RU2415934C2 - Клетка-хозяин, содержащая вектор для продуцирования белков, требующих гамма-карбоксилирования - Google Patents
Клетка-хозяин, содержащая вектор для продуцирования белков, требующих гамма-карбоксилирования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2415934C2 RU2415934C2 RU2007140550/10A RU2007140550A RU2415934C2 RU 2415934 C2 RU2415934 C2 RU 2415934C2 RU 2007140550/10 A RU2007140550/10 A RU 2007140550/10A RU 2007140550 A RU2007140550 A RU 2007140550A RU 2415934 C2 RU2415934 C2 RU 2415934C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- carboxylation
- gamma
- promoter
- cell according
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 115
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 70
- 102100038182 Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 108010013113 glutamyl carboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 108091005606 gamma-carboxylated proteins Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 88
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 53
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 claims description 45
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims description 36
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims description 36
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims description 36
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims description 36
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims description 36
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 30
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 30
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 30
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 26
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 16
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 16
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 16
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 16
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 15
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 10
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims description 9
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 claims description 9
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims description 9
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 6
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 claims description 6
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 claims description 5
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 5
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 5
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 5
- 101710181748 Venom protease Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 claims description 4
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 4
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 claims description 4
- 102000043253 matrix Gla protein Human genes 0.000 claims description 4
- 108010057546 matrix Gla protein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010025221 plasma protein Z Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 102000004210 Vitamin K Epoxide Reductases Human genes 0.000 abstract description 62
- 108090000779 Vitamin K Epoxide Reductases Proteins 0.000 abstract description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 90
- 101000742236 Homo sapiens Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Proteins 0.000 description 29
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 229940031422 benefix Drugs 0.000 description 10
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 10
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 9
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 6
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 6
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 6
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 5
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 5
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 5
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108090000040 Russellysin Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 5
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 4
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 4
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 241000143336 Acanthophiinae Species 0.000 description 3
- -1 FIX Proteins 0.000 description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229940105772 coagulation factor vii Drugs 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- BUFJIHPUGZHTHL-NKFFZRIASA-N phyllohydroquinone Chemical compound C1=CC=CC2=C(O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(O)=C21 BUFJIHPUGZHTHL-NKFFZRIASA-N 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KUTXFBIHPWIDJQ-BTPXSFBUSA-N (1ar,7as)-7a-methyl-1a-[(e,7r,11r)-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-enyl]naphtho[2,3-b]oxirene-2,7-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)[C@@]2(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@]1(C)O2 KUTXFBIHPWIDJQ-BTPXSFBUSA-N 0.000 description 2
- QEDVGROSOZBGOZ-WXXKFALUSA-N (e)-but-2-enedioic acid;n-[2-[[2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenoxy)propyl]amino]ethyl]morpholine-4-carboxamide Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.C=1C=C(O)C=CC=1OCC(O)CNCCNC(=O)N1CCOCC1.C=1C=C(O)C=CC=1OCC(O)CNCCNC(=O)N1CCOCC1 QEDVGROSOZBGOZ-WXXKFALUSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 241000237974 Conus textile Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283323 Delphinapterus leucas Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 244000019194 Sorbus aucuparia Species 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 108010085662 ecarin Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 235000006414 serbal de cazadores Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 2
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000256182 Anopheles gambiae Species 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000276401 Batrachoididae gen. sp. Species 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 241000272060 Elapidae Species 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079356 FIIa Proteins 0.000 description 1
- 206010016077 Factor IX deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000823435 Homo sapiens Coagulation factor IX Proteins 0.000 description 1
- 101000918470 Homo sapiens Coagulation factor X Proteins 0.000 description 1
- 101710172804 K protein Proteins 0.000 description 1
- 241000222712 Kinetoplastida Species 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000251752 Myxine glutinosa Species 0.000 description 1
- 241000251748 Myxinidae Species 0.000 description 1
- 102000004960 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Human genes 0.000 description 1
- 108020000284 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Proteins 0.000 description 1
- 241000276398 Opsanus tau Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100031475 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 239000000305 astragalus gummifer gum Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 108010008250 drotrecogin alfa activated Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000045338 human GGCX Human genes 0.000 description 1
- 229940052349 human coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940099813 human coagulation factor x Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940047434 kogenate Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- JIDVGUQUQSOHOL-UHFFFAOYSA-N myxin Chemical compound C1=CC=C2[N+]([O-])=C3C(OC)=CC=CC3=[N+]([O-])C2=C1O JIDVGUQUQSOHOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940112216 novoseven Drugs 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000003711 snail venom Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000008181 tonicity modifier Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 239000002821 viper venom Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой эукариотическую клетку-хозяина для продуцирования гамма-карбоксилированного белка, содержащую вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии. При этом клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии. Данное изобретение относится также к способу получения гамма-карбоксилированного белка и способу получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови или стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови, на основе полученного гамма-карбоксилированного белка. Изобретение позволяет получать гамма-карбоксилированный белок с высокой степенью эффективности. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 табл.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные контрольные последовательности. Данное изобретение дополнительно относится к способу получения белка, требующего гамма-карбоксилирования, с высокими выходами.
Предшествующий уровень техники
Кровотечение является обычной клинической проблемой. Оно является следствием заболевания, травмы, хирургического вмешательства и медицинского лечения. Механическая остановка кровотечения является настоятельной необходимостью. Это может быть затруднительным или даже невозможным из-за локализации кровотечения или из-за того, что кровь диффундирует из многих (маленьких) сосудов. Пациентам, которые имеют кровотечение, таким образом, может требоваться лечение агентами, которые поддерживают гемостаз. Это могут быть продукты, происходящие из крови (гемотерапия), агенты, которые вызывают высвобождение эндогенных гемостатических агентов, рекомбинантные факторы свертывания крови (F) или агенты, которые задерживают растворение сгустков крови.
Среди продуктов, происходящих из крови, часто получаемых из местного госпиталя, лечением первого ряда являются цельная кровь для замещения объема и поддержки гемостаза, упакованные красные кровяные клетки для улучшения способности транспортировать кислород, концентраты тромбоцитов для повышения числа тромбоцитов (если оно является низким, или они являются дефективными) и свежая замороженная плазма для поддержки гемостаза (свертывание крови и агрегация тромбоцитов). Второй линией продуктов, происходящих из плазмы, которые поддерживают гемостаз, являются криопреципитат, концентраты комплекса протромбина, концентраты активированного комплекса протромбина и очищенные факторы свертывания крови. Несколько факторов свертывания крови доступны сегодня в виде человеческих рекомбинантных белков, неактивных (факторы свертывания крови VIII и IX) и активированных (фактор свертывания крови VIIa).
Гемофилия представляет собой наследственное или приобретенное расстройство, связанное с кровотечением, либо с ненормальным или находящимся в недостатке фактором свертывания крови, или с антителами, направленными на фактор свертывания крови, которые ингибируют функцию прокоагулянта. Самыми обычными гемофилиями являются гемофилия А (недостаток фактора свертывания крови VIII) и гемофилия В (фактор IX). Очищенные или рекомбинантные одиночные факторы свертывания крови являются главным способом лечения пациентов с гемофилией. У пациентов с ингибиторными антителами имеется проблема с лечением, так как они также могут нейтрализовать фактор свертывания крови, который вводится пациенту.
Активная форма белка С (АРС) представляет собой ингибитор свертывания плазмы путем деградации активированных факторов свертывания крови Va и VIIIa. Было показано, что рекомбинантный АРС является эффективным средством для лечения чрезмерного свертывания крови у пациентов с сепсисом.
Факторы свертывания крови для терапевтического применения можно получить из человеческой плазмы, хотя процесс их очистки является непростым и требует многих стадий, несколько из которых нацелено на устранение загрязняющих вирусов. Но даже при расширенных мерах безопасности и тестирования продуктов, происходящих из крови, нельзя исключить загрязнения инфекционными вирусами или прионами. Из-за этого риска весьма желательным является получение человеческих терапевтических белков из рекомбинантных клеток, выращенных в средах без компонентов животного происхождения. Этот подход не всегда является прямым, так как для того, чтобы многие белки вырабатывались в полностью функциональной форме, т.е. были правильно посттрансляционно модифицированными, требуется млекопитающее-хозяин. Среди факторов свертывания крови, выпускаемых в рекомбинантных клетках в промышленном масштабе, находятся FVII (NovoSeven), FVIII (Kogenate, Recombinate, Refacto) и FIX (BeneFix) (Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11:169-177, 1997) и активный белок С (Xigris). Одним из главных препятствий при получении больших количеств полностью функциональных рекомбинантных человеческих факторов свертывания крови является домен Gla, присутствующий у FII, FVII, FIX, FX, белка S и белка С. Этот домен содержит остатки глутаминовой кислоты, которые посттрансляционно модифицируются добавлением карбоксильных групп. Выработка этих факторов затруднена тем фактом, что их сверхэкспрессия приводит к образованию недокарбоксилированного и, следовательно, неактивного белка. Модификации Gla представляют собой результат действия фермента, зависимого от витамина K, называющегося γ-глутамилкарбоксилазой (GGCX). Этот фермент был подробно исследован многими учеными, конкретно теми, которые участвуют в исследовании факторов свертывания крови (WO-A-8803926; Wu et al. Science 254(5038); 1634-1636, 1991; Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274(24): 16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS Letters 445:256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276(11):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1264-1269, 2002; Czerwiec et al., Eur J Biochem 269:6162-6172, 2002; Hallgren et al., Biochemistry 41(50):15045-15055, 2002; Harvey et al., The Journal of Biological Chemistry 278(10):8363-8369, 2003). Попытки коэкспрессировать GGCX с фактором свертывания крови FIX были предприняты по меньшей мере двумя научными группами, но они не были успешными (Rehemtulla, et al. 1993, ibid; Hallgren et al. 2002, ibid). Принимая во внимание большой интерес к ферментам GGCX, можно предположить, что значительно больше исследований потерпели неудачу и поэтому не были описаны. GGCX требует в качестве кофактора восстановленного витамина К. Восстановленный витамин К превращается с помощью GGCX в эпоксид витамина К, который рециклируется до восстановленного витамина К с помощью витамин K-эпоксидоредуктазы (VKOR). Таким образом, для эффективного зависимого от витамина К карбоксилирования белков требуются два фермента - GGCX и VKOR. Клонирование и идентификацию VKOR описали в 2004 году (Li et al., Nature 427:541-543, 2004, Rost et al., Nature 427:537-541, 2004). Белок VKOR представляет собой полипептид из 163 аминокислот с по меньшей мере одним предсказываемым трансмембранным участком. В рекомбинантных клетках, экспрессирующих VKOR, данная активность локализуется в микросомальной субклеточной фракции.
Для человеческого FII (протромбин) по меньшей мере 8 из 10 остатков Glu должны быть правильно модифицированы для того, чтобы получить полностью функциональный протромбин (Malhotra, et al., J. Biol. Chem. 260:279-287, 1985; Seegers and Walz. Prothrombin and other vitamin K proteins. CRC Press, 1986). Аналогично свертывающая активность человеческого фактора свертывания крови IX требует γ-карбоксилирования по меньшей мере 10 из 12 остатков глутаминовой кислоты в домене Gla (White et al., Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997). Были предприняты большие усилия по получению высоких уровней выработки rhFII с использованием нескольких разных систем, таких как системы экспрессии на основе клеток СНО, клеток ВНК, клеток 293 и вируса осповакцины, но все они потерпели неудачу или привели к недокарбоксилированному продукту и, таким образом, функционально неактивному протромбину (Jorgensen et al., J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38(2):129-136, 1995; Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10:214-225, 1997; Vo et al. 1999, ibid; Wu and Suttie Thromb Res 96(2):91-98, 1999). Сообщавшиеся ранее продуктивности карбоксилированного рекомбинантного человеческого протромбина являются низкими - 20 мг/л для мутантного протромбина (Côte et al., J. Biol. Chem 269:11374-11380, 1994), 0,55 мг/л для человеческого протромбина, экспрессируемого в клетках СНО (полностью карбоксилированный, Jørgensen et al. 1987, ibid), 25 мг/л в клетках СНО (степень карбоксилирования не указана, Russo et al. 1997, ibid).
Насколько известно, о коэкспрессии белка, требующего γ-карбоксилирования, и VKOR ранее не сообщалось.
WO 92/19636 раскрывает клонирование и идентификацию последовательности человеческой и коровьей витамин K-зависимой карбоксилазы. В данной заявке говорится о коэкспрессии витамин K-зависимой карбоксилазы (GGCX) и витамин K-зависимого белка в подходящей клетке-хозяине для того, чтобы получить витамин K-зависимый белок. Коэкспрессия данной карбоксилазы и витамин K-зависимого белка не проиллюстрирована примерами.
В WO 2005/038019 заявлен способ увеличения общей продуктивности γ-карбоксилированного белка контролируемой коэкспрессией γ-карбоксилированного белка и GGCX. Данное изобретение проиллюстрировано примерами с улучшенной продуктивностью факторов свертывания крови II и FIX.
WO 2005/030039 говорит о коэкспрессии витамин K-зависимых белков с витамин K-эпоксидредуктазой (VKOR) для того, чтобы улучшить γ-карбоксилирование. Однако такая коэкспрессия не проиллюстрирована примерами.
Sun et al. (Blood 106: 3811-3815, 2005) было показано, что коэкспрессия фактора свертывания крови Х (FX) и VKOR увеличивает долю γ-карбоксилированного белка. Кроме того, Wajih et al. (JBC 280:31603-31607, 2005) продемонстрировали увеличение доли γ-карбоксилированного фактора свертывания крови IX (FIX) путем коэкспрессии с VKOR. В обеих публикациях сообщили, что VKOR увеличивал долю γ-карбоксилированного белка, но коэкспрессия VKOR не улучшала общую продуктивность фактора свертывания крови.
Существует потребность в улучшенных способах получения активированных факторов свертывания крови с повышенными выходами. Настоящее изобретение предложено для удовлетворения этой потребности.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно первому аспекту данного изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, где данная клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
В другом аспекте предложена клетка, которая модифицирована генно-инженерным образом для экспрессии (1) белка, который требует γ-карбоксилирования, и (2) витамин K-эпоксидоредуктазы, где данные белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 10:1 до 500:1.
Согласно другому аспекту предложена генетически модифицированная эукариотическая клетка, содержащая: (1) полинуклеотид, кодирующий белок витамин K-эпоксидоредуктазу, где указанная кодирующая последовательность белка витамин К-эпоксидоредуктаза функциональным образом связана с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию белка витамин K-эпоксидоредуктаза указанной клеткой; (2) полинуклеотид, кодирующий белок, требующий карбоксилирования белком γ-глутамилкарбоксилазой, функциональным образом связанный с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию указанного белка, требующего карбоксилирования, указанной клеткой, и (3) полинуклеотид, кодирующий гамма-глутамилкарбоксилазу.
Согласно еще одному другому аспекту предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
Согласно другому аспекту предложен способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий: (1) культивирование клетки, экспрессирующей рекомбинантный белок, который требует гамма-карбоксилирования, витамин K-эпоксидоредуктазу и γ-глутамилкарбоксилазу, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.
Согласно другому аспекту предложен способ получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови или стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови, включающий проведение очистки активного карбоксилированного белка, полученного согласно описанным выше способам, и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
Согласно другому аспекту предложен способ стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови у субъекта, включающий введение фармакологически эффективного количества выделенного гамма-карбоксилированного белка, полученного описанными выше способами, нуждающемуся в этом пациенту.
Данный белок, требующий гамма-карбоксилирования, полученный способами по настоящему изобретению, можно использовать в гемостатической или антитромботической терапии.
Краткое описание графических материалов
Фиг.1 показывает карту плазмиды вектора коэкспрессии F10NopA (фактор Х+GGCX) и карту плазмиды вектора экспрессии VKORzeo (VKOR).
Фиг.2 показывает карты плазмид векторов, используемых для коэкспрессии FII, GGCX и VKOR.
Подробное описание изобретения
Согласно первому аспекту данного изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, где данная клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
В одном воплощении указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор. В другом воплощении первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1. В другом воплощении первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
В другом воплощении данная клетка дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии. В одном воплощении данная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, дополнительно содержит третий промотор, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1. В другом воплощении первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
Первый промотор может быть немедленным-ранним промотором человеческого цитомегаловируса (hCMV), и второй и третий промотор могут быть ранним промотором SV40.
В одном конкретном воплощении и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая, витамин K-эпоксидоредуктазу, и, возможно, γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, локализуются в том же самом векторе экспрессии. В другом воплощении эти две или, возможно, три молекулы нуклеиновой кислоты локализуются в двух или более чем в двух отдельных векторах экспрессии.
В другом аспекте предложена клетка, которая модифицирована генно-инженерным образом для экспрессии (1) белка, который требует гамма-карбоксилирования, и (2) витамин K-эпоксидоредуктазы, где белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 10:1 до 500:1. В другом воплощении белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 5:1 до 500:1.
Белок, который требует гамма-карбоксилирования, выбран из группы, состоящей из фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови FVII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови FIX, протромбина, фактора свертывания крови II, фактора свертывания крови FII, фактора свертывания крови X, фактора свертывания крови FX и их активированных форм FVIIa, FIXa, FXa, белка С, белка S, белка Z, костного белка Gla, матриксного белка Gla, белка 6, специфичного для задержки роста, протеаз змеиного яда, аналогичных факторам свертывания крови, таких как протеазы змеиного яда, подобные фактору X, и белок, подобный FXa Acanthophiinae.
В одном воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор свертывания крови, зависимый от витамина K. В другом воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор IX. В третьем воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протромбин. В четвертом воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор X. В пятом воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор VII.
Белок, который требует гамма-карбоксилирования, предпочтительно представляет собой человеческий белок, но все эукариотные белки охвачены данным изобретением. Витамин K-эпоксидоредуктаза предпочтительно представляет собой человеческий белок, но в настоящем изобретении могут быть использованы все эукариотические витамин K-эпоксидоредуктазы. γ-глутамилкарбоксилаза предпочтительно представляет собой человеческий белок, но в настоящем изобретении могут быть использованы все эукариотические γ-глутамилкарбоксилазы.
Согласно другому аспекту предложена генетически модифицированная эукариотическая клетка-хозяин, содержащая:
(1) полинуклеотид, кодирующий белок витамин K-эпоксидоредуктазу, где указанная последовательность, кодирующая белок витамин K-эпоксидоредуктазу, функциональным образом связана с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию белка витамин K-эпоксидоредуктазы указанной клеткой;
(2) полинуклеотид, кодирующий белок, требующий карбоксилирования белком γ-глутамилкарбоксилазой, функциональным образом связанный с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию указанного белка, требующего карбоксилирования, указанной клеткой;
(3) полинуклеотид, кодирующий гамма-глутамилкарбоксилазу, где указанная последовательность, кодирующая белок гамма-глутамилкарбоксилазу, функциональным образом связана с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию белка гамма-глутамилкарбоксилазы указанной клеткой.
В одном воплощении данная клетка способна экспрессировать белок витамин K-эпоксидоредуктазу и белок, требующий карбоксилирования, в соотношении по меньшей мере 1:10. В другом воплощении указанное соотношение составляет по меньшей мере 1:5.
Клетка-хозяин предпочтительно представляет собой эукариотическую клетку. Типичные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются, клетки насекомых, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих. Клетки млекопитающих являются особенно предпочтительными. Подходящие линии клеток млекопитающих включают клетки СНО, НЕK, N50, 293, Per С.6, ВНК и COS и их производные, но не ограничиваются ими. В одном воплощении клеткой-хозяином является клеточная линия млекопитающих CHO-S.
Согласно еще одному другому аспекту предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии. В одном воплощении данная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор. Первый промотор может быть в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1. В другом воплощении это соотношение составляет 5:1. Данный вектор также может содержать молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии. Указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, может содержать третий промотор, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1. В другом воплощении это соотношение составляет 5:1. Белок, который требует гамма-карбоксилирования, можно выбрать из группы, состоящей из фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови FVII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови FIX, протромбина, фактора свертывания крови II, фактора свертывания крови FII, фактора свертывания крови X, фактора свертывания крови FX и их активированных форм FVIIa, FIXa, FXa, протеаз змеиного яда, аналогичных факторам свертывания крови, таких как протеазы змеиного яда, подобные фактору Х и белку, подобному FXa Acanthophiinae, белка С, белка S, белка Z, костного Gla белка, матриксного Gla белка, белка 6, специфичного для задержки роста.
Согласно другому аспекту предложен способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий: (1) культивирование клетки, экспрессирующей рекомбинантный белок, который требует гамма-карбоксилирования, витамин K-эпоксидоредуктазу и γ-глутамилкарбоксилазу, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.
Указанная клетка экспрессирует белок, который требует гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктазу в соотношении по меньшей мере 10:1 при условиях, подходящих для экспрессии обоих белков.
Можно ожидать, что факторы свертывания крови, зависимые от витамина K (FII, FVII, FIX, FX и их активированные формы FIIa или тромбин, FVIIa, FIXa, FXa), полученные настоящим способом коэкспрессии с одним VKOR или в комбинации с GGGX, являются полезными при предупреждении и лечении кровотечения после травмы, хирургического вмешательства или заболеваний печени, почек, тромбоцитов или заболеваний, связанных с факторами свертывания крови (гемофилия). Подобным образом, можно ожидать, что фактор свертывания крови белок С и его активированная форма АРС являются полезными при предупреждении и лечении расстройств, связанных с повышенным свертыванием крови, в присутствии или в отсутствие пониженных уровней белка С. Данный способ также применим к другим белкам, которые требуют посттрансляционного карбоксилирования.
Настоящее изобретение будет применимо для улучшения продуктивности любого белка, который зависит от γ-карбоксилирования, причем такие белки включают протромбин, фактор свертывания крови II (FII), фактор свертывания крови VII (FVII), фактор свертывания крови IX (FIX), фактор свертывания крови Х (FX), белок С, белок S, белок Z, костный Gla белок (также известный как BGP или остеокальцин), матриксный Gla белок (MGP), обогащенный пролином Gla полипептид 1 (PRRG1), обогащенный пролином Gla полипептид 2 (PRRG2), белок 6, специфичный для задержки роста (Gas 6), но не ограничиваются ими. Другими подходящими белками являются: FXa-подобный белок в яде змей семейства Elapidae (пoдceмeйcтвa Acanthophiinae) и в яде конических улиток (Conus textile).
Каждый из этих белков, включая кодирующие их последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, является хорошо известным. Таблица 1 определяет репрезентативные последовательности дикого типа и мутантных форм разных белков, которые можно использовать в настоящем изобретении.
Будет понятно, что данное изобретение не ограничивается конкретным белком или последовательностью, кодирующей белок, одного из этих белков, подлежащих коэкспрессии. Кроме того и конкретно по отношению к факторам свертывания крови, в данной области были раскрыты многочисленные мутантные формы данных белков. Настоящее изобретение в равной степени приложимо к этим мутантным формам, включая встречающиеся в природе аллельные варианты, данных белков, а также к последовательностям дикого типа. В одном воплощении данное изобретение может иметь дело с любым белком дикого типа или с белком по меньшей мере с 90%-ной, предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательности с ним.
Идентичность последовательности между двумя последовательностями можно определить компьютерным анализом попарного выравнивания, используя такие программы, как BestFit, Gap или FrameAlign. Предпочтительным инструментом выравнивания является BestFit. На практике при поиске последовательностей, сходных/идентичных с запрашиваемой последовательностью, из базы данных последовательностей обычно необходимо проводить первоначальную идентификацию аналогичных последовательностей, используя подходящее программное обеспечение, такое как Blast, Blast2, NCBI Blast2, WashU Blast2, FastA, Fasta3 и PILEUP, и матрицу подсчета, такую как Blosum 62. Такие программные пакеты стремятся к близкому приближению к «золотому стандарту» алгоритма выравнивания Смита-Уотермана (Smith-Waterman). Таким образом, предпочтительное программное обеспечение/программное средство поиска для применения в оценке сходства, т.е. того, как две первичные полипептидные последовательности выравниваются, основано на алгоритме Смита-Уотермана. Термин «идентичность» относится к прямым соответствиям, термин «сходство» допускает консервативные замены.
Термин «витамин K-эпоксидоредуктаза» или «VKOR» в том виде, как он здесь используется, относится к ферменту, который катализирует восстановление эпоксида витамина K и витамина K с образованием восстановленного витамина K.
Витамин K-редуктазы являются широко распространенными, и они были клонированы из нескольких разных видов, таких как мышь (Mus musculus), крыса (Rattus norveigicus), курица (Gallus gallus) и крупный рогатый скот (Bos taurus). Гомологичные белки можно предсказать из последовательностей из организмов самого разнообразного филогенетического происхождения, таких как млекопитающие, птицы, земноводные, костистые рыбы, двукрылые, кинетопластиды и бактерии. Таблица 2 представляет неограничивающий список репрезентативных последовательностей предсказанных белков-гомологов человеческой VKOR (которые отсортированы согласно виду, из которого они происходят), которые можно использовать в настоящем изобретении.
Термин «γ-глутамилкарбоксилаза» или «GGCX» в том виде, как он здесь используется, относится к ферменту, зависимому от витамина К, который катализирует карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты.
Ферменты GGCX являются широко распространенными, и они были клонированы из многих разных видов, таких как белуха (Delphinapterus leucas), рыба-жаба (Opsanus tau), курица (Gallus gallus), миксина (Myxine glutinosa), мечехвост (Limulus polyphemus) и коническая улитка (Conus textile) (Begley et al., 2000, ibid; Bandyopadhyay et al. 2002, ibid). Карбоксилаза из конической улитки схожа с карбоксилазой крупного рогатого скота, и ее экспрессировали в клетках COS (Czerwiec et al. 2002, ibid). Другие белки, аналогичные GGCX, можно найти у насекомых и прокариот, таких как Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster и Leptospira с номерами доступа NCBI: gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281 и gi 24197548 (Bandyopadhyay et al. 2002, ibid) соответственно. Карбоксилазные ферменты демонстрируют замечательный эволюционный консерватизм. Несколько ферментов, не являющихся человеческими, показали, или для них можно было предсказать активность, аналогичную активности человеческой GGCX, которую использовали авторы данного изобретения, и, следовательно, их можно использовать в качестве альтернативы человеческому ферменту.
Таблица 3 определяет репрезентативные последовательности предсказываемых белков, гомологичных человеческой GGXC (отсортировано согласно виду, из которого они происходят), которые можно использовать в настоящем изобретении.
Каждый из определенных выше белков GGCX можно использовать в настоящем изобретении в качестве карбоксилазного фермента.
Одним способом осуществления коэкспрессии белков является применение разных промоторов в виде части соответствующих последовательностей контроля экспрессии. Данная область насыщена примерами разных векторов клонирования, промоторов и других последовательностей контроля экспрессии, которые способны к экспрессии гетерологичных белков до разного уровня или в разной степени. Методика рекомбинантной экспрессии является подходящим образом разработанной так, что специалист в области экспрессии белка способен выбрать промоторы и другие контрольные последовательности для осуществления коэкспрессии белка, требующего карбоксилирования, витамин K-эпоксидоредуктазы и, возможно, γ-карбоксилазы. Выбор того, какие конкретные промоторы и другие последовательности контроля экспрессии следует использовать, является вопросом иднивидуального выбора.
В одном воплощении контрольные последовательности, ассоциированные с белком, требующим гамма-карбоксилирования, содержат сильный промотор. В одном воплощении это - немедленный-ранний промотор человеческого цитомегаловируса (hCMV). Сильный промотор здесь определяется как промотор, дающий по меньшей мере в 5 раз более высокое число транскриптов мРНК, чем слабый промотор, используемый в той же самой клетке при аналогичных условиях.
В другом воплощении контрольные последовательности, ассоциированные с витамин K-эпоксидоредуктазой и, когда она присутствует, с γ-глутамилкарбоксилазой, содержат слабый промотор. В одном воплощении - это ранний промотор SV40. В другом воплощении белок, требующий гамма-карбоксилирования, витамин K-эпоксидоредуктаза и, возможно, γ-глутамилкарбоксилаза, находятся под контролем разных промоторных элементов с промотором, контролирующим экспрессию витамин K-эпоксидоредуктазы и, возможно, γ-глутамилкарбоксилазы, являющимся более слабым, чем промотор, контролирующий экспрессию белка, требующего гамма-карбоксилирования.
Данное изобретение было проиллюстрировано примерами использования сильного промотора CMV (Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985) для сверхэкспрессии фактора Х и более слабого промотора SV40 (Wenger et al. Anal Biochem 221:416-418, 1994) для контроля экспрессии витамин K-эпоксидоредуктазы и, возможно, экспрессии GGCX. Другой сильный промотор, который можно было использовать согласно настоящему изобретению, включает, но не ограничивается pEF-1α [ген субъединицы человеческого фактора элонгации 1α (Mizushima and Nagata, Nuc Acids Res 18:5322, 1990; Goldman et al., BioTechniques 21:1013-1015, 1996)], pRSV [вирус саркомы Рауса (German et al., Proc Natl Acad Sci USA 79:6777-6781, 1982)] и pUbC [человеческий убиквитин (Schorpp et al., Nuc Acids Res 24:1787-1788, 1996)].
Данное изобретение также распространяется на очищенный гамма-карбоксилированный белок, получаемый способами по настоящему изобретению, и на его применение в коагуляционной терапии.
Согласно еще одному другому аспекту данного изобретения предложен способ стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови у субъекта, включающий введение фармакологически эффективного количества выделенного гамма-карбоксилированного белка, полученного способами, описанными выше, пациенту, нуждающемуся в этом.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен способ получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови, включающий очистку активного карбоксилированного белка, экспрессируемого в клетке-хозяине, адаптированной для экспрессии белка, требующего гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилазы в соотношении по меньшей мере 5:1, и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
Композиции по изобретению можно получить традиционными методиками с использованием традиционных фармацевтических эксципиентов, хорошо известных в данной области, но вероятнее всего она будет находиться в форме, подходящей для инъекции либо парентерально, либо непосредственно в место поражения.
Порошки, подходящие для получения водного препарата для инъекции путем добавления подходящего разбавителя, обычно содержат активный ингредиент совместно с подходящими носителями и эксципиентами, суспендирующим агентом и одним или более чем одним стабилизатором или консервантом. Данный разбавитель может содержать другие подходящие эксципиенты, такие как консерванты, модификаторы тоничности и стабилизаторы.
Фармацевтические композиции по изобретению также могут находиться в форме эмульсий масло-в-воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, такое как оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, такое как, например, жидкий парафин, или смесь любых из этих масел. Подходящие эмульгаторы могут представлять собой, например, встречающиеся в природе камеди, такие как аравийская камедь или камедь трагаканта, встречающиеся в природе фосфатиды, такие как лецитин из соевых бобов, сложные эфиры или неполные эфиры, происходящие от жирных кислот или ангидридов гекситола (например сорбитанмоноолеат), и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.
Фармацевтические композиции по данному изобретению также могут находиться в форме стерильного раствора или суспензии в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, который можно приготовить согласно известным методикам, используя один или более чем один подходящий диспергирующий или увлажняющий агент и суспендирующий агент, которые были упомянуты выше. Стерильный инъецируемый препарат также может представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле.
Для дополнительной информации в отношении композиций читатель отсылается к Главе 25.2 в Томе 5 Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansh; председатель редакционного совета), Pergamon Press 1990; или к Тому 99 Drugs and the pharmaceutical sciences; Protein formulation and delivery (Eugen J. McNally, ответственный редактор), Marcel Dekker Inc. 2000.
Количество активного ингредиента, которое объединяют с одним или более чем одним эксципиентом для получения стандартной лекарственной формы с необходимостью будет варьировать в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, и конкретного пути введения. Например, композиция, предназначенная для инъекции человеку, обычно будет содержать, например, от 0,2 мг до 6 г или от 0,5 мг до 2 г активного агента, смешанного с подходящим и удобным количеством эксципиентов, которое может варьировать от примерно 5 до примерно 98 процентов от общей массы композиции. Стандартные лекарственные формы обычно будут содержать от примерно 0,2 мг до примерно 10 г или от примерно 1 мг до примерно 500 мг активного ингредиента. Белковые терапевтические агенты обычно хранят замороженными или лиофилизированными. Для дополнительной информации по путям введения и схемам дозирования читатель отсылается к Главе 25.3 в Томе 5 Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansh; председатель редакционного совета), Pergamon Press 1990.
Величина дозы соединения для терапевтических или профилактических целей естественно будет варьировать согласно природе и тяжести состояний, возрасту и полу животного или пациента и пути введения согласно хорошо известным принципам медицины. При использовании соединения для терапевтических или профилактических целей его обычно будут вводить так, чтобы получалась суточная доза в интервале, например, от 20 мкг до 75 мг на кг массы тела или от 0,5 мг до 75 мг на кг массы тела, которое, при необходимости, дают в раздельных дозах. В общем, при использовании парентерального пути будут вводиться меньшие дозы. Таким образом, например, для внутривенного введения обычно будет использоваться доза в интервале, например, от 20 мкг до 30 мг на кг массы тела или от 0,5 мг до 30 мг на кг массы тела. Аналогично, для введения ингаляцией будет использоваться доза в интервале, например, от 20 мкг до 30 мг на кг или от 0,5 мг до 25 мг на кг массы тела. В качестве альтернативы, данное соединение можно вводить в виде инфузии 1 мкг - 10 мг на кг массы тела в час на протяжении периода времени от нескольких часов до нескольких суток.
Экспериментальный раздел
Данное изобретение будет дополнительно описано следующими неограничивающими примерами.
При осуществлении настоящего изобретения на практике будут использоваться, если не указано иначе, традиционные способы молекулярной биологии и генной инженерии, находящиеся в пределах квалификации специалиста в данной области. Такие методики полностью раскрыты в литературе. Смотрите, например, Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (2002); Glover & Hames, eds., DNA Cloning 3: A Practical Approach, Vols. I, II & III, IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds., Methods in Enzymology, Academic Press; Weir et al., eds., Handbook of Experimental Immunology, 5th ed., Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh, (1997).
Пример 1
Для исследования важности VKOR в экспрессии карбоксилированных белков авторы данного изобретения экспрессировали человеческий фактор свертывания крови Х (FX) в клетках СНО. Полностью функциональный FX экспрессировали ранее Camire et al. 2000 (Biochemistry 39:14322-14329), которые получили приблизительно 1 мкг карбоксилированного FX на миллион клеток в сутки, и Himmelspach et al. 2000 (Thromb Res 97:51-67), которые заявили получение вплоть до 25% (19,5 мкг) активного FX на миллион клеток в сутки, используя линию клеток СНО, которую подвергали DHFR амплификации. Himmelspach et al. сообщали о неполном процессинге рекомбинантного FX, и действительно показанная максимальная продуктивность FX составляла 5 мкг/мл культуральной среды. В обеих публикациях клетки выращивали как прикрепленные клетки в среде, содержащей сыворотку. Клетки выращивали до желательной конфлюентности, среду заменяли средой, не содержащей сыворотки, и продолжали инкубацию для обеспечения накопления продукта. Затем оценивали количество продукта из этой «бессывороточной» среды. Эта методика культивирования не подходит для получения белка в большом масштабе, так как клетки будут вырабатывать продукт только в течение короткого периода времени. Кроме того, данный продукт будет загрязнен сывороточными белками, такими как бычий FX, что является крайне нежелательным, так как сывороточные белки будет трудно удалить, и они, в случае присутствия в продукте, инъецированном пациенту, могут вызвать образование антител. Таким образом, не было показано, что полученные линии клеток являются подходящими для промышленного получения фармацевтического FX.
Создание стабильных линий клеток, продуцирующих рекомбинантный человеческий фактор Х
Кодирующую последовательность FX ПЦР-амплифицировали из кДНК печени человека, используя праймеры:
F10F1: 5'-CACACCATGGGGCGCCCACT-3' (SEQ ID NO:2)
F10R1: 5'-GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA-3' (SEQ ID NO:3)
Клонирование продукта ПЦР сначала осуществляли ТА-ТОРО клонированием в pCDNA3.1-V5His (Invitrogen). Клоны, содержащие правильную последовательность FX, идентифицировали секвенированием ДНК и кратковременной экспрессией в клетках COS-7. Фрагмент с тупым концом, содержащий кодирующую последовательность FX, затем клонировали в вектор экспрессии nopА, расщепленный EcoRV и обработанный фосфатазой. Полученные клоны F10nopA (SEQ ID NO:6) подтверждали секвенированием ДНК вставленной последовательности и кратковременной экспрессией в COS-7.
Кодирующую последовательность VKOR ПЦР-амплифицировали из кДНК печени человека, используя праймеры:
VF1: 5'-CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA-3' (SEQ ID NO:4)
VR1: 5'-GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-3' (SEQ ID NO:5)
Клонирование продукта ПЦР сначала осуществляли ТА-ТОРО клонированием в pCDNA3.1-V5His (Invitrogen). Клоны, содержащие правильную кодирующую последовательность VKOR (SEQ ID NO:1), идентифицировали секвенированием ДНК. Фрагмент HindIII-NotI, содержащий последовательность VKOR, затем переносили в вектор экспрессии pZeoSV2+ (Invitrogen), расщепленный теми же самыми ферментами. Полученные клоны VKORzeo (SEQ ID NO:7) подтверждали секвенированием ДНК.
Клетки CHO-S (Invitrogen) выращивали в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) F12, содержащей Glutamax I и 9% FBS (фетальная бычья сыворотка), обработанную нагреванием, по существу как рекомендовано Invitrogen. Трансфекцию CHO-S осуществляли F10nopA, расщепленным PvuI (линеаризованным), VKORzeo, расщепленным SspI, и Lipofectamine 2000, по существу как рекомендовано Invitrogen. Смесь для трансфекции ДНК содержала 1,6-кратный молярный избыток F10NopA по сравнению с VKORzeo. В сутки после трансфекции трансфицированные клетки высевали в 96-луночные планшеты в селективную среду: ростовая среда плюс 400 мкг/мл G418. Таким образом, конструкт VKORzeo не был выбран, но был случайным образом интегрирован в G418-устойчивых трансфектантов. На следующие сутки проверяли планшеты для подтверждения получения подходящего числа клонов на лунку (5-10). Через шесть суток после трансфекции селективную среду заменяли ростовой средой, дополненной витамином К (1 мкг/мл). На следующие сутки отбирали образцы из планшетов и анализировали на активность FX, используя анализ, основанный на яде цепочной гадюки (RVV-X), который активирует FX до FXa. Затем измеряли активность FXa с использованием хромогенного субстрата (S2765, Chromogenix, Mölndal, Sweden). Анализ RVV-X эквивалентен анализу, использованному Himmelspach et al. для той же самой цели. Идентифицировали лунки с наивысшей активностью и содержащиеся в них клоны наращивали и подвергали клонированию при низкой плотности клеток. После клонирования при низкой плотности клеток и выбора лучших клонов выбранные клоны наращивали и переводили на рост в среде, не содержащей белка (CD-CHO, дополненная, как рекомендовано Invitrogen, плюс 1 мкг/мл витамина K). Продуктивность рекомбинантного FX оценивали в культурах в Т-колбах. Экспрессию VKOR оценивали анализами ПЦР в реальном времени. Обнаружили, что все выбранные клоны, экспрессирующие полностью активный FX, также экспрессировали VKOR. Из этого авторы данного изобретения заключают, что коэкспрессия VKOR улучшает экспрессию полностью активного человеческого фактора свертывания крови X. Полученные линии клеток хорошо растут в среде, не содержащей белка и животных компонентов, и продуцируют FX в отсутствие селективного давления антибиотиков. Полученные линии клеток, следовательно, считаются подходящими для продуцирования белка в большом масштабе и способны продуцировать большие количества активного FX. Доля полностью активного FX также является значительно более высокой, чем сообщали ранее.
Пример 2
Анализы продуктивности и соотношений мРНК для коэкспрессии FX, VKOR и GGCX
Клоны, полученные в Примере 1, выращивали в Т-колбах в химически определенной среде для СНО, не содержащей белков, без антибиотиков (Invitrogen). Пробы для получения кДНК отбирали из 4-суточных культур и пробы для оценок продуктивности отбирали из культур через 5 суток после обычного гидролиза. Контрольные пробы также получали из родительской нетрансфицированной линии клеток CHO-S, выращенной в той же самой среде, и анализы контрольных проб давали ожидаемые результаты. Спин-культуры выращивали в CD-CHO, дополненной или не дополненной добавками, не содержащими животные компоненты. Количество активного rhFX оценивали анализом, основанным на RVV-X, как в Примере 1, и на стандарте серийно разбавленного фактора X, происходящего из очищенной плазмы (Haematologic Technologies Inc., Vermont, USA). РНК выделяли с Trizol™ согласно протоколу, предоставленному поставщиком, Invitrogen. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой I из набора DNA-free™ от Ambion. Синтез кДНК проводили, используя гексамерные праймеры и содержимое набора из системы синтеза первой нити Superscript™ для ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой, Invitrogen). Праймеры и зонды, меченные Vic, для ОТ-ПЦР в реальном времени выбирали, используя программное обеспечение Primer Express™ от Applied Biosystems.
Олигонуклеотиды человеческой γ-карбоксилазы
5' ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3' прямой праймер (SEQ ID NO:8)
5' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3' обратный праймер (SEQ ID NO:9)
5' CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3' зонд (SEQ ID NO:10)
Олигонуклеотиды человеческого фактора Х
Праймеры были изготовлены Operon/Qiagen, и зонды были заказаны у Applied Biosystems.
5' CCGCAACAGCTGCAAGCT-3' прямой праймер (SEQ ID NO:11)
5' TGTCGTAGCCGGCACAGA-3' обратный праймер (SEQ ID NO:12)
5' CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG зонд (SEQ ID NO:13)
Олигонуклеотиды человеческого VKOR
5' GCTGGGCCTCTGTCCTGAT-3' прямой праймер Seq(SEQ ID NO:14)
5' ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC-3' обратный праймер Se(SEQ ID NO:15)
5' CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG зонд S(SEQ ID NO:16)
Также использовали контрольные праймеры и зонд GAPDH грызунов (Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan® Rodent GAPDH Control Reagents Protocol) - длина ампликона 177 п.н. Реакции ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на 7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems. Ожидаемую длину амплифицированных продуктов ПЦР подтверждали на агарозных гелях.
| Таблица 4 | ||||
| Результаты анализов клонов, экспрессирующих FX, ПЦР в реальном времени | ||||
| Название клона | FX мРНК/клетку | VKOR мРНК/клетку | GGCX мРНК/клетку | GAPDH мРНК/клетку |
| FX1-5 | 137 | 0,62 | 1 | 1553 |
| FX2-5 | 13 | 0,48 | 0,26 | 2985 |
| FX3-9 | 3 | 0,03 | 0,17 | 1891 |
| FX6 | 267 | 3 | 11 | 2289 |
| FX17-2 | 319 | 2 | 37 | 2381 |
| Таблица 5 | ||||
| Оценка продуктивности и соотношения мРНК. Соотношения рассчитывали из данных в таблице 4. Продуктивность оценивали из анализов активности разбавленных проб культуры | ||||
| Название клона | Соотношение FX:VKOR | Соотношение FX:GGCX | Активный FX мкг/мл Т-колбы | Активный FX мкг/мл спин-культуры |
| FX1-5 | 221:1 | 137:1 | 0,5 | не делали |
| FX2-5 | 27:1 | 50:1 | 2,4 | не делали |
| FX3-9 | 100:1 | 18:1 | 0,8 | не делали |
| FX6 | 89:1 | 24:1 | 6,9 | 14 |
| FX17-2 | 160:1 | 9:1 | 8,7 | 21 |
Все показатели продуктивности, перечисленные в Таблице 5, выше показателей продуктивностей, полученных ранее от неамплифицированных линий клеток. Оценка общей концентрации FX, включая неактивный FX, была проведена с использованием анализа Biacore и посредством SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и Вестерн-блоттинга.
Анализ Biacore для оценки концентрации общего rhFX
Аналитические системы BIAcore3000™, проточный буфер (10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, 3,4 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 0,05% Р20, рН 7,4), кроличьи антимышиные Fc в 0,15 М NaCl (RAM Fc, № партии 610) и сенсорные чипы СМ5 приобретали у Biacore AB (Uppsala, Sweden). Процедуру проводили при скорости тока 5 мкл/мин при 25°. Для ковалентного сочетания 11000 RU (крысиные единицы) улавливающего антитела RAM Fc (35 мкл, 30 мкг/мл в 10 мМ натрий-ацетате, рН 5,0) с каналом 4 чипа СМ5 использовали стандартизированную методику аминного сочетания (35 мкл время активации) при 25°. После иммобилизации регенерировали поверхность 5 мкл 10 мМ глицинового буфера, рН 1,8 и проводили дополнительное уравновешивание проточным буфером. С помощью 20 мкл тока мышиного моноклонального антитела IgG против FX N77121M (Biodesign, Maine, USA) (разбавленного 1/100 в проточном буфере) улавливали 660 RU. Связывание FX в среде приводило к образованию очень стабильного комплекса с пренебрежимо малой диссоциацией. Для каждой новой пробы FX поверхность RAM Fc воспроизводимо регенерировали для множественных сэндвич-экспериментов. Для количественной оценки связывания 5 мкл FX использовали разницу RU между каналом 4 со связанным RAM Fc и каналом 3 с чистой поверхностью. Прогоняли стандарт (2, 4, 6, 8, 10, 15 и 20 мкг/мл в среде) pdFX от Haematologic Technologies Inc. (Vermont, USA), разницу RU откладывали на графике по отношению к концентрации phFX и аппроксимировали к данным уравнение для одного сайта связывания. Разницу RU неизвестных проб использовали для расчета концентрации rhFX из стандартной кривой.
| Таблица 6 | |||
| Доля полностью активного продуцированного rhFX. Общее количество rhFX оценивали из проб спин-культуры, используя анализ Biacore, и количество активного rhFX оценивали анализом RVV-X. Все пробы происходят из спин-культур в ростовой среде, не содержащей животных компонентов | |||
| Клон/проба | Общий FX мкг/мл (анализ Biacore) | Активный FX мкг/мл (RVV-X) | % активного FX |
| FX17-2/p050131 | 18,6 | 10,1 | 54 |
| FX17-2/p050202 | 20,6 | 9,6 | 47 |
| FX17-2/p050225 | 11,8 | 12,1 | 103 |
| FX17-2/sp2050309 | 38,3 | 16,3 | 43 |
| FX17-2/sp1050309 | 25,1 | 13,6 | 54 |
| FX17-2/sp2050310 | 39,7 | 21,1 | 53 |
| FX17-2/sp1050310 | 28,1 | 13 | 46 |
Результаты в Таблице 6 показывают, что коэкспрессия VKOR увеличивает экспрессию полностью активного rhFX. Высокая доля (43-103%) полностью активного rhFX согласуется с данными SDS-PAGE, Вестерн-блоттинга и очистки белка.
Пример 3
Коэкспрессия человеческого протромбина, GGCX и VKOR
Для получения линии клеток, способной продуцировать высокие уровни полностью активного человеческого протромбина (hFII), авторы данного изобретения ранее коэкспрессировали зависимую от витамина К модификацию фермента γ-глутамилкарбоксилазы (GGCX) и hFII. Используя эту стратегию, авторы данного изобретения получили клон Р1Е2. Р1Е2 представляет собой высокопродуктивный клон, экспрессирующий rhFII, но, несмотря на то что экспрессия правильно модифицированного rhFII является значительно усиленной по сравнению с другими клонами, вырабатывающими FII, все же только 20-60% (в зависимости от условий культивирования) общего количества этого выработанного rhFII являются полностью γ-карбоксилированными. В попытке дополнительно улучшить уровень полностью γ-карбоксилированного rhFII и, следовательно, снизить стоимость выработки rhFII была протестирована новая стратегия экспрессии с использованием витамин K-эпоксидредуктазы (VKOR). Авторы данного изобретения клонировали VKOR в двух разных векторах под контролем двух разных промоторов: pCMV - в векторе рHygro, и pSV40 - в векторе pZeo. Установлено, что в клетках СНО промотор pCMV имеет приблизительно в 6 раз более высокую промоторную активность, чем промотор pSV40. Оба конструкта использовали в двух отдельных котрансфекциях для получения клеточных линий, вырабатывающих rhFII.
Создание линии клеток и оценки продуктивности
Создание линии клеток инициировали котрансфекциями CHO-S конструктом РР6 (кодирующим hFII и hGGCX) (SEQ ID NO:20) и любым из конструктов VKOR (Фиг.1-2). Молярные соотношения, используемые при данных трансфекциях, составляли 2:3 (PP6:VKOR). После посева и селекции трансфектантов в 96-луночных планшетах затем подвергали скринингу в общей сложности 5500-8500 клонов на трансфекцию, используя хромогенный анализ на основе экарина. После первоначального скрининга выбрали 18 пулов клонов. После второго скрининга выбрали 9 пулов клонов, нарастили их и подвергли третьему скрининговому анализу. Для каждой трансфекции выбирали лучший продуцирующий пул клонов для ограничивающего разбавления. В шесть 96-луночных планшетов высевали 0,5 клеток/лунку. Выбирали 24 клона и увеличивали их объем после скрининга. Так как не производилась селекция на векторы, кодирующие VKOR, провели анализ Taqman для подтверждения экспрессии VKOR. Во всех трех лучших выбранных клонах A3F4 (РР6/pZeoVKOR), В11Е8 и В9А12 (РР6/pHygroVKOR) определяли мРНК VKOR. Для оценки и сравнения продуктивности rhFII для клонов PP6/VKOR по сравнению с клоном Р1Е2 проводили четыре раунда экспериментов со спин-культурами.
| Таблица 7 | |||||
| Выработка rhFII в колбах для спин-культур | |||||
| Клеточ- ная линия |
ID пробы | Серия эксперимента | Активный rhFII (мкг/мл) | SPR (пг/клетку/сутки) | Доля активного rhFII (активный rhFII/общий rhFII в %) |
| A3F4 | 050317 | А | 10,3 | 1,38 | 100 |
| A3F4 | 050415 | Б | 27,6 | 1 | 100 |
| A3F4 | 050425 | В | 23 | 2,6 | 100 |
| В9А12 | 050317 | А | 10,3 | 0,84 | 68 |
| В9А12 | 050413 | Б | 27,4 | 1 | 100 |
| В9А12 | 050424 | В | 14,4 | 6,06 | 79 |
| В11Е8 | 050317 | А | 13 | 1,74 | 75 |
| В11Е8 | 050414 | Б | 27,4 | 2,2 | 80 |
| В11Е8 | 050424 | В | 22,2 | 4 | 78 |
| Р1Е2 | 050415 | Б | 37,6 | 2,1 | 61 |
| Р1Е2 | 050424 | В | 25,4 | 2,5 | 21 |
Новый подход для коэкспрессии VKOR, GGCX и rhFII привел к получению нескольких клонов, экспрессирующих rhFII, продуцирующих значительно более высокую долю (60-100%) полностью активного rhFII по сравнению с клоном Р1Е2 (20-60%, смотрите Таблицу 1). Для двух из клонов, В11Е8 и В9А12 (в обоих случаях котрансфекция РР6/рHygro VKOR), была получена более высокая удельная скорость продуцирования (количество активного белка, продуцированного на клетку в сутки, SPR), чем для клона Р1Е2, при тех же самых условиях культивирования. Клон A3F4 продуцировал 100% полностью карбоксилированного rhFII во всей серии экспериментов по культивированию. Этот клон имеет наивысшее отношение мРНК обоих модифицированных ферментов (GGCX и VKOR) по отношению к FII по сравнению с двумя другими клонами. Однако A3F4 не продуцирует больше полностью активного rhFII по сравнению с другими клонами.
Пример 4
Улучшенное γ-карбоксилирование путем сверхтрансфекции VKOR
Во второй попытке использовать VKOR для улучшения продуцирования rhFII клон Р1Е2 (Пример 3) модифицировали для коэкспрессии VKOR. В этом случае для трансфекции Р1Е2 (смотрите Приложение, Фиг.1) использовали конструкт pHydroVKOR (SEQ ID NO:22) и клоны подвергали скринингу на улучшенную продуктивность анализом активности протромбиназы. Всего 7000-8000 клонов подвергали скринингу, используя конечную точку анализа протромбиназы, адаптированного к 96-луночному формату. После первоначального скрининга выбирали шестнадцать пулов клонов. Выбранные пулы клонов наращивали и подвергали скринингу как анализом с экарином, так и анализом протромбиназы, для того, чтобы оценить долю активного rhFII. После этого скрининга выбирали и наращивали 6 пулов клонов. Выбирали три пула лучше всего продуцирующих клонов для клонирования ограниченным разведением. Выбирали двадцать восемь клонов, происходящих из всех трех пулов, и увеличивали их объем после первоначального протромбиназного скрининга. После второго скрининга выбирали восемь клонов и увеличивали их объем. Для подтверждения экспрессии VKOR в одном клоне из каждого клонированного пула проводили анализы Taqman. Во всех трех лучших выбранных клонах, M3F6, Р4А4 и O3G3, определяли мРНК VKOR. Для оценки продуктивности rhFII для клонов P1E2/VKOR по сравнению с родительским клоном Р1Е2 проводили три серии шейкерных или спин-культур.
Для подтверждения экспрессии VKOR в одном клоне из каждого клонированного пула проводили анализы Taqman. Во всех трех лучших выбранных клонах, M3F6, Р4А4 и O3G3, определяли мРНК VKOR. В силу процедур селекции и скрининга, использованных для получения этих клонов, считается, что они экспрессируют оптимальный уровень VKOR. Этот оптимальный уровень экспрессии дополнительно охарактеризован в Примере 5.
Родительскую линию клеток Р1Е2, не содержащую конструкта VKOR, выращивали параллельно при тех же самых условиях, что и контроль.
Результаты экспериментов по культивированию показали, что количество и доля активного rhFII варьировала при разных условиях культивирования, но для большинства серий количество полностью активного продуцированного rhFII было большим для новых клонов P1E2/VKOR, чем для исходной линии клеток Р1Е2.
Пример 5
Установление оптимальных соотношений экспрессии мРНК
Матричную РНК, полученную из линий клеток в Примере 4 и 5, анализировали ПЦР в реальном времени аналогично Примеру 3. Для GGCX и VKOR использовали те же самые олигонуклеотиды, что и в Примере 3.
Олигонуклеотиды для протромбина представляли собой следующее:
5' TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3' прямой праймер (SEQ ID NO:17)
5' CATCCGAGCCCTCCACAA 3' обратный праймер (SEQ ID NO:18)
5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3' зонд (SEQ ID NO:19)
| Таблица 9 | ||||
| Анализы соотношений мРНК при пиковой экспрессии человеческого протромбина (rhFII) | ||||
| Линия клеток | Соотношение мРНК FII/GGCX | Соотношение мРНК FII/VKOR | Соотношение мРНК VKOR/GGCX | Лучшая полученная продуктивность* (активный rhFII мг/л) |
| A3F4 | 5 | 13 | 0,4 | 27,6 |
| В9А12 | 86 | 32 | 3 | 27,4 |
| В11Е8 | 29 | 33 | 0,9 | 27,4 |
| M3F6 | 304 | 15 | 20 | 74,7 |
| O3G3 | 218 | 17 | 13 | 76,8 |
| Р4А4 | 255 | 128 | 2 | 64,2 |
| Р1Е2 (контроль без VKOR) | 221 | VKOR не определяется | VKOR не определяется | 48,4 |
| * Измерение продуктивности, проведенное при аналогичных условиях в спин-колбах или шейкерных колбах | ||||
Результаты в таблице 9 показывают, что существует оптимальный уровень экспрессии GGCX и VKOR по отношению к выработанному γ-карбоксилированному белку. Клоны M3F4, O3G3 и Р4А4 получали трансфекцией Р1Е2 (полученного ранее трансфекцией конструктом, содержащим rhFII+GGCX) конструктом, содержащим VKOR, под контролем сильного промотора CMV. Скрининг проводили анализом, специфически определяющим клоны с улучшенной продуктивностью полностью активного rhFII. Таким образом, выбрали клоны с оптимальным уровнем экспрессии VKOR по отношению к rhFII и GGCX.
Матричную РНК, полученную из линий клеток в Примерах 4 и 5, анализировали ПЦР в реальном времени аналогично Примеру 3. Все анализы включали контрольную реакцию с GAPDH, как и в Примере 3.
Claims (20)
1. Эукариотическая клетка-хозяин для продуцирования гамма-карбоксилированного белка, содержащая вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и
вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, где данная клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, где данная клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.
2. Клетка-хозяин по п.1, где
указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и
указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин К-
эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор,
где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и
указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин К-
эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор,
где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
3. Клетка-хозяин по п.2, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.
4. Клетка-хозяин по п.2, где первый промотор представляет собой немедленный-ранний промотор человеческого цитомегаловируса (hCMV), и второй промотор представляет собой ранний промотор SV40.
5. Клетка-хозяин по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, дополнительно содержит третий промотор, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.
6. Клетка-хозяин по п.5, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.
7. Клетка-хозяин по п.5, где третий промотор представляет собой ранний промотор SV40.
8. Клетка-хозяин по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу, находятся в одном векторе экспрессии.
9. Клетка-хозяин по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении от 5:1 до 500:1.
10. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, выбран из группы, состоящей из фактора свертывания крови FVII, фактора свертывания крови FIX, протромбина, фактора свертывания крови FX, FVIIa, FIXa, FXa, протеаз змеиного яда, подобных фактору X, белка С, белка S, белка Z, костного Gla белка, матриксного Gla белка, белка 6, специфичного для задержки роста.
11. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор свертывания крови, зависимый от витамина К.
12. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор FIX.
13. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой FX.
14. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протеазы змеиного яда, подобные фактору X.
15. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протромбин.
16. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой FVII.
17. Клетка по любому из пп.1-16, которая представляет собой клетку млекопитающего.
18. Способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий (1) культивирование клетки по любому из пп.1-17 и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.
19. Способ по п.18, где указанная клетка экспрессирует белок, который требует гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктазу в соотношении по меньшей мере 10:1 при условиях, подходящих для экспрессии обоих белков.
20. Способ получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови или стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови, включающий получение активного карбоксилированного белка по любому из пп.18 или 19, очистку указанного белка и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0500831 | 2005-04-13 | ||
| SE0500831-3 | 2005-04-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007140550A RU2007140550A (ru) | 2009-05-20 |
| RU2415934C2 true RU2415934C2 (ru) | 2011-04-10 |
Family
ID=37087286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007140550/10A RU2415934C2 (ru) | 2005-04-13 | 2006-04-10 | Клетка-хозяин, содержащая вектор для продуцирования белков, требующих гамма-карбоксилирования |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7989193B2 (ru) |
| EP (1) | EP1874928A1 (ru) |
| JP (1) | JP5461008B2 (ru) |
| KR (2) | KR20130140221A (ru) |
| CN (1) | CN101198696B (ru) |
| AR (1) | AR053053A1 (ru) |
| AU (1) | AU2006234788B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0609120A2 (ru) |
| CA (1) | CA2602793C (ru) |
| IL (1) | IL186036A0 (ru) |
| MX (1) | MX2007012704A (ru) |
| NO (1) | NO20075088L (ru) |
| NZ (1) | NZ561925A (ru) |
| RU (1) | RU2415934C2 (ru) |
| TW (1) | TWI384070B (ru) |
| WO (1) | WO2006110083A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200708222B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2825633C1 (ru) * | 2019-09-20 | 2024-08-28 | Зилэнд Фарма А/С | БЛОКАТОРЫ Kv1.3 |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006101474A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-28 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins |
| JP2007506433A (ja) | 2003-09-23 | 2007-03-22 | ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル | ビタミンｋエポキシド還元酵素遺伝子内の一塩基多型とワルファリン用量とを相関させるための方法および組成物 |
| GB0324044D0 (en) | 2003-10-14 | 2003-11-19 | Astrazeneca Ab | Protein |
| CA2602793C (en) | 2005-04-13 | 2016-11-22 | Astrazeneca Ab | A host cell comprising a vector for production of proteins requiring gamma-carboxylation |
| CA2632794C (en) * | 2005-12-02 | 2015-04-07 | Wake Forest University Health Sciences | Compositions and methods for increasing production of recombinant gamma-carboxylated proteins |
| DK1969127T4 (en) * | 2005-12-21 | 2017-10-16 | Cnj Holdings Inc | Process for the preparation of biologically active vitamin K-dependent proteins by recombinant methods |
| US8206967B2 (en) | 2007-07-06 | 2012-06-26 | Medimmune Limited | Method for production of recombinant human thrombin |
| EP2245171A2 (en) * | 2008-02-01 | 2010-11-03 | Chromocell Corporation | Cell lines and methods for making and using them |
| WO2010088630A2 (en) * | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Chromocell Corporation | Cell lines expressing cftr and methods of using them |
| WO2012088222A2 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins |
| EP2816108A1 (en) * | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Baxter International Inc | Transformed fungus with vitamin K dependent activity |
| CN104293737B (zh) * | 2014-09-16 | 2017-06-13 | 太原博奥特生物技术有限公司 | 一种包含表达功能性重组人凝血因子ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法 |
| CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN106317226B (zh) | 2016-08-19 | 2017-09-05 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 用于构建融合蛋白的连接肽 |
| WO2018032638A1 (zh) | 2016-08-19 | 2018-02-22 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 用于构建融合蛋白的连接肽 |
| CN111239386B (zh) * | 2020-01-20 | 2023-03-14 | 河南科技大学 | 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用 |
| CN111154725A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-15 | 河南科技大学 | 一种用于筛选维生素k循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系、制备方法及其应用 |
| US11981718B2 (en) | 2020-05-27 | 2024-05-14 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |
| KR102665227B1 (ko) * | 2021-06-30 | 2024-05-10 | 씨제이제일제당 주식회사 | 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법 |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3043857A1 (de) | 1980-11-21 | 1982-07-08 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur herstellung von blutgerinnungsfaktoren und danach hergestellte praeparation der faktoren ii und vii |
| US4599308A (en) | 1981-10-06 | 1986-07-08 | Hamer Dean H | Protein from SV40 recombinants |
| EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
| GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| EP0289586A4 (en) | 1986-11-17 | 1990-04-10 | New England Medical Ct | INCREASING GAMMA CARBOXYLATION OF RECOMBINANT, VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS. |
| US6224864B1 (en) | 1986-12-03 | 2001-05-01 | Pharmacia & Upjohn Company | Antibiotic 10381A, and process for the preparation of anitbiotics 10381B |
| EP0380508A4 (en) * | 1987-05-18 | 1991-04-03 | Integrated Genetics, Inc. | Improved protein c molecules and method for making and activating same |
| US5648254A (en) | 1988-01-15 | 1997-07-15 | Zymogenetics, Inc. | Co-expression in eukaryotic cells |
| US5118614A (en) | 1988-01-18 | 1992-06-02 | Tessek Sdruzeni Praha | Concentrates of coagulation factors ii, vii, ix and x, method of their preparation and use |
| JPH05508551A (ja) | 1990-07-23 | 1993-12-02 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | ガンマーカルボキシラーゼおよび使用の方法 |
| US5965789A (en) * | 1991-01-11 | 1999-10-12 | American Red Cross | Engineering protein posttranslational modification by PACE/furin in transgenic non-human mammals |
| US5268275A (en) | 1991-05-08 | 1993-12-07 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Vitamin K-dependent carboxylase |
| US5219995A (en) | 1992-07-14 | 1993-06-15 | Alpha Therapeutic Corporation | Plasma fraction purification |
| US6015686A (en) * | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
| US5639661A (en) | 1994-03-23 | 1997-06-17 | The University Of Iowa Research Foundation | Genes and proteins for treating cystic fibrosis |
| DE4430204A1 (de) | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, welches als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet ist und seine Verwendung |
| ES2241030T3 (es) | 1996-03-20 | 2005-10-16 | Baxter Aktiengesellschaft | Preparado farmaceutico para el tratamiento de alteraciones de la coagulacion sanguinea. |
| JP2002500011A (ja) | 1997-12-24 | 2002-01-08 | イミュネックス・コーポレーション | Ｖ２０１ｄｎａ及びポリペプチド |
| EP1196610A2 (en) | 1999-07-09 | 2002-04-17 | Cohesion Technologies, Inc. | Ecarin polypeptides, polynucleotides encoding ecarin, and methods for use thereof |
| AU6366100A (en) | 1999-07-23 | 2001-02-13 | Case Western Reserve University | Novel methods and reagents for the treatment of osteoarthritis |
| US20020106381A1 (en) | 2000-06-13 | 2002-08-08 | High Katherine A. | Methods for administering recombinant adeno-associated virus virions to humans previously exposed to adeno-associated virus |
| EP2311943A3 (en) | 2000-10-02 | 2011-05-04 | Novo Nordisk Health Care AG | Factor VII glycoforms |
| WO2003004647A1 (fr) | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Ecarine genetiquement modifiee et procede d'elaboration |
| US7635577B2 (en) | 2001-07-06 | 2009-12-22 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Process for producing human thrombin by gene modification technique |
| CN1254273C (zh) | 2001-07-10 | 2006-05-03 | 财团法人化学及血清疗法研究所 | 药学上稳定的止血组合物 |
| JP2007506433A (ja) * | 2003-09-23 | 2007-03-22 | ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル | ビタミンｋエポキシド還元酵素遺伝子内の一塩基多型とワルファリン用量とを相関させるための方法および組成物 |
| GB0324044D0 (en) * | 2003-10-14 | 2003-11-19 | Astrazeneca Ab | Protein |
| ES2379764T3 (es) | 2003-10-14 | 2012-05-03 | Baxter International Inc. | Polipéptido VKORC1 de reciclaje de la vitamina K-epóxido, una diana terapéutica de la curamina y sus derivados |
| DE602004026759D1 (de) | 2003-10-24 | 2010-06-02 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Neue rekombinante tierzellen mit hoher proteinproduktion, verfahren zur konstruktion davon sowie verfahren zur massenproduktion von protein unter verwendung davon |
| JP2008523837A (ja) | 2004-12-21 | 2008-07-10 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | ガンマ―カルボキシル化に欠陥のある宿主系におけるガンマ―カルボキシル化ポリペプチドの発現 |
| CA2602793C (en) | 2005-04-13 | 2016-11-22 | Astrazeneca Ab | A host cell comprising a vector for production of proteins requiring gamma-carboxylation |
| CA2632794C (en) | 2005-12-02 | 2015-04-07 | Wake Forest University Health Sciences | Compositions and methods for increasing production of recombinant gamma-carboxylated proteins |
| DK1969127T4 (en) | 2005-12-21 | 2017-10-16 | Cnj Holdings Inc | Process for the preparation of biologically active vitamin K-dependent proteins by recombinant methods |
| US8206967B2 (en) | 2007-07-06 | 2012-06-26 | Medimmune Limited | Method for production of recombinant human thrombin |
-
2006
- 2006-04-10 CA CA2602793A patent/CA2602793C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-10 KR KR1020137031720A patent/KR20130140221A/ko not_active Ceased
- 2006-04-10 US US11/572,870 patent/US7989193B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-10 WO PCT/SE2006/000426 patent/WO2006110083A1/en active Application Filing
- 2006-04-10 KR KR1020077026252A patent/KR101599062B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-10 NZ NZ561925A patent/NZ561925A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-04-10 JP JP2008506406A patent/JP5461008B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-10 EP EP06733282A patent/EP1874928A1/en not_active Withdrawn
- 2006-04-10 RU RU2007140550/10A patent/RU2415934C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-04-10 MX MX2007012704A patent/MX2007012704A/es active IP Right Grant
- 2006-04-10 AU AU2006234788A patent/AU2006234788B2/en not_active Ceased
- 2006-04-10 BR BRPI0609120-2A patent/BRPI0609120A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-04-10 CN CN200680020955.7A patent/CN101198696B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-11 AR ARP060101428A patent/AR053053A1/es unknown
- 2006-04-13 TW TW095113200A patent/TWI384070B/zh not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-18 IL IL186036A patent/IL186036A0/en unknown
- 2007-09-26 ZA ZA200708222A patent/ZA200708222B/xx unknown
- 2007-10-09 NO NO20075088A patent/NO20075088L/no not_active Application Discontinuation
-
2011
- 2011-06-23 US US13/167,134 patent/US8304224B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-10-31 US US13/665,441 patent/US20130065295A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HALLGREN K.W. et.al. Carboxylase overexpression effects full carboxylation but poor release and secretion of factor IX: implications for the release of vitamin K-dependent proteins. Biochemistry. 2002 Dec 17, 41(50): 15045-55. ГЛИК Б. ПАСТЕРНАК ДЖ. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: МИР, 2002, с.149-154. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2825633C1 (ru) * | 2019-09-20 | 2024-08-28 | Зилэнд Фарма А/С | БЛОКАТОРЫ Kv1.3 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20130065295A1 (en) | 2013-03-14 |
| US20080312127A1 (en) | 2008-12-18 |
| BRPI0609120A2 (pt) | 2010-11-16 |
| NO20075088L (no) | 2007-11-12 |
| CA2602793C (en) | 2016-11-22 |
| NZ561925A (en) | 2010-04-30 |
| US7989193B2 (en) | 2011-08-02 |
| KR101599062B1 (ko) | 2016-03-02 |
| ZA200708222B (en) | 2008-11-26 |
| AU2006234788A1 (en) | 2006-10-19 |
| KR20130140221A (ko) | 2013-12-23 |
| EP1874928A1 (en) | 2008-01-09 |
| CN101198696A (zh) | 2008-06-11 |
| WO2006110083A1 (en) | 2006-10-19 |
| RU2007140550A (ru) | 2009-05-20 |
| CN101198696B (zh) | 2014-02-26 |
| AU2006234788B2 (en) | 2011-07-14 |
| IL186036A0 (en) | 2008-02-09 |
| JP5461008B2 (ja) | 2014-04-02 |
| US8304224B2 (en) | 2012-11-06 |
| TW200716753A (en) | 2007-05-01 |
| AR053053A1 (es) | 2007-04-18 |
| MX2007012704A (es) | 2008-01-14 |
| CA2602793A1 (en) | 2006-10-19 |
| TWI384070B (zh) | 2013-02-01 |
| KR20080002949A (ko) | 2008-01-04 |
| US20120077229A1 (en) | 2012-03-29 |
| JP2008535517A (ja) | 2008-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2415934C2 (ru) | Клетка-хозяин, содержащая вектор для продуцирования белков, требующих гамма-карбоксилирования | |
| US8697440B2 (en) | Compositions and methods for producing gamma-carboxylated proteins | |
| EP2108045B1 (en) | Improved fix-mutant proteins for hemophilia b treatment | |
| KR101942619B1 (ko) | 인자 ｘ 돌연변이체 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190411 |