12 мкм. Через 3 месяца ремоделированная зона имплантации уменьшилась в размере, при этом сохраняла ту же морфологию, что и на сроке 1 месяц (Фиг. 3Б). Фиброзная капсула, окружающая имплантат, полностью исчезла.
В разработанном матриксе через 1 месяц после имплантации количество клеток увеличилось, они равномерно заселили матрикс (Фиг. 3В, 3Г). Матриксный материал медленно деградировал, через 3 месяца его количество в области имплантации сократилось, но все еще оставалось существенным. Фибробласты, заселившие матрикс, ремоделировали имплантированный материал, изменяя его морфологию, в результате чего ткань, сформированная на месте имплантата, начала приобретать сетчатый вид (Фиг. 3Д). На фиг. 3Е представлена морфология области имплантации через 3 месяца на большем увеличении, на которой хорошо различимы фрагменты матриксного материала, окруженные клетками. Фиброзная капсула, окружавшая имплантат, уменьшилась. Ее толщина составляла 47±22 мкм.
Коллагеновая губка, имплантированная подкожно, была резорбирована в течение 2-4 недель. Через 1 месяц фрагменты коллагеновой губки уже не выявлялись в области имплантации. Через 10 дней после имплантации наблюдали процесс инфильтрации коллагеновой губки нейтрофилами, макрофагами и фибробластами. При этом этот процесс шел неравномерно. В одних случаях (28%) в раннем периоде после имплантации (10 дней) губка была обильно инфильтрована клетками (Фиг. 2В), в других случаях (72%) практически не наблюдали инфильтрации материала клетками, а фрагмент коллагеновой губки был окружен плотной фиброзной капсулой толщиной 48±12 мкм (Фиг. 2Д).
Из представленных результатов следует, что заявляемый матриксный материал, получаемый разработанными способами, обладает низкой скоростью биодеградации в организме млекопитающих, является биосовместимым и не токсичным in vivo.
Для итоговой оценки работоспособности заявляемых изобретений был проведен эксперимент, в ходе которого образцы матриксного материала, полученные по примеру 1, имплантировали в область травматического повреждения спинного мозга крыс. В качестве контроля одной группе животных имплантировали материал, сформированный из пектина, а другой группе проводили имплантацию стерильной коллагеновой губки.
Модель острой травмы спинного мозга создавали путем удаления фрагмента спинного мозга длинной 2 мм на уровне 12 грудного - 1 поясничного позвонка, согласно работам Вэрли (Woerly S., Pinet Е., De Robertis L. et al. Heterogeneous PHPMA hydrogels for tissue repair and axonal regeneration in the injured spinal cord // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 1998. Vol. 9. P. 681-711; Woerly S., Doan D., Sosa N. et al. Reconstruction of the transected cat spinal cord follow-ing NeuroGel™ implantation: axonal tracing, immunohistochemical and ultrastructural studies // International Jornal of Developmental Neuroscience. 2001. Vol.19. P. 63-83).
Анестезию осуществляли ингаляцией медицинского эфира. Волосяной покров на спине животного обрабатывали антисептическим раствором. Выбривали операционное поле. Зону операционного поля обрабатывали 70% этиловым спиртом.
Кожу рассекали по спине, продольно, над позвоночником от 9 грудного до 3 поясничного позвонков. Подкожные фасции отделяли ножницами по уровню кожного разреза. С двух сторон от остистого отростка 12 грудного позвонка (Т12), вплотную к нему, выполняли 2 параллельных разреза длиной приблизительно 15 мм, отделяя мышцы от поверхности позвонка.
Проводили ламинэктомию на уровне 12 грудного позвонка, открывая прямой доступ к спинному мозгу. Спинной мозг пересекали одноразовым лезвием скальпеля. Кровотечение останавливали гемостатической коллагеновой губкой (ОАО Лужский завод "БЕЛКОЗИН"). После остановки кровотечения отсекали фрагмент спинного мозга длиной приблизительно 2 мм.
После полного гемостаза образовавшийся дефект спинного мозга в первой контрольной группе заполняли коллагеновой губкой. Во второй контрольной группе дефект заполняли пектиновым гелем, в экспериментальной группе - заявляемым матриксным материалом. Имплантат изолировали коллагеновой мембраной. После чего рану послойно ушивали.
В течение трех дней после операции проводили курс антибактериальной терапии: 100 мкл 5% цефтриоксона внутрибрюшинно 2 раза в день. Осмотр оперированных животных проводили ежедневно в течение 3 месяцев до окончания эксперимента. Мочу спускали дважды в день. Трофические нарушения оценивали по общему виду крыс, потере массы тела, состоянию волосяного покрова, наличию трофических язв, пролежней.
Животных выводили из эксперимента на сроках 10 дней, 1 месяц, 3 месяца глубоким эфирным наркозом.
Из всех прооперированных крыс 17 животных составляли первую контрольную группу - «Коллагеновая губка». Во вторую контрольную группу - группа «Пектиновый гель» - входили 7 животных. Экспериментальная группа - группа «Матриксный материал» - включала 19 животных.
Результаты имплантации трех типов биополимерных матриксов в область дефекта спинного мозга крыс выявили существенные различия между исследуемыми группами.
Магниторезонансные томограммы спинного мозга крыс на 4 день после операции показали, что в первой контрольной группе, дефект в которой заполняли коллагеновой губкой, область травмы характеризовалась сильным отеком (Фиг. 4А). Эффект развития отека в группе «Матриксный материал» был выражен существенно меньше (Фиг. 4Б).
Анализ двигательной активности животных проводили на основе видеозаписей, по три кадра из которых для каждой группы представлены на Фиг. 5. В первой контрольной группе у половины животных (55,5%) в течение всего периода наблюдения сохранялась параплегия задних конечностей. Начиная с 14 сут после операции регистрировали лишь слабые движения в тазобедренных суставах, дальнейшего улучшения не происходило (Фиг. 5А). У остальных животных произошло восстановление двигательных функций, которое достигло максимума на сроке 8 недель после операции и в среднем составляло 4,3 балла по шкале оценки локомоторной активности «ВВВ». У 42,8% животных наблюдали гипертонус одной из конечностей. Более чем у половины животных наблюдали явления аутотомии - животные отгрызали задние конечности или хвост, что представлено на Фиг. 6, где показан внешний вид задних конечностей крыс из первой контрольной группы (А), второй контрольной группы - «Пектиновый гель» (Б) и группы «Матриксный материал» (В) на 60 день после сегментэктомии спинного мозга. Для животных из группы «Матриксный материал» был отмечен нормальный вид задних конечностей (фиг. 6В).
В группе «Пектиновый гель» не наблюдали восстановления двигательной активности экспериментальных животных (Фиг. 5Б). У животных наблюдали лишь слабые движения в тазобедренных суставах (1-2 балла по шкале «ВВВ»). Отличительной чертой данной группы было отсутствие выраженных явлений аутотомии и гипертонуса (фиг. 6Б).
В группе «Матриксный материал» наблюдали довольно сильный разброс данных по таким показателям как восстановление двигательной активности, явления аутотомии и гипертонуса. У 1 крысы не было восстановления двигательной активности вплоть до конца эксперимента, но 1 задняя конечность при этом двигалась сразу после операции. Возможно, наличие одной рабочей задней конечности препятствовало физиологическому восстановлению второй конечности. Еще у 2 крыс тоже не было восстановления, но их вывели из эксперимента на сроке 10 дней, поэтому их дальнейшая судьба не известна. Хотя в целом у остальных животных этой группы на этом сроке двигательная активность оценивается от 1 до 6 баллов - от движений в тазобедренных суставах до активных движений в тазобедренных, коленных и голеностопных суставах.
Через три месяца после операции у крыс из экспериментальной группы «Матриксный материал» отмечали дальнейшее улучшение двигательной активности задних конечностей. В этой группе наблюдали крыс, способных к самостоятельному передвижению с использованием обеих задних конечностей и периодической координацией их с передними. У одной крысы восстановилась двигательная активность только в одной задней конечности. У некоторых крыс обе задние конечности сохраняли физиологическое положение и использовались для ходьбы, хотя при этом вес не удерживался подошвенными поверхностями лап. В целом восстановление двигательной активности задних конечностей крыс из экспериментальной группы «Матриксный материал» варьировало от 5 до 15 баллов по шкале «ВВВ» через три месяца после имплантации. Максимальное восстановление двигательной активности животных в 15 баллов соответствовало стабильной подошвенной ходьбе и координации между передними и задними конечностями (Фиг. 5В).
Гистологический анализ спинного мозга крыс, подвергнутых сегментэктомии и последующей реконструктивной терапии, выявил следующие особенности в группах.
Были проанализированы гистологические препараты спинного мозга крыс из групп «Коллагеновая губка» и «Матриксный материал», выведенных из эксперимента в раннем послеоперационном периоде (10 дней после сегментэктомии и реконструктивной терапии).
В группе «Коллагеновая губка» в области травмы спинного мозга наблюдали экспериментально созданную полость, заполненную коллагеновой губкой. Внутри губки в некоторых местах отмечали скопления эритроцитов и лимфоцитов. Не наблюдалось массивной инфильтрации имплантата клетками реципиента. Губка не способствовала консолидации рострального и каудального фрагментов мозга, разобщенных травмой.
В группе «Матриксный материал» на этом же сроке отмечалось восстановление физической целостности спинного мозга путем консолидации с помощью материала рострального и каудального фрагментов. Часть рубца, прилежащая к ростральному участку мозга, представлена гомогенным рыхлым соединительнотканным рубцом, в котором почти не выявляются остатки геля.
Центральную область рубца заполняют многочисленные фрагменты геля, разобщенные тяжами ткани, в которых в том числе выявляются новые сосуды. При иммуноцитохимическом маркировании нейрональных структур антителами против β-III-тубулина интенсивно окрашивается ростральная и каудальная части мозга. В области рубца выявляются единичные нервные волокна.
В сером веществе спинного мозга в областях, прилежащих к области травмы, наблюдается гибель нейронов, особенно выраженную в каудальной части в контрольной группе. В группе «Матриксный материал» несмотря на деструктивные процессы серое вещество в каудальной части находится в более сохранной форме.
Были проанализированы гистологические препараты спинного мозга крыс из группы «Матриксный материал» через 1 месяц после операции. Наблюдали морфологическую картину строения тканей рубца и прилежащих тканей спинного мозга, отличную от контрольной группы. У животных данной группы формировался рыхлый рубец, в котором выявлялись нейрональные структуры, маркируемые антителами против β-III-тубулина. Астроцитарная реакция на границе ростральной сохранной части мозга и рубца была слабая, не наблюдалось плотной сети астроцитов и их отростков, которой обычно отводится важная роль в блокировании регенерирующих аксонов. Астроциты в рубце не выявлялись.
Через 3 месяца после операции в группе «Матриксный материал» наиболее типичная картина строения спинного мозга экспериментальных животных была следующей. Выявили выраженную консолидацию рострального и каудального фрагментов (Фиг. 7). В области травмы все еще выявлялись многочисленные фрагменты геля, разделенные тяжами ткани, в которых методом иммуногистохимии обнаруживались нейрональные структуры. На Фиг. 7А представлена гистологическая картина в области травматического повреждения и имплантации, выявляемая рутинным общеморфологическим окрашиванием срезов гематоксилином и эозином. Фиг. 7Б демонстрирует результат выявления нейрональных структур методом непрямого иммуногистохимического маркирования антителами против β-III-тубулина и получения изображения с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Область рубца была подробно изучена методом конфокальной лазерной микроскопии, которая подтвердила наличие значительного числа нейрональных структур (НС), прорастающих в имплантат (Фиг. 7В). На Фиг. 7 В видно, что отростки нейронов проникали непосредственно в гель, что подтверждает, что этот матриксный материал поддерживает регенерацию нервных проводников. В области рубца были видны макрофаги, что свидетельствует о продолжающемся процессе биодеградации имплантата (Фиг. 7Г).
В контрольной группе строение спинного мозга на сроке 3 месяца после операции также было неоднородным среди различных животных. Одним из распространенных вариантов - очевидно, самым неблагоприятным - стало формирование в области травмы посттравматической капсулы, которая препятствовала регенерации нервных волокон (Фиг. 8А). Некоторое количество нервных волокон прорастали по периферии, огибая капсулу, но они не были способны эффективно преодолеть этот барьер (Фиг. 8Б). Капсула состояла из значительного числа клеток, что подтверждалось окраской гистологических препаратов с помощью DAPI (Фиг. 8В). Внутреннее содержимое капсулы представлено также отчасти клетками и неклеточным содержимым. В другом случае в такой же капсуле отчетливо выявлялись полиморфноядерные нейтрофилы. Вероятно, капсула образовалась в результате слишком сильного воспалительного процесса и массивной инфильтрации лейкоцитов.
В других случаях у животных наблюдали формирование слишком плотного рубца. На границе спинного мозга и рубца продолжается дегенеративный процесс, сопровождающийся формированием патологических полостей. В этой области наблюдаются многочисленные макрофаги. Фрагментов имплантированного матрикса на этом сроке не выявляется, а сами ткани рубца представляют собой очень плотно упакованные коллагеновые волокна, ориентированные в поперечном направлении, что выявлялось специфической окраской с помощью пикросириуса красного. Очевидно, аксоны были не способны преодолеть такой барьер. Плотность астроцитов на границе сохранной ткани спинного мозга и рубца повышена, по сравнению с тканью спинного мозга в норме, а также с областью имплантации матриксного геля в описанной выше экспериментальной группе. В дистальной части рубца нервные клетки и их отростки не выявляются. В контрольной группе были также животные, демонстрировавшие некоторое восстановление двигательной активности задних конечностей, которое в целом было ниже, чем в группе «Матриксный материал».
В результате проведенного исследования удалось установить, что заявляемые изобретения, позволяют создать имплантируемый матриксный материал, обладающий не только биосовместимостью, продемонстрированной в экспериментах in vitro и in vivo при подкожной имплантации, но и обеспечивающей регенерацию поврежденного мозга, стимулируя частичное восстановление нервных проводников и препятствует образованию плотных структур рубца, который является непреодолимым барьером при нейрорегенерации.
Представленные выше результаты подтверждают, что создан композиционный матриксный материал для нужд регенеративной медицины и тканевой биоинженерии, обладающий следующими преимуществами.
1. Материал является биосовместимым и слабо иммуногенным, что наиболее выгодно отличает его от известных материалов на основе хитина и хитозана, для которых характерны достаточно выраженные иммунные реакции несмотря на ряд сходных физико-химических и функциональных свойств.
2. Материал способен эффективно обеспечивать процессы регенерации тканей, в частности при имплантации в область травматического повреждения спинного мозга лабораторных животных (крыс) он способствует восстановлению локомоторных функций крыс до 8,5±3,3 баллов по шкале «ВВВ», что существенно выше, чем при использовании всех указанных аналогов.
3. Материал обладает свойством медленной биодеградации, обеспеченной сочетанием в составе композиционного матрикса модифицированного растительного полисахарида (пектина со степенью этерификации до 50%) и белков внеклеточного матрикса, что способствует сохранению имплантированного материала в организме млекопитающих в течение нескольких месяцев. Такая скорость биодеградации соизмерима с медленной регенерацией тканей мозга и потому обеспечивает эффективный репарационный процесс. В этом отношении материал обладает преимуществом по сравнению с таковыми на основе коллагенов, а также гиалуроновой кислоты и ее производных, которые деградируют в организме млекопитающих в течение 1 месяца, при том что репарационный процесс требует периода в несколько месяцев.
4. Разработанный матрикс обладает способностью ограничивать формирование плотных структур рубца и цист с плотной оболочкой, которые возникают при естественном репарационном процессе после травматического повреждения мозга за счет миграции и адгезии клеток нейроглии и соединительной ткани. Структуры формирующегося рубца хотя и способствуют восстановлению целостности мозга, тем не менее формируют непреодолимый барьер для роста и регенерации отростков нервных клеток. Данное свойство, характерное для разработанного матрикса, является преимуществом по сравнению с чисто белковыми матриксами (на основе исключительно коллагенов, ламинина, фибронектина), которые в силу очень высоких адгезионных свойств для клеток нейроглии и соединительной ткани являются причиной формирования более плотной структуры рубца и могут создавать препятствия для регенерации аксонов.
5. Разработанный матриксный материал и способы его получения предусматривают такую схему формирования материала из отдельных компонентов, при которой процесс формирования структур гидрогеля требует исключительно физиологических условий среды и дополнительных инициирующих гелеобразование компонентов, не являющихся токсичными и применяемыми в физиологических концентрациях. Сам процесс формирования материала в виде композиционного гидрогеля протекает при 37°С, что делает возможным окончательное формирование материала внутри организма реципиента, что таким образом позволяет специалисту имплантировать не только предформированные изделия на основе композиционного материала (полученные путем преформинга), но и использовать инъекционную форму введения материала с постформингом внутри организма реципиента. Это может быть удобным при реконструкции небольших повреждений тканей или при отсутствии открытого операционного поля, доступного для хирургических манипуляций.
6. По сравнению с большинством аналогов материал обладает высокими иммобилизационными свойствами в отношении биогенных и ксеногенных субстанций различной химической структуры. За счет использования пектинов с низкой степенью этерификации формируются в процессе гелеобразования упорядоченные ячеистые структуры типа «egg-box» («коробки для яиц»). Такие структуры обладают свойством привлечения в ячеистую структуру различных субстанций. Это свойство пектинового компонента позволяет эффективно иммобилизовать другие компоненты материала.
Claims (10)
1. Имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины, включающий биосовместимую полимерную смесь из растительного полисахарида и белков внеклеточного матрикса коллагенов I и IV типов, отличающийся тем, что в качестве растительного полисахарида используют пектин со степенью этерификации не более 50%, причем конечные концентрации компонентов в матриксном материале находятся в диапазоне, вес. %:
пектин со степенью этерификации не более 50% 0,5-2,0
коллаген I типа 0,1-1,5
коллаген IV типа 0,01-0,5
2. Имплантируемый матриксный материал по п. 1, отличающийся тем, что в качестве коллагена IV типа используют препарат его NCl-гексамеров.
3. Способ получения имплантируемого матриксного материала для регенеративной медицины в форме гидрогеля, заключающийся в смешивании при температуре не выше 5°С уксуснокислого раствора коллагена I типа до конечной концентрации 0,1-1,5 вес.% с раствором коллагена IV типа до конечной концентрации 0,01-0,1 вес.%, затем полученную смесь смешивают с предварительно приготовленным инициатором гелеобразования, включающим раствор хлорида кальция в концентрации, обеспечивающей процесс гелеобразования, нетоксичную буферную систему в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси, и раствор хлорида натрия до физиологической концентрации; после чего вводят раствор пектина со степенью этерификации не выше 50% до конечной концентрации 0,5-2,0 вес.% и формируют гель путем повышения температуры смеси до физиологической.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве коллагена IV типа используют препарат его NCl-гексамеров.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что сформированный гель подвергают лиофильной сушке.
6. Способ получения имплантируемого матриксного материала для регенеративной медицины в форме гидрогеля, заключающийся в смешивании при температуре не выше 5оС уксуснокислого раствора коллагена I типа до конечной концентрации 0,1-1,5 вес.% с раствором коллагена IV типа до конечной концентрации 0,01-0,1 вес.%, затем полученную смесь нейтрализуют, стабилизируют нетоксичной буферной системой и добавляют хлорид натрия до физиологической концентрации, после чего прибавляют раствор пектина со степенью этерификации не выше 50% до конечной концентрации 0,5 - 2,0 вес.%, получая жидкую композицию, из которой формируют гель.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что в качестве коллагена IV типа используют препарат его NC1-гексамеров.
8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что формирование геля ведут путем наслаивания на поверхность жидкой композиции раствора инициатора гелеобразования, включающего хлорид кальция в концентрации, обеспечивающей процесс гелеобразования, нетоксичную буферную систему, поддерживающую нейтральный рН и хлорид натрия до физиологической концентрации в матриксном материале, с последующим повышением температуры до физиологической.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что сформированный гель подвергают лиофильной сушке.
10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что формирование геля производят путем введения жидкой композиции непосредственно в область имплантации в организм реципиента.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013147902/05A RU2597085C2 (ru) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | Имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины и способ его получения (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013147902/05A RU2597085C2 (ru) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | Имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины и способ его получения (варианты) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013147902A RU2013147902A (ru) | 2015-05-20 |
| RU2597085C2 true RU2597085C2 (ru) | 2016-09-10 |
Family
ID=53283533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013147902/05A RU2597085C2 (ru) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | Имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины и способ его получения (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2597085C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786443C1 (ru) * | 2022-04-05 | 2022-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Биодеградируемая 3D-матрица для заживления дефектов кожи на основе композитного поликапролактона |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2188206C2 (ru) * | 1998-04-10 | 2002-08-27 | Октафарма Аг | Способ стерилизации нативного коллагена в жидкой среде, полученный стерильный нативный коллаген, содержащие его композиции и их применение |
| RU2249462C1 (ru) * | 2003-08-21 | 2005-04-10 | Севастьянов Виктор Иванович | Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации и способ его получения |
| RU2321597C2 (ru) * | 2002-04-19 | 2008-04-10 | Новартис Аг | Биоматериал, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантат и вкладыш |
| RU2392287C2 (ru) * | 2003-06-06 | 2010-06-20 | Хьюманотоселл Гмбх | Матрица, клеточный имплантат и способы их получения и применения |
-
2013
- 2013-11-07 RU RU2013147902/05A patent/RU2597085C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2188206C2 (ru) * | 1998-04-10 | 2002-08-27 | Октафарма Аг | Способ стерилизации нативного коллагена в жидкой среде, полученный стерильный нативный коллаген, содержащие его композиции и их применение |
| RU2321597C2 (ru) * | 2002-04-19 | 2008-04-10 | Новартис Аг | Биоматериал, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантат и вкладыш |
| RU2392287C2 (ru) * | 2003-06-06 | 2010-06-20 | Хьюманотоселл Гмбх | Матрица, клеточный имплантат и способы их получения и применения |
| RU2249462C1 (ru) * | 2003-08-21 | 2005-04-10 | Севастьянов Виктор Иванович | Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации и способ его получения |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| K., Suzuki Y., Ohnishi K. et al. Pegeneration of transected spinal cord in young adult rats using freeze-dried alginate gel //Neuroreport. 1999. Vol.10. P. 2891-2894. * |
| Suzuki K., Suzuki Y., Ohnishi K. et al. Pegeneration of transected spinal cord in young adult rats using freeze-dried alginate gel //Neuroreport. 1999. Vol.10. P. 2891-2894. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786443C1 (ru) * | 2022-04-05 | 2022-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Биодеградируемая 3D-матрица для заживления дефектов кожи на основе композитного поликапролактона |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013147902A (ru) | 2015-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sun et al. | 3D printing collagen/chitosan scaffold ameliorated axon regeneration and neurological recovery after spinal cord injury | |
| CA2672495C (en) | Novel injectable chitosan mixtures forming hydrogels | |
| El Blidi et al. | Extraction methods, characterization and biomedical applications of collagen: A review | |
| CN101366978B (zh) | 可注射用的微粒组织充填材料及其制备方法 | |
| JP3634748B2 (ja) | イオン性ポリサッカライドゲルの温度制御ｐＨ依存性形成 | |
| DE69906321T2 (de) | Zusammensetzungen von kollagengeweben | |
| CN107224617B (zh) | 一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法 | |
| EP2273997B1 (de) | Verfahren und zusammensetzung zur regeneration von gewebe mit hilfe von stamm- oder knochenmarkzellen | |
| KR20140100469A (ko) | 교차-결합된 히알루론산의 섬조 및 이들의 이용 방법 | |
| US20210393396A1 (en) | Dermal layer for grafting having improved graft survival rate and method for producing same | |
| Ramakrishnan et al. | Silk fibroin-based bioengineered scaffold for enabling hemostasis and skin regeneration of critical-size full-thickness heat-induced burn wounds | |
| KR101710639B1 (ko) | 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법 | |
| DE69903945T2 (de) | Dreidimensionale biomaterialien, frei von zellulären komponenten und produkten, enthaltend hyaluronsäure-derivate, für die in-vivo regeneration von gewebezellen | |
| Si et al. | Control-released basic fibroblast growth factor-loaded poly-lactic-co-glycolic acid microspheres promote sciatic nerve regeneration in rats | |
| CN1800372A (zh) | 组织工程化细胞外基质的制备方法 | |
| DE69302262T2 (de) | Kollagenmikrokapseln enthaltende injezierbare zusammensetzung | |
| Climov et al. | Natural biomaterials for skin tissue engineering | |
| KR20190096946A (ko) | 지방 세포에 활성인 신규 조성물 | |
| RU2597085C2 (ru) | Имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины и способ его получения (варианты) | |
| CN108853595A (zh) | 一种磷酸钙修饰的交联玻尿酸微球的制备方法 | |
| RU2433828C1 (ru) | Инъекционный гетерогенный биополимерный гидрогель для заместительной и регенеративной хирургии и способ его получения | |
| RU2832796C1 (ru) | Способ получения композиции биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля | |
| RU2563992C2 (ru) | Композитные матриксы на основе фиброина шелка, желатина и гидроксиапатита для регенерации костной ткани | |
| RU2695066C1 (ru) | Способ лечения травматических разрывов печени с использованием пленочного покрытия на основе бактериальной целлюлозы | |
| KR20190012589A (ko) | 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20180627 |