RU2584346C2 - Способ выделения нуклеиновых кислот - Google Patents
Способ выделения нуклеиновых кислот Download PDFInfo
- Publication number
- RU2584346C2 RU2584346C2 RU2014124569/15A RU2014124569A RU2584346C2 RU 2584346 C2 RU2584346 C2 RU 2584346C2 RU 2014124569/15 A RU2014124569/15 A RU 2014124569/15A RU 2014124569 A RU2014124569 A RU 2014124569A RU 2584346 C2 RU2584346 C2 RU 2584346C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medicine
- rna
- diagnosis
- nucleic acid
- dna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 abstract description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 12
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 10
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- BMYCCWYAFNPAQC-UHFFFAOYSA-N 2-[dodecyl(methyl)azaniumyl]acetate Chemical group CCCCCCCCCCCCN(C)CC(O)=O BMYCCWYAFNPAQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000712471 Dhori virus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- YDMCWONVABEGBK-UHFFFAOYSA-N carbamimidoylazanium;phenoxide Chemical compound NC(N)=N.OC1=CC=CC=C1 YDMCWONVABEGBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RROSXLCQOOGZBR-UHFFFAOYSA-N sodium;isothiocyanate Chemical compound [Na+].[N-]=C=S RROSXLCQOOGZBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине. Изобретение раскрывает способ выделения нуклеиновых кислот с использованием изопропанола на этапе преципитации и осаждения ДНК, отличающийся тем, что при начальной обработке биологического материала используют гидрохлорид гуанидина и детергент в натрий-ацетатном буфере, а в качестве соосадителя нуклеиновых кислот применяют 0,05% линейный полиакриламид. Выделенная данным способом нуклеиновая кислота может быть использована при постановке полимеразной цепной реакции, также в практической медицине и ветеринарии для диагностики наследственных заболеваний человека и животных, судебной медицине, генной дактилоскопии, диагностике возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных, в том числе заболеваний передающихся половым путем. Преимуществом способа является упрощение выделения НК из крови и тканей человека и животных, что весьма актуально при проведении массовых анализов различных образцов в процессе диагностики инфекционных заболеваний. Использование в изобретении линейного полиакриламида ЛПАА в качестве соосадителя позволяет повысить выход НК из образца. 1 ил., 3 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине, является способом выделения нуклеиновых кислот из крови, ткани и мазков человека и животных. Выделенная данным способом НК может быть использована при постановке полимеразной цепной реакции, также в практической медицине для диагностики наследственных заболеваний человека, судебной медицине, генной дактилоскопии, диагностике возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных, в том числе заболеваний передающихся половым путем.
В основе диагностики и лечения многих заболеваний человека и животных лежат идентификация возбудителя и определение этиологии заболевания. Постановка полимеразной цепной реакции необходима в следующих случаях: для уточнения диагноза, в силу наличия у многих заболеваний серонегативного периода в ИФА, выявления наследственной патологии, предрасположенности к тому или иному заболеванию. ПЦР исследование отличается высокой чувствительностью и специфичностью, возможностью автоматизации процесса. Метод ПЦР включает в себя следующие основные этапы: выделение нуклеиновых кислот - ДНК и РНК, амплификация и анализ результатов. В основе ПЦР диагностики лежит многократное увеличение определенного участка последовательности нуклеиновых кислот при помощи фермента - термостабильной ДНК-полимеразы Taq-полимеразы. В случае анализа РНК этому этапу предшествует этап синтеза кДНК на матрице РНК с помощью РНК-полимеразы. Для улучшения чувствительности и специфичности ПЦР-анализа необходимо качественное и быстрое выделение и очистка нуклеиновых кислот - НК обеспечивающая минимальные потери материала. Проблема качественного получения НК для анализа наиболее остро стоит в случае с РНК, из-за ее быстрого лизиса РНК-азами. Учитывая вышесказанное, разработка нового метода для выделения НК является актуальной и практически значимой задачей.
В настоящее время существует несколько способов получения НК. Так для получения НК используются следующие методы:
1. Для выделения ДНК
Известен способ подготовки биологического материала для ДНК-ПЦР генамплификационной диагностики путем лизиса образца, многократной экстракции водонасыщенным фенолом или смесью фенол-хлороформ и осаждение ДНК этанолом в присутствии ацетата натрия (Мазин А.В. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990, с. 13-14). Основными недостатками данной методики является использование токсичных агентов, требующих особых условий работы, хранения и утилизации, длительностью выделения 3,5-4 часа в связи с переосаждением целевого продукта, низким выходом 25-30%.
2. Для выделения РНК
Основным способом выделения РНК является фенохлоформная экстракция по Хромински (Chomezynski P., Mackey К. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V. 10. P. 221-224).
100 мкл исследуемого образца смешивается с 600 мкл лизирующего раствора 4 M гуанидин изотиоционат, 50 мM цитрат натрия, 0.5% лаурил саркозилат, 100 мM µ-меркаптоэтанол, после чего добавляется 60 мкл 2 M NaAc pH=4.0, 600 мкл водонасыщенного фенола, тщательно перемешивается пипетированием. К полученной смеси приливается 120 мкл хлороформа, и инкубируется на льду в течение 10 минут. Смесь центрифугируется 15 минут при 12000 g. Водная (верхняя) фазу отбирается в отдельные пробирки, смешивается с равным объемом хлороформа, тщательно перемешивается и инкубируется при комнатной температуре 30 минут. Раствор отцентрифугировать 15 минут при 12000 g. Осадок двукратно промывается 80% этанолом, высушивается. После растворения РНК можно использовать для постановки обратной транскрипции. Основными недостатками данной методики является использование токсичных агентов, требующих особых условий работы, хранения и утилизации, а также с длительностью протокола 3 часа в связи с переосаждением целевого продукта, а также низким выходом около 7%.
3. Выделение ДНК и РНК
Выделение ДНК/РНК методом сорбции на силике. 100 мкл исследуемого образца смешивается со 450 мкл лизирующего раствора 6 M Guanidine thiocyanate; 50 мМ NaAc pH=5.4; 5 мМ EDTA; 5% Triton Х-100, после чего в каждую пробирку добавляется по 25 мкл 0,1% силики. Сорбент последовательно отмывают раствором 4 M гуанидинтиоционата, дважды 70%-ным этанолом, затем ацетоном и после чего проводят элюцию ДНК с сорбента. Супернатант содержит очищенные РНК и ДНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и ПЦР. (см. Boom R., Sol С.J. А et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acid. J. Clin. Microbiol., 1990, v. 28, N 3, p. 495-503). Основным недостатком данного метода является сложность подготовки сорбента и большое количество отмывок получаемого материала, кроме того, использование данного метода для получения нуклеиновых кислот требует использования дополнительного оборудования шейкера.
Наиболее близким к предлагаемому методу является следующий.
Осадок клеток ресуспендируется в лизирующем растворе 3 M натрий изотиоционат, 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 15 мМ ЭДТА, pH 8.0, 1% N-лаурилсаркозил, 1% поливинилпирролидон, 10 мМ дитиотриэтол и 0.6 г Ballotini бус 0.1 мм. Образец гомогенизируется в течение 1-3 мин, из супернатанта прецитипитируется НК при помощи изопропанола в течение 20 мин на льду, после чего центрифугируется в течение 20 мин при 14,000 × g, супернатант удаляется и осадок промывается дважды этанолом, высушивается и ресуспендируется в буфере (см. S. Mcllroy, К. Porter, R. J. Seviour, and D. Tillet Appl / Environ Microbiol. 2008 November; 74(21):6806-6807). Данный метод предназначен для выделения НК из растворов с высокой концентрацией 10-15 мг биомассы, при использовании данного метода при выделении НК из клинических образцов характеризующихся низкой концентрацией НК, поливинилпирролидон ингибирует ферментативные реакции, в том числе обратную транскрипцию.
Задача изобретения - упрощение способа выделения НК из крови и тканей человека и животных, что весьма актуально при проведении массовых анализов различных образцов в процессе диагностики инфекционных заболеваний.
Существенным отличием заявляемого способа является использование линейного полиакриламида (ЛПААГ) в качестве соосадителя для очистки и концентрирования НК. ЛПААГ не ингибирует большинство ферментативных реакций, что позволяет использовать его для выделения НК, которые служат матрицей в реакциях полимеризации. Линейный 0,05% полиакриламид связывается с ДНК и хорошо осаждается спиртами, что повышает выход НК из образца.
Способ осуществляют следующим образом:
Вносят 300 мкл лизирующего раствора в пластиковую пробирку емкостью 1,5 мл, не касаясь ее края. Добавляют 100 мкл исследуемого образца и, плотно закрыв крышку пробирки, перемешивают на вортексе в течение 3-5 сек. Термостатируют пробу 15 мин при 65°C, осаждают конденсат центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек. Добавляют 500 мкл реагента для преципитации НК и перемешивают пробу на вортексе в течение 3-5 сек. Центрифугируют пробирку при 14000 об/мин в течение 15 мин. Не задевая осадок, полностью удаляют надосадочную жидкость отдельным наконечником из каждой пробирки. Добавляют к осадку 500 мкл промывочного раствора №1 и 3-5 раз аккуратно переворачивают пробирку. Центрифугируют пробирку при 14000 об/мин в течение 5 мин. Не задевая осадок, полностью удаляют надосадочную жидкость отдельным наконечником из каждой пробирки. Добавляют к осадку 300 мкл промывочного раствора №2 и 3-5 раз аккуратно переворачивают пробирку. Центрифугируют пробирку при 14000 об/мин в течение 5 мин. Не задевая осадок, полностью удаляют надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки). Открывают крышку пробирки и высушивают осадок при 65°C в течение 5 мин. Добавляют к осадку 50 мкл буфера для растворения НК и прогревают пробу при 65°C в течение 10 мин. Осаждают капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в течение 3-5 сек. Готовый препарат используют для постановки полимеразной цепной реакции.
Составы смесей для выделения НК следующие:
Лизирующий буфер
гуанидин тиоцианат 4 M,
NaAc pH=5.2 150 мМ,
EDTA 25 мМ,
Triton Х-100 5%,
b-MeEtOH* 0.1 M,
линейный ПААГ 0.05%
Буфер для преципитации
NaAc pH=5.2 400 мМ,
изопрапанол 90%
Промывочный раствор 1
Этанол 70%
Промывочный раствор 2
Ацетон 70%
Пример 1. Приготовление линейного политакриламида
Линейный полиакриламид ЛПААГ хорошо осаждается спиртом, что позволяет использовать его в качестве соосадителя для очистки и концентрирования ДНК. ЛПААГ не ингибирует большинство ферментативных реакций. Для осаждения следует брать 2-5 мкл 0.5% раствора (в зависимости от объема осаждаемой ДНК).
Приготовить 10% AA (без МБАА) в 40 мМ TrisHCl, 20 мМ NaAc, 1 мM EDTA, pH 7.8. Добавить 1/100 V 10% персульфата аммония и 1/1000 ТЕМЕД, 30 мин. Осадить 2.5 V EtOH. Центрифугировать как для осаждения ДНК. Осадок промыть 70% EtOH. Растворить с концентрацией 10 мкг/мкл 1%.
Пример 2. Обнаружение возбудителя боррелиоза
Клеща вносили в 300 мкл лизирующего раствора и прокалывали пластиковым носиком. Пробу термостатировали 15 мин при 65°C, конденсат осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек, после чего добавляли 500 мкл реагента для преципитации НК и пробу перемешивали на вортексе в течение 3-5 сек. Пробирку центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 мин. Не задевая осадок, полностью удаляли супернатант. Осадок промывали 500 мкл раствора 1, затем после центрифугирования при 14000 об/мин в течение 5 мин, осадок промывали раствором 2. Пробу центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин. Не задевая осадок, полностью удаляли супернатант, пробирки высушивали при 65°C в течение 5 мин. К осадку добавляли 50 мкл буфера для растворения НК и прогревали пробу при 65°C в течение 10 мин. Полученный препарат использовали для постановки ПЦР реакции в режиме реального времени на амплификаторе iqCycler4 Bio-rad. В качестве референс метода использовали выделение ДНК фенол хлороформной экстракцией и медом сорбции на силике (табл.1).
| Таблица 1 | ||
| Выявляемость возбудителя клещевого боррелиоза, N=300 | ||
| Метод выделения | Группы сравнения | Выявляемость клещевого боррелиоза |
| Выделение ДНК методом сорбции на силике | вся группа | 10,7% |
| не напитавшиеся клещи | 10,7% | |
| напитавшиеся клещи | 10,7% | |
| Выделение РНК методом переосаждения из раствора с хаотропными агентами | вся группа | 17% |
| не напитавшиеся клещи | 18,7% | |
| напитавшиеся клещи | 15,3% | |
| Выделение ДНК методом экстракции фенол хлороформом | вся группа | 16,3% |
| не напитавшиеся клещи | 17,3% | |
| напитавшиеся клещи | 15,3% | |
Различия в выявляемости возбудителя клещевого боррелиоза статистически достоверны отличия метода переосаждения из раствора с ЛПААГ и метода сорбции на силике p<0.05, выделения ДНК методом экстракции фенол-хлороформом и методом сорбции на силике p<0.05. Различия в выявляемости методом переосаждения из раствора с хаотропными агентами и выделение ДНК методом экстракции фенол-хлороформом статистически не достоверны.
Пример 3
Выделение РНК для обнаружения вируса клещевого энцефалита Пробы обрабатывали так, как написано в примере 2. Было проведено сравнение эффективность выделения РНК методом сорбции на силике, и методом переосаждения из раствора с ЛПААГ, и экстракцией по Хромински для выделения РНК (Таб. 2).
Проведенный эксперимент показал статистически значимые отличия в выявляемости вируса клещевого энцефалита между методом переосаждения из раствора с ЛПААГ и методом сорбции на силике p<0.05, оценено при помощи критерия Хи-квадрат с использованием программы Statistika, а также выделения РНК по Хромински и методом сорбции на силике p<0.05.
| Таблица 2 | ||
| Выявляемость вируса клещевого | ||
| Метод выделения | Группы сравнения | Выявляемость клещевого энцефалита |
| Выделение ДНК/РНК методом сорбции на силике | вся группа | 8,0% |
| не напитавшиеся клещи | 7,3% | |
| напитавшиеся клещи | 8,7% | |
| Выделение РНК/ДНК методом переосаждения из раствора с хаотропными агентами | вся группа | 13,0% |
| не напитавшиеся клещи | 12,0% | |
| напитавшиеся клещи | 14% | |
| Выделение РНК по Хромински | вся группа | 14,0% |
| не напитавшиеся клещи | 12,6% | |
| напитавшиеся клещи | 15,3% | |
Различия в выявляемости методом переосаждения из раствора с ЛПААГ и выделение РНК по Хромински статистически не значимы.
Пример 4
Была проведена серия экспериментов по выделению РНК из культуральной среды РНК-содержащего фага MS2. Выделение РНК проводилось одновременно тремя различными методами фенол-хлоформная экстракция по Хроминки, при помощи набора для выделения РНК «RNA-Ss», Россия и переосаждением РНК из раствора с ЛПААГ. Критериями сравнения являлись чувствительность и воспроизводимость результатов эксперимента. Наиболее предпочтительный метод выделения РНК определяли при помощи титрования, табл. 3.
Эффективность амплификации при выделении РНК методом фенол-хлороформной экстракции составила 1.84 (92%), при выделении комплектом реагентов с ЛПААГ - 1.88 (94%).
| Таблица 3 | ||||
| Средние значения пороговых циклов C(t) для различных методов выделения | ||||
| Метод | Значения порогового цикла C(t) при различных концентрациях исходного материала (количество фаговых частиц/мл) | |||
| 5*105 | 5*104 | 5*103 | 5*102 | |
| Выделение РНК методом фенол-хлороформной экстракции | 36.06±0.87 | 39.10±0.93 | 45.09±1.33 | 46.62±1.53 |
| Выделение РНК с ЛПААГ | 35.27±0.82 | 39.45±0.95 | 43.39±0.89 | 46.16±1.08 |
| Выделение РНК набором для выделения «RNA-Ss» | Никаких достоверных результатов получено не было | |||
На рисунке показаны графики зависимости накопления флуоресценции от цикла амплификации для внутреннего контрольного образца при титровании в 10 раз при использовании комплекта реагентов с ЛПААГ.
Из полученных данных видно, что с помощью сравнения значений пороговых циклов при выделении РНК различными методами можно сделать вывод, что наиболее предпочтительными методами являются выделение РНК методом фенол - хлороформной экстракции и комплектом реагентов с ЛПААГ. Однако, метод выделение РНК методом фенол-хлороформной экстракции является достаточно трудоемким и тем самым неудобным для технологического применения. При выделении РНК набором для выделения «RNA-Ss» никаких достоверных результатов получено не было.
Как видно из предложенных примеров, обработка биологических материалов и их ПЦР-анализ позволяют быстро и надежно выявлять вирусо-и бактерионосительство не только у людей, в том числе клинически здоровых серонегативных лиц, но и проводить выделение возбудителей заболеваний в организмах-переносчиках (например в клещах).
Таким образом, применение подготовки биологических материалов предложенным способом позволяет ускорить время исследования без снижения чувствительности ПЦР теста. Чувствительность и специфичность ПЦР близки к предельно возможной, а результаты получают в течение одного дня. Данная обработка позволяет использовать для ПЦР практически любой материал: целых насекомых, гистологические препараты, сухие пятна крови и тканей, количество исследуемого материала во многих случаях составляет несколько микролитров.
Claims (1)
- Способ выделения нуклеиновых кислот с использованием изопропанола на этапе преципитации и осаждения ДНК, отличающийся тем, что при начальной обработке биологического материала используют гидрохлорид гуанидина и детергент в натрий-ацетатном буфере, а в качестве соосадителя нуклеиновых кислот применяют 0,05% линейный полиакриламид.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014124569/15A RU2584346C2 (ru) | 2014-06-17 | 2014-06-17 | Способ выделения нуклеиновых кислот |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014124569/15A RU2584346C2 (ru) | 2014-06-17 | 2014-06-17 | Способ выделения нуклеиновых кислот |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014124569A RU2014124569A (ru) | 2015-12-27 |
| RU2584346C2 true RU2584346C2 (ru) | 2016-05-20 |
Family
ID=55023215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014124569/15A RU2584346C2 (ru) | 2014-06-17 | 2014-06-17 | Способ выделения нуклеиновых кислот |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2584346C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2751244C1 (ru) * | 2020-09-30 | 2021-07-12 | Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ экстракции нуклеиновых кислот из ногтевых пластин |
| RU2781833C1 (ru) * | 2022-08-19 | 2022-10-18 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Промомед Рус" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2628695C1 (ru) * | 2016-06-14 | 2017-08-21 | Общество с ограниченной ответственностью "Биологическая среда" | Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6043032A (en) * | 1993-09-22 | 2000-03-28 | Tosoh Corporation | Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences |
| EP1660631B1 (en) * | 2003-08-01 | 2013-04-24 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for purifying short rna molecules |
-
2014
- 2014-06-17 RU RU2014124569/15A patent/RU2584346C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6043032A (en) * | 1993-09-22 | 2000-03-28 | Tosoh Corporation | Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences |
| EP1660631B1 (en) * | 2003-08-01 | 2013-04-24 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for purifying short rna molecules |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HONG CHEN et al. Evaluation of Five Methods for Total DNA Extraction from Western Corn Rootworm Beetles. August 2010. Vol. 5. Is. 8. e11963. PP. 1-6. TRIzol (R) LS Reagent. Пособие. 2010. Найдено в Интернет 24.06.2015, найдено на https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. * |
| СЕВЕРИН С. Е. Практикум по биохимии. 1989. стр. 169. Найдено в Интернет 24.06.2015, найдено на http://lib.e-science.ru/book/50/page/169.html. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2751244C1 (ru) * | 2020-09-30 | 2021-07-12 | Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ экстракции нуклеиновых кислот из ногтевых пластин |
| WO2022071833A1 (ru) * | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека | Способ экстракции нуклеиновых кислот из ногтевых пластин |
| RU2810467C1 (ru) * | 2022-08-08 | 2023-12-27 | Михаил Владимирович Фаниев | Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата тестикулярной ткани у инфертильных мужчин |
| RU2781833C1 (ru) * | 2022-08-19 | 2022-10-18 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Промомед Рус" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae |
| RU2835079C1 (ru) * | 2024-04-23 | 2025-02-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ивановский государственный химико-технологический университет" | 5-[4'-(1"-метилиндол-2"-ил)фенил]-10,15,20-трис(n-метилпиридин-3'-ил)порфирин трииодид, проявляющий свойство осаждения нуклеиновых кислот из растворов |
| RU2835183C1 (ru) * | 2024-05-30 | 2025-02-24 | ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК" (ИЦиГ СО РАН) | Способ выделения двуцепочечной РНК из штамма E. coli HT115 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014124569A (ru) | 2015-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8367817B2 (en) | Reagents for isolation of purified RNA | |
| CA2985652C (en) | Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples | |
| JP3943601B2 (ja) | アルカリプロテアーゼを用いる核酸の単離方法 | |
| US10308929B2 (en) | Method of preparing biological material | |
| CN104769111B (zh) | 用于非洗提样品的一步法核酸扩增的方法 | |
| CN108410951B (zh) | 一种新的核酸提取试剂及其应用 | |
| CN109207475A (zh) | 一种快速核酸提取方法 | |
| JP2008527997A (ja) | 核酸の抽出及び同定方法 | |
| US12297425B2 (en) | Nucleic acid extraction composition, reagent and kit containing the same and use thereof | |
| JP2007509620A (ja) | 迅速かつ低コストな核酸の単離方法 | |
| RU2584346C2 (ru) | Способ выделения нуклеиновых кислот | |
| JPWO2018061877A1 (ja) | 核酸を抽出する方法及びそれに用いるキット | |
| Thatcher | Nucleic acid isolation | |
| JP2010523094A (ja) | 生体分子の精製方法 | |
| Rimmer et al. | Validation of high throughput methods for tissue disruption and nucleic acid extraction for ranaviruses (family Iridoviridae) | |
| JP2023527475A (ja) | 核酸抽出方法及び用途 | |
| CN103160496B (zh) | 一种大型实验动物血液总rna提取和纯化方法 | |
| JP2023138629A (ja) | 核の保存方法 | |
| CN102329791A (zh) | 适用于实验小鼠基因分型的鼠尾dna提取试剂盒及其应用 | |
| CN115667508A (zh) | 用于柱方式的单管聚合酶链式反应用核酸分离的缓冲液组合物及其用途 | |
| RU2807254C1 (ru) | Универсальный способ выделения ДНК и лизирующая смесь для его осуществления | |
| Galingging et al. | Identification of Viral Nervous Necrosis in Grouper Fish (Epinephelus sp.) by reverse transcriptase-polymerase chain reaction with different RNA extraction methods | |
| RU2628695C1 (ru) | Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления | |
| JP7584800B2 (ja) | デジタル微生物叢解析 | |
| US20250027077A1 (en) | DEVICES AND METHODS FOR mtDNA EXTRACTION |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170618 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20200525 |