CN104293737B

CN104293737B - 一种包含表达功能性重组人凝血因子ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法

Info

Publication number: CN104293737B
Application number: CN201410470196.0A
Authority: CN
Inventors: 张全爱; 赵邑; 张禄卿; 郑耀武; 何永吉; 潘薇薇; 赵峰梅; 梁雅丽; 曹鹏程; 赵亚蕊
Original assignee: TAIYUAN BO-AO-TE BIOTECH Ltd
Current assignee: Shanxi Boaote Medical Laboratory Co.,Ltd.
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2014-09-16
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2034-09-16
Also published as: CN104293737A

Abstract

一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法，目的是构建含FⅦ、GGCX及VKORC1重组核酸的表达载体，利用GGCX及VKORC1的协同表达提高重组FⅦ的g‑羧基化修饰；本发明宿主细胞包含编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸；高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法包括构建一种表达载体，利用脂质体法将该表达载体介导进入DHFR缺陷型CHO动物细胞内，DMEM培养基筛选阳性克隆；无血清驯化培养该宿主细胞株；利用镍离子亲和层析纯化hFⅦ重组蛋白，SDS‑PAGE及Western blot检测；凝血酶原时间(PT)测定FⅦ重组蛋白促凝血活性。

Description

一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及包含一种表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含：编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸。其中小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX），及人凝血因子Ⅶ（FⅦ）在所述的宿主细胞中均获得稳定表达。本发明同时还涉及一种可高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法，该宿主细胞在特定条件和规模下培养可显著提高功能性人凝血因子Ⅶ的产率。

背景技术

凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ, FⅦ)是一种维生素K依赖的单链糖蛋白，主要由肝脏合成，是凝血块形成起始的关键分子之一，在凝血过程中发挥着极其重要的作用。FⅦ主要通过与组织因子（tissue facter, TF）结合，形成TF-FⅦ复合物，从而启动外源凝血途径，并对内源性凝血途径具有特殊的调控作用。人FⅦ在血浆中主要以酶原形式存在，当FⅦ的Arg₁₅₂-Ile₁₅₃之间的肽链裂解后，由单链形式转变为双链形式，形成活性FⅦa。FⅦa由含153个氨基酸、分子量为20 kDa的轻链，含254个氨基酸、分子量为30 kDa的重链，通过原135位和262位氨基酸之间形成的二硫键连接。临床研究表明, FⅦ对血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大面积外科手术的止血具有令人满意的治疗效果。而目前药用FⅦ的主要来源为血浆提取，但血浆中FⅦ含量很低，仅有200-400 mg/ml，难以满足临床需要；同时血浆提取制备工艺复杂，批间差异较大、稳定性较差；而且以血浆作为原料，大大增加了外源病毒的感染风险。

血浆提取制备FⅦ，由于含量有限、工艺复杂、感染风险等原因而受到限制，基因重组制备FⅦ成为开发和研究的重点，而基因工程技术的发展也为FⅦ的体外重组制备提供了可能。FⅦ的凝血活性功能需要复杂的翻译后加工，包括谷氨酸的g-羧基化、天冬氨酸的β-羟基化、N-糖基化、O-糖基化等，因此必须利用具有复杂的蛋白后加工的真核表达系统来完成。目前已有包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统的多种FⅦ重组制备策略被公开(参见CN101376875A, CN102321668A, CN101906438A )，在一定程度上实现了FⅦ的重组表达。然而其中具有g-羧基谷氨酸区修饰的功能性重组蛋白却含量甚少，成为阻碍其进一步开发利用的瓶颈。g-羧基谷氨酸区（也称“Gla”区）的翻译后修饰，是FⅦ保持凝血活性的关键。而Gla修饰，是g氨基酸羧化酶（GGCX）在还原型维生素K辅酶作用下的结果(de VisserMC, Roshani S, Rutten JW, van Hylckama Vlieg A, Vos HL, Rosendaal FR, ReitsmaPH., 2011. Haplotypes of VKORC1, NQO1 and GGCX, their effect on activitylevels of vitamin K-dependent coagulation factors, and the risk of venousthrombosis.Thromb Haemost.106(3):563-565.)。在Gla修饰中，还原型维生素K被GGCX氧化形成维生素K环氧化物，然后维生素K环氧化物又被还原酶复合体亚基1（VKORC1）再循环为还原型维生素K参与羧基化修饰。因此，GGCX和VKORC1是FⅦ进行谷氨酸g-羧基化、保证凝血活性的关键酶蛋白。然而研究发现，细胞培养基中外源维生素K的添加，无法提高FⅦ的表达水平（参见CN101124320A）；FⅦ与VKORC1的共表达对其表达水平的提高也贡献有限（参见CN101124320A）；且与GGCX的协同表达，也难以实现功能性FⅦ的有效释放（参见CN101124320A）。因此，VKORC1作用下还原型维生素K的供应形式，是该反应的限速步骤；GGCX和 VKORC1的协同作用是活性FⅦ稳定高水平表达的关键。已有报道通过FⅦ、GGCX及VKORC1的共表达在一定程度上提升提高了功能性FⅦ的表达水平（参见CN101198696A）。然而由于不同启动子之间的启动强度差异，以及外源基因片段过大，共表达基因之间的相互影响，导致功能性FⅦ的整体生产率依然较低。绝缘体是一类独特的染色质调控元件，可通过阻止异染色质扩散，降低共表达单元相互影响，维持被保护基因的持续表达，从而有效提高目的基因的表达水平（参见CN101285072A）。通过插入绝缘子基因单元提高外源基因的转录和合成水平，是目前活性蛋白质制备的一种有效策略。

发明内容

本发明的目的是克服上述已有技术的不足，通过基因重组技术，构建含FⅦ、GGCX及VKORC1重组核酸的表达载体，利用GGCX及VKORC1的协同表达提高重组FⅦ的g-羧基化修饰，同时引入绝缘子insulator（4X）重组核酸，通过脂质体转染和亚克隆筛选提供一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞；同时利用氨甲喋呤(amethopterin, MTX)梯度加压筛选及金属亲和层析，提供一种可高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法。

本发明第一方面，提供了一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于包含：编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸；其中FⅦ、VKORC1和GGCX在宿主细胞中均获得稳定表达。

其中，编码维生素K依赖的FⅦ重组核酸和二氢叶酸还原酶（DHFR）重组核酸通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，利用CAG启动子（CMV early enhancericken beta actinpromoter，由AG promoter和hCMV-IE enhancer组成）启动；编码VKORC1重组核酸和GGCX重组核酸同样通过IRES连接，CAG启动子启动；且两个启动子组成的重组核酸表达单元通过绝缘子insulator（4X）重组核酸隔离。所述宿主细胞为DHFR缺陷型CHO哺乳细胞。

所述的绝缘子insulator（4X）由经部分改造的鸡HS4绝缘体单元4倍串联而成；经改造的鸡HS4绝缘体重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；绝缘子insulator（4X）插入位置为两个启动子组成的重组核酸表达单元的下游；

所述编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸其核苷酸序列为SEQ IDNO:2；所述编码小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸其核苷酸序列为SEQ IDNO:3；所述编码小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:4；

所述表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体从上游到下游依次包含以下表达元件：

1）第一启动子，所述启动子选自CAG promoter（CMV early enhancericken betaactin promoter）；

2）人凝血因子Ⅶ（FⅦ）cDNA基因；

3）内部核糖体进入位点（IRES），连接筛选基因二氢叶酸还原酶基因（DHFR），利用同

一个启动子启动目的基因FⅦ和筛选基因DHFR的表达，有利于通过筛选基因的扩增提高目的基因的扩增；

4）筛选基因二氢叶酸还原酶基因（DHFR）；

5）第二启动子，所述启动子同样选择CAG promoter；

6）小鼠维生素K还原酶复合体亚基1基因（VKORC1）；

7）内部核糖体进入位点（IRES），连接VKORC1和GGCX基因，通过同一启动子

CAG promoter实现双基因的协同表达；

8）小鼠g氨基酸羧化酶基因（mGGCX）；

9）绝缘子insulator（4X），降低外源基因之间的相互影响，提高活性FⅦ的整体生产率；

本发明还提供了一种可高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法，所述方法包括：

1）构建一种表达载体，该表达载体中FⅦ重组核酸通过IRES与DHFR重组核酸连接，由CAG启动子启动共表达；同时含有CAG启动子启动、由IRES连接VKORC1重组核酸和mGGCX重组核酸组成的表达单元；两个重组核酸表达单元由绝缘子insulator（4X）重组核酸隔离；

2）利用脂质体法将1）所述表达载体介导进入DHFR缺陷型CHO动物细胞内，通过DMEM培养基筛选阳性克隆；利用有限稀释法亚克隆稳定表达细胞株；挑选高表达阳性克隆扩大培养，氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选，提高FⅦ表达水平；

3）无血清驯化培养该宿主细胞株；

4）利用镍离子亲和层析纯化FⅦ重组蛋白，SDS-PAGE及Western blot检测；

5）凝血酶原时间(PT)测定FⅦ重组蛋白促凝血活性。

与现有技术相比，本发明通过FⅦ、GGCX及VKORC1的共表达，实现了FⅦ保持其凝血活性关键的谷氨酸的g--羧基化修饰；在FⅦ和DHFR基因单元、GGCX和VKORC1基因单元之间插入绝缘子insulator（4X），避免了基因之间的相互影响，大大增加了基因表达的协同性，提高了功能性FⅦ的表达水平；利用DHFR系统，通过MTX加压筛选，获得高表达细胞株。

附图说明

图1为高效表达活性人凝血因子Ⅶ的真核表达质粒构建流程图；图2为人凝血因子Ⅶ的SDS-PAGE分析结果；图2中，M为标准蛋白质分子量，1为重组人凝血因子Ⅶ纯化样；图3为人凝血因子Ⅶ的Wester Blot分析结果；图3中，1、2、3、4为重组人凝血因子Ⅶ纯化样。

具体实施方式

实施例1：功能性重组人凝血因子Ⅶ表达载体pInsulator4x-CAGGS-VKORC1-GGCX-

FVII的构建；

(1) 人凝血因子Ⅶ（FⅦ）、小鼠维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORCl)和小鼠γ-谷氨酰基羧化酶（GGCX）基因克隆。

分别取人胎肝组织、小鼠肝组织，利用TRIZOLLS试剂盒提取制备总RNA，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性；以总RNA作为模版，采用Oligo（dT）为引物，按照试剂盒使用说明合成cDNA第一链；以各自逆转录反应产物为模版，分别以设计合成的FVII、GGCX和VKORC引物扩增目的片段。PCR反应体系如下：cDNA 模板10 ul、25mmol/L 10×PCRBuffer 5 ul、25mmol/L Mg^2＋ 1.5 ul、引物（10mmol/L）各2.5 ul、Tag DNA酶2.5 ul和10mmol/L dNTP 5 ul，加ddH₂O至50 ul。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，以94℃变性30 s，55.5 ℃(FVII)或60.0 ℃(GGCX)或65.0 ℃(VKORC)退火50 s，70 ℃延伸1 min，再延伸10min，共30个循环，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后4 ℃保存待用。

FⅦ(Genbank:NM-019616.3)、VKORCl (Genbank:NM-178600) 和GGCX(Genbank:

NM-019802.5)基因RT-PCR引物设计如下：

GGCX-For : ACCGGTCCACCATGGCTGTGCACCGCGGCTC (Age I)

GGCX-Rev: GGATCCTTAGAACTCAGAGTGAACATGCTCAG (Bam HI)

VKORC1- For: GCGGCCGCCACCATGGGCACCACCTGGAGGAGC (Not I)

VKORC1- Rev: CTCGAGTTAGTGCTTTTTGGTCTTGTGTTCTG（Xho I）

FⅦ-For: ATATGCGGCCGCCACCATGGTCTCCCAG (Not I)

FⅦ-Rev: CGCGCAATTGTTAGGGAAATGGGGCTC (Mun I)

将鉴定正确的PCR产物利用胶回收试剂盒纯化后与pGEM-T载体按照3：1（mol/mol）的比例，在T4 DNA连接酶作用下16 ℃过夜连接，然后转化E.coli DH5α感受态细胞。转化液涂布于LB琼脂平板上（含氨苄青霉素0.1 mg/ml，IPTG 4 mmol/ml，X-gal 0.8 mg/L），37 ℃孵育过夜。挑取白色单菌摇菌，小量提取质粒DNA，酶切鉴定（FⅦ:1401 bp; VKORC1 :504bp; GGCX: 2291 bp），对重组子进行DNA测序分析（由上海生工生物工程有限公司完成）。

(2) pCAGGS-IRES-AscI载体构建

从载体pCAGGS出发，进行载体改造，引入IRES单元和AscI酶切位点。主要通过以下方案实施完成：

1) pCAGGS- AscI载体构建

根据pCAGGS载体上酶切位点，设计linker-AscI-For:AGCTGGCGCGCC；linker-AscI-Rev:

GATCGGCGCGCC，用PCR仪温度95 ℃逐渐降低褪火温度，形成双链linker。HindIII和BamHI双酶切pCAGGS，胶回收4280 bp酶切产物，其与双链linker 4 ℃过夜连接形成pCAGGS-AscI。将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞后，用LB/Amp+ 平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mL LB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，XhoI和AscI双酶切，目的片段为558 bp、3734 bp和HindIII、BamH I分别单酶切鉴定，pCAGGS- AscI载体不能被酶切。

2) pCAGGS-linker-1st-AscI载体构建

根据构建载体需要设计linker:pCAGGS-linker-F1: AATTCGATATCGGATCCACCGGTGC

GGCCGCCGTCTCGAGCTTGAGCTCGGGA；pCAGGS-linker-R1: GATCTCCCGAGCTCAA

GCTCGAGACGGCTAGCGCGGCCGCACCGGTGGATCCGATATCG，用PCR仪温度95 ℃逐渐降低褪火温度，形成双链pCAGGS-linker1。BgIII和EcoRI双酶切pCAGGS- AscI，胶回收4291 bp酶切产物，其与双链pCAGGS-linker 4 ℃过夜连接形成pCAGGS-linker-1st-AscI。再将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞后，用LB/Amp+ 平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mL LB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，XbaI和SacI双酶切鉴定，目的片段为150bp、4109 bp。

3) pCAGGS-linker-2nd-AscI载体构建

根据构建载体需要设计linker:pCAGGS-linker-F2:CATCGATCCGGATGATCACAATTGC

AGCTGCATGCTTCCCGGGAAA；pCAGGS-linker-R2:GATCTTTCCCGGGAAGCATGCAGC

TG CAATTGTGATCATCATCCGGATCGATGAGCT，用PCR仪温度95 ℃逐渐降低退火，形成双链pCAGGS-linker2。BgIII和SacI双酶切载体2，胶回收4254 bp酶切产物，其与双链pCAGGS-linker2 4 ℃过夜连接形成pCAGGS-linker-2nd-AscI。再将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞后，用LB/Amp+ 平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mLLB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，XbaI和SphI双酶切鉴定，目的片段为184 bp、4116 bp。

4) pCAGGS-IRES-AscI载体构建

SphI和XmaI双酶切pCAGGS-linker-2nd-AscI，胶回收4296 bp酶切产物，与同样经双酶切pIRES(购于Clontech公司)的607 bp酶切产物室温连接4-5 h，形成连接产物pCAGGS-IRES-

AscI。然后将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞后，用LB/Amp+ 平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mL LB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，XmaI和SphI双酶切鉴定，目的片段为607 bp、4296 bp。

(3) pCAGGS-IRES-DHFR-AscI 载体构建

取1 uL pSV2- DHFR质粒(购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)为模板，进行PCR扩增，上游引物：DHFR-F：GTCACCCGGG CCACCATGGTTCGACCATTGAAC，下游引物DHFR-R:GGCCAGATCTTA GTCTTTCTTCTCGTAGACTT，反应条件94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共27个循环。末次循环后于72 ℃延伸10 min。取10 uL PCR产物（588 bp）进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，并进行XmaI和Bgl II双酶切，胶回收目的片段。然后将pCAGGS-IRES-AscI经同样的酶处理后，胶回收4895 bp片段，其与PCR产物室温连接4-5 h，形成重组产物pCAGGS- IRES-dhfr-AscI。然后将重组产物转化到E.coli DH5α感受态细胞后，用LB/Amp+平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mL LB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，XmaI和Bgl II双酶切鉴定，目的片段为588 bp、4895bp。

(4) pCAGGS-FVII-IRES-DHFR-AscI 载体构建

根据FⅦ基因序列设计引物：上游引物FⅦ-N-for:GGCCGCGGCCGCCACCATGGTCTCC

CAG,下游引物:FⅦ-N-Rev:GTCAACGCGTTAGCGCGCCGGCGCCGGTGCA.以pGEM-FⅦ模板，进行PCR扩增，反应条件是94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸10 min；1 %琼脂糖电泳胶回收210 bp片段（insert 1）。然后将insert 1片段经NotI和MluI双酶切后胶回收,准备连接。

MluI和EcoRI 双酶切pGEM-FⅦ质粒，1%琼脂糖凝胶电泳，回收1257 bp片段（insert 2）。Not I和Mun I双酶切载体pCAGGS-IRES-DHFR-AscI，胶回收5421 bp片段。然后将此片段和insert 1、insert 2于4 ℃过夜连接，形成重组质粒pCAGGS-FⅦ-IRES-DHFR-AscI。SphI和EcoRI双酶切鉴定，目的片段为1530 bp和5381 bp。

(5) pCAGGS-VKORC1-IRES-GGCX-AscI 载体构建

XmaI和Bgl II双酶切载体pCAGGS-IRES- DHFR-AscI，胶回收4895 bp的酶切产物1；同时Age I和Bam HI双酶切载体pGEM-GGCX，胶回收2285 bp的酶切产物2。然后将酶切产物1和酶切产物 2以分子量为3:1 的比例连接，形成重组质粒pCAGGS-IRES- GGCX-

AscI。将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞后，用LB/Amp+ 平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mL LB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，Sal I酶切鉴定，目的片段为7180 bp。

Not I 和Xho I 双酶切载体pCAGGS-IRES-GGCX-AscI，胶回收7164 bp的酶切产物3；同时，同样的酶双酶切载体pGEM-VKORC1，胶回收497 bp的酶切产物4，然后将酶切产物3和酶切产物4连接，形成重组载体pCAGGS-VKORC1-IRES-GGCX-AscI。将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞后，用LB/Amp+ 平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mLLB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，Not I 和XhoI酶切鉴定，酶切片段为497 bp和7164 bp。

(6) pInsulator4x-CAGGS-VKORC1-GGCX 载体构建

Sal I和 Asc I 双酶切载体pCAGGS-VKORC1-IRES-GGCX-AscI，胶回收酶切产物5662 bp; MauB I和Bpi I 双酶切pinsulator4x（东北师范大学郑耀武教授提供），胶回收酶切产物9696 bp.然后将以上2个酶切产物连接形成重组质粒pinsulator4x-CAGGS-VKORC1-GGCX。将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞后，用LB/Amp+ 平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mL LB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，Sal I和 Asc I酶切鉴定，酶切片段为866 bp和14492 bp。

(7) 功能性重组人凝血因子Ⅶ表达载体pInsulator4x-CAGGS-VKORC1-GGCX-FⅦ的构建

Sal I和 Asc I 双酶切载体pCAGGS-FVII-IRES-DHFR-AscI，胶回收4837 bp酶切产物；同样的酶双酶切载体pinsulator4x-CAGGS-VKORC1-GGCX，胶回收14492 bp酶切产物，然后将以上2个酶切产物连接形成重组质粒pinsulator4x-CAGGS-VKORC1-GGCX-FVIIa，将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞后，用LB/Amp+ 平板筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆菌溶于5 mL LB培养基37 ℃、200 r/min振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，Sal I和 Asc I酶切鉴定，酶切片段为4837 bp和14492 bp。

通过一系列的基因克隆操作，钓取的FVII基因、GGCX基因及VKORC1均成功插入到载体的特定克隆位置，PCR鉴定及酶切鉴定结果均显示克隆成功。功能性人凝血因子Ⅶ表达载体构建流程图见图1。

实施例2：CHO哺乳动物细胞的转染、筛选及克隆化

(1) 实例1构建的pIsulator4x-VOKRC1-GGCX-FⅦ质粒线性化

Swa I 酶切质粒，25 ℃酶切8 h，然后加入1/10体积的3 M的乙酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-20 ℃孵育2 h，14000 rpm 低温离心10 min。弃上清，加入70 %乙醇500 uL，14000 rpm 低温离心1 min。重复以上步骤，弃上清，加入10 uL无菌水。

(2) 质粒转染

采用lipofectin脂质体转染CHO细胞。含4 g/L次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）DMEM培养基（HT选择培养基）常规培养DHFR缺陷型CHO细胞，至对数生长期时，按照2×10⁵/L接种至6孔板，2 ml/L，培养至细胞长成50%～70％单层时弃去培养液，用无血清培养基洗涤细胞2次，将lipofectin脂质体和pIsulator4x-VOKRC1-GGCX-FⅦ质粒按照1：1的比例混合。混匀形成DNA-脂质体复合体，室温静止20 min后均匀滴入细胞孔中，轻柔摇匀细胞板，37℃培养，5-6 h 后换新鲜培养液。24 h后将细胞分至培养皿中，48 h后利用DMEM培养基筛选阳性克隆，获得抗性细胞集落。

（3）加压筛选及克隆化

获得的抗性细胞集落按照10 %的接种量接种培养，先用20 nM MTX筛选，7天左右换液，待细胞生长状态好时，再提高至40 nM MTX筛选，选择生长状态良好的细胞集落进行有限稀释法克隆筛选稳定的CHO细胞株。

实施例3：人重组凝血因子Ⅶ的表达、纯化及鉴定

（1）FⅦ的表达、纯化

经有限稀释获得的高表达细胞株，经无血清驯化后，在MTX压力下扩大培养，收集培养上清。1000rpm，4℃离心后，上清经0.22 µM滤膜过滤后Ni sepharose^TM 6 Fast Flow分离纯化。平衡缓冲液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、10 mM 咪唑pH 7.8）平衡Ni sepharose^TM6 Fast Flow柱，然后将过滤后上清上柱。上样后再用平衡缓冲液洗至基线，然后用洗脱缓冲液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、50 mM 咪唑pH 7.8）洗脱杂蛋白，最后用洗脱缓冲液（20mM Tris、500 mM 氯化钠、250 mM 咪唑pH 7.8）洗脱目的蛋白峰。

（2）FⅦ的SDS-PAGE、Western blot分析

洗脱峰组分经10000 MWCO超滤管超滤交换至hFⅦ储存液（25 mM Hepes; 100 mMNaCl; 5 mM CaCl2; pH 7.5），浓缩后即重组FⅦ纯化样。FⅦ纯化样品经12 % SDS-PAGE电泳分析后，用电转仪(Bio-Rad)将SDS-PAGE 胶中的蛋白转至PVDF 膜上, 用封闭液(PBST +5%脱脂奶粉)封闭过夜, PBST 洗膜4次，10 min/次，加入1:500稀释的抗6His tag鼠多抗作为一抗，4 ℃过夜，PBST 洗膜4次后，加入1:5000稀释的AP标记的羊抗鼠 IgG，室温反应2h，用PBST 洗膜4次后，最后用BCIP/NBT 显色试剂盒避光显色并拍照，结果见图2和图3。

（3）FⅦ的表达水平分析及活性测定

重组FⅦ纯化样，利用bradford法测蛋白浓度（以BSA作为标准蛋白），计算重组宿主细胞FⅦ的表达水平和产率，结果如表1。凝血酶原时间(PT)测定FⅦ重组蛋白促凝血活性：利用人凝血因子Ⅶ促凝活性检测试剂盒的说明，以人凝血因子Ⅶ缺乏血浆为基质血浆，采用凝血酶原时间(PT)测定重组FⅦ纯化样的效价。以诺其Novoseven(60 KIU)作为标准品，利用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆倍比稀释，测定不同稀释倍数的促凝时间。以标准品效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（S）对对数作标准曲线。人凝血因子Ⅶ缺乏血浆倍比稀释待测重组FⅦ，计算样品hFⅦ的效价，结果显示重组FⅦ纯化样品的效价与诺其Novoseven(60 KIU)标准品的效价相当，约为45KIU/mg，具有良好的促凝血活性。

表1 重组hFⅦ的测定及活性hFⅦ比率

利用实例1构建的功能性重组人凝血因子Ⅶ表达载体pIsulator4x-VOKRC1-GGCX-FⅦ

通过脂质体转染、MTX加压筛选，最后经亚克隆筛选最终获得一株高表达表达功能性FⅦ的宿主细胞。扩大培养后收集细胞上清，经镍柱分离纯化，最终获得促凝血活性较好（45KIU/mg）、表达水平较高（42.15 mg/ml）的功能性重组FⅦ。

SEQUENCE LISTING

<110> 太原博奥特生物技术有限公司

<120> 包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法

<130> 2014

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1367

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 1

ctcactgact ccgtcctgga gtaggatgag agataatggc cttacgttgt gccagaggag 60

ggtcaggctg gatttagcaa gatttacctt ctccaaagag cggtgctgca gtggcacagc 120

tgcccacgga ggtggggggg tcaccgtccc tggaggtgat gaagaactgc ggggatgtgg 180

cactgaggga catggccagt gggcacggtg ggtgggttgg ggttggtctt ggggatcttg 240

gagggctttt ccagccttca tgatttgacg attgtatgaa catctacatg gcaattctcc 300

agctgcctgt cccagtccta ctgacccagc tgtatctctc caggcaagct cttccacccc 360

ttctgcttgc atccagacac catcaaacat gcaggctcag acacggggac cagcagtgtc 420

tgtggccttt ttgtgctcct ctccatgctg ggttttaact tgctctttgt ccttctatcc 480

tatcttctga tccttaaggc tgttctgaac gctgtgactt ggagagtgtc ccagagccct 540

caacacctgc atgtcccacg tccatgctgt cctgctcttc cttatcccca agatctgcct 600

ctccgtgatg cactgaattg gcaaacatgt gtcaccccag accaacaatg tcacagcaaa 660

ctcccccttg ataggacagg agggaatggc tttacactga gacaggggag gtttgggttg 720

gatatgagga ggcagttttt cccccagagg gtggtgacgc actgaacagg ttgcccaagg 780

aggctgtgga tgccccatcc ctgcaggcat tcaaggccag gctggatgtg gctctgggca 840

gcctgggctg ctggttggtg accctgcaca tagcaggggg ttggagctgg gtgagcactg 900

tgctcctttg caacccaggc cattctatga ttctgtcatt ctaaatctct ctttcagcct 960

aaagcttttt ccccgtatcc ccccaggtgt ctgcaggctc aaagagcagc gagaagcgtt 1020

cagaggaaaa cgatcgcgtg ccaccttccc cgtgccgggc tgtccccgca cgctgccggc 1080

tccggctcgg ggatgcgggg ggagcgccgg accggagcgg agccccaggc ggctcgctgc 1140

tgccccctag cggaagaggg atgcaattac atccctgggg gctttggcgg ggggctctcc 1200

ccgtgagctc ccgcggacgc ccccttccag gactttccag gaaagcctgc ttctcttctt 1260

caacctttcg gcactttctt ccttttcctg aggctctaaa taaggtctcc gggagagggc 1320

actcggcaga gtggtttcct ggaggcgttt cctagactag acagcaa 1367

<210> 2

<211> 1335

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60

gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120

gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180

tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240

tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300

gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360

acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420

agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480

gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540

aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600

gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660

atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720

aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780

cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840

atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900

ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960

ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg 1020

ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080

atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140

gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200

agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag 1260

tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga 1320

gccccatttc cctag 1335

<210> 3

<211> 486

<212> DNA

<213> Mus

<400> 3

atgggcacca cctggaggag ccctggactc gtgcggcttg cactgtgcct cgctggctta 60

gccctctcac tgtacgcact gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgcgatga aaattaccgc 120

gcgctctgcg atgtgggcac ggccatcagc tgttcccgcg tcttctcctc tcggtggggc 180

cggggctttg ggctggtgga gcacatgcta ggagcggaca gcgtcctcaa ccaatccaac 240

agcatatttg gttgcctgtt ctacacctta cagctgttgt taggttgctt gaggggacgt 300

tgggcctcta tcctactggt gctgagttcc ctggtgtccg tcgctggttc cgtgtacctg 360

gcctggatcc tgttctttgt gttatatgat ttctgcattg tgtgcattac cacctatgcc 420

atcaatgtgg gtctgatgtt gcttagcttc cagaaggtac cagaacacaa gaccaaaaag 480

cactga 486

<210> 4

<211> 2274

<212> DNA

<213> Mus

<400> 4

atggctgtgc accgcggctc cgcactggtt gctcccgcct cagataaagt acagaaaaac 60

aagtctgcac agacatcagg actgaaacag ggcagccgaa tggagaaaat tttagggttt 120

gaatggacag atttatctag ctggcagagt gtcgtgaccc tgcttaacaa accaacggac 180

cctgcaaacc tggctgtctt tcgttttctc tttgctttct tgatgctgct ggacattccc 240

caggaacgcg gccttagctc cctggaccga aaatacttgg atgggctgga tgtgtgccgt 300

ttccccttgc tggatgcctt gcgcccactg ccactggact ggatgtatct tgtctacacc 360

atcatgtttc tgggggcact gggcatgatg ctggggctat gctaccggct aagctgtgtg 420

ttattcctgc taccgtactg gtacgtgttt ctcctggaca agacttcgtg gaacaatcac 480

tcctatctgt atggtttgtt ggcctttcag ttgacattca tggatgcaaa ccactactgg 540

tctgtggatg gcttgctgaa tgcccgaaag aagaatgctc acgtgcccct ttggaactac 600

acagttctgc gtggccagat cttcatcgtg tacttcatcg cgggtgtgaa gaagctcgat 660

gctgactggg ttgggggcta ctccatggag cacctgtccc ggcactggct cttcagtccc 720

ttcaagctgg tgttgtcgga ggagctgaca agcctgctgg tagtacactg gtgtgggctt 780

ctccttgacc tctcggctgg cttcctgctc ttctttgatg cctccagacc cgtcggcctg 840

ttcttcgtgt cctactttca ctgcatgaac tcgcagctct tcagcatcgg gatgtttccc 900

tatgtcatgc tggccagcag ccctctcttc tgctcagctg aatggcctcg gaagttggta 960

gcccgatgcc cgaaaaggct gcaagagctg ctgcccacca aagccgctcc tcggcctagt 1020

gcttcctgtg tgtataagag gtcccggggc aaagctggcc cgaagcccgg gctgcgccac 1080

cagctgggag ccatcttcac cctgctctac ctcctagagc agctcttcct gccctattcc 1140

cacttcctga cccagggtta caataactgg acaaatgggc tgtatggcta ttcctgggac 1200

atgatggtgc actcccgctc ccaccagcac gtaaagatca cctaccgcga cggcctcacg 1260

ggcgagctgg gctaccttaa ccctggggta ttcacacaga gccggcgatg gaaggatcat 1320

gcagacatgc tgaagcaata tgccacttgc ctgagcctcc tgcttcccaa gtacaatgtc 1380

actgagcccc agatctactt tgatatttgg gtctccatca atgaccgctt ccagcagagg 1440

ctttttgacc ctcgtgtgga catcgtgcag gctgtctggt cccccttcca gcgcacacct 1500

tgggtgcagc cactcttgat ggatttatct ccctggagga ccaagttaca ggatattaag 1560

agcagtctgg acaaccacac cgaggtggtc ttcattgcag atttccctgg gcttcacttg 1620

gagaattttg tgagtgaaga cctgggcaac actagcatcc agctgctgca gggagaagtc 1680

accgtggaat tggtggcaga acagaaaaat cagactcttc aagaaggaga gaaaatgcag 1740

ttgcctgctg gagagtacca taaagtctat actgtatcat ctagtccttc ctgctacatg 1800

tacgtctatg tcaacactac agaggtcgca ctggagcaag acctggcata tctgcaagaa 1860

ttaaaggaga aggtggagaa cggaagtgaa acagggcccc tgcctccaga acttcagcct 1920

cttttggaag gggaagtaaa agggggccct gagccaacac ctctggtcca aacttttctc 1980

agacgacaga ggaagctcca agaaattgaa cgcaggcgaa atagcccttt ccatgagcga 2040

tttctccgct tcgtgctgcg aaagctctac gtctttcgac gcagcttcct gatgactcga 2100

atttcactcc gaaacctgct attaggccgc ccttccctag agcaactagc ccaagaggtg 2160

acatatgcaa acttgcgacc atttgaacca gttgatgagt caagtgcttc aaacacagat 2220

tcttcaaatc acccgtcaga gccagattct gagcatgttc actctgagtt ctga 2274

Claims

1.一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于包含编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠γ氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子“insulator（4X）”重组核酸；其中FⅦ、VKORC1和GGCX通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，利用CAG启动子启动；绝缘子“insulator（4X）”重组核酸由经部分改造的鸡HS4绝缘体单元4倍串联而成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；FⅦ、VKORC1和GGCX在宿主细胞中均获得稳定表达。

2.如权利要求1所述的一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征是编码维生素K依赖的hFⅦ重组核酸和二氢叶酸还原酶（DHFR）重组核酸通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，利用CAG启动子启动；编码VKORC1重组核酸和GGCX重组核酸同样通过IRES连接，CAG启动子启动；且两个启动子组成的重组核酸表达单元通过绝缘子“insulator（4X）”重组核酸隔离。

3.如权利要求1或2所述的包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于绝缘子“insulator（4X）”重组核苷酸插入位置为两个启动子组成的重组核酸表达单元的下游。

4.如权利要求1或2所述的包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于所述编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；所述编码小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:3；所述编码小鼠γ氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

5.如权利要求1所述的包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征是该宿主细胞为DHFR缺陷型CHO哺乳动物细胞。

6.一种功能性重组人凝血因子Ⅶ的高水平表达方法，其特征是：

1）构建一种表达载体，该表达载体中FⅦ重组核酸通过IRES与DHFR重组核酸连接，由CAG启动子启动共表达；同时含有CAG启动子启动、由IRES连接VKORC1重组核酸和GGCX重组核酸组成的表达单元；两个重组核酸表达单元由绝缘子“insulator（4X）”重组核酸隔离，“insulator（4X）”插入位置为两个启动子组成的重组核酸表达单元的下游；

2）利用脂质体法将1）所述表达载体介导进入DHFR缺陷型CHO动物细胞内，DMEM培养基筛选阳性克隆；利用有限稀释法亚克隆稳定表达细胞株；挑选高表达阳性克隆扩大培养，氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选，提高hFⅦ表达水平；

3）无血清驯化培养该宿主细胞株；

4）利用镍离子亲和层析纯化hFⅦ重组蛋白，SDS-PAGE及Western blot检测；

5）凝血酶原时间(PT)测定FⅦ重组蛋白促凝血活性。