RU2583179C2 - Способ консервации клеток и культур клеток - Google Patents
Способ консервации клеток и культур клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2583179C2 RU2583179C2 RU2013141186/13A RU2013141186A RU2583179C2 RU 2583179 C2 RU2583179 C2 RU 2583179C2 RU 2013141186/13 A RU2013141186/13 A RU 2013141186/13A RU 2013141186 A RU2013141186 A RU 2013141186A RU 2583179 C2 RU2583179 C2 RU 2583179C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- container
- cells
- period
- pressure
- time
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title abstract description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title description 3
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 45
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 114
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 40
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims 4
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 5
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000000604 fetal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000006676 mitochondrial damage Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012806 monitoring device Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/16—Physical preservation processes
- A01N1/162—Temperature processes, e.g. following predefined temperature changes over time
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/16—Physical preservation processes
- A01N1/165—Pressure processes, e.g. following predefined pressure changes over time
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к консервации клеток, образующих ядро, а именно к способу снижения апоптоза хранящихся клеток и к охлажденной композиции, содержащей клетки, образующие ядро, где клетки находятся в контейнере и хранятся с помощью указанного выше способа. Способ включает: 1) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере; 2) добавление газа в указанный контейнер таким образом, чтобы давление внутри контейнера достигало 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды, где указанный газ представляет собой или включает газ ксенона; 3) сохранение указанного давления в указанном контейнере в продолжение первого периода времени, в течение которого температура в указанном контейнере равна 22°C-37°C; 4) после указанного первого периода времени снижение указанной температуры в контейнере до 0,1°C-10°C с одновременным сохранением указанного давления на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды; 5) сохранение указанного контейнера при указанной более низкой температуре и при давлении на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды в течение второго периода времени, где указанный второй период времени больше чем указанный первый период времени; и 6) после указанного второго периода времени, снижение давления в указанном контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры в указанном контейнере до 22°C-37°C. Осуществление способа позволяет снизить апоптоз клеток. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил.
Description
Перекрестная ссылка на родственную заявку
[0001] Данная заявка утверждает приоритет заявки США с серийным номером 61/436441, зарегистрированной 7 февраля 2011 г, раскрытие которой включено в данную работу ссылкой.
Область техники, к которой относится изобретение
[0002] Настоящее изобретение в общем относится к консервации клеток и более конкретно к консервации эукариотных, образующих ядро клеток in vitro.
Уровень изобретения
[0003] Хранение биологического материала, содержащего живые клетки в течение как короткого так и длинного периодов времени, представляет собой один из самых значительных стимулов в современной медицинской науке. Охлаждение до температуры внутри интервала от -20°С до -176°С в присутствии криозащитных веществ до сих пор представляет собой самый широко применяемый способ хранения живых клеток. Механизм криозащиты включает защитное действие на образование кристаллов льда, которые разрушают клетки и/или клеточные компоненты. Однако данные и другие общепринятые способы консервации клеток вызывают стресс в клетках, которые хранятся, и апоптоз почти всегда индуцирован в части клеток, которые подвержены манипуляциям, возникшим при хранении. (См., например, de Boer F., et al. J. Hematother. Stem Cell Res. 2002 Dec; 11(6):951-63; Shapiro AM, et al. Diabetes Technol. Ther. 2000 Autumn; 2(3):449-52; Cookson P., et al. Transfus Med. 2010 Dec; 20(6):392-402). Кроме того, клетки, которые получены непосредственно от органов и тканей и не культивировались, часто повреждаются в течение хранения и транспортировки. Таким образом, существует постоянная и нереализованная потребность в улучшенных способах для консервации клеток и защиты их от летальных событий, таких как апоптоз, в течение хранения и/или транспортировки. Настоящее изобретение удовлетворяет данной и другим потребностям.
Сущность изобретения
[0004] Настоящее изобретение относится к способу снижения апоптоза. Способ включает основные стадии, включающие: i) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере и добавление газа, содержащего ксенон, в контейнер, так что давление внутри контейнера достигает 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды; ii) хранение контейнера из i) при 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды в продолжение периода времени, в течение которого температура в контейнере равна 22°С-37°С; iii) снижение температуры в контейнере до 0,1°С-10°С с одновременным установлением давления 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды; iv) хранение контейнера при 0,1°С-10°С и давлении 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды в течение периода времени; и v) последовательно снижение давления в контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры до 22°С-37°С. Клетки, обработанные согласно данной процедуре, претерпевают меньше апоптоза чем эталон.
[0005] В различных вариантах осуществления, период времени, в течение которого контейнер хранится при 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды при 22°С-37°С, составляет от 15 минут до 24 часов. Период времени, в течение которого контейнер хранится при 0,1°С-10°С и давлении 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды составляет от 2 часов до трех недель, который включает, но не обязательно ограничен, периодом от 2 часов до 24 часов, или по меньшей мере до 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток, 12 суток, 13 суток, 14 суток, и т.д., вплоть до трех недель. Способ включает снижение апоптоза в клетках млекопитающего, которые могут быть клетками человека.
[0006] Изобретение также относится к охлажденной композиции, содержащей клетки, образующие ядро, где клетки присутствуют в контейнере и хранятся при температуре 0,1°С-10°С и где давление внутри контейнера составляет 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды из-за введения в контейнер газа, содержащего ксенон.
Краткое описание чертежей
[0007] Фиг. 1 показывает процентное содержание клеток U-937 клеточной линии лейкемической моноцитной лимфомы человека, определенное методом поточной цитометрии после 24 часов (фиг. 1А) и 7 суток (фиг. 1В) хранения в чашках Петри в течение указанного периода либо в контейнере либо в стандартном инкубаторе с СО2 при 37°С, сделанном для культивирования клеток (“контроль”). После удаления из хранилища, клеткам постепенно снижали давление в продолжение периода в 60 минут, окрашивали с помощью антиCD14 антитела и сортировали поточной цитометрией. АнтиCD14 антитело является маркером моноцитов и макрофагов. Наносили на график процент общих клеток, которые положительно окрашивали АнтиCD14 антитело.
[0008] Фиг. 2 показывает процентное содержание живых клеток Jurkat клеточной линии лейкемической моноцитной лимфомы по отношению к общему числу клеток за 24 часа хранения при давлении в 4 атм избыточного ксенона. Клетки обрабатывали, как описано для фиг. 1. Клетки хранили в присутствии или в отсутствие апоптического индуктора доксорубицина (доксо) при указанных температурах. Живые клетки отличали от погибших клеток, используя стандартный метод исключения голубого трипана.
[0009] Фиг. 3 показывает изменение в количествах живых клеток Jurkat в культуре после переноса их из условий хранения и помещения их в стандартные условия культивирования (37°С в воздухе с 5% СО2). Клетки окрашивали красителем трипаном голубым перед и после 24 часов инкубирования при стандартном условии для определения числа клеток. Клетки контрольной группы культивировали в стандартных условиях культивирования при давлении окружающей среды, включая период хранения. Клетки контроля брали в нулевые сутки эксперимента из той же самой колбы, что и экспериментальные клетки и помещали в чашки Петри. Фиг. 4 показывает, что избыточное давление в 4 атм, полученное введением газа, содержащего ксенон, в контейнер препятствовало развитию как спонтанного (серии no Doxo на диаграмме) так и индуцированного (серии Doxo на диаграмме) апоптоза в клетках Jurkat. В данном наборе опытов контролировали активность каспазы 3 после 24 часов хранения. Фиг.5 показывает окрашивание клеток U-937 клеточной линии лейкемической моноцитной лимфомы (хранившихся согласно вышеописанному методу в течение 24 часов (фиг. 5А) и 7 суток (фиг. 5В) под давлением на 4 атм выше окружающего давления Хе) с красящим агентом JC-1, что делает возможной оценку состояния митохондрий с помощью поточной цитометрии.
[0010] Фиг. 6 показывает окрашивание клеток U-937 клеточной линии лейкемической моноцитной лимфомы, сохраняемых в соответствии со способом изобретения, в 1, 14, и 28 сутки хранения. Клетки окрашивали, используя красящий комплект аннексин-FITC/иодид пропидия, который позволяет провести различие между живыми, некротическими, апоптическими клетками на ранней и поздней стадиях. После окончания периода хранения, среду заменяли и клетки дополнительно культивировали в течение 1 суток в обычных условиях для оценки степени восстановления. 'Xe+4': газовая смесь из 95% Хе+5% СО2 (избыточное давление 4 атм) при +4С, 'NG+4': хранение при давлении окружающей среды и при температуре +4С; NG+37 сделанные эталонные образцы, которые культивировали при 37°С, 5% СО2 с замещением культуральной среды каждые трое суток.
Подробное описание изобретения
[0011] Настоящее изобретение относится к способам ингибирования апоптоза. Способ основан на открытии авторов, состоящего в том, что обработка образующих ядро клеток, имеющихся в атмосфере, содержащей ксенон, при определенных давлениях и температурах, как далее описано в данной заявке, приводит к пониженному апоптозу в клетках. Данное изобретение особенно пригодно для снижения апоптоза в клетках при хранении и/или транспортировке. В различных вариантах воплощения, обработанные клетки с использованием способа изобретения можно хранить под давлением при температуре от 0,1°С до +10°С в течение периода вплоть до двух недель. Данное изобретение можно практиковать без применения обычных средств для предотвращения замораживания.
[0012] В целом, изобретение включает следующие последовательные стадии: i) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере и добавление в контейнер ксенона или газовой смеси, содержащей Хе, так что давление внутри контейнера достигает 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды (абсолютное давление 1,5-5,0 атм); ii) хранение контейнера из i) при давлении 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды в продолжение периода времени, в течение которого температура в контейнере равна 22°С-37°С; iii) снижение температуры в контейнере до 0,1°С-10°С с одновременным установлением давления 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды; iv) хранение контейнера при 0,1°С-10°С и давлении 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды в течение периода времени; и v) снижение давления в контейнере в iv) до давления окружающей среды и повышение температуры до 22°С-37°С. При выполнении данных стадий, клетки из v) претерпевают меньше апоптоза чем эталон.
[0013] Эталон, по которому можно сравнивать клетки, обработанные согласно способу изобретения, может быть любым подходящим эталоном. Например, эталон может быть контролем для клеток, которые не были подвергнуты воздействию одного или нескольких параметров, использованных для обработки клеток, применяющихся по способу изобретения. Эталон может представлять собой типовую кривую, площадь под кривой, график, таблицу, или любое другое изображение данных, по которым можно делать сравнение эффектов способа изобретения.
[0014] В одном варианте воплощения, давление для хранения клеток представляет собой 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды, и все давления до десятичной доли располагаются между данными значениями. Все давления, указанные в данном описании, если не отмечено особо, означают избыточную атм (гипербарная или гиператмосферная). Давление окружающей среды означает нормальное атмосферное давление без дополнительного давления, которое обычно находится в интервале 0,84-1,07 атм, со средним давлением окружающей среды, принятым равным 1 атм.
[0015] Изобретение, как ожидают, будет подходящим для ингибирования апоптоза в любой клетке(ах), образующей ядро. В различных вариантах воплощения, клетки, предназначенные для данного способа изобретения, способны к пролиферации. Клетки могут иметь потенциал, чтобы различаться по одному или многократным происхождениям. Таким образом, клетки могут иметь тотипотентность, плюрипотентность, мультипотентность или унипотентность. Соответственно клетки могут быть стволовыми клетками, включающими но без ограничения только ими, стволовые клетки взрослых особей, тканевые определенные стволовые клетки, фетальные стволовые клетки, зародышевые стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, такие как мезенхимные стволовые клетки или кроветворные стволовые клетки. Например, миобласты и кардиомицеты могут быть произведены из мезенхимных стволовых клеток, в то время как кроветворные стволовые клетки могут быть произведены из стволовых клеток костного мозга. В одном варианте воплощения, клетки могут быть гаплоидными, такими как неоплодотворенные ооциты.
[0016] В некоторых вариантах воплощения, клетки могут быть иммортализированы, такие как клеточные линии, которые обычно устанавливаются размножением и/или пассированием клеток, отделенных от первоначального источника. В других вариантах воплощения использован способ для ингибирования апоптоза в клетках, которые были выделены из первичной ткани, а именно, в одноразовых суспензиях клеток, полученных от образца первичной ткани. В другом варианте воплощения, клетки, обработанные согласно способу изобретения, могут быть частью ткани, включающей, но без ограничения, биопсию ткани, срез ткани, или культуру ткани. В одном варианте воплощения, клетки, обработанные с применением способов изобретения, представляют собой свободные пластинки. В другом варианте воплощения, клетки, обработанные с применением способа изобретения, не присутствуют в органе. Клетки можно получать или производить от любого животного. В одном варианте воплощения, животное является млекопитающим. В одном варианте воплощения, млекопитающее является человеком.
[0017] Как обсуждено выше, способ изобретения первоначально включает хранение клеток, образующих ядро, в контейнере и добавление в контейнер ксенона (или газовой смеси, содержащей Хе), так что давление внутри контейнера достигает 0,5-4,0 атм выше давления окружающей среды, включительно, и при этом включаются все значения до десятичной доли, которые располагаются между данными значениями. В данном отношении, контейнер может быть любым контейнером, который подходит для хранения сосуда, в котором клетки выращивают и/или хранят in vitro. В частности, любой сосуд, такой как тест-пробирка, чашка Петри, пробирка Эппендорфа, чашка для культуры ткани, многолуночный планшет для культуры, и т.д., в котором присутствуют клетки, может быть помещен в контейнер. Следует осознавать, что когда сосуд, в котором присутствуют клетки, помещают в контейнер, сосуд располагают так, чтобы клетки в нем подвергались действию добавленного ксенона и давлению в контейнере. Например, если сосуд, в котором присутствуют клетки, является тест-пробиркой, то тест-пробирку не запаивают, что позволяет ксенону, добавленному в контейнер, осуществлять давление на клетки и быть включенным в клетки.
[0018] Контейнер, в который добавлен ксенон и который защищает сосуд, в котором присутствуют клетки, может представлять собой любой подходящий контейнер. Подходящие контейнеры могут быть твердыми, такими как банка, колба, резервуар или пробирка. Контейнер должен обладать способностью к поддержанию герметичной для газа окружающей среды. Таким образом, контейнер может обладать способностью к тому, чтобы быть герметично запаянным. Контейнер также может быть эластичным, способным к запечатыванию контейнером, пример которого включает, но без ограничения, пакет. Его предпочитают для контейнера, и ксенон (или газовая смесь с Хе), который добавляют в него, должен быть стерильным. При осуществлении способа изобретения, можно использовать любую подходящую систему для установления атмосферы, в которой клетки сохраняются, чтобы обеспечивать атмосферу при требуемом парциальном или общем давлении ксенона. Общие черты такой системы включают резервуар для газа, в силу чего резервуар предпочтительно реально присоединен к контейнеру. Подходящие газовые системы могут содержать компоненты, включающие, но без ограничения, клапаны, насосы, насадки, входные и выходные отверстия, и их комбинации, а также контролирующее устройство для контроля компонентов системы и тем самым количества газа, доставленного в контейнер, и скорости, с которой доставляется газ. Данная система может дополнительно включать один или несколько компонентов, применяемых для удаления ксенонсодержащей атмосферы из контейнера и/или для создания вакуума в контейнере. Вся система или любой компонент или порция компонента могут быть запущены вручную, или могут быть автоматизированы, чтобы управляться компьютерами и компьютерными программами.
[0019] В одном варианте воплощения, клетки хранят или подвергают экспозиции газовой смесью ксенона СО2 и необязательно содержащей азот. Таким образом, газовая смесь может содержать от 9% ксенона, 5% СО2 и остаток N2 до 95% ксенона и 5% СО2. В одном варианте воплощения, ксенон (или газовую смесь, содержащую ксенон), вводят в атмосферу внутри контейнера с удалением или без удаления загрязнителя имеющегося газа/воздуха до тех пор, пока концентрация ксенона в газовой атмосфере внутри контейнера не составляет по меньшей мере 9%. В одном варианте воплощения, атмосфера в контейнере состоит из ксенона. В альтернативном варианте воплощения, атмосфера может состоять из ксенона и следовых примесей. Таким образом, в одном варианте воплощения, атмосфера может состоять в основном из ксенона и по меньшей мере из 5% СО2.
[0020] Температура, при которой ксенон на начальной стадии добавляют в контейнер, является изменчивой и будет зависеть от типа клеток, которые подвергаются обработке. В целом, температура может находиться в интервале от 22°С до 37°С, включительно, и при этом включаются все целые числа между данными значениями и все числа между следующими друг за другом целыми числами до значения десятичных долей. Не зависимые от температуры в течение добавления ксенона или газовой смеси, содержащей Хе, как только давление внутри контейнера достигает 0,5-4 атм выше давления окружающей среды, клетки сохраняются в контейнере под давлением в продолжение периода времени, в течение которого температура в контейнере составляет от 22°С до 37°С, включительно, и при этом включаются все значения до десятичных долей между ними. Период времени, в течение которого клетки сохраняются при данной температуре и интервале давления, может изменяться от 15 минут до 24 часов, включая все интервалы времени между ними. В связи с этим, и без намерения ограничиваться любой конкретной теорией полагают, что сохранение клеток при 22°С-37°С и 0,5-4 атм выше давления окружающей среды приводит к клеткам, которые становятся насыщенными ксеноном, и что это, вместе с проведением оставшихся стадий данного способа приводит к ингибированию апоптоза в клетках, что улучшает долговечность клеток в течение хранения и транспортировки.
[0021] После того как клетки сохранялись при 0,5-4 атм выше давления окружающей среды при 22°С-37°С в течение от 15 минут до 24 часов, температуру в контейнере снижали до 0,1°С-10°С, включительно, и при этом включаются все целые числа между данными значениями и все числа между следующими друг за другом целыми числами до значения десятичных долей, в то же время устанавливается давление 0,5-4 атм выше давления окружающей среды. В одном варианте воплощения, температуру в контейнере снижали помещением контейнера в охлаждаемый кожух. Данный интервал температуры и давления поддерживают в течение периода времени, который мог изменяться от 2 часов до 3 недель, включая все интервалы времени между ними, но не меньшего времени, чем требуется для клеток внутри контейнера для достижения температуры от 0,1°С до 10°С. Таким образом, данное изобретение применимо для хранения клеток при пониженной температуре и повышенном давлении в течение 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, или более суток.
[0022] После хранения клеток при 0,5-4 атм выше давления окружающей среды и от 0,1°С до 10°С, давление в контейнере снижают до давления окружающей среды (как, например, открытием клапана или крышки) и температуру контейнера поднимают до 22°С-37°С, включительно, и при этом включаются все целые числа между данными значениями и все числа между следующими друг за другом целыми числами до значения десятичных долей. Данные клетки претерпевают меньший апоптоз чем эталон.
[0023] Контейнер, содержащий клетки, обработанные в соответствии со способом изобретения, можно перевозить в местность и/или индивидууму или в хозяйственный объект для применения во множестве процедур, и клетки еще будут претерпевать меньший апоптоз чем эталон.
[0024] Изобретение также относится к охлаждаемой композиции, содержащей клетки, образующие ядро, которые подвержены воздействию повышенной концентрации ксенона или газовой смеси, содержащей Хе под давлением, но претерпевают меньший апоптоз чем клетки, которые не были подвержены воздействию повышенной концентрации ксенона под давлением.
[0025] Следующий пример предназначен для того, чтобы иллюстрировать, но не ограничивать данное изобретение.
[0026] Для получения данных, представленных в этих примерах, клетки U-937 лейкемической моноцитной лимфомы культивировали в среде RPMI-1640, снабженной 15% эмбриональной бычьей сывороткой и 10 мкг/мл гентамицина в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Чашки Петри, содержащие культуру клеток в фазе экспоненциального роста, помещали на удерживающую подставку и переносили в контейнеры, имеющие внутренний объем приблизительно в 1,5 л, которые были сделаны для сохранения гипербарных условий. Смесь газов Хе-СО2 (95% и 5% соответственно) использовали для создания давления от 0,5 до 4,0 атм выше давления окружающей среды в течение периода из 5-10 минут, с конкретными параметрами, представленными на фигурах, присутствующих в данном описании. Температуру выдерживали от 22°С до 37°С в данном варианте воплощения изобретения. Газы смешивали в отдельном сосуде (или в контейнере/пробирке) на основе расчета их парциального давления. Контейнер с чашками Петри выдерживали при данной температуре и данном давлении в течение 2 часов. Затем контейнер переносили в холодильник с пониженной температурой (от 0,1°С до +5°С), с одновременным сохранением давления. Контейнер выдерживали при данных условиях в течение приблизительно 4 недель. После этого, давление снимали и контейнер, содержащий клетки, выдерживали в течение 7 суток в помещении при температуре от +4°С до +10°С и атмосферном давлении.
[0027] Авторы выбрали для обработки клетки Jurkat и клетки U-937 согласно вышеприведенной процедуре, потому что они обладают ядерным и полномасштабным апоптическим каскадным механизмами. В соответствии с этим, данные клетки отвечают за большое число как внеклеточных так и внутриклеточных проапоптических сигналов и использовались в качестве модельных клеток для анализа апоптоза (Pimentel-Muinos FX, Seed B. Regulated commitment of TNF receptor signaling: a molecular switch for death or activation. Immunity. 1999 Dec; 11(6):783-93; Karas M, Zaks TZ, Liu JL, LeRoith D. T cell receptor-induced activation and apoptosis in cycling human T cells occur throughout the cell cycle. Mol. Biol. Cell. 1999 Dec; 10(12):4441-50; Valavanis C, Hu Y, Yang Y, Osborne BA, Chouaib S, Greene L, Ashwell JD, Schwartz LM. Model cell lines for the study of apoptosis in vitro. Methods Cell Biol. 2001; 66:417-36).
[0028] После осуществления на клетках способа данного изобретения, авторы анализировали количество живых клеток (фиг. 1), активность каспазы-3, которая является указанием на интенсивность апоптоза (фиг. 2). Данные, представленные на фиг. 1 и 2, показали, что способ изобретения ингибирует спонтанную гибель клеток.
[0029] Обработка ксеноном также улучшала рост клеток после экспозиции доксорубицина (фиг. 3). В частности, клетки эталона (контроля) продолжали претерпевать гибель, вызванную доксорубицином, в то время как наблюдалось повышение числа живых клеток в образцах, обработанных ксеноном (Хе+37 доксо, Хе+4 доксо). Ксенон предотвращал развитие как спонтанного (не доксо и необработанного) так и индуцированного (доксо) апоптоза как в клетках Jurkat (фиг. 4), так и в клетках U-937 (фиг. 5).
[0030] Доксорубицин, будучи известным индуктором апоптоза, вызывает поражение митохондрального мембранного потенциала. Ксенон (как в комбинации с охлаждением так и без охлаждения) оказывает защитное действие на клеточные митохондрии. Например, в присутствии ксенона процентное содержание обработанных доксорубицином клеток с неповрежденными митохондриями было существенно выше, чем в клетках, хранившихся без ксенона (фиг. 5) как после 24 ч так и 7 суток хранения. После 7 суток хранения, ксенон также значительно снижал поражение митохондрий по сравнению с контролем (без газа, 37°С), что обусловлено ростом клеток без клеточного деления в среде - обычно данные клетки делятся каждые 2-3 суток. Полагают, что защита митохондрий происходит из-за того, что присутствие ксенона защищает органеллы от действия холода (фиг. 2, группы Хе+4 и NG+4 с доксо и без доксо).
[0031] Хотя данное изобретение описано подробно с целями иллюстрации, понятно, что такая подробность дается исключительно для такой цели, и варианты могут быть сделаны здесь специалистами в данной области без отклонения от сути и охвата изобретения, которое определено следующими пунктами формулы изобретения.
Claims (14)
1. Способ снижения апоптоза, включающий:
i) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере;
ii) добавление газа в указанный контейнер, так что давление внутри контейнера достигает 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды, где указанный газ представляет собой или включает газ ксенона;
iii) сохранение указанного давления в указанном контейнере в продолжение первого периода времени, в течение которого температура в указанном контейнере равна 22°C-37°C;
iv) после указанного первого периода времени, снижение указанной температуры в контейнере до 0,1°C-10°C с одновременным сохранением указанного давления на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды;
v) сохранение указанного контейнера при указанной более низкой температуре и при давлении на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды в течение второго периода времени, где указанный второй период времени больше, чем указанный первый период времени; и
vi) после указанного второго периода времени, снижение давления в указанном контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры в указанном контейнере до 22°C-37°C.
i) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере;
ii) добавление газа в указанный контейнер, так что давление внутри контейнера достигает 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды, где указанный газ представляет собой или включает газ ксенона;
iii) сохранение указанного давления в указанном контейнере в продолжение первого периода времени, в течение которого температура в указанном контейнере равна 22°C-37°C;
iv) после указанного первого периода времени, снижение указанной температуры в контейнере до 0,1°C-10°C с одновременным сохранением указанного давления на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды;
v) сохранение указанного контейнера при указанной более низкой температуре и при давлении на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды в течение второго периода времени, где указанный второй период времени больше, чем указанный первый период времени; и
vi) после указанного второго периода времени, снижение давления в указанном контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры в указанном контейнере до 22°C-37°C.
2. Способ по п. 1, где указанный первый период времени равен от 15 минут до 24 часов.
3. Способ по п. 1, где указанный второй период времени равен от 2 часов до трех недель.
4. Способ по п. 1, где указанный второй период времени равен по меньшей мере 2 суткам, предпочтительно, по меньшей мере 7 суткам, еще более предпочтительнее, по меньшей мере 14 суткам.
5. Способ по п. 1, где указанное давление в указанном контейнере в течение указанного второго периода времени на 3 атм - 4 атм выше давления окружающей среды.
6. Способ по п. 1, где указанная температура в течение указанного второго периода времени равна 4°C-10°C.
7. Способ по п. 1, где указанное давление постепенно снижают в указанном контейнере после второго периода времени на протяжении третьего периода времени, причем указанный третий период времени составляет вплоть до 60 минут.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный газ представляет собой газ ксенона.
9. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный газ представляет собой смесь газов, которая включает газ ксенона, газ диоксида углерода и газ азота, причем содержание указанного газа ксенона больше, чем содержание указанного газа диоксида углерода и меньше, чем содержание указанного газа азота.
10. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный газ представляет собой смесь газов, которая включает газ ксенона, газ диоксида углерода, причем содержание указанного газа ксенона больше, чем содержание указанного газа диоксида углерода.
11. Способ по любому из пп. 1-7, где указанные клетки представляют собой клетки млекопитающего или клетки человека.
12. Охлажденная композиция, содержащая клетки, образующие ядро, где клетки присутствуют в контейнере и хранятся с помощью способа, определенного в любом из пп. 1-11.
13. Охлажденная композиция, определенная в п. 12, где указанный контейнер содержит газ под давлением, который включает ксенон.
14. Охлажденная композиция, определенная в п. 12 или 13, где указанные клетки представляют собой клетки человека.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161436441P | 2011-02-07 | 2011-02-07 | |
| US61/436,441 | 2011-02-07 | ||
| PCT/US2012/023790 WO2012109107A1 (en) | 2011-02-07 | 2012-02-03 | Method for preserving cells and cell cultures |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013141186A RU2013141186A (ru) | 2015-03-20 |
| RU2583179C2 true RU2583179C2 (ru) | 2016-05-10 |
Family
ID=46638908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013141186/13A RU2583179C2 (ru) | 2011-02-07 | 2012-02-03 | Способ консервации клеток и культур клеток |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10098340B2 (ru) |
| EP (1) | EP2672812A4 (ru) |
| JP (1) | JP6103648B2 (ru) |
| CN (1) | CN103442557B (ru) |
| AR (2) | AR085326A1 (ru) |
| CA (1) | CA2824948C (ru) |
| IL (1) | IL227516B (ru) |
| RU (1) | RU2583179C2 (ru) |
| TW (1) | TWI600764B (ru) |
| WO (1) | WO2012109107A1 (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2012228972A1 (en) | 2011-03-16 | 2013-10-24 | Dynasil Biomedical Corporation | Methods and materials for prolonging useful storage of red blood cell preparations and platelet preparations |
| AR088166A1 (es) | 2011-09-26 | 2014-05-14 | Rich Products Corp | Metodo para la preservacion de tejido vivo |
| US9686978B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-06-27 | Rich Technologies Holding Company, Llc | Platelet concentrate preservation method |
| TWI732357B (zh) | 2018-12-27 | 2021-07-01 | 財團法人工業技術研究院 | 細胞培養裝置及方法 |
| US11629821B1 (en) | 2022-01-19 | 2023-04-18 | Praxair Technology, Inc. | Gas dosing apparatus with directional control valve |
| CN114600872A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-06-10 | 西安北光医学生物技术有限公司 | 一种细胞、组织或器官的抗损伤保存的方法及保存系统 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080031971A1 (en) * | 2003-10-21 | 2008-02-07 | Aga Ab | Use Of Xenon For The Prevention Of Programmed Cell Death |
| US20090081785A1 (en) * | 2007-09-24 | 2009-03-26 | Hememics Biotechnologies, Inc. | Desiccated Biologics And Methods Of Preparing The Same |
| US20100009334A1 (en) * | 2008-07-07 | 2010-01-14 | Ilyin Ilya Y | Method for treatment and storage of platelets |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2051092C (en) * | 1990-09-12 | 2002-07-23 | Stephen A. Livesey | Method and apparatus for cryopreparation, dry stabilization and rehydration of biological suspensions |
| JP3167415B2 (ja) * | 1992-04-30 | 2001-05-21 | オリンパス光学工業株式会社 | 固相免疫検査における抗原細胞の保存方法 |
| US5580714A (en) * | 1995-03-08 | 1996-12-03 | Celox Laboratories, Inc. | Cryopreservation solution |
| DE19910986C2 (de) | 1999-03-11 | 2001-06-07 | Aga Ab | Verwendung von Xenon bei der Behandlung von Neurointoxikationen |
| US20050255169A1 (en) * | 2002-07-05 | 2005-11-17 | Messer Griesheim | Adjuvant containing xenon |
| AU2004285468B2 (en) * | 2003-10-22 | 2011-02-24 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods, compositions and devices for inducing stasis in cells, tissues, organs, and organisms |
| GB0418540D0 (en) * | 2004-08-19 | 2004-09-22 | Protexeon Ltd | Use |
| EP2391205A2 (en) * | 2009-01-30 | 2011-12-07 | L'air Liquide-societe Anonyme Pour L'etude Et L'exploitation Des Procedes Georges Claude | Process for preserving biological materials for extended periods of time |
-
2012
- 2012-02-03 JP JP2013552679A patent/JP6103648B2/ja active Active
- 2012-02-03 WO PCT/US2012/023790 patent/WO2012109107A1/en active Application Filing
- 2012-02-03 US US13/982,766 patent/US10098340B2/en active Active
- 2012-02-03 RU RU2013141186/13A patent/RU2583179C2/ru active
- 2012-02-03 CA CA2824948A patent/CA2824948C/en active Active
- 2012-02-03 CN CN201280008033.XA patent/CN103442557B/zh active Active
- 2012-02-03 EP EP12744773.8A patent/EP2672812A4/en not_active Ceased
- 2012-02-07 TW TW101103948A patent/TWI600764B/zh active
- 2012-02-07 AR ARP120100400A patent/AR085326A1/es active IP Right Grant
-
2013
- 2013-07-17 IL IL227516A patent/IL227516B/en active IP Right Grant
-
2022
- 2022-02-14 AR ARP220100286A patent/AR124865A2/es unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080031971A1 (en) * | 2003-10-21 | 2008-02-07 | Aga Ab | Use Of Xenon For The Prevention Of Programmed Cell Death |
| US20090081785A1 (en) * | 2007-09-24 | 2009-03-26 | Hememics Biotechnologies, Inc. | Desiccated Biologics And Methods Of Preparing The Same |
| US20100009334A1 (en) * | 2008-07-07 | 2010-01-14 | Ilyin Ilya Y | Method for treatment and storage of platelets |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6103648B2 (ja) | 2017-03-29 |
| CA2824948A1 (en) | 2012-08-16 |
| WO2012109107A1 (en) | 2012-08-16 |
| TWI600764B (zh) | 2017-10-01 |
| CN103442557B (zh) | 2016-05-25 |
| TW201237168A (en) | 2012-09-16 |
| US20130344596A1 (en) | 2013-12-26 |
| IL227516A0 (en) | 2013-09-30 |
| EP2672812A4 (en) | 2014-09-03 |
| JP2014504510A (ja) | 2014-02-24 |
| CN103442557A (zh) | 2013-12-11 |
| RU2013141186A (ru) | 2015-03-20 |
| CA2824948C (en) | 2020-06-02 |
| EP2672812A1 (en) | 2013-12-18 |
| US10098340B2 (en) | 2018-10-16 |
| AR124865A2 (es) | 2023-05-10 |
| IL227516B (en) | 2018-11-29 |
| AR085326A1 (es) | 2013-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2583179C2 (ru) | Способ консервации клеток и культур клеток | |
| KR100779812B1 (ko) | 비-조혈 조직으로부터의 비-배아세포의 보존 | |
| Veeck | Does the developmental stage at freeze impact on clinical results post-thaw? | |
| Camboni et al. | Alginate beads as a tool to handle, cryopreserve and culture isolated human primordial/primary follicles | |
| Gouk et al. | Cryopreservation of mouse testicular tissue: prospect for harvesting spermatogonial stem cells for fertility preservation | |
| AU2002326901A1 (en) | Preservation of non embryonic cells from non hematopoietic tissues | |
| EP2984928A1 (en) | Biological sample vitrification carrier and usage thereof | |
| EP3742898A2 (en) | Device and method for freeze drying biological samples | |
| Alcay et al. | Effects of low molecular weight cryoprotectants on the post-thaw ram sperm quality and fertilizing ability | |
| Silvestre et al. | Rabbit and pig ear skin sample cryobanking: effects of storage time and temperature of the whole ear extirpated immediately after death | |
| Oliva et al. | Vitrification and storage of oral mucosa epithelial cell sheets | |
| Zhurova et al. | Intracellular ice formation in confluent monolayers of human dental stem cells and membrane damage | |
| CN108812642A (zh) | 一种依结构层次制备胎盘组织及冻存的系统方法和应用 | |
| US20210087532A1 (en) | Compositions and method for establishing organoid cultures from cryogenically preserved tissue | |
| Hu et al. | Liquid nitrogen vapor is comparable to liquid nitrogen for storage of cryopreserved human sperm: evidence from the characteristics of post-thaw human sperm | |
| Maltaris et al. | Simple prediction of the survival of follicles in cryopreserved human ovarian tissue | |
| Tsuribe et al. | Viability of primordial follicles derived from cryopreserved ovine ovarian cortex tissue | |
| EP3035798A1 (en) | Boron added cell cryopreservation medium | |
| Wiweko et al. | Ovarian tissue vitrification as a method for fertility preservation: A study of follicle number and morphology after vitrification | |
| RUKHLIADA et al. | Method of hyperbaric cryopreservation of ovarian tissue in xenon | |
| RU2158759C2 (ru) | Способ хранения клеточных культур в суспензии | |
| Saxe et al. | General cell culture principles and fibroblast culture | |
| Sugishita et al. | Methods of ovarian tissue cryopreservation: vitrification | |
| TWI836467B (zh) | 冷凍保存劑及其用途 | |
| WO2024015037A2 (en) | Compositions, methods, and associated devices for cryopreservation of biological specimens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |