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KR100779812B1 - 비-조혈 조직으로부터의 비-배아세포의 보존 - Google Patents

비-조혈 조직으로부터의 비-배아세포의 보존 Download PDF

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KR100779812B1
KR100779812B1 KR1020047003710A KR20047003710A KR100779812B1 KR 100779812 B1 KR100779812 B1 KR 100779812B1 KR 1020047003710 A KR1020047003710 A KR 1020047003710A KR 20047003710 A KR20047003710 A KR 20047003710A KR 100779812 B1 KR100779812 B1 KR 100779812B1
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cell
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존 케이. 프래서
마크 에이치. 헤드릭
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사이토리 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 냉동보존된, 지방 조직에서 유래된 줄기 세포 및 선조 세포를 함유하는 집단, 상기 세포 집단의 회수 및 저장 방법, 및 해동시 상기 집단의 치료학적 용도에 관한 것이다. 또한, 포유류 환자에서 나중의 치료학적, 구조적 또는 미용적 사용을 위해 지방 조직으로부터 추출되고 보존될 수 있는 연결 조직 기질 물질에 관한 것이다.
지방 조직, 줄기 세포, 선조 세포, 연결 조직 기질, 냉동보존

Description

비-조혈 조직으로부터의 비-배아세포의 보존{PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES}
본 출원은 2001년 9월 14일 출원된 미국 가특허 출원 제60/322,070호의 이익을 주장한다.
본 발명은 지방 조직에서 유래된 세포 집단, 특히 후속 사용을 위해 냉동보존된 지방 조직에서 유래된 줄기 세포 및 선조(progenitor) 세포, 및 상기 냉동보존된 세포의 치료학적 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 지방 조직으로부터 추출된 연결 조직 기질 물질의 처치 및 저장, 및 저장 후 상기 물질의 치료학적 및 미용적 사용에 관한 것이다. 상기 세포 집단 및 기질 물질은 다양한 질병 및 질환을 갖는 환자에서 치료학적, 구조적 및(또는) 미용적 처리를 위해 사용될 수 있다. 바람직한 태양에서, 냉동보존되고 해동된 세포는 자가(자기) 복구, 재구성, 재건 및 진단적 응용에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 줄기 및 선조 세포 및 연결 조직의 수집, 처리 및 냉동보존 방법에 관한 것이다. 인간에서의 사용을 위해 우선적으로 의도되나, 상기 방법 및 회수되고 보존된 물질들은 수의학에 사용될 수도 있고, 다른 포유류에 적용가능하다.
조직 공학
조직 공학은 생물학적 조직의 빌딩 블록을 손상되거나 결손된 신체 구조 또는 기관을 재생, 복구 또는 재건하는데 사용하는 기술에 통상적으로 적용되는 용어이다. 예를 들면, 심장 마비는 성장하는 새로운 심장 조직에 의해 치료될 수 있거나, 서서히 치유되는 뼈 골절은 뼈 생성 세포의 적용에 의해 치료될 수 있다.
조직 공학의 핵심 빌딩 블록은 (1) 세포, 바람직하게는, 사용자 정의된 방식으로 많은 상이한 조직을 다량 생성할 수 있는 높은 증식 및 분화력을 갖는 세포, (2) 조직이 발달하는 입체 구조를 제공하는, 천연, 인공 또는 복합 물질인 골격, 및 (3) 세포가 상기 골격을 사용하여 신규 또는 복구된 조직을 생성하게 하는 성장 인자 및 화학 약물이다.
본 발명의 목적은 지방 조직의 추출, 지방 조직에서 목적하는 성분의 분리, 및 상기 처음 2개의 빌딩 블록 범위 내의 물질, 즉, 줄기 및 선조 세포, 및 천연 골격인 연결 조직 기질 물질을 함유하는 지방 조직에서 유래된 세포 집단의 저장이다.
배경
줄기 세포 및 선조 세포
줄기 세포는 인체의 지배 세포이다(Blau HM, TR Brazelton and JM Weimann "The Evolving Concept of a Stem Cell: Entity Or Function?" Cell, 105, p829-841, (2001)). 배로부터의 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포(ESCs)는 전부는 아니더라도 인체의 다수의 세포 및 조직 유형이 되는 것으로 알려져 있다. 초기 태아 세포로도 지칭되는 상기 ESCs는 개체의 모든 유전 정보를 함유할 뿐만 아니라, 인 체의 200+ 상이한 세포 및 조직 중 임의의 것으로 될 수 있는 발생기의 능력을 함유한다. 진행중인 연구는 상기 세포가 거대한 과학적 및 임상적 잠재력을 가지고 있다는 것을 암시한다(Weissman IL "Translating Stem And Progenitor Cell Biology To The Clinic: Barriers And Opportunities" Science 287, p1442-1446, (2000)).
그러나, ESCs는 그의 사용에 이론적 한계를 갖는다. 임상적으로 사용될 경우, 이들은 반드시 한 개체의 배아 형태로부터 유래될 것이다. 상기 개체에서 유래된 줄기 세포 또는 조직이 또 다른 사람에게 이식될 때, 거부반응을 방지하기 위해 세포 수여자는 독성의 면역 억제 약물을 필요로 할 수 있다. 게다가, 어떤 개체로부터의 세포는 바이러스 또는 기타 드물지만 중요한 질병을 수여자에게 전달할 수 있다. 또한, ESC류 세포(예, 기형종)는 종양을 형성하는 것으로 알려져 있다. 환자에서의 사용을 위해 개발된 ESCs로부터 발달된 임의의 조직은 종양을 나타내어서는 안되고, 조직의 성장, 성장 정지 또는 치유를 지시하는 정상 신호에 반응할 수 있는 선천적인 능력을 가져야 한다.
최근, 비-배아 또는 '성숙' 줄기 세포가 확인되었고, ESCs의 임상적 사용에 대한 중요한 잠재적 대안이다(Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R. Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, and Marshak DR "Multilieage Potential Of Adult Human Mesenchymal Stem Cells, Science, 284, p143-147, (1999); Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP and Hedrick MH "Multilineage Cells From Human Adipose Tissue: Implications For Cell-Based Therapies", Tissue Eng 7, p211-218, (2001)). 상기 세포는, 이들이 손상된 조직을 치유할 수 있도록 아마도 외상 또는기타 파괴적 질병 과정에 반응하기를 기다리면서, 전부는 아니더라도 다수의 조직에 조용히 거주한다. 최근의 과학적 증거는, 각 개체가 전부는 아니더라도 다수의 세포 및 조직으로 될 수 있는 ESC의 능력을 공유할 수 있는 줄기 세포 풀(pool)을 갖는다는 것을 암시한다.
선조 세포는 줄기 세포와 성숙 세포 사이의 중간 집단이다. 이들은 대개 복수 개의 성숙 세포 유형을 생산할 수 있는 능력으로 일반적으로 더 제한되며, 정의에 의해, 이들은 증식 능력 및 제한되거나 존재하지 않는 자기-부활 능력으로 상당히 더 제한된다. 선조 세포의 예는 조혈 시스템의 CFU-GM 및 BFU-E 세포, 및 전구-지방세포, 및 중간엽 시스템의 전구-골모세포를 포함한다.
조직 공학을 위한 세포의 근원으로서의 지방 조직
최근, 지방 조직은 치료적 응용에 적합한 줄기 세포, 선조 세포 및 기질 물질의 근원인 것으로 밝혀졌다(Zuk et al, ibid; Huang, JI, SR Beanes, Zhu M, HP Lorenz, Hedrick MH and Benhaim P "Rat extramedullary adipose tissue as a source of osteochondrogenic progenitor cells" Plast Reconstr Surg. 109: p1033-1041, discussion, p1042-1043, (2002); Mizuno H, Zuk PA, Zhu M, Lorenz HP, Benhaim P and Hedrick MH "Myogenic Differentiation by Human Processed Lipoaspirate Cells. Plast Reconstr Surg. 109: p199-209; discussion 210-1 (2000)). 지방 조직은 또한, 혈관 내피 세포의 풍부한 근원이며(Kern PA, Knedler A and Eckel RH "Isolation And Culture Of Microvascular Endothelium From Human Adipose Tissue" J Clin Invest 71, p1822-1829, (1983)), 상기 혈관 내피 세포는 신 혈관의 성장을 촉진하고 줄기 및 선조 세포 성장을 자극함으로써 조직 재생 및 조직 공학에서 역할을 할 수 있다(Hutley LJ, Herington AC, Shurety W, Cheung C, Vesey DA, Cameron DP and Prins JB "Human Adipose Tissue Endothelial Cells Promote Preadipocyte Proliferation" Am J Physiol Endocrinol Metab, 281, p1037-1044, (2001)). 다른 조직 유형은 상기 세포를 함유하나, 어떠한 다른 조직도 그렇게 적은 사망률로 사람으로부터 상당량 추출될 수 없다. 흡입 보조의 지방성형(지방흡입)은 인체의 미학적 재건을 위해 매우 흔히 행해지는 처리이다. 미국 미학적 성형 수술 협회(American Society for Aesthetic Plastic Surgery)는 2001년 동안 미국에서 385,000건이 넘는 지방흡입술이 행해졌다고 보고한다. 현재, 지방흡입 및 지방 조직의 제거를 위한 기타 절차 후 얻어진 조직을 폐기 및 파괴하는 것이 일반적으로 행해지고 있다.
지방 조직에서 유래된 줄기 및 선조 세포 집단은 다수의 세포 유형으로 분화될 수 있는 것으로 나타났다(Zuk et al, ibid; Huang et al, ibid; Mizuno et al, ibid). 가장 중요하게도, 중배엽 기원의 세포 계대로의 분화가 이 분화 능력을 가장 잘 특성화하지만, 내배엽 및 외배엽 계대로의 분화에 대한 증거가 존재한다. 인체의 모든 세포가 중배엽, 내배엽 또는 외배엽에서 유래하므로, 상기 데이타는 지방 조직에서 유래된 줄기 및 선조 세포가 인체의 임의의 세포로 발달될 수 있는 잠재력, 따라서 막대한 치료적 잠재력을 갖는다는 것을 암시한다(WO00/53795, 2000 년 9월 14일 공개). 예를 들면, 뼈, 연골, 근육 및 지방은 중배엽에서 유래되고, 신경 및 피부 세포는 외배엽에서 유래되고, 이자 및 장과 같은 다양한 기관은 내배엽 세포로 치료될 수 있다. 이러한 잠재적인 분화전능성 분화력 이외에, 상기 세포는 상당한 증식력을 가져서, 다수의 계대(주기)에 걸쳐 시험관내 배양될 수 있다. 이러한 쌍을 이루는 능력(분화 및 증식)으로 인해, 지방 조직에서 유래된 줄기 및 선조 세포는 조직 공학 및 유전자 의학에서 중요하다.
그러나, 줄기 세포의 유용성은 조직 공학에 한정되지 않는다. 따라서, 줄기 세포의 증식 및 분화력은 줄기 세포의 자손이 유전자/유전자 산물 전달 비히클로서 사용되는 유전자 전달 및 유전자 요법 접근법에 이용된다.
세포 냉동보존
개별 세포, 세포 펠렛 또는 세포 현탁액이 동결되고 세포 내부 및 외부의 유체가 얼면서, 국소 용질 농도의 변동 및 세포 내부 및 주위에서 얼음 결정의 형성으로 인해 세포가 손상될 기회가 다수 존재한다(Karlsson JO and Toner M, "Long-Term Storage Of Tissues By Cryopreservation: Critical Issues" Biomaterials 17, p243-256, (1996)). 상기 사건의 부정적 효과가 동결방지제의 사용 및 냉각 속도의 조절에 의해 최소화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일정 동결방지제는 세포벽을 침투하여 유해할 수 있는 농도 차이를 감소시킴으로써 작용한다. 유사하게, 세포가 서서히 냉각될 때, 물 유출 속도가 세포내 얼음 형성 동안 세포 탈수를 촉진하는 과도한 초냉각을 방지하기에 충분히 높다. 상이한 냉각 속도가 상이한 세트에 사용되었고, 일부 프로토콜은 수학적 모델을 사용하여 다단계 냉각 공정의 사 용을 지지한다. 또한, 다수의 상이한 동결방지제가 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌에 기재되었다(Pegg D E "The Current Status Of Tissue Cryopreservation", Cryo Letters 22, p105, (2001); Karlsson JO and Toner M., ibid; Rowley SD "Hematopoietic Stem Cell Cryopreservation: A Review of Current Techniques" J Hematother. 1, p233, (1992)).
비-조혈 인간 줄기 및 선조 세포의 냉동보존에 대한 공개된 내력은 발견되지 않았으나, 백혈병 및 일정 유전 질환의 치료에서 조혈 줄기 세포(통상의 골수 이식의 임상적 효능을 담당하는 세포)의 증명된 임상적 효능은 다수의 연구가 조혈 세포의 냉동보존의 최적화를 지향하게 하였다. 2개의 연구는 15년 이하의 냉동보존 기간 후 해동된 제대혈로부터의 상기 세포의 회복을 조사하였다(Mugishima H, Harada K, Chin M, Suzuki T, Takagi K, Hayakawa S, Sato K, Klein JP and Gale RP "Effects Of Long-Term Cryopreservation On Hematopoietic Progenitor Cells In Umbilical Cord Blood", Bone Marrow Transplant 23, P395-396, (1999); Kobylka P, Ivanyi P, and Breur-Vriesendorp BS "Preservation of Immunological and Colony-forming Capacities of Long-Term (15 years) cryopreserved Cord Blood Cells" Transplantation 65, p1275, (1998)). 레(Re) 등에 의한 또 다른 연구는 7년 이상 동안 저장된 냉동보존된 골수 줄기 세포의 임상적 효능을 보여주었다(Re A, Vijayaraghavan K, Basade MM, He S, and Gulati SC "Long-Term Cryopreservation: Successful Trilineage Engraftment After Autologous Bone Marrow Transplantation With Bone Marrow Cryopreserved For Seven Years", J Hematother 7, p185, (1998)).
따라서, 골수 및 혈액에서 유래된 조혈 줄기 세포의 냉동보존은 잘 확립되어 있다. 최근, 대규모 제대혈 줄기 세포 은행이 설립되었고, 현재 전 세계적으로 몇 개의 사설 제대혈 은행 및 수 십개의 공립 비연관 공여자 재대혈 은행이 있다. 미국 특허 제5,004,681호 및 제5,192,553호는 제대혈 줄기 세포 뱅킹(banking)을 기재하고 있다.
줄기 및 선조 세포 냉동보존
인체의 모든 세포 집단과 같이, 지방 조직에서 유래된 줄기 및 선조 세포도노화한다(D'Ippolito G, Schiller PC, Ricordi C, Roos BA, and Howard GA "Age-Related Osteogenic Potential Of Mesenchymal Stromal Stem Cells From Human Vertebral Bone Marrow", J Bone Miner Res 14, p1115-1122, (1999); Muschler GF, Nitto H, Boehm CA, and Easley KA "Age- and Gender-Related Changes In The Cellularity Of Human Bone Marrow And The Prevalence Of Osteoblastic Progenitors", J Orthop Res 19, p117-125, (2001); O'Driscoll SW, Saris D.B., Ito Y, and Fitzimmons JS "The Chondrogenic Potential Of Periosteum Decreases With Age" J Orthop Res 19, p95-103, (2001); Long MW, Ashcraft EK, Normalle D, and Mann KG "Age-Related Phenotypic Alterations In Populations Of Purified Human Bone Precursor Cells" J Gerontol A Biol Sci Med Sci 54, pB54, (1999); Mueller SM and Glowacki J "Age-Related Decline In The Osteogenic Potential Of Human Bone Marrow Cells Cultured In Three-Dimensional Collagen Sponges" J Cell Biochem 82, p583-590, (2001)). 세포 노화는 세포 기능의 감소와 관련되어 있다. 이들 세포의 냉동보존은 세포가 생기를 보유하도록 한다. 특히, 냉동저장에 일반적으로 사용되는 온도(-196℃)에서, 화학 반응에 불충분한 에너지가 존재하고, 따라서, 대사, 세포 분할 및 노화를 위한 에너지가 존재하지 않는다. 이론적으로, 무한의 복사 에너지만이 냉동보존된 세포의 손상 또는 상해 원이다(Karlsson, et al, ibid). 따라서, 개체는 젊었을 때 자신의 줄기 세포를 냉동보존하여, 인체에 남아있는 줄기 세포가 더 나이들어 기능이 저하되는 노년에의 잠재적 사용을 위한 더 젊은 세포 공급원을 확보하는 합리적인 선택을 할 수 있다. 노화 이외에도, 인체 외부에 줄기 세포를 저장하는 것을 합리화하는 다른 상해가 존재한다. 예를 들면, 통상의 암 화학요법 및 방사선요법이 줄기 세포의 기능에 부정적인 영향을 미치고, 줄기 세포에 대한 상기 치료의 유해한 효과는 요법의 일부 부작용과 관련될 수 있다는 다수의 증거가 존재한다(Kashyap, et al, "Effects Of Allogencic Bone Marrow Transplantation On Recipient Bone Mineral Density: A Prospective Study", Biol Blood Marrow Transplant 6, p344, (2000); Banfi A, Podesta M, Fazzuoli L, Sertoli M.R., Venturini M, Santini G, Cancedda R, and Quarto R "High-Dose Chemotherapy Shows A Dose-Dependent Toxicity To Bone Marrow Osteoprogenitors: A mechanism for Post-bone Marrow Transplantation Osteopenia", Cancer 92, P2419, (2001); Galotto M, Berisso G, Delfino L, Podesta M, Ottaggio L, Dallorso S, Dufour C, Ferrara G.B., Abbondandolo A, Dini G, Bacigalupo A, Cancedda R, and Quarto R "Stromal Damage As Consequence Of High-Dose Chemo/Radiotherapy In Bone Marrow Transplant Recipients", Exp Hematol 207, P1460, (1999)). 따라서, 상기 절차를 거칠 환자는 세포가 화학요법 또는 방사선요법의 영향을 받지 않도록 줄기 및 선조 세포를 추출하여 저장하는 합리적인 선택을 할 수 있다.
지방 조직에서 유래된 연결 조직 기질 물질
지방 조직은 풍부한 혈액이 공급되는 성숙 지방세포 및 기타 세포 집단의 느순한 응집체이며, 복잡한 연결 조직 기질에 의해 상호 고정되어 있다. 이 기질은 주로 핵심 구조 단백질인 콜라겐으로 이루어져 있다. 이것은 세포가 재구성된 기관에서 성장하게 하는 골격으로서 조직의 재건에, 또는 조직 손상의 복구에 중요하다.
발명의 요약
줄기 및 선조 세포를 포함하는 지방 조직에서 유래된 세포 집단을 단리하고, 해동시 상기 세포의 치료적 사용을 위해 냉동보존한다. 또한, 지방 조직에서 유래된 연결 조직 기질 물질을 추출하고, 나중의 치료적 사용을 위해 저장할 수 있다.
특히, 본 발명은 냉동보존된 지방 조직에서 유래된 줄기 세포, 선조 세포 함유 집단 및 기질 물질의 단리, 보존, 및 복구, 재구성 및(또는) 재건을 위한 치료학적, 구조적 또는 미용적 응용분야에서 치료학적 사용에 관한 것이다. 유전자 요법에서 대체 또는 신규 유전자 서열을 전달하는데 사용하기 위한 이종 유전자 서열을 함유하는 줄기 및 선조 세포도 고려된다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 냉동보존되고 해동된 세포는 자가(자기) 재구 성에 사용될 수 있다. 더 바람직한 태양에서, 연결 조직 기질 물질이 자가(자기) 또는 동종이계(비-자기) 복구 및 재건에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 연결 조직 기질 및 줄기 및 선조 세포 함유 집단의 수집, 처리 및 냉동보존 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 유일한 조성물, 즉, 본원에 기재된 처리 및 방법에 의해 단리된 세포 집단 및 기질 물질에 관한 것이다.
도 1은 외부의 일부를 잘라낸 깡통을 갖는 지방 조직의 수집에 사용하기 위한 수집 장치의 개략도임.
도 2는 도 1의 외부의 일부를 잘라낸 깡통 도면임.
도 3은 본원의 방법에 따라 냉동보존되고 해동된 후 지방 조직에서 유래된 세포 집단으로부터의 배양에서 형성된 연골세포의 현미경사진(100배 확대)임. (본 영상에서 암회색으로 보이는 알시안 블루(Alcian Blue; 연골 유형의 세포를 염색하는데 사용되는 표준 시약)로 염색함).
도 4는 본 발명에 따라 처리되고 저장된 후 해동되고 랫트 심장에 이식된 랫트 지방 조직에서 유래된 세포의 현미경 사진(400배 확대)임 (이식 후 5일에 동물을 희생시킴). 이식된 세포 집단을 화살표로 표시함.
도 5는 본 발명에 따라 처리되고 저장된 후 해동되고 면역결핍 마우스의 방광에 이식된 인간 지방 조직에서 유래된 세포의 현미경 사진(400배 확대)임. 동물을 이식 후 30일에 희생시킴. 이식 전에 세포를 브로모데옥시우리딘으로 표지함. 표지된 세포는 본 영상에서 암회색/흑색 핵으로 나타나고, 그 예를 화살표로 강조함.
도 6은 본 발명에 따라 제조되고 저장된 지방 조직에서 유래된 기질의 골격에서 성장하는 인간 지방 조직에서 유래된 세포의 현미경 사진(400배 확대)임. 지방을 충분히 함유하는 성숙 지방세포를 화살표로 강조함.
본 발명은 지방 조직에서 유래된 냉동보존된 줄기 및 선조 세포 함유 집단, 해동시 상기 세포의 치료학적 사용, 및 상기 물질을 얻기 위한 방법 및 처리에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 지방 조직에서 유래된 연결 조직 기질 물질, 및 상기 물질의 추출, 보존 및 저장에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 지방조직에서 유래된 줄기 및 선조 세포를 함유하는 집단, 및 연결 조직 기질의 나중 사용을 위한 수집, 처리 및 저장에 관한 것이다. 상기 과정은 지방조직에서 유래된 세포 및 물질의 뱅킹으로 통칭된다. 바람직한 실시태양은 줄기 및(또는) 선조 세포를 인체의 특정 부위로 전신 또는 국소 전달함으로써 치료가능한 질병을 갖는 것으로 진단된, 세포 및 물질이 원래 유래되었던 개체에서 이 산물들의 저장-후 사용에 관한 것이다. 이 실시태양은 지방조직에서 유래된 줄기 및 선조 세포를 함유하는 집단, 및(또는) 연결 조직 기질의 자가 뱅킹 및 이식으로 기재될 수 있다.
줄기 세포의 수 및 역량이 노화에 따라 감소한다는 것이 이제 증명되었다. 따라서, 개체들은, 그들이 나이가 들면서 이들을 필요로 할 경우 그들에게 이용가 능한 저장된, 살아있는 젊은 줄기 세포원을 갖도록, 비교적 젊었을 때 자신의 줄기 세포 및 관련 산물들을 뱅킹하는 것이 합리적이다. 줄기 세포 또는 선조 세포의 전달이 의학적으로 유익할 수 있는 다양한 질환은 골다공증, 심근경색, 뼈 골절, 사고 또는 관절염을 통한 연골 손상, 신경학적 손상 또는 질환, 및 미학적 또는 외상 관련 성형 수술을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 줄기 세포 및(또는) 선조 세포의 전달이 유익한 다수의 질병이 존재하고, 이의 새로운 응용분야가 매일 발견되고 있으므로, 상기 목록은 본 발명의 유용성을 제한하는 것이 아니다. 뱅킹된 세포의 이점은 자가(자기) 세포로서 이들은 수혈 또는 이식 관련 질병의 도입 위험이 없으며, 동종이계 세포(다른 사람에 의해 공여된 세포)에 대한 중요 위험인자인 거부 또는 이식편 대 숙주 질병 위험이 없다는 사실을 포함한다. 또한, 조혈 줄기 세포(골수, 말초 또는 제대혈에서 유래된, 혈액 세포를 만드는 줄기 세포)의 연구에서, 다른 사람에서 유래된 세포보다 자가 세포의 사용이 상당히 더 유효하며, 조혈 재구성(기능성 혈액 세포 집단의 발달)에 몇 배나 더 적은 세포가 요구된다.
세포 회수, 단리 및 보존 방법은 다음 단계의 일부 또는 전부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: (a) 지방 조직의 수집; (b) 수집 부위에서 조직의 포장; (c) 조직의 처리 시설(은행)로의 운송; (d) 줄기 및 선조 세포를 함유하는 집단의 추출 및 세포 연결 조직 기질 물질의 단리를 위한 지방 조직의 처리; (e) 세포 및 기질 물질의 검사 및 시험; (f) 저장; (g) 저장된 상태로부터 세포 및 기질 물질의 회복; (h) 임상 요법을 위해 회복된 세포 및 기질 물질의 조사; (i) 세포의 임의적 생체외 조작; (j) 모든 은행 업무의 효능 및 품질을 최대화하도록 기능하는 품질 시스템; 및 (k) 인간 세포계 및 조직의 복구, 재구성 및 재건에의 치료적 사용. 당업자는 상기 단계의 수행 순서가 달라질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 실시는 조직 뱅킹의 일반적 방향에 속하고, 따라서, 그 실시는 상기 문제를 다루는 전문 단체, 예를 들면, 미국 조직 은행 연합(the American Association of Tissue Banks) 및 미국 혈액 은행 연합(the American Association of Blood Banks)의 요건에 따라야 한다. 미국 FDA와 같은 정부 기관도 본원에 제시된 처리 및 사용에 적용가능한 기준을 요구할 수 있다. 그러나, 본 발명의 신규성에 비추어, 현재 존재하는 어떠한 기준도 직접 적용될 수 없다.
지방 조직의 수집
지방 조직은 본 발명에 의해 고려되는 줄기 및 선조 세포를 함유하는 집단 및 연결 조직 기질 물질(바람직한 목적 성분)의 근원이다. 그러나, 잔류 부분에 존재하는 지방 조직의 다른 성분(폐기가능한 성분)도 의학적 중요성을 가질 수 있고, 다른 용도에 사용될 수 있다. 지방 조직은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들면, 지방 조직은 미학적 신체 재건 목적으로 수행되는 것과 같은 다양한 통상의 지방흡입 절차 중에 수집될 수 있다. 지방 조직은 뱅킹을 위한 지방 조직의 수집을 위해 고안되고 이 목적 전용의 장치 내로 수집될 수 있거나, 또는 지방흡입 절차를 수행하는 개인에 의해 지방흡입물의 수집을 위해 사용되는 통상의 장치내로 수집될 수 있다.
줄기 세포의 수집을 위해 본원에 기재된 방법은 골수, 피부 또는 골격과 같은 근원을 사용하는 다른 방법보다 우수하다. 이것은 폐쇄된 시스템에서 수행될 수 있고, 상술한 바와 같이, 지방흡입은 골수 채취 또는 피부 및 근육 생검과 관련된 부작용없이 훨씬 다량의 조직을 얻는다.
또한, 지방 조직은 피부 및 관련된 지방 조직의 외과적 절개와 함께 수집될 수 있다. 그 예는 터미 턱(tummy tuck), 지방절제술 또는 다른 외과적 절차에 부수하여 일어나는 것을 포함한다.
지방 조직의 수집은 바람직하게는 무균 조건 하에서 이루어진다. 수집 즉시, 지방 조직 및(또는) 수집 장치를 밀봉하고 처리 시설로 운송해야 한다. 어떤 경우에는 수집 시설 및 처리 시설이 근접해 있어, 간단한 밀봉 및 한 영역에서 다른 영역으로의 산물의 운송이 가능할 것으로 기대된다.
수집된 지방 조직의 양
흡입된 지방 조직은 다양한 양의 줄기 세포, 선조 세포, 기질 물질, 혈액, 혈청, 지질, 지방세포, 혈관 내피 세포, 혈관 평활근 세포 및 혈관 주위 세포를 함유한다(Hausman G.J. and R.L. Richardson "Cellular And Vascular Development In Immature Rat Adipose Tissue" J Lipid Res 24, p522-532 (1983); Greenwood M.H., "Adipose Tissue: Cellular Morphology And Development" Ann Intern Med 103, p996-999, (1985); Kern, et al, ibid).
제1 태양에서, 약 400g 이상의 지방 조직이 얻어진다. 실제 경험에 따르면, 400g의 지방 조직은 약 1 억개의 핵생성된 세포를 생성한다. 그러나, 어떤 조건에 서는 더 적거나 많은 양의 지방 조직이 허용될 수 있다. 예를 들면, 비만이거나 과체중의 개체로부터는 마른 사람보다 더 많은 양의 조직을 채취하는 것이 허용되거나 바람직할 수 있다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 정상 체중 지수의 사람보다 비만인 사람으로부터 더 많은 조직이 얻어질 수 있으나, 통상의 지방성형 절차로부터 얻어진 지방 세포가 고갈된 산물의 총 세포 수율은 크게 다르지 않다. 이는 마른 사람이 지방 조직 그램 당 더 많은 비-지방세포를 갖기 때문이다.
상기 관찰의 한 결과는 본 발명의 용도가 지방 조직이 추출된 개체의 체중 지수에 의해 제한되지 않는다는 것이다.
게다가, 지방 조직에서 유래된 줄기 세포 및 선조 세포는, 냉동보존 전후, 배양되어 증식됨으로써 치료에 이용가능한 세포 수를 상당히 증가시킬 수 있다.
체중 지수의 조직 및 세포 수율에 대한 영향
체중 지수 얻어진 조직의 양 (g) 총 세포 수율 (x 107)
정상 641 ±142 2.1 ±0.4
비만 1,225 ±173 2.4 ±0.5
p 값 0.03 0.6

한 예시적 수집 절차에서, 무균 용기에 포장된 수집 장치가 사용될 수 있다. 한 특정 태양에서, 수집 키트(10)는 유리 지질, 지질성형에 사용된 용액 및 혈액을 흘려보내나 지방 조직 단편을 수집 장치의 세포 수집부(15)에 보유시키는 의학 등급 필터(14) 물질을 함유하고 의학 등급 물질로 이루어진 무균 수집 깡통(12)으로 이루어질 수 있다. 깡통(12)은 필터(14) 물질 한 측면의 흡입 근원에 부착된 관(18)의 연결을 위한 포트(16), 및 구부러지기 쉬운 관(22)에 의해 일회 사용의 폐기가능한 무균 지방흡입 캐뉼러(24)에 연결된 제2 포트(20)을 갖는다. 깡통(12)은 다른 포트(26, 28) 및 연결 수단(30, 32)을 함유하여, 조직 처리 중에 사용된 것과 같은 물질의 진입 및 배출을 허용할 수도 있다. 장치는 또한, 혈액 수집 백(bag)에 부착된 라벨과 비슷한 라벨을 부착하여, 접착성 라벨-기재의, 문자로 된 조직 수집에 관한 정보(예, 공여자 확인사항, 날짜, 시간)를 부가할 것이다. 깡통(12)은 필터에 의해 보유된 조직의 양을 측정하기 위한 수단 또는 표시(나타내지 않음)를 가질 수도 있다. 클램프 또는 밸브(34)가 관(18, 22)에 부착되거나, 유체 또는 사용된 체적량의 흐름을 조절하기 위해 임의의 다양한 관 또는 접근 포트(16, 20, 26, 28, 30, 32)에 포함될 수 있다.
약 90% 이상의 줄기 세포 및 선조 세포를 보유하기에 적당한 전형적인 필터 물질은 두께가 200 ㎛이고, 공극 크기가 265 ㎛이며 47%가 개방 영역인 폴리에스테르 메쉬이다.
사용전 깡통 및 부착된 성분의 무균은 베타- 또는 감마-조사, 증기 무균기에서 적당한 물질의 오토클레이빙, ETO 노출 등을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 바람직한 태양에서, 무균은 FDA 및 기타 통제 기관에 의해 요구되는 것과 같은 소정의 요건에 따른 무균성을 제공하는 것으로 확인된 용량의 감마-조사에 의해 수행된다.
수집 키트(10)는 바로 사용할 수 있게 하기 위해, 지방흡입 전에 수술실에 놓여질 수 있다.
다수의 대안적인 성분, 물질 및 장치가 당업자에게 인식될 것이고, 상기 태양은 단지 예로서만 제공되며, 본 발명 및 본 개시에 포함된 청구범위의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 미학적 신체 재건을 위해 자격을 갖춘 의사에 의해 수행된 흡입 보조의 지방성형(지방흡입)은 지방 조직의 바람직한 근원이다. 이 절차는 통상 100g을 넘는 지방흡입물을 생성하나, 본 발명 하에 처리되고 저장될 수 있는 조직의 양에 대한 상한 또는 하한치는 없다. 동력 보조의 지방성형 및 초음파 보조의 지방성형과 같은 다른 지방성형 기술도 지방 조직을 수집하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 단독으로 또는 배성형술과 같은 대수술과 관련하여 지방절제술(지방 조직의 외과적 절개)를 사용하는 기술은 본 발명의 범위 내이다.
지방흡입 절차를 위해 환자를 처치한 후, 수집 장치가 지방흡입 펌프에 부착되고, 캐뉼러가 의사의 관례에 따라 공여자에 삽입된다.
보통의 무균 조치를 유지하면서, 절차가 끝날 때까지 또는 수집 장치가 가득 찰 때까지 지방흡입 절차를 수행한다. 이어서, 수집 장치(10)을 밀봉하여, 조직을 함유하는 내부 구획의 무균성을 유지한다. 상술한 수집 장치의 조작에 대한 구체적인 지시에 따라 연결된 관을 가지거나 가지지 않은 수집 깡통을 진공 펌프로부터 분리하고 처리 시설로 운송할 수 있다.
수집 시스템의 사용에 대한 지시
상술한 수집 장치의 조작에 대한 예시적 지시사항은 다음과 같다:
1. 일반적인 지방성형에 대해 보통 수행하는 바와 같이 환자를 처치한다.
2. (통상의 트랩 및 인-라인(in-line) 미생물 필터를 구비한) 지방흡입 펌프 를 수집 용기(12)에서 유도된 홀(18)에 연결한다.
주목: 수집 시스템은 조직 단편 및 응집물을 수집하도록 고안된다. 염수, 혈액 및 유리 지질은 필터 및 수집 용기를 자유롭게 통과할 것이다. 따라서, 흡입 펌프의 오염을 방지하기 위해, 수집 용기는 인-라인 미생물 필터를 구비한 통상의 트랩의 상류에 위치되어야 한다.
3. 수집 장치(12)의 흡입 포트(16)에 부착된 관(18) 상의 밸브(34) 및 캐뉼러(24)에 부착된 관(22)이 열려 있도록 한다.
4. 캐뉼러 흡입 팁(24)의 배향을 확인하고, 캐뉼러를 지방 조직을 제거하기 위한 통상의 지방흡입 캐뉼러로 사용한다.
5. 1.2 리터 이하의 지방 조직이 수집 용기 내에 수집된 후, 입구 및 출구 상의 밸브(34)를 닫아 장치를 완전히 밀봉한다.
시스템의 무균성은 효과적인 밀봉에 달려있다.
6. 밸브의 바깥쪽 약 2 인치에서 장치의 양 쪽에 있는 관을 (절단에 의해) 제거한다.
7. 고객 확인사항 바코드 라벨을 수집 용기(12)에 부착한다. 절차의 날짜 및 시간을 라벨에 기록한다.
8. 나머지 고객 확인사항 바코드 라벨을 작업 계획표에 부착하고, 상기 작업 계획표를 완결한다. 이 서식 한 부를 지방흡입물 조직과 함께 반납하고, 한 부는 기록을 위해 남겨두고, 나머지 한 부는 환자에게 준다.
바람직한 태양에서, 수집 용기(12)를 밀봉하고, 처리 장소로 운송한다. 임 의로, 무균 세척 용액(예, 등장 염수)을 장치 및 조직에 통과시키는 흡입을 사용하여 조직을 세척할 수 있다. 운송 동안 줄기 세포의 생존력을 증진시키도록 고안된 보존제를 조직에 첨가할 수도 있다.
환자 정보, 지방흡입이 수행된 날짜 및 시간 이외에, 조직이 얻어진 부위 및 공여자에 관한 다른 의료 데이타(나이, 성, 병력 등)를 기록하는 것이 적당할 수도 있다.
조직 수집 장소와 조직 처리 장소가 밀접해 있는 경우, 수집 용기를 운송을 위해 포장할 필요가 없을 수 있다.
그러나, 지방 조직이 일정 거리 운송되어야 할 경우, 운송에 관여된 개체를 생물학적으로 위험할 수 있는 인간 물질에의 노출로부터 보호하는 방식으로 포장되어야 한다. 또한, 운송 동안 산물의 생존력의 보존을 최대화해야 한다.
운반에 관여된 사람의 보호는 수집 장치를 적당히 밀봉하거나, 지방 조직을 더 용이하게 밀봉된 무균 용기로 옮김으로써 조절된다. 이어서, 1차 용기는 운반 동안 일어날 것으로 생각되는 최악의 조건 하에서 밀봉을 보유하는 것으로 확인된 2차 및 3차 용기로 포장된다.
조직 생존력의 보호는 처리 시설로의 신속하고 효율적인 운송에 의해 달성된다. 온도 조절도 세포 생존력을 최대화하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 수집 깡통은 단열 용기 내에 놓여져야 한다. 포장은 예상되는 운송 기간 내내 적당한 온도를 유지하는, 당업자에게 공지된 임의의 온도 조절(예, 젖은 얼음, 동결된 겔 팩)로 보강된다. 바람직한 태양에서, 냉각제 및 단열 용기는 소 정의 온도 조절 기능을 제공하여야 한다(예를 들면, 이들은 적어도 소정의 시간 동안 소정의 온도 미만의 온도를 유지해야 한다).
밀봉 및 포장의 다른 태양이 당업자에게 인식될 것이고, 필요에 따라 관리 요건 또는 품질 시스템 증진에 상응하기 위해 사용될 수 있다.
수집 시점과 처리 시점 사이에서 지방 조직의 줄기 세포 구획의 생존력을 보존하기 위해, 필수적으로 운송 조건을 조절해야 한다. 또한, 시험되지 않은 인간 생물학적 물질의 운반에 관한 관리 요건이 존재한다.
지방 조직의 처리
지방 조직의 처리는 지방 조직 단편을 임의로 세척하여 잔류 유리 지질 및 혈액을 제거한 후 관심있는 세포 집단을 추출하는 일련의 세척 및 추출 단계를 포함한다. 지방 조직의 성질에 비추어, 적당한 접근법은 연결 조직을 파괴시킴으로써 조직을 분해하는 것이다. 지질의 낮은 부력 밀도로 인해, 유리 지질 및 지질이 풍부한 성숙 지방세포는 통상의 등장 완충 용액에 뜨는 반면, 지방 조직에서 유래된 줄기 세포 및 선조 세포는 침강하여, 더 풍부한 지방세포 집단을 쉽게 분리할 수 있다. 적당한 완충 용액은 플라즈마 라이트(Plasma Lyte) A(등록상표) (박스터 인크.(Baxter, Inc.)), 노르모졸(Normosol) R (애보트 레보러토리즈(Abbott Laboratories)) 및 인산염 완충 염수를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
조직 분해는 단백분해 효소, 예를 들면, 아교질분해효소, 트립신 또는 파파인, 민싱(mincing) 또는 전단력을 사용하는 기계적 분해, 또는 기타 수단을 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 효소 및 기계적 파괴 와 같은 방법의 조합 및(또는) DNase 및 지질분해효소와 같은 비-단백분해 효소를 포함하는 효소의 조합이 사용될 수도 있다.
분해는 지방 연결 조직 기질로부터 세포를 유리시킨다. 이어서, 성숙한 지방세포는 평형 밀도 원심분리, 부력 밀도 부유법 또는 기타 수단에 의해 제거될 수 있다. 이어서, 남아있는 지방세포가 고갈된 세포 집단은 원심분리, 급회전 막 분리, 분별 부착 및 항체가 코팅된 비드와 같은 고상 구조체에의 용리, 형광 활성화된 세포 분류, 또는 기타 분리 수단, 또는 이들의 조합을 비롯한 다양한 수단에 의해 농축될 수 있다.
지방 조직으로부터 얻어진 세포 집단(및 지방세포 고갈된 세포 집단)의 추가 분획화가 수행될 수 있다. 관심있는 세포 종류가 최대로 보유되도록 주의해야 한다. 다수의 세포 분리 기술이 당업계에 공지되어 있고, 지방 조직으로부터 분리된 세포 집단을 더 조작하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, 세포 집단을 적혈구가 분해되는 저장성 쇼크에 노출시키는 적혈구의 삼투압 민감성을 이용함으로써 잔류 적혈구를 제거할 수 있다. 평형 밀도 원심분리 또는 원심분리적 엘루트리에이션(elutriation)과 같은 원심분리 방법, 및 면역자기 세포 선택, 형광 활성화된 세포 분류 또는 패닝(panning) 기술을 사용할 수 있다. 양성 선택, 음성 선택, 및 이들의 조합이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
플라스틱에의 부착 및 세포 배양 방법이 세포 분획화 및 (또는) 처리의 일부로 사용될 수 있다.
세포 배양, 항체 매개된 양성 및(또는) 음성 선택, 차별 밀도 원심분리, 원심분리적 엘루트리에이션, 또는 당업계에 공지된 기타 수단에 의해 세포 집단을 선조세포로부터 줄기 세포를 분리시키는 정도까지 분획화하고 농축할 수 있다. 그러나, 순수하거나 농축된 집단을 생성하기 위해 당업계에 공지된 임의의 수단 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다.
지방조직에서 유래된 연결 조직 기질 물질은 전체 지방 조직으로부터 직접, 또는 줄기 및 선조 세포 집단이 추출된 조직으로부터 추출될 수 있다. 바람직한 태양에서, 기질 물질은 주로, 줄기 및 선조 세포를 함유하는 세포 집단이 수집기 부분(15)으로부터 유리되고 농축 및 냉동보존을 위해 이 세포 집단이 제거된 후 세포 수집기 부분(15) (필터로 둘러싸인 영역) 내에 보유된다. 기질 물질의 추출은 다양한 수단에 의해 수행될 수 있다. 그 예는 저장성 쇼크(예, 무균 증류수)에의 노출, 소듐 도데실 술페이트, 트리톤 X-100, 트윈 20과 같은 이온성 또는 비이온성 세정제를 사용한 추출, 아세톤 또는 이소프로필 알콜과 같은 유기 용매를 사용한 추출에 의한 성숙 지방세포의 분해를 포함한다. 추출용 용제의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포를 물로 분해하고, 잔류 세포 물질을 세정제로 세척하여 추출한 다음, 잔류 지질을 아세톤을 사용하여 추출할 수 있다.
바람직한 태양에서, 지방 조직을 무균의 완충 등장 염수로 세척하고, 적당한 분해를 제공하기에 충분한 아교질분해효소 농도, 온도 및 시간에서 아교질분해효소와 배양한다. 적당한 용액은 약 10 ㎍/ml 내지 약 50 ㎍/ml의 아교질분해효소 농도를 갖고, 약 30℃ 내지 약 38℃에서 약 20분 내지 약 60분 동안 배양된다. 상기 변수는, 시스템이 목적하는 세포 집단을 추출하는데 유효하다는 것을 확인하기 위해 경험적 연구에 의해 최적화된 아교질분해효소의 근원에 따라 달라질 것이다. 특정 바람직한 농도, 시간 및 온도는 약 37℃에서 45분 동안 배양된 20 ㎍/ml 아교질분해효소(블렌드자임(Blendzyme) 1, 로슈(Roche))이다. 특정 바람직한 태양에서, 사용된 아교질분해효소는 관련 당국(예, 미국 FDA)에 의해 인간에서의 사용을 위해 승인된 물질이다. 사용된 아교질분해효소는 미생물 및 내독소와 같은 오염물질이 없어야 한다.
세포 및(또는) 기질 물질 처리는 수동으로, 또는 상기 열거된 단계의 일부 또는 전부를 포함하는 자동화된 방식으로 수행될 수 있다.
바람직한 태양에서, 세포 집단의 우발적인 미생물 또는 동시에 처리되는 다른 공여자로부터의 세포로의 오염 위험의 최소화는 폐쇄된 처리 시스템의 사용에 의해 촉진된다.
폐쇄된 무균 유체 경로를 유지하는 방법을 사용하여, 수집 장치에 시약을 첨가하고, 페기물 및 세포를 수집 장치로부터 제거할 수 있다. 이는 조직의 세척을 위한 등장 완충 용액의 첨가, 조직을 분해하기 위해 사용된 효소의 첨가, 및 소화 후 추출된 세포 집단의 제거를 포함한다.
바람직한 태양에서, 이것은 무균 연결 장치를 사용하여 수집 장치로부터 유래된 폐쇄된 무균 관을 완충 염수 백으로부터 유래된 또 다른 폐쇄된 무균 관 부분에 연결함으로써 달성된다. 유사하게, 세척 동안 생성된 유체 폐기물은 폐쇄된 무균 폐기물 백에 이르는 폐쇄된 무균 관에 연결된 폐쇄된 무균 관을 통해 수집 장치 로부터 제거된다. 처리 동안 지방 조직으로부터 유리된 세포 역시 제2 폐쇄된 무균 용기에 이르는 폐쇄된 무균 관에 연결된 폐쇄된 무균 관을 통해 수집 장치로부터 제거된다. 이 태양에서, 폐기물 용기 및 세포 수집 용기는 구부리기 쉬운 무균 플라스틱 백이다. 이어서, 세포 수집 백을 원심분리기에 놓고, 세포를 10분 동안 400xg에서 침강시켜 안정한 세포 펠렛을 생성한다.
이어서, 상기 백에서 유래된 폐쇄된 무균 관을 제2 폐기물 백에 이르는 폐쇄된 무균 관에 연결하여, 세포 고갈된 용액을 옮기고 세포 펠렛을 보유할 수 있다. 이어서, 세포 펠렛을 재현탁시키고, 냉동보존을 위해 처리할 수 있다. 마지막으로, 상기 세포를 함유하는 백을 적당한 냉동보존 용기에 이르는 폐쇄된 무균 관에 연결할 수 있다.
이렇게 하여, 세포를 수집 시점에서부터 냉동저장 시점에 이르기까지 폐쇄된 무균 유체 경로 내에서 완전히 유지할 수 있다.
지방 조직에서 유래된 기질 물질은 일련의 폐쇄된 무균 관 연결의 동일한 일반적 방법으로 처리될 수 있다. 연결 조직 기질은 먼저 줄기 및 선조 세포를 함유하는 집단을 추출하지 않고 조직으로부터 직접 추출되거나, 또는 조직 소화의 종료시에 존재하는 점착성 폐기물을 추출함으로써 추출된다.
바람직한 태양에서, 관련 당국에 의해 인간에서의 사용에 승인된 시약 및 시스템을 사용하려는 노력이 이루어진다. 이는 공여자 안전성을 촉진하고 관련 규정에의 순응성을 개선하기 위한 것이다. 요구되는 시약이 인간에서의 사용에 승인된 형태로 이용가능하지 않을 경우, 시약 또는 성분이 소정의 적합 기준을 만족하는 것을 보장하기 위해 확인 시험이 수행되어야 한다. 상기 기준은 순도 분석, 내독소 함량, 무균성 등을 포함한다.
인간에서의 사용에 승인된 무균의 등장 완충 용액은 의료에서 매우 일반적이며, 몇몇 제조사 및 배급사로부터 상품으로 입수가능하다. 유사하게, 무균 연결 장치를 사용하는 연결에 적합한 폐쇄된 무균 관을 갖는 폐쇄된 무균 백이 혈액 뱅킹의 일부로서 흔히 이용가능하다. 냉동보존에 적합한 구부러지기 쉬운 플라스틱 백도 골수 이식 프로그램에 흔히 사용되고, 구입 가능하다.
회수된 세포 및 기질 물질 상에서 수행되는 일반적인 시험은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다:
처리의 종료시 세포 집단
총 세포 수율
세포의 무균성
세포의 생존력
다음을 포함하나 이에 제한되지 않는, 최종 산물 내의 하위집단의 함유량:
내피세포
줄기 세포
선조 세포
혈액 세포
잔류 성숙 지방세포
처리의 종료시 기질 물질
콜라겐 함유량
무균성
콜라겐 온전성
상기 시험 및 검사는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들면, 세포 생존력은 생존 색소 배제에 의해 측정될 수 있고, 줄기 세포 함유량은 확인된 클론원성 분석 시스템에서 CFU-F의 성장 또는 면역검출법을 사용한 세포 표면 페노타이핑(phenotyping)의 사용에 의해 측정될 수 있고, 콜라겐 온전성은 투과 전자 현미경법에 의해 측정될 수 있다. 상기 분석은 예로서 열거되며, 대안이 당업자에게 공지되어 있으므로 잠재적 분석의 완전한 목록은 아니다.
세포 냉동보존 및 저장
상기 지시된 바와 같이, 세포 동결은 적당한 첨가제 및 확인된 냉동보존 방법 없이는 세포에 파괴적이다. 또한, 줄기 및 선조 세포가 지방 조직 및 다른 생물학적 물질로부터 동결 전에 분리되어야 한다는 것이 밝혀졌다. 지방 조직을 냉동보존하고 해동 후 줄기 세포를 분리하려는 시도는 생존하는 줄기 세포의 유용한 양을 생성하지 못했다.
동결방지제는 세포막을 통과할 수 있는 침투 동결방지제, 및 비침투 동결방지제의 일반적 카테고리로 분류된다. 침투 동결방지제의 예는 디메틸 술폭시드 (DMSO), 글리세롤 및 1,2-프로판디올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비침투 동결방지제의 예는 히드록시에틸 전분, 알부민 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
가장 흔히 사용되는 침투 동결방지제는 DMSO이고, 이는 종종 자가 혈장, 인간 혈청 알부민 및(또는) 히드록시에틸 전분과 같은 비침투제와 함께 사용된다.
바람직한 태양에서, 사용된 특정 동결방지 첨가제(들)은 해동 후 세포의 적당한 회복을 보장한다.
냉동보존 후 생존 세포의 회복은 동결 과정 동안 냉각 속도를 조절함으로써 최적화될 수 있다. 가장 일반적인 냉각 프로토콜은 개시로부터 약 -50℃까지인 냉각의 중요기 동안 -1℃ 내지 -3℃의 일정한 냉각 속도를 유지한다.
이 속도는 컴퓨터로 조절된 속도 동결의 사용, 냉각된 유기 용매 배스에서의 침지, 또는 기계적 냉동 장치 내로의 배치를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 태양에서, 선택된 시스템의 능력은 소정의 냉각 속도를 생성하기 위해 확인될 것이다. 그러나, 선택된 냉각 속도는, 사용된 속도가 냉동보존 후 세포의 적당한 회복을 제공하는 것으로 확인된다면, 상술된 변수(개시로부터 -50℃까지 -1℃ 내지 -3℃)를 초과할 수 있다.
세포를 적당한 온도까지 냉각시킨 후, 샘플을 장기 저장 용기로 옮길 수 있다. 바람직한 태양에서, 이 용기는 샘플이 챔버의 액상에 침지되거나 증기상에 유지될 수 있는 진공 재킷 액화 질소 진공병 형태를 취할 것이다. 상기 용기는 다수의 제조자 및 배급자를 통해 이용가능하며, 농업(동물의 정자 및 난자의 저장) 및 의학 분야(인간 정자 뱅킹 및 골수 이식 프로그램)에서 흔히 사용된다.
바람직한 면에서, 처리된 세포는 5 (부피)% 인간 혈청 알부민(미국 적십자 혈액 서비스(American Red Cross Blood Services), 미국 워싱턴 소재)이 보강된 등 장 완충 용액(예, 플라즈마-라이트 A, 박스터)에 재현탁되고, 4℃까지 냉각된다. 이어서, 디메틸 술폭시드(DMSO)를 동결방지제로서 첨가하여 약 5% 내지 약 20%, 바람직하게는 10% DMSO의 최종 농도를 얻는다. 관심있는 세포의 동등하거나 우수한 해동후 회복이 달성된다는 것을 입증하기 위해 적당한 확인 시험이 수행된다면, 20 부피% 이하의 최종 DMSO 농도를 사용할 수 있다. 세포의 온도를 4℃로 유지하기 위해 냉각 팩을 사용하여 첨가 동안 세포를 일정하게 혼합시키면서, 예를 들면, 실린지 펌프를 사용하여 DMSO를 서서히(약 15분에 걸쳐) 첨가한다.
DMSO를 첨가한 후, 세포를 무균 방식으로 액화 질소 중의 장기 저장에 적당한 구부러지기 쉬운 플라스틱 백으로 옮긴다. 백을 밀봉하고, 알루미늄 인클로저와 같은 작은 상자에 놓는다. 이 상자를 세포를 -1℃/분의 조절된 속도로 4℃ 내지 -50℃까지 냉각시키는 냉동 장치에 놓는다. 이어서, 온도를 약 -10℃/분의 속도로 -90℃까지 감소시킨다. 이어서, 상자를 액화 질소 진공병의 증기상에 놓는다.
바람직한 태양에서, (하나를 넘는 냉동저장 용기를 사용하거나, 또는 복수 개의 구획으로 분할된 냉동저장 용기를 사용함으로써) 세포를 복수 개의 부분표본으로 냉동보존한다. 이렇게 하여, 나머지의 저장 조건을 손상시키지 않고 냉동 세포의 일부를 회복할 수 있다.
다른 냉동보존 기술의 예는 질소의 액상에 저장, 기계적 냉동 장치에 저장, 냉동 백 대신 하나 이상의 냉동튜브에 저장, 더 높거나 더 낮은 DMSO 최종 농도의 사용 등을 포함한다. 유사하게, 물질을 항상 폐쇄된 무균 유체 경로 내에 유지하 지 않거나, 또는 물질이 결코 상기 경로에 존재하지 않는 시스템을 사용하는 태양이 사용될 수 있다.
지방 조직에서 유래된 기질 물질은 주로, 중성 pH에서 물에 불용성인 매우 안정한 단백질인 콜라겐으로 이루어져 있다. 이 물질을 현탁액 또는 건조 펠렛으로 동결하고 영하의 온도에서 저장하거나, 잔류 수분 함유량이 0.5 내지 5 중량%가 되도록 동결 건조하고 주위 온도(25℃ 미만)에서 저장하거나, 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 상기 물질을 저장할 수 있다. 상기 물질은 바로 사용할 수 있도록 완전히 처리된 물질 또는 중간 제조 산물로서 저장될 수 있다.
적당한 저장 용기는 미리 채워진 실린지, 유리 앰플, 튜브 또는 구부러지기 쉬운 플라스틱 백을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기질 물질의 안정성으로 인해, 저장 조건은 그다지 중요하지 않고, 장기 및 단기 저장을 위한 다수의 수단이 당업자에게 명백할 것이다.
냉동보존된 세포의 회복
온도가 상승되고 세포가 해동되는 조건이 또한 중요하다. 예를 들면, 매우 작은 세포내 얼음 입자는 핵생성 및 재결정화를 유도할 수 있다. 유사하게, 동결 동안 관찰된 삼투압 스트레스도 해동 동안 세포 손상의 근원이 될 수 있다. 추가로, 동결방지제인 DMSO가 4℃를 넘는 온도에서 세포에 독성인 것을 암시하는 증거가 있다(Hak A.M., F.G. Offerijns and C.C. Verheul "Toxic Effects Of DMSO On Cultured Beating Heart Cells At Temperatures Above Zero" Cryobiology 10, p244-250, (1973)). 따라서, 해동 후 이 약제에의 노출이 최소화되어야 한다.
또한, 폐쇄된 무균 시스템 및 승인된 시약의 사용이 본 발명의 사용의 바람직한 측면이다.
바람직한 태양에서, 세포를 함유하는 작은 상자를 액화 질소 저장 용기로부터 꺼내고, 상기 상자로부터 냉동 장치 백을 꺼내어 구부러지기 쉬운 무균 외부 상자(예, 지플록(ziploc)식 플라스틱 무균 백)에 놓는다. 이 백을 밀봉하고, 37℃ 수조에 침지시켜 온도를 약 4℃까지 상승시킨다. 백을 해동 동안 천천히 조작하여, 백 내부의 물질의 조도가 질벅해질 때까지 가온 동안 물질 전체에 열이 균일하게 전달되도록 한다. 그 시점에서, 냉동백을 수조 및 외부 용기로부터 꺼내고, 백으로부터의 관 또는 포트를 폐쇄된 무균 용기에 이르는 폐쇄된 무균 관에 연결시키면서 냉각 팩에 놓는다. 상기 용기는 5% 인간 혈청 알부민과 같은 단백질 원으로 보강된 등장 완충 용액을 함유할 수 있다. 이어서, 세포를 관을 통해 냉동백으로부터 알부민 용액을 함유하는 페쇄된 무균 용기에 옮긴다. 이 수용 용기를 원심분리하여, 세포를 펠렛으로 할 수 있다. 폐쇄된 무균 유체 시스템을 보존하는 수단에 의해 연결된 제2 폐쇄된 무균 백으로 액상을 배출함으로써 과량의 알부민 용액 및 DMSO를 세포로부터 제거할 수 있다. 이어서, 세포를 환자에 전달하기 위해 부가의 등장 용액에 재현탁시킬 수 있다.
상기 특정 태양에서 상술한 바와 같이, 세포를 복수 개의 냉동저장 용기 또는 냉동저장 용기의 복수 개의 구획에 저장할 경우, 회복시에 요구되는 백 또는 구획만을 해동하면 된다.
DMSO를 제거하기 위해 세척 및 원심분리를 사용하지 않거나, 다른 단백질원 으로의 보강과 같이, 다른 세척 조건 또는 용액을 사용하거나, 또는 폐쇄된 무균 유체 경로를 사용하지 않는 대안적 태양도 본 발명의 범위 내일 수 있다.
세포 회복을 증진시키기 위해 세척 용액에 부가의 조성물을 첨가할 수 있다. 예를 들면, 냉동보존 동안 파열된 세포는 종종 그의 DNA를 매질에 분비할 것이다. DNA의 고도로 하전된 중합성으로 인해, 세포가 응집될 수 있다. 따라서, DNase(DNA를 절단하는 효소)와 같은 약제를 첨가하여 세포 응집을 최소화할 수 있다.
호비츠(Horwitz) 등은 인간 골수에서 유래된 골선조 세포(osteoprogenitor cell)를 골 생성 유전병인 불완전 골형성증 환자에 이식한 결과를 기재하였다(Horwitz EM, Prockop DJ, Gordon PL, Koo WW, Gordon PL, Neel MD, Sussman M, Orchard P, Marx JC, Pyeritz RE and Brenner MK "Transplantability and Therapeutic Effects Of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Cells In Children With Osteogenesis Imperfecta" Nat Med 5, p3009, (1999); Horwitz EM, Prockop DJ, Gordon PL, Koo WW, Gordon PL, Neel MD, McCarville ME, Orchard PJ, Pyeritz RE and Brenner MK "Clinical Responses To Bone Marrow Transplantation In Children With Severe Osteogenesis Imperfecta" Blood 97, p1227, (2001)). 상기 연구에서, 환자는 32억 개의 이식된 핵생성된 세포 용량을 투여받았다. 머슬러(Muschler) 등에 의해 공개된 데이타는 이 32억 개의 핵생성된 골수 세포가 약 176,000 개의 골선조 세포(CFU-AP)를 함유한다는 것을 나타낸다(Muschler GF, Nitto H, Boehm CA and Easley KA "Age-And Gender-Related Changes In The Cellularity Of Human Bone Marrow And The Prevalence Of Osteoblastic Progenitors" J Orthop Res 19, p117, (2001)).
동물 연구에서, 올릭(Orlic) 등(Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Bodine DM, Leri A and Anversa P "Mobilized Bone Marrow Cells Repair The Infracted Heart, Improving Function And Survival" Proc Natl Acad Sci USA 98, p10344, (2001); Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Bodine DM, Leri A and Anversa P "Transplanted Adult Bone Marrow Cells Repair Myocardial Infarcts In Mice" Ann NY Acad Sci 938, p221, (2001); Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Pickel J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A and Anversa P "Bone Marrow Cells Regenerate Infracted Myocardium" Nature 410, p701, (2001))은 줄기 세포가 심근경색 후 손상된 심근에 혼합될 수 있고, 상기 혼합이 심장 기능의 개선과 관련있다는 것을 증명하였다. 한 연구에서, 그의 그룹은 줄기 세포가 생존의 개선을 부여한다는 것을 증명하였다(Orlic, et al, "Mobilized Bone Marrow Cells Repair The Infracted Heart, Improving Function And Survival" Proc Natl Acad Sci USA 98, p10344, (2001)). 부분적으로 정제된 줄기 세포 분획을 사용한 동물 연구로부터 올릭 등의 결과는 출발 전체 골수의 약 1%에 해당하는 24,000개의 세포를 주입하여 수행되었다. 냉동보존된 혈액 및 골수에서 유래된 줄기 세포를 사용하여 얻어진 공개된 결과들은 혈액 및 골수에서 유래된 줄기 세포가 줄기 세포 생존력을 보유할 수 있다는 것을 암시하였다.
실시예 1
14명의 개체로부터 수집된 샘플로부터 하기 데이타를 얻었다. 흡입 보조의 지방성형을 사용하여 수집을 수행하였고, 조직을 도 1 및 2에 나타낸 상술한 수집 장치에 수집하였다. 이어서, 장치를 밀봉하고, 2개의 동결된 겔 팩과 함께 단열 운송 용기에 놓고, 처리 시설로 운송하였다. 이어서, 조직을 등장 염수로 세척하고, 리버레이스 블렌드자임(Liberase Blendzyme) 1 아교질분해효소(20 ㎍/ml; 로슈 다이아그노틱스, 미국 인디애나주 인디아나폴리스 소재)를 사용하여 소화시켜 처리하였다. 유리된 세포를 4℃에서 10분 동안 400xg로 원심분리하여 농축하고, 냉동보존의 준비에 있어서 5% 인간 혈청 알부민(미국 적십자 혈액 서비스, 미국 워싱턴 소재) 및 10% DMSO (크리오서브(Cryoserv); 에드워즈 라이프 사이언시스(Edwards Life Sciences), 미국 캘리포니아주 어빈 소재)가 보강된 50 ml 플라즈마-라이트 A(박스터 인크)에 재현탁시켰다.
생존 세포의 가시화를 위해 트립판 블루 색조 배제를 사용하여 혈구계로 세포 수를 세었다. 1,000개의 세포를 배지에 10일 동안 평판 배양하고 플레이트를 골원성 전구체의 마커로서 알칼리성 인산분해효소를 발현하는 세포에 대해 염색하하는 CFU-AP 분석법을 사용하여 줄기 세포 함유량을 측정하였다. 14개 샘플에 대한 정보를 하기에 열거하였다:
샘플 번호 수집된 조직의 양 (g) 처리후 세포 생존력 (%) 총 핵생성된 생존 세포 함유량 (x 108) 총 CFU-AP 함유량 (x 106)
1 1100 95 1.33 2.1679
2 800 62.2 1.18 2.36
3 400 81 2 0.4
4 650 78.1 1.6 10.4
5 1300 84.9 1.35 10.8
6 150 98 0.26 0.52
7 950 89 1.3 4.849
8 1200 71 1.1 1.958
9 700 79 1.02 0.4386
10 100 91.8 0.37 0.481
11 750 93.3 1.21 0.605
12 160 51 0.2 0.24
13 300 97 0.53 1.06
14 100 76.5 0.16 0.2656
평균 619 82 0.97 2,610,000
최소 100 51 0.16 240,000
최대 1,300 98 2.0 10,800,000

치료학적 유용성
상기 데이타는 지방흡입으로부터 얻어진 평균 CFU-AP (줄기 세포) 분량이 2.6 x 106개의 세포임을 증명한다. 최소의 수집(샘플 6, 10 및 14)에서도 176,000개가 넘는 CFU-AP를 얻었다.
수집된 샘플의 부분표본을 10% DMSO를 사용하여 상술한 바와 같이 냉동보존하고, -1℃/분의 조절된 속도로 4℃에서 -50℃까지 냉각시켰다. 샘플이 -50℃에 도달하면, -50℃에 도달할 때까지 냉각 속도를 -10℃/분으로 증가시켰다. 이 후, 부분표본을 밀봉된 냉동챔버 내 액화 질소 위의 증기부에 놓았다.
샘플을 평균 약 30일 동안 -196℃로 유지하였다.
냉동보존된 세포 집단의 부분표본을 해동하고, 핵생성된 세포의 회복 및 다-계대 분화 역량의 보유에 대해 분석하였다.
세포 용기를 37℃ 수조에 놓고, 용기 내의 세포 및 배지의 조도가 질벅해질 때까지 서서히 교반하여 세포를 해동시켰다. 용기를 수조에서 즉시 꺼내고, 4℃로 평형화된 겔 팩에 놓았다. 용기를 열고, 세포를 20% 혈청이 보강된 조직 배양 배지를 함유하는 세척 용액에 방출하였다. 세포를 4℃에서 400xg로 원심분리하여 세척하고, 세포가 없는 상청액을 폐기하고, 세포를 10% 혈청이 보강된 조직 배양 배지에 재현탁하였다. 세포 수를 세고, 트립판 블루 색조 배제를 사용하여 생존력을 측정하고, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 세포의 증식 및 분화 능력을 측정하고 해동후 줄기 세포의 함유량을 평가(CFU-AP 분석법)하기 위해 세포를 배양하였다.
80.9%의 냉동보존된 세포가 해동후 회복되는 것으로 측정되었다. 상기 세포에서 지방세포 계대에 따른 분화(동결전의 103%), 골형성 분화(동결전의 105%) 및 신경세포 분화(동결전의 97%) 능력의 손실은 나타나지 않았다. 배양물의 결절 구조로 인해 연골형성 분화의 정량적 측정은 불가능하였다. 그러나, 질적 수준에서, 냉동보존 후 연골형성 능력의 손실은 관찰되지 않았다. 냉동보존되고 해동된 세포의 샘플의 예를 도 3에 나타내었다.
실시예 2
특정 지방 조직 샘플에 적용된 처리의 유용성을 증명하기 위해 하기 데이타를 인용한다.
샘플 ID#: SVF 94
공여자 성별: 여성
공여자 연령: 68
지방 조직 수집
수집된 조직의 양: 400 ml
수집 방법: 흡입 보조의 지방성형
조직 수용 형태(수집 장치): 도 1 및 2에 나타낸 상술한 무균 수집 장치
수집 기간: 약 2시간
수집시 수집된 데이타:
지방성형 절차의 날짜 및 시간
의사 확인사항
공여자 확인사항 (바 코드 확인기에 연결됨)
현재의 약물치료
폐경 상태
흡연자 또는 비흡연자
사전 수술
사전 지방성형
일반적인 건강 이력
조직의 처리 장소로의 운송
운송을 위한 포장: 이중 플라스틱 백에 밀봉된 수집 장치
운송 기간: 2.5시간
운송 중 샘플의 온도 (수령시 측정): 4℃
조직 처리
사용된 시스템 종류: 폐쇄된 무균 유체 경로
조직 세척 용액: 등장 염수 (38℃)
사용된 세척 용액의 부피: 1,500 ml
세척액 수집 수단: 3 L 혈장 전달 백 (무균 도킹에 의해 부착됨)
조직 소화 방법: 효소적/아교질분해효소: 블렌드자임 1, 로슈 다이아그노스틱스; 20 ㎍/ml로 사용됨
조직 소화 시간: 60분
조직 소화 부피: 600 ml
방출된 세포 수집 수단: 600 ml 혈장 전달 백
세포 농축 수단: 4℃에서 10분 동안 400xg로 소르발(Sorvall) RC3 원심분리기에서 원심분리
세척액 수집 수단: 상청액을 600 ml 혈장 전달 백(카터 메디칼(Charter Medical))에 배출
세포 현탁 배지: 5% 인간 혈청 알부민이 보강된 플라즈마 라이트 A(등록상표) (박스터 인크); 총 부피 52 ml
동결방지제: 크리오서브(Cryoserv) DMSO (에드워즈 라이프 사이언스) 5.75 ml 첨가
냉동보존 방법
동결방지제 첨가 수단: 0.25 ml/분으로 실린지 펌프를 사용하여 첨가. 세포를 4℃로 미리 냉각시킴; 동결방지제를 첨가하는 동안 4℃로 미리 조절된 인슐-아 이스(Insul-Ice) (폴리폼 팩커스(Polyfoam Packers))를 사용하여 온도를 유지함.
냉동보존 용기: 알루미늄 외부 용기(퍼시픽 사이언시스(Pacific Sciences)) 내에 놓인 줄기 세포 동결 백(폴 메디칼(Pall Medical)) (2개의 백이 사용됨)
냉동보존 수단: 하기 프로그램에 따른 냉동보존 챔버의 컴퓨터-조절된 냉각을 사용한 MVE 크리오세이브(KryoSave):
시작 온도: 4℃
냉각 속도 A: -1℃/분
냉각 범위 A: 4℃ 내지 -50℃
냉각 속도 B: -10℃/분
냉각 범위 B: -50℃ 내지 -90℃
종료(유지) 온도: -90℃
냉동저장 조건: MVE 1841 액화 질소 저장 탱크의 증기상
세포 시험
세포 계수 수단: 혈구계 및 수동 계수
최종 세포 수율: 4.5 x 107 핵생성된 생존 세포
세포 생존력: 트립판 블루 색소 배제. 80% 생존 세포
CFU-AP 함유량: 7.7 CFU-AP/1,000 핵생성된 세포
345,375 총 CFU-AP
무균성 분석: 상청액의 10 ml를 박트 얼러트(BacT_Alert) 무균성 시험 시스 템의 호기성 튜브에 첨가하고, 10 ml를 혐기성 튜브에 첨가. 배양물을 14일 동안 유지. 무균성 결과: 미생물의 성장이 검출되지 않음.
냉동보존된 세포의 해동후 분석
줄기 세포 분석 (CFU-AP)
동결전: 153.5 CFU-AP/평판 배양된 20,000개 세포
해동후: 146 CFU-AP/평판 배양된 20,000개 세포
CFU-AP의 해동후 회복: 95%. 초기 CFU-AP 수율 = 345,375, 해동후 수율(95% 회복) = 328,106에 기초함.
세포 증식
20,000개의 세포를 줄기 세포 조직 배양 배지(10% 소 태아 혈청 및 항생제가 보강된 DMEM)에 평판 배양하고, 37℃에서 14일 동안 공기 + 5% CO2의 가습 분위기에서 배양하였다. 단시간의 트립신처리에 의해 세포를 회수하고, 세포 수/수율을 혈구계를 사용하여 결정하였다.
동결전: 세포 생산 2.2 ±0.1 x 104 핵생성된 세포
해동후: 세포 생산 2.4 ±0.4 x 104 핵생성된 세포
요약: 통계적으로 유의한 증식력의 차이가 없음.
시험은 냉동보존되고 해동된 세포가 보존 전에 시험된 세포의 동일한 1회분과 실질적으로 동일한 생존력을 갖는다는 것을 나타내었다.
세포 배양에서 세포는 연골세포(연골), 골모세포(뼈), 신경 세포(신경) 및 지방세포(지방)로의 분화 능력의 손실없이 해동후 완전한 기능을 보유하는 것으로 나타났다.
또한, 냉동보존된 랫트 지방 조직에서 유래된 세포를 또 다른 랫트의 심장에 이식하는 랫트 모델에서 상기 세포의 생체내 분화가 증명된다(도 4). 이식 1주일 후 해동된 세포의 수집은 이들이 수용자 심장에서 증식 및 분화력을 보유한다는 것을 나타내었다. 해동된 인간 지방 조직에서 유래된 세포를 면역결핍 마우스의 방광에 이식한 후에 유사한 결과가 얻어졌으며, 이는 인간 세포의 평활근 유형 세포로의 분화(도 5)를 증명한다. 이는 온전한 지방 조직의 냉동저장을 사용하여 지방 조직에서 유래된 세포를 성공적으로 냉동보존하려는 이전의 접근법의 실패와 대조된다(Lidagoster, MI, Cinelli PB, Levee EM and Sian CS "Comparison of Autologous Fat Transfer in Fresh, Refrigerated, and Frozen Specimens: an Animal Model. Ann Plast Surg. 44, P512-515 (2000)).
기질 물질의 회복
기질 물질의 회복은 기질을 저장하기 위해 사용된 특정 수단에 의존할 것이다. 상기 수단은 제조 중간체인 물질을 해동하기 위해 실린지에 저장된 물질에 액체 비히클을 첨가한 후 처리를 계속하는 것과 같이 변경된 선택사항을 포함할 수 있다. 저장된 기질의 유용성은, 저장된 기질 물질이 회복되어 지방 조직의 시험관내 생성을 위한 골격으로 사용되는 도 6에서 증명된다. 도 6은 기질 골격 상에 지질이 풍부한 성숙 지방세포(화살표)의 생성을 나타낸다.
세포 및 기질 물질의 저장후 검사
임상적 사용을 목적으로 하는 세포 및 기질을 임상적 응용에 앞서 검사 및(또는) 시험할 수 있다. 상기 시험의 수행시에는, 해동된 세포의 생존력을 보존하도록 주의해야 한다.
가능한 시험은 트립판 블루 색소 배제 또는 유사한 기술을 사용한 세포 수 및 생존력의 측정, DNA 지문술 또는 유사한 방법에 의한 세포 공여자 정체성의 확인을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 태양에서, 냉동저장 백에 이르는 무균 관 내에 밀봉된 냉동보존된 물질의 일부를 백의 내용물을 손상시키거나, 해동하거나, 또는 환경에 노출시키지 않으면서 백으로부터 절개할 수 있다. 백의 전체 내용물을 해동시키기 전에, 상기 길이의 관에 밀봉된 세포를 해동시켜 검사할 수 있다. 이렇게 하여, 세포의 주요부가 해동되기 전에, 시험을 수행할 수 있고, 공여자 및 세포의 정체성을 확인할 수 있다.
또한, 처리 종료시의 세포에 대해 상기 열거된 모든 또는 임의의 검사 및 시험(예, 면역페노타이핑 또는 클론원성 배양)이 사용될 수 있다.
임상적 응용에 앞서 세포 및 기질의 저장후 조작
지방 조직 내의 줄기 및 선조 세포 집단의 성질로 인해, 이들은 조직 공학 및 유전자 의학을 비롯한 다수의 분야에 사용될 수 있다. 상기 영역 내의 특정 분야는 상기 세포 집단의 수용자 내로의 배치 또는 연구에의 사용에 앞서 그들의 조작을 필요로 할 것이다.
그 예는 세포 집단의 수 및(또는) 순도를 증가시키기 위한 세포 배양, 하위집단의 농축 또는 정제, 유전 물질의 세포로의 도입, 또는 목적하는 표현형 또는 기능의 획득을 촉진하기 위해 세포 배양을 기초로 한 세포 집단의 분화를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
품질 시스템의 세포 및 기질 뱅킹에의 적용
통합된 품질 시스템은 본 발명의 선택 부분이다. 상기 시스템은 본 발명의 모든 측면에 걸쳐, 처리의 통제 및 실책 기회의 최소화를 보장할 것이다.
선택적이긴 하지만, 품질 시스템의 부재 하에서 본 발명의 실시는 결국 품질의 저하, 샘플 확인 실책 및 기타 문제를 야기할 것이다.
미국 조직 은행 연합 및 미국 혈액 은행 연합과 같은 전문 단체는 그들의 관심 영역에 적용가능하고 본 발명과 관련하여 상당히 중요한 품질 시스템의 설계서에 대한 요건을 가지고 있다. 유사하게, 반드시 일반적인 것은 아니지만, 국제 기준 조직(International Organization for Standards)에 의해 확립된 기준의 ISO 9000 시리즈가 본 발명에 적용될 수 있다. 미국 FDA에 의해 발표된 우수 조직 관행(Good Tissue Practices)을 포함하는 규정에 샘플 통치 규정이 포함되어 있다.
본 발명의 실시에 적용가능한 품질 시스템의 일부 요소는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다:
조직 취급(조직 수집을 통한 공여자의 프로그램과의 첫 접촉으로부터 처리 시설에서의 접수, 처리, 시험, 저장 및 방출)의 각 측면에 대한 절차의 공정 제어;
전체 제조 동안 세포 집단/기질 물질 산물 라벨 붙이기;
품질 시스템의 개발 및 실행 담당자의 지정을 비롯한 프로그램의 편성, 관리 및 감독;
직원의 선택, 훈련 및 교육;
공급품의 선택, 구입, 검사 및 사용;
기구의 선택, 구입, 검사, 유지 및 사용;
공급업체 평가
당해 프로그램에 의해서만 또는 이를 위해서만 제조된 제품의 고안 및 제조;
문서 및 기록의 생성, 변경 및 제어;
설비;
공정의 개선;
실책/사고 검출;
고객 불만의 문서화 및 대응;
제품 및 공정 설계서의 개발;
안전성;
품질 시스템에 대한 순응성을 평가하기 위한 내부 프로그램의 개발 및 실행.
본 발명의 실시는 상기 선택적 요소의 어느 것도 포함하지 않거나, 그 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본 발명의 지방 조직에서 유래된 줄기 및 선조 세포 집단 및 기질 물질은 다수의 잠재적 치료학적, 구조적 및 미용적 용도를 갖는다. 상기 용도를 위한 세포 및(또는) 기질 물질은 그들이 사용될 개체(자가 응용), 또는 관련 또는 비관련 공여자(동종이계 응용)로부터 제공될 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 상기 세포 및(또는) 기질 물질은 지방 조직이 얻어진 사람에게 반환되는 자가 응용으로 사용된다. 이 방법은 항-거부반응 약품의 사용을 피하고, 조직의 거부반응 및 감염 인자의 도입 위험을 감소시킨다. 이 방법은 줄기 세포 및 선조 세포 집단 및 기질 물질이 상기 세포를 사용하고자 하는 근원적 상태의 일부가 아닌 상태에서 실행가능하다. 예를 들면, 자가 줄기 및 선조 세포는 심근 조직의 복구 또는 연골 복구를 촉진하는데 적합할 수 있다. 그러나, 유전자 전달이 없이는, 지방 조직에서 유래된 자가 줄기 및 선조 세포는 뼈 생성의 유전적 질환인 불완전 골형성증 환자에서 뼈 복구에의 사용에 적합하지 않을 것이다. 상기 경우에서는, 관련 또는 비관련 공여자로부터의 동종이계 줄기 및 선조 세포가 바람직할 수 있다.
본 발명의 변경 및 변형이 그 취지 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 포함된 특정 실시예 및 태양은 예로서만 제공되며, 본 발명은 첨부된 청구범위의 용어에 의해서만 제한된다.
예를 들면, 바람직한 수집 방법은 초기에 목적하는 성분을 폐기가능한 성분으로부터 분리하기 위해 그 내부에 투과성 막을 갖는 수집 장치를 이용하나, 단일 환자로부터의 지방흡입물은 전부가 단일 수집 용기에서 수집될 수 있고, 수집된 물질 전부가 냉동보존 전 줄기 세포, 선조 세포 및 임의의 다른 목적하는 성분의 분리 및 단리를 위한 장소로 운송될 수 있다.
나아가, 본 발명은 또한 총 지방흡입물의 수집, 운송 및 냉동보존을 고려한다. 이어서, 줄기 세포, 선조 세포 및 임의의 다른 목적하는 성분은 흡입물을 적당한 처리 온도(예, 4℃ 이상이나, 바람직하게는 체온 이하)로 재가열한 후, 상술한 방법을 사용하여 회복 및 분리될 수 있다.

Claims (53)

  1. 폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 조직을 제거, 처리 및 보존하도록 구성된 자체 완비형(self-contained) 세포 처리 및 보존 장치 중으로 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 지방 조직을 도입하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치 내에서 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 성숙 지방 세포 및 연결 조직이 분리되도록, 지방 조직 중에 존재하는 성숙 지방 세포 및 연결 조직으로부터 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단을 분리하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단을 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치와 함께 농축하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 농축된 세포 집단을 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치에 연결된 냉동보존 용기에 공급하는 단계; 및
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단을 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치와 함께 냉동보존하는 단계를 포함하는, 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단을 처리 및 보존하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포 처리 장치는 용기 내에 수용된 투과성 막을 포함하는 세포 수집 챔버를 포함하고, 지방 조직은 튜빙(tubing)을 통해 세포 수집 챔버의 투과성 막 중으로 도입되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 투과성 막은 다공성 필터를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 추가로 분리 단계 이전에
    세포 수집 챔버 중에서 지방 조직을 세척하는 단계; 및
    지방 조직 중의 성숙 지방 세포, 연결 조직, 혈액, 유리 지질, 혈병 및 튜메슨트 용액(tumescent solution)으로부터 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 분해하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 분해 단계가 지방 조직을 아교질분해효소, 트립신, 파파인, DNAse 및 지질분해효소로부터 선택된 하나 이상의 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 분해 단계가 기계적 전단작용 또는 민싱(mincing)을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 분리 단계가 원심분리 또는 부력 밀도 부유법을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 분리 단계가 원심분리, 급회전 막 분리, 고상 구조체로의 차별 부착, 일루트리에이션(elutriation) 및 형광 활성 세포 분류 중 1종 이상 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 고상 구조체가 항체로 덮인 비드를 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 농축된 세포 집단이 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 농축된 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 줄기 세포가 풍부한 상 및 선조 세포가 풍부한 상으로 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 냉동보존 단계가
    농축된 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포 집단을 1종 이상의 동결방지 첨가제와 혼합하는 단계;
    혼합물이 -50℃에 도달할 때까지 -1℃/분 내지 -3℃/분의 일정한 냉각 속도로 혼합물을 냉각시키는 단계; 및
    냉각된 혼합물을 액화 질소를 함유하는 저장 용기에 두는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 동결방지 첨가제가 침투 동결방지제, 비침투 동결방지제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 침투 동결방지제가 디메틸 술폭시드, 글리세롤, 1,2-프로판디올, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 비침투 동결방지제가 자가 혈장, 인간 혈청, 히드록시에틸 전분, 알부민, 폴리비닐 피롤리돈 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 추가로
    농축된 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포 집단을 5% 인간 혈청 알부민 용액 중의 세포 현탁액으로 제조하는 단계;
    세포 현탁액을 4℃로 냉각하는 단계;
    세포 현탁액을 4℃로 유지하면서 최종 디메틸 술폭시드 농도가 5 내지 20 부피%가 되도록 디메틸 술폭시드를 냉각된 현탁액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 디메틸 술폭시드의 최종 농도가 10 부피%인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 농축된 세포 집단을 냉동보존하기 전에 농축된 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 하나 이상의 부분으로 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 냉동보존되고 농축된 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포 집단의 온도를 4℃로 상승시켜 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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  40. 폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 조직을 제거, 처리 및 보존하도록 구성된 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치 중으로 지방 유래 연결 조직 기질(matrix)을 포함하는 지방 조직을 도입하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치 내에서 세포 성분이 지방 유래 연결 조직 기질로부터 분리되도록, 지방 조직 중에 존재하는 세포 성분을 분리하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 유래 연결 조직 기질을 냉동보존 용기에 공급하는 단계; 및
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 유래 연결 조직 기질을 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치와 함께 냉동보존하는 단계를 포함하는, 지방 유래 연결 조직 기질을 처리 및 보존하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 세포 처리 장치는 용기 내에 수용된 투과성 막을 포함하는 세포 수집 챔버를 포함하고, 지방 조직은 튜빙을 통해 세포 수집 챔버 중으로 도입되는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 투과성 막은 다공성 필터를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 추가로 분리 단계 이전에
    세포 수집 챔버 중에서 지방 조직을 세척하는 단계; 및
    지방 조직 중의 성숙 지방 세포, 연결 조직, 혈액, 유리 지질, 혈병 및 튜메슨트 용액으로부터 지방 유래 연결 조직 기질을 분해하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 분해 단계가 지방 조직을 아교질분해효소, 트립신, 파파인, DNAse 및 지질분해효소로부터 선택된 하나 이상의 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  45. 제43항에 있어서, 분해 단계가 기계적 전단작용 또는 민싱을 포함하는 방법.
  46. 제40항에 있어서, 분리 단계가 원심분리 또는 부력 밀도 부유법을 포함하는 방법.
  47. 제40항에 있어서, 분리 단계가 원심분리, 급회전 막 분리, 고상 구조체로의 차별 부착, 일루트리에이션 및 형광 활성 세포 분류 중 1종 이상 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  48. 제40항에 있어서, 냉동보존 단계가
    농축된 지방 유래 연결 조직 기질을 1종 이상의 동결방지 첨가제와 혼합하는 단계;
    혼합물이 -50℃에 도달할 때까지 -1℃/분 내지 -3℃/분의 일정한 냉각 속도로 혼합물을 냉각시키는 단계; 및
    냉각된 혼합물을 액화 질소를 함유하는 저장 용기에 두는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 동결방지 첨가제가 침투 동결방지제, 비침투 동결방지제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 침투 동결방지제가 디메틸 술폭시드, 글리세롤, 1,2-프로판디올, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 비침투 동결방지제가 자가 혈장, 인간 혈청, 히드록시에틸 전분, 알부민, 폴리비닐 피롤리돈 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 디메틸 술폭시드의 최종 농도가 10 부피%인 방법.
  52. 폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 조직을 제거, 처리 및 보존하도록 구성된 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치 중으로 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 지방 조직을 도입하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치 내에서 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 성숙 지방 세포 및 연결 조직이 분리되도록, 지방 조직 중에 존재하는 성숙 지방 세포 및 연결 조직으로부터 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단을 분리하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단을 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치와 함께 농축하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 농축된 세포 집단을 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치에 연결된 냉동보존 용기에 공급하는 단계; 및
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하는 세포 집단을 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치와 함께 냉동보존하는 단계를 포함하는 방법을 수행하여 얻어진 농축된 지방 유래 줄기 세포 및 선조 세포 집단을 포함하는, 인간 세포계 및 조직의 복구, 재구성 및 재건을 위한 조성물.
  53. 폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 조직을 제거, 처리 및 보존하도록 구성된 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치 중으로 지방 유래 연결 조직 기질을 포함하는 지방 조직을 도입하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치 내에서 세포 성분이 지방 유래 연결 조직 기질로부터 분리되도록, 지방 조직 중에 존재하는 세포 성분을 분리하는 단계;
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 유래 연결 조직 기질을 냉동보존 용기에 공급하는 단계; 및
    폐쇄된 유체 경로를 유지하면서 지방 유래 연결 조직 기질을 자체 완비형 세포 처리 및 보존 장치와 함께 냉동보존하는 단계를 포함하는 방법을 수행하여 얻은 지방 유래 연결 조직 기질을 포함하는, 인간 세포계 및 조직의 복구, 재구성 및 재건을 위한 조성물.
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