CN104254603A

CN104254603A - 用于制备xa因子抑制剂的重组解毒剂的方法

Info

Publication number: CN104254603A
Application number: CN201380012568.9A
Authority: CN
Inventors: 卢根民; 帕梅拉·B·康利; 乌马·辛哈
Original assignee: Portola Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Portola Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2013-02-13
Publication date: 2014-12-31
Also published as: US20190127720A1; US20150376592A1; US20130230901A1; HK1205188A1; WO2013123087A1; IL234073A0; US20230383276A1; US20220098565A1; EP2814955A1; US20170240879A1; JP2015507929A; KR20140131957A

Abstract

本发明公开用于改进功能性fXa衍生物蛋白的产生的方法和分离的细胞，所述功能性fXa衍生物蛋白充当fXa抑制剂解毒剂。一个方面涉及一种分离的细胞，其包含r-解毒剂多核苷酸和弗林蛋白酶多核苷酸。另一个方面涉及一种用于通过在细胞中表达经预加工的r-解毒剂多肽和弗林蛋白酶多肽来制备裂解双链r-解毒剂的方法。

Description

用于制备XA因子抑制剂的重组解毒剂的方法

相关申请的交叉引用

本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2012年2月14日提交的美国临时申请序号61/598,694的权益，所述临时申请特此以引用的方式整体并入。

领域

本公开涉及适用于表达和纯化fXa衍生物的细胞和方法。

背景

抗凝血剂在市场上满足在具有血块形成趋势的患者中治疗或预防不当血栓形成的需要，例如像患有凝血障碍的患者，这些患者受到限制在一段时间内无法活动或正在接受医疗手术。但是，抗凝血疗法的一个主要限制是与治疗有关的出血风险，以及在过量的情况下或在需要紧急外科手术时对于快速逆转抗凝血活性的能力的限制。因此，对于各种形式的抗凝血疗法而言的特定和有效的解毒剂是非常可取的。出于安全考虑，在新的抗凝血剂药物的开发中，具有抗凝血剂-解毒剂对也是有利的。

此前报道的fXa蛋白的修饰衍生物可用作针对fXa的抗凝血剂的解毒剂。fXa蛋白的修饰衍生物不与fXa竞争来装配成凝血酶原酶复合物，而是结合并且/或者大致上中和抗凝血剂，如fXa抑制剂。在美国公布2009/0098119和2010/0255000中描述的这些修饰蛋白衍生物需要翻译后修饰以获得适当的结构和功能。此类翻译后修饰包括除去前原肽和fX衍生物前体中的内部-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头序列的裂解，以形成成熟的fX衍生物蛋白。

宿主细胞系统中的不完全或低效率的加工可导致功能性蛋白的分离降低。因此，在本领域中需要改进可用作fXa抑制剂解毒剂的功能性fXa衍生物蛋白的加工效率的系统。

概述

本文公开用于增加功能性r-解毒剂蛋白的产生的方法和细胞。用弗林蛋白酶体内处理人Xa因子衍生物(即前体r-解毒剂)允许改进功能性、2-链蛋白的加工是以前不为人所知的。因此，本文描述的方法和细胞通过在体内共表达r-解毒剂和弗林蛋白酶来改进功能性r-解毒剂的产生。

本公开的方面涉及一种分离的细胞，其包括：

第一多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽，以及

第二多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：2至少约80%序列同一性的多肽。

在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸是在单独的多核苷酸构建体上，并且在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸在相同的多核苷酸构建体上，它们可具有单独的调控元件。

在一相关方面，提供一种多核苷酸构建体，其包括：第一多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽；和第二多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：2至少约80%序列同一性的多肽。

另一个方面涉及一种制备包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的裂解双链多肽或与SEQ ID NO：3具有至少约80%序列同一性的多肽的方法，其中所述方法包括在分离的细胞中表达：

分离的细胞可以是允许加工和裂解所需要的翻译后修饰的任何合适宿主细胞。合适的细胞包括(通过非限制性的实例)真菌细胞如酵母细胞、细菌细胞和哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。在相关实施方案中，所述哺乳动物细胞是选自由CHO、COS、BHK和HEK 293组成的组的细胞类型。在另一实施方案中，所述细胞类型是CHO。在又一个实施方案中，CHO细胞类型是亚型K、M或DG44。

附图说明

图1描绘优化的人弗林蛋白酶的cDNA序列和翻译的氨基酸。翻译的氨基酸序列在本文中称为SEQ ID NO：2。所描绘的cDNA序列代表SEQ ID NO：4。

图2A-B示出在实施例2中所述的弗林蛋白酶转染对14G1的效果(解毒剂的表达水平：图2A和功能活性：图2B)。3%、10%、30%和100%指相对于转染的总DNA而言含弗林蛋白酶质粒的百分比。图2中的GFP是指绿色荧光蛋白。表达水平通过使用识别单链和双链解毒剂分子的抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测量。功能活性是通过在fXa抑制剂贝曲西班(betrixaban)存在下的fXa显色活性测定来测量。只有正确地裂解的r-解毒剂分子才能够结合贝曲西班并且中和其针对fXa的抑制活性。

图3证明实施例2中所述的弗林蛋白酶转染对解毒剂的14G1表达和加工的效果(使用LC(轻链)抗体通过蛋白质印迹来确定质量)。通过蛋白质印迹评估的蛋白质量表明，弗林蛋白酶的转染完全消除了单链(SC)r-解毒剂前体。

图4示出利用可选择的fX衍生物构建体进行的弗林蛋白酶的瞬时转染(通过蛋白质印迹确定质量)。如实施例2中描述的，与弗林蛋白酶的共转染没有改进des-Gla fX衍生物的裂解效率。

图5A-B示出实施例3中所描述的14G1-弗林蛋白酶微矩阵实验(克隆＃92，＃94)中的解毒剂蛋白的表达水平(图5A)和功能活性(图5B)。

图6A-D示出实施例3中表征的克隆＃94的解毒剂蛋白的表达水平(图6A)和功能活性(图6B)。还描绘了使用抗-HC(重链，图6C)抗体和抗-LC(轻链，图6D)抗体的蛋白质印迹。BR(实验室规模的反应器)6进料3在第2天和第4天添加。BR6的播种密度为10x10⁵个细胞/毫升。

图7示出SEQ ID NO：1，fXa衍生物(也称为前体r-解毒剂)，其中接头在氨基酸106-111处。

图8示出SEQ ID NO：3，fXa衍生物(也称为r-解毒剂)，其中接头被除去。

详述

I. 定义

除非另有说明，本公开的实践将使用常规组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术，这些技术都在本领域的技能范围内。参见，例如，Sambrook等人, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版; Ausubel等人编 (1987) Current Protocols In Molecular Biology; MacPherson, B.D. Hames和G.R. Taylor编, (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow和Lane编 (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Harlow和Lane编 (1999) Using Antibodies, a Laboratory Manual; 以及R.I. Freshney编 (1987) Animal Cell Culture。

所有数字表示，例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，是视情况而定以1.0或0.1的增量来(+)或(-)变化的近似值。尽管不总是明确地陈述，但是应当理解所有数字表示的前面加了术语“约”。尽管不总是明确地陈述，但是也应当理解本文描述的试剂仅是示例性的，并且所述试剂的等效物是本领域已知的。

除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个提及物。

如本文所用，术语“包含”意欲指组合物和方法包括所述要素，但不排除其它要素。“基本上由……组成”在用于定义组合物和方法时将意味着排除对于针对预定用途的组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物不排除痕量污染物或惰性载体。“由……组成”将意味着排除超过痕量的其它成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语的每一种定义的实施方案在本发明的范围内。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在其最广泛的意义，是指两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚单位可通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚单位可通过其它键，例如酯、醚等来连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且对于可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是可互换使用的并且是指任何长度的聚合形式核苷酸，无论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行已知的或未知的任何功能。下面是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可在多核苷酸的装配之前或之后给予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分间断。多核苷酸可在聚合之后进行进一步修饰，如通过与标记组分缀合。所述术语也指双链和单链分子。除非另有说明或要求，作为多核苷酸的本公开的任何实施方案包含双链形式和已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。

多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；并且当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。这种字母表示可被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库，并且用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性检索。

如本文关于核酸如DNA或RNA所使用的术语“分离的”或“重组的”是指分子与分别存在于大分子以及多肽的天然来源中的其它DNA或RNA分离。术语“分离的”也在本文中用于指与其它细胞蛋白分离的多核苷酸、多肽和蛋白质，并且意欲包括纯化的和重组的多肽。在其它实施方案中，术语“分离的或重组的”是指与细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在天然状态下通常相缔合的细胞成分和其它成分分离。例如，分离的细胞是从不同表现型或基因型的组织或细胞分离出的细胞。分离的多核苷酸与其在原生或天然环境中，例如在染色体上通常与其缔合的3'和5'连续核苷酸分离。本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来将它与其天然存在的对应物区分开来。

无需明确叙述并且除非另有规定，否则可推断当本公开涉及一种多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，这类物质的等效物或生物等效物意欲在本公开的范围之内。如本文所用的术语“其生物等效物”在涉及参考蛋白质、抗体、多肽或核酸时，意欲与“其等效物”同义，意指具有最小的同源性，同时仍保持所需结构或功能的那些物质。在另一个实施方案中，术语多核苷酸的“生物等效物”是指在严格条件下与参考多核苷酸或其补体杂交的物质。除非本文中具体叙述，否则预期本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等效物。例如，等效物意指至少约80%同源性或同一性并且替代地至少约85%或者至少约90%，或者至少约95%，或者98%同源性或同一性并且显示与参考蛋白、多肽或核酸大致上等同的生物活性。

“杂交”是指可在不同“严格性”条件下进行的杂交反应。提高杂交反应的严格性的条件是众所周知的，并且在本领域中是公开的：参见，例如，Sambrook等人见下文。相关条件的实例包括(以严格性递增的顺序)：25℃、37℃、50℃和68℃的孵育温度；10XSSC、6XSSC、1XSSC、0.1XSSC的缓冲液浓度(其中SSC是0.15 M NaCl和15 mM柠檬酸盐缓冲液)和它们的使用其它缓冲系统的等效物；0%、25%、50%和75%的甲酰胺浓度；从5分钟至24小时的孵育时间和持续时间递增的洗涤、递增的频率或减小的缓冲液浓度。

与另一个序列具有一定百分比(例如80%、85%、90%或95%)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)是指在比较这两个序列时，一定百分比的碱基(或氨基酸)在比对时是相同的。比对和百分比同源性或序列同一性可使用本领域中已知的软件程序来确定，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人编1987) 增刊30、第7.7.18节、表7.7.1中描述的那些软件程序。优选地，比对使用缺省参数。优选比对程序是BLAST，其使用缺省参数。具体来说，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用下列缺省参数：遗传密码=标准；过滤器=无；链=两个；截留值=60；期望= 10；矩阵= BLOSUM62；描述=50个序列；排序方式=高分数；数据库=非冗余，GenBank + EMBL+ DDBJ + PDB + GenBank CDS翻译+ SwissProtein + SPupdate+PIR。这些程序的详情可在下列网址中找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。

“同源性”、“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较各序列中可为比较目的来比对的位置来确定。当所比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在所述位置上是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置的数目而变化。“无关”或“非同源的”序列与本公开的序列之一共有小于40%的同一性，或者小于25%的同一性。

如本文所用，“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或由所转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来自基因组DNA，那么表达可包括在真核细胞中的mRNA的剪接。

“聚合物转染(Polyfection)”是指基于聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)的转染技术。

当用DNA构建体转染细胞时，除了携带所感兴趣的基因(即弗林蛋白酶、选择标记和r-解毒剂前体)的DNA构建体以外，还可转染非编码载体DNA。“总转染DNA”是指DNA的总量(通常以μg为单位)，并且包括质粒DNA(或其它DNA构建体)和载体DNA。

在蛋白质分离的上下文中使用时，术语“部分”是指基于特定性质分离出来的材料的集合。具体的性质可包括(作为非限制性实例)尺寸、质量、等电点、电荷等。

应用于多核苷酸的术语“编码”是指如下多核苷酸：如果所述多核苷酸在其天然状态下或通过本领域技术人员公知的方法操作时，可被转录和/或翻译以产生一种多肽和/或其片段的mRNA，那么所述多核苷酸被说成“编码”所述多肽。反义链是这种核酸的补体，并且编码序列可从其中推断出。

如本文所用的术语“构建体”是指人工DNA片段。这些构建体包括例如质粒、引物、粘粒、表达载体和类似物。

术语“非内源性”是指非所述细胞原生的多肽或多核苷酸。“非内源性的”多核苷酸或多肽通常是指已经通过基因转移或蛋白质施用而引入细胞的多核苷酸或多肽。当术语“非内源性”适用于多核苷酸时，所述多核苷酸可位于染色体外或染色体内(作为进入宿主细胞基因组中的整合DNA片段)。

术语“内源性”是指所述细胞原生的多肽或多核苷酸(即，天然表达或存在于细胞中的多肽或多核苷酸)。

术语“表达水平”是指存在于细胞中的蛋白质的量。表达水平可相对于另一种蛋白质(无论是内源性或非内源性表达的)来定义。确定蛋白质的表达水平的方法是本领域已知的并在本文中描述。

“Xa因子”或“fXa”或“fXa蛋白”是指血液凝固途径中的丝氨酸蛋白酶，它是从非活性因子X(fX)产生的。Xa因子通过被称为内在Xase的复合物中的因子IXa与其辅因子因子VIIIa或被称为外在Xase的复合物中的因子VIIa与其辅因子组织因子来活化。fXa与因子Va形成膜结合的凝血酶原酶复合物并且是凝血酶原酶复合物中的催化凝血酶原转化为凝血酶的活性成分。凝血酶是催化血纤维蛋白原转化为纤维蛋白，最终导致血液凝块形成的酶。

“des-Gla fXa”是指不具有Gla-结构域的fXa。这些fXa衍生物描述于美国专利号8,153,590中，其全部内容以引用的方式并入本文。

如本文所用的“fXa衍生物”是指修饰的fXa蛋白，其不与fXa竞争来装配成凝血酶原酶复合物，并且具有减少的或没有促凝血活性，还结合并且/或者大致上中和抗凝血剂，如fXa抑制剂。fXa衍生物的实例在WO2009/042962中提供，并且进一步在本文提供，如SEQ ID NO：3(图8)和其生物等效物。

如本文使用的术语“弗林蛋白酶”或“成对碱性氨基酸裂解酶”是指如下蛋白质，其具有与GenBank登录号NP_002560(人)、NP_001074923(小鼠)或NP_062204(大鼠)的任何代表性弗林蛋白酶序列大致上相同的氨基酸序列。编码弗林蛋白酶的合适cDNA以GenBank登录号NM_002569(人)、NM_001081454(小鼠)或NM_019331(大鼠)提供。在具体的方面，弗林蛋白酶是指人弗林蛋白酶。代表性人弗林蛋白酶蛋白序列提供于SEQ ID NO:2(图7)，并且代表性人弗林蛋白酶cDNA序列提供于SEQ ID NO:4(图7)。

“r-解毒剂前体”是指由SEQ ID NO：1所代表的fXa衍生物，其包含相对于fXa的3个突变。第一个突变是在FX的Gla结构域中缺失6-39 aa。第二个突变是用-RKR-置换活化肽序列143-194 aa。这产生连接轻链和重链的-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头。一旦分泌，这种接头就在CHO中裂解，产生裂解的双链多肽。因此，术语“裂解双链多肽”是指SEQ ID NO：3的多肽，或与SEQ ID NO：3具有80%同一性的多肽，其具有两个链并且由至少一个二硫键连接在一起。N末端链由SEQ ID NO：3的氨基酸1-105组成并且C末端链由SEQ ID NO：3的氨基酸106-359组成。任选地，LC链可含有接头的1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。这些额外的残基由所述接头多肽的不完全除去产生。第三个突变是活性位点残基S379突变至Ala残基。这种氨基酸取代分别对应于SEQ ID NO：1和3的氨基酸296和290。术语“r-解毒剂”是指接头裂解和加工后的多肽。这由SEQ ID NO：3代表。

术语“CHO”是指中国仓鼠卵巢细胞。

“COS”是指通过用可产生较大T抗原、但具有基因组复制缺陷的SV40基因组型式将来自于非洲绿猴的肾细胞的CV-1细胞系永生化所获得的细胞系。COS一词是来自如下细胞的缩写，所述细胞来源于(Origin) CV-1(猿)，并携带SV40遗传物质。

“BHK”是指幼仓鼠肾细胞。

“HEK 293”是指最初来自于在组织培养中生长的人胚胎肾细胞的人胚胎肾(Human Embryonic Kidney) 293细胞。

术语“选择标记”是指赋予适于人工选择的性状的所引入细胞中的基因。它们是一种类型的报告基因，其用于实验室微生物学、分子生物学和基因工程中以指示转染或意在将外源DNA引入细胞中的其它程序的成功。选择标记可包括(通过非限制性实例)抗生素抗性基因，例如，提供对嘌呤霉素、新霉素和潮霉素等的抗生素抗性的基因。嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(PAC)基因赋予对嘌呤霉素的抗性。neo基因提供对新霉素、卡那霉素和遗传霉素的抗性。潮霉素磷酸转移酶基因(hph)提供对潮霉素的抗性。还包括的基因例如为二氢叶酸还原酶(DHFR)，或它们的突变体，其提供对氨甲蝶呤的抗性。术语“选择标记”也意在描述一种允许研究人员区分想要的和不想要的细胞的标记。实例包括产生具有显著表型(如颜料或荧光)的蛋白质的基因。

术语“抗生素抗性”是指具有经受得住抗生素暴露的能力的细胞。所述抗生素的浓度为已知可消除缺乏抗生素抗性基因的细胞并允许具有抗生素抗性基因的细胞存活的浓度。通常，在不继续选择的情况下具有抗生素抗性的细胞将保持抗生素抗性。然而，自发突变可能导致失去抗性，在这种情况下，可能需要额外的选择或抗生素暴露以消除失去了抗性的细胞。

术语“DNA构建体”是指包含目标多核苷酸和任选的其它功能元件的DNA。其它功能元件可包括例如复制起点、选择标记、启动子和终止序列。

“染色体外DNA”是指远离染色体而位于或保持在细胞中的DNA。

在DNA构建体的上下文中使用时，术语“整合”是指将DNA构建体插入宿主细胞(例如分离的细胞)的基因组中。

“质粒”或“DNA质粒”是与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在许多情况下，它是圆形的并且是双链的。质粒提供用于在微生物群体内进行水平基因转移的机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择优势。质粒可携带如下基因，所述基因在竞争性环境小生境中提供对天然存在的抗生素的抗性，或者所产生的蛋白质可在类似情境下充当毒素。

术语“细胞培养基”是指在细胞培养中使用的培养基。培养基被设计成支持细胞的生长，并且取决于细胞类型而不同。本领域技术人员知道基于宿主细胞类型来选择合适的培养基。典型的细胞培养技术和培养基的实例在本文中描述。

如本文所用，“基因递送”、“基因转移”、“转导”、“转染”等是涉及将外源性多核苷酸(有时被称为“转基因”)引入至宿主细胞中的术语，而与用于引入的方法无关。

细胞和构建体

用弗林蛋白酶在体内处理人Xa因子衍生物(即r-解毒剂前体)允许改进功能性、2-链蛋白的加工。因此，本公开的方面涉及用于表达和加工fXa衍生物的细胞和构建体。

本公开提供改进或增强将单链r-解毒剂前体加工成裂解双链r-解毒剂蛋白的细胞和方法，所述裂解双链r-解毒剂蛋白充当fXa抑制剂的解毒剂。因此，本公开的一个实施方案提供一种含有编码fXa衍生物的第一多核苷酸和编码弗林蛋白酶蛋白的第二多核苷酸的分离的细胞。在一个方面，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸是在单独的多核苷酸构建体上。在另一个方面，第一多核苷酸和第二多核苷酸在同一个多核苷酸构建体上。因此，本公开的另一个实施方案提供一种包括所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的多核苷酸构建体。

在一个方面，fXa衍生物具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80%序列同一性的多肽。由SEQ ID NO：1代表的fXa衍生物包含相对于fXa的三个突变。第一个突变是在FX的Gla结构域中缺失6-39 aa。第二个突变用-RKR-替换活化肽序列143-194 aa。这产生了连接轻链和重链的-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头。一旦分泌，所述接头就在CHO中裂解，产生双链fXa分子。第三个突变是活性位点残基S379突变至Ala残基。这种氨基酸取代分别对应于SEQ ID NO：1和3的氨基酸296和290。fXa衍生物不与fXa竞争来装配成凝血酶原酶复合物，而是结合并且/或者大致上中和抗凝血剂，如fXa抑制剂。可用作解毒剂的衍生物经过修饰，以减少或消除固有的促凝血和抗凝血活性，同时保留结合抑制剂的能力。在结构上，所述衍生物被修饰成不提供促凝血活性或提供降低的促凝血活性。“促凝血活性”在本文中被称为试剂引起血液凝固或血块形成的能力。降低的促凝血活性是指与野生型fXa相比，促凝血活性降低了至少约50%，或大于约90%或大于约95%。

在另一个实施方案中，与野生型因子Xa相比，与SEQ ID NO：3具有至少80%序列同一性的氨基酸序列具有降低的促凝血活性。在另一实施方案中，与SEQ ID NO：3具有至少80%序列同一性的氨基酸序列不装配成凝血酶原酶复合物。在进一步的实施方案中，与野生型因子Xa相比，与SEQ ID NO：3具有至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性的氨基酸序列具有降低的促凝血活性。在进一步的实施方案中，与SEQ ID NO：3具有至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性的氨基酸序列不装配成凝血酶原酶复合物。

在一个实施方案中，所述分离的细胞还包含双链多肽，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，弗林蛋白酶蛋白具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(图1)。

在某些实施方案中，本文中描述的分离的细胞进一步包括可在细胞中表达的选择标记。在进一步的实施方案中，选择标记提供对选自由嘌呤霉素、甲氨蝶呤、新霉素和潮霉素组成的组的化合物的抗性。在一个实施方案中，选择标记提供对甲氨蝶呤的抗性。在另一实施方案中，选择标记提供对嘌呤霉素的抗性。在另一个实施方案中，选择标记为细胞提供抗生素抗性。

本文描述的多核苷酸可被包含于DNA构建体上和/或从DNA构建体中表达。DNA构建体的实例包括质粒、粘粒、表达载体、噬菌粒、福斯质粒和人工染色体例如细菌人工染色体、酵母人工染色体以及人类人工染色体。在某些实施方案中，所述第一多核苷酸或第二多核苷酸是在染色体外的DNA构建体上。在另一个实施方案中，所述第一多核苷酸或第二多核苷酸是在整合到所述分离的细胞的染色体DNA中的DNA构建体上。表达载体整合到其基因组中的稳定细胞系可允许细胞群体中的更稳定的蛋白质表达，从而产生更一致的结果。所述第一多核苷酸和第二多核苷酸可被包含在一个DNA构建体上或单独的构建体上。当它们被包含在一个构建体上时，它们可使用单独启动子来表达或使用同一启动子。用于从一个启动子表达两种蛋白质的方法是本领域已知的，并且包括，例如，利用内部核糖体进入序列(IRES)。

包含所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的所述DNA构建体或质粒可通过本领域技术人员已知的多种方法转染到细胞中。在一个实施方案中，所述DNA质粒或构建体通过聚合物转染来转染到分离的细胞中。在另一实施方案中，包含第二多核苷酸的质粒或DNA构建体占总转染DNA的约1%至约50%。或者，包含第二多核苷酸的所述质粒或DNA构建体占总转染DNA的约1%至约90%，或总转染DNA的约1%至约80%，或约1%至约70%，或约1%至约60%，或约1%至约50%，或约1%至约40%，或约1%至约30%，或约1%至约10%，或约3%至约10%。在进一步的实施方案中，包含第二多核苷酸的质粒或DNA构建体为总转染DNA的约3%，或总转染DNA的约5%，或约10%，或约15%，或约20%，或约25%，或约30%，或约35%，或约40%，或约45%，或约50%，或约60%。

本公开的细胞可通过使用基因递送媒介物将所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸引入细胞或组织中来制备。基因递送方法包括多种已知技术，如载体介导的基因转移(通过例如病毒感染/转染，或各种其它基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物)以及有助于递送“裸”多核苷酸的技术(如电穿孔、“基因枪”递送以及用于引入多核苷酸的各种其它技术)。所引入的多核苷酸可稳定地或短暂地保持在宿主细胞中。稳定保持通常需要所引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或整合至宿主细胞的复制子如染色体外复制子(例如质粒)或细胞核或线粒体的染色体中。如本领域所知，已知多种载体能够介导基因转移至哺乳动物细胞中。

在某些实施方案中，多核苷酸通过转染引入到细胞中。转染技术是本领域熟知的，并且可包括基于化学品的转染，如磷酸钙转染和聚合物转染，以及非基于化学品的转染，如电穿孔、光学转染和基因电转移。还包括脂质体转染技术。脂质体转染通常使用带正电荷的(阳离子)脂质，以与带负电荷的(阴离子)遗传物质形成聚集体。已假定此聚集体上的净正电荷可通过带负电荷的磷脂双层来提高转染的有效性。

在一个方面，引入第一多核苷酸在引入第二多核苷酸之前执行。在一个方面，引入第一多核苷酸在引入第二多核苷酸之后执行。在又一个方面，第一多核苷酸和第二多核苷酸与细胞共孵育。在具体的方面，第一多核苷酸和第二多核苷酸是在同一构建体上，从而引入同时进行。

在其它实施方案中，本文描述的分离的细胞进一步包括：包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第一多肽或具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽；和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第二多肽或具有与SEQ ID NO：3至少约80%序列同一性的多肽。肽的低效裂解产生SEQ ID NO：1的单链多肽或具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽。本文描述的方法和分离的细胞可提高fXa衍生物的裂解效率。因此，在某些实施方案中，具有SEQ ID NO：3、与SEQ ID NO：3的80%同源性或包含接头残基的SEQ ID NO：3的双链多肽与SEQ ID NO：1的多肽或与SEQ ID NO：1具有至少约80%序列同一性的多肽的比率可以是至少约9:1。或者，所述比率可以是至少约7:3、8:2、95:5或99:1。

在本文描述的细胞中，弗林蛋白酶以比细胞的内源表达水平更高的表达水平产生。本公开的实施方案涉及如本文所述的分离的细胞，其进一步包括包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：2至少约80%序列同一性的多肽。在相关实施方案中，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的表达水平是内源性弗林蛋白酶的表达水平的至少3倍。在进一步的实施方案中，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的表达水平是内源性弗林蛋白酶的表达水平的至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。

蛋白质可从合适的宿主细胞系统中表达并纯化。合适的宿主细胞包括原核和真核细胞，其包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、羊细胞、猿猴细胞和人细胞。细菌细胞的实例包括大肠杆菌、肠沙门氏菌和格氏链球菌。在某些实施方案中，细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞。细胞可从商业供应商处购买，如美国典型培养物保藏中心(ATCC, Rockville Maryland, USA)，或使用本领域已知的方法从分离株进行培养。合适的真核细胞的实例包括但不限于HEK 293细胞、仓鼠细胞系BHK-21、CHO细胞；小鼠细胞系，例如NIH3T3、NS0和C127；猿猴细胞系如COS和Vero；和人细胞系，如HeLa、PER.C6(商业上购自Crucell公司)、U-937和Hep G2。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是选自由CHO、COS、BHK和HEK 293组成的组的细胞类型。在另一实施方案中，细胞类型是CHO。在又一实施方案中，细胞是选自由K、M和DG44组成的组的CHO细胞亚型。昆虫细胞的非限制性实例包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)。适用于表达的酵母的实例包括，但不限于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、耶氏酵母属(Yarrowia)或毕赤酵母属(Pichia)。参见例如美国专利号4,812,405、4,818,700、4,929,555、5,736,383、5,955,349、5,888,768和6,258,559。

制备fXa衍生物的方法

从表达r-解毒剂前体蛋白的细胞系制备功能性r-解毒剂的先前方法由于前体蛋白的低效裂解而导致功能性r-解毒剂的产率降低。r-解毒剂前体(SEQ ID NO：1)和弗林蛋白酶的体内共表达允许前体高效裂解成功能性双链r-解毒剂蛋白(SEQ ID NO：3)。此外，在体内共表达r-解毒剂前体蛋白和弗林蛋白酶允许来自细胞的r-解毒剂蛋白的表达增加，以及功能增加。在某些实施方案中，约70%的r-解毒剂前体被裂解。在其它实施方案中，约75%、80%或85%的r-解毒剂前体被裂解。在优选的实施方案中，约90%或更多被裂解。在更优选的实施方案中，约95%或更多被裂解。在另一个优选的实施方案中，约99%或更多被裂解。在细胞中表达的弗林蛋白酶的量是允许单链多肽至少约70%裂解成双链多肽的量。或者，弗林蛋白酶的表达水平是允许单链多肽至少约75%、80%、85%、90%、95%或99%裂解的表达水平。裂解不仅依赖于接头，而且依赖于接头周围的序列。实施例3 (图4)表明，并不是每一种fX衍生物都改进了接头裂解的效率。

还提供了制备经过加工的fXa衍生物的方法。在一个方面，所述方法需要在本公开的细胞中表达fXa衍生物与弗林蛋白酶蛋白。在另一个方面，所述方法进一步允许所表达的fXa衍生物在细胞中被弗林蛋白酶蛋白裂解。

凭借裂解，未加工的单链fXa蛋白变成双链多肽。这种蛋白由弗林蛋白酶裂解，弗林蛋白酶也被称为PACE(成对碱性氨基酸裂解酶)。弗林蛋白酶裂解刚好在碱性氨基酸靶序列下游的蛋白(规范地表示为，Arg-X-(Arg/Lys)-Arg; SEQ ID NO: 6)。

SEQ ID NO：3的多肽或具有与SEQ ID NO：3至少80%序列同一性的多肽是指作为fXa抑制剂解毒剂的裂解双链fXa衍生物蛋白。此蛋白被加工和裂解，导致除去-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头序列。接头序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸编号106-111。在某些实施方案中，可能在不完全除去接头序列的情况下发生裂解。因此，裂解的双链多肽可包含SEQ ID NO：3，并且在SEQ ID NO：3的氨基酸105之后有1、2、3、4、5或6个接头氨基酸。在裂解后，由于在两个链之间的二硫键，双链fXa衍生物保持连接。

本文公开的方法方面的其它实施方案进一步包括从细胞分离的蛋白质部分，其包含具有与SEQ ID NO：3至少约80%序列同一性的多肽。在相关实施方案中，分离的蛋白质部分进一步包括具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽。具有SEQ ID NO：3、与SEQ ID NO：3的80%同源性或包含接头残基的SEQ ID NO：3的多肽代表裂解的双链多肽，它是功能性蛋白。肽的低效裂解产生SEQ ID NO：1的单链多肽或具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽。本文描述的方法和分离的细胞可提高fXa衍生物的裂解效率。因此，在某些实施方案中，具有SEQ ID NO：3、与SEQ ID NO：3的80%同源性或包含接头残基的SEQ ID NO：3的双链多肽与SEQ ID NO：1的多肽或与SEQ ID NO：1具有至少约80%序列同一性的多肽的比率可以是至少约9:1。或者，所述比率可以是至少约7:3、8:2、95:5或99:1。

在另一个实施方案中，本发明提供通过本文所述的细胞、构建体或方法制备的双链fXa衍生物的制剂。

裂解的fXa衍生物可使用本领域技术人员已知的方法从宿主细胞纯化。在一种水平上，这些技术包括将细胞环境粗分级分离成多肽和非多肽部分。如果已经从其它蛋白质分离出多肽，则可使用色谱和电泳技术进一步纯化目标多肽，以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合于制备纯肽或多肽的分析方法是过滤、离子交换色谱、混合模式树脂、排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱或等电点聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白液相色谱法或甚至HPLC。

一般来说，“纯化”是指已进行分级分离以除去各种其它组分的蛋白质或肽组合物，并且所述组合物大致上保留其表达的生物学活性。在使用术语“大致上纯化”时，这种表示是指如下组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要成分，诸如构成组合物中的约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或更多的蛋白质。

根据本公开，用于定量蛋白质或肽的纯化程度的各种方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括，例如，确定活性部分的比活性，或通过SDS/PAGE分析来评估一个部分内的多肽的量。用于评估一个部分的纯度的优选方法是计算所述部分的比活性，将它与初始提取物的比活性比较，从而计算纯度，本文中通过“纯化倍数”来评估。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于所选择来跟踪纯化的具体测定技术以及所表达的蛋白质或肽是否表现出可检测的活性。

适用于蛋白质纯化的各种技术为本领域技术人员所熟知的。这些包括，例如，硫酸铵沉淀、PEG(聚乙二醇)、抗体等或通过热变性，随后离心；色谱步骤如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些和其它技术的组合。如在本领域中一般已知的，认为进行各种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并且仍然产生制备大致上纯化的蛋白质或肽的合适方法。

实施例1

表达r-解毒剂蛋白的亲本稳定细胞系的开发

产r-解毒剂细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)克隆，首先用含有r-解毒剂cDNA的表达载体对其进行稳定转染，从而产生亲本克隆。用在单独载体中的全长人弗林蛋白酶cDNA进一步转染(“弗林蛋白酶超级转染”)所述亲本克隆，以改进在r-解毒剂前体中的-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头的加工。r-解毒剂的氨基酸序列和表达载体的DNA序列已经进行了描述。

用于产生r-解毒剂蛋白的宿主细胞系是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO-DUX B11细胞系。使用阳离子脂质体转染试剂(Lipofectamine 2000)用编码r-解毒剂的表达载体对其进行转染。在逐步增加甲氨蝶呤(0、50、250和500 nM)的情况下培养转染池的“子池”；使适用于500 nM甲氨蝶呤的子池适应在商业无血清培养基(CDM4CHO，购自Hyclone, Logan, UT)中的悬浮培养。将表现出最佳生长和产物表达的子池亚克隆。针对生长和生产率来筛选克隆。从最好三个子克隆(13F5-3C11、14G1-3A4、14G1-6A8)在CDM4CHO培养基中制成研究细胞库(RCB)，并测试无菌性和是否存在支原体。

针对初始细胞培养开发和弗林蛋白酶超级转染来选择13F5-3C11和14G1-6A8细胞系。用全长人弗林蛋白酶cDNA稳定转染的克隆14G1-6A8最终被选择为用于产生r-解毒剂的最终细胞系。

实施例2

使用含弗林蛋白酶载体的瞬时转染

为评估细胞因子对r-解毒表达和加工的影响，用含有弗林蛋白酶、Rbm3(推定的RNA结合蛋白3)、XBP1(X盒结合蛋白1)、ATF6(激活转录因子6)或TCTP(翻译控制肿瘤蛋白)cDNA(互补脱氧核糖核酸)的载体瞬时转染在ProCHO培养基中的14G1克隆(14G1-6A8)。在某些情况下，将这些载体中的两个共转染以测试它们的组合效果。在瞬时转染后第3、5、7和10天，检查r-解毒剂的表达水平和质量。有趣的是，只有弗林蛋白酶转染改进了功能性蛋白的总百分比，这可能是由于-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头的加工得到增强，或加工和分泌的细胞内瓶颈得到缓解。图1示出优化的全长人弗林蛋白酶cDNA和翻译的氨基酸序列。图2示出蛋白表达水平和功能活性。图3示出通过蛋白质印迹评估的蛋白质量，其表明弗林蛋白酶的转染完全消除了单链r-解毒剂前体，而所测试的其它实例对存在的单链r-解毒剂前体的量没有影响。

意外的是，如图4所示，弗林蛋白酶与以前公开的另一种fX衍生物des-Gla Xi(美国专利申请号2010-0255000)的共转染并没有改进-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头裂解。这些结果表明，-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头通过弗林蛋白酶的裂解依赖于两个因素：-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头和接头侧翼的氨基酸序列。此外，先前已显示，在同一fXa衍生物构建体中用-RKR-替换-RKRRKR-(SEQ ID NO：5)接头没有产生适当加工的双链分子(参见例如美国专利号5,968,897)。基于这些初步发现，在嘌呤毒素选择下，使14G1克隆进一步经受弗林蛋白酶-载体的转染，以用于产生稳定的细胞系。

实施例3

具有稳定转染人弗林蛋白酶cDNA的产r-解毒剂细胞系

通过用含有全长人弗林蛋白酶cDNA的载体转染14G1-6A8细胞系来产生r-解毒剂生产细胞系。将含有嘌呤霉素选择标记的第二个载体共转染以用于克隆选择。

简而言之，在初始细胞培养开发过程中，首先使含有r-解毒剂表达载体并且在CDM4CHO培养基中产生的亲本稳定细胞系(14G1-6A8)适应ProCHO5培养基(商业上购自Lonza公司，目录＃BE12-766Q)。将克隆14G1-6A8与MTX(甲氨蝶呤，500 nM)一起保持在ProCHO5培养基中，然后进行含有优化全长人弗林蛋白酶cDNA的载体的转染。

将含有弗林蛋白酶的载体与嘌呤霉素选择载体共转染。共转染在没有MTX的ProCHO5培养基中通过基于聚合物的化学方法(聚合物转染)进行。在化学转染中使用的质粒DNA的最佳比率(w/w)是10%弗林蛋白酶-载体质粒:10%嘌呤霉素-载体质粒:80%载体DNA。

使共转染细胞在嘌呤霉素(15 μg/mL)中保持10天。在选择过程结束时，获得了在选择剂的存在下具有良好生长表现的转染细胞池。将来自每个池的细胞冷冻备用。

通过将池(1个细胞/孔)限制性稀释到在96孔板中的没有嘌呤霉素的100 μL ProCHO5培养基中来进行单细胞克隆。基于r-解毒剂表达水平、功能活性和蛋白质印迹来选择个别克隆。

随后，在小旋管培养物中对候选克隆进行扩增和筛选，并且在ProCHO5中培养6天。基于蛋白质的表达水平和质量，选择了10个克隆的子集用于测试不同培养条件的矩阵研究，从其中选择四个候选克隆(克隆＃92、＃94、＃126和＃127)并且建立了RCB。在矩阵实验(图5)和1.5升的生物反应器中(图6 A，B)进一步测试克隆＃92和＃94的生长。克隆＃94最终被选定为用于产生r-解毒剂的最终克隆。

在从96孔板中的候选克隆初始细胞扩增之后，在没有MTX或嘌呤霉素的ProCHO5培养基中，克隆＃92、＃94、＃126和＃127共10次传代之后，建立RCB。没有MTX或嘌呤霉素的10%DMSO+90%ProCHO5培养基被用作用于RCB的冷冻培养基(1 mL/小瓶，30x 10⁶个细胞/ mL)。

本文所提及或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文献和电子版可用信息的内容以引用的方式整体并入本文，其程度犹如明确地并单独地指出将各个别出版物以引用的方式并入本文一般。申请人保留将来自任何这些文章、专利、专利申请或其它实体和电子文件的任何和全部的材料和信息完全并入本申请的权利。

本发明已在本文中进行了广泛性和一般性的描述。落在一般性公开范围内的每个较狭义的物种和亚属群也是本发明的构成部分。这包括具有附带条件或否定限制的本发明的一般性描述，以从类属中除去任何主题而不管删除的材料在本文中是否进行了具体叙述。

其它实施方案处于以下权利要求中。此外，根据Markush组描述了本发明的特征或方面，本领域技术人员将认识到本发明还因此根据Markush组的任何个别成分或成分亚组进行了描述。

Claims

1.一种分离的细胞，其包含：

第一多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽；以及

第二非内源性多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：2至少约80%序列同一性的多肽。

2.如权利要求1所述的分离的细胞，其中所述细胞选自由细菌细胞、哺乳动物细胞和酵母细胞组成的组。

3.如权利要求2所述的分离的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

4.如权利要求3所述的分离的细胞，其中所述哺乳动物细胞是选自由CHO、COS、BHK和HEK 293组成的组的细胞类型。

5.如权利要求4所述的分离的细胞，其中所述细胞类型是CHO。

6.如权利要求5所述的分离的细胞，其中所述细胞是选自由K、M和DG44组成的组的CHO细胞亚型。

7.如权利要求2所述的分离的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。

8.如权利要求7所述的分离的细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求1至8中任一项所述的分离的细胞，其进一步包含选择标记。

10.如权利要求9所述的分离的细胞，其中所述选择标记提供对选自由嘌呤霉素、甲氨蝶呤、新霉素和潮霉素组成的组的化合物的抗性。

11.如权利要求10所述的分离的细胞，其中所述选择标记提供对甲氨蝶呤的抗性。

12.如权利要求10所述的分离的细胞，其中所述选择标记提供对嘌呤霉素的抗性。

13.如权利要求12所述的分离的细胞，其中所述选择标记为所述细胞提供抗生素抗性。

14.如权利要求1所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸或第二多核苷酸是在染色体外DNA构建体上。

15.如权利要求1所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸或第二多核苷酸是在整合到所述分离的细胞的染色体DNA中的DNA构建体上。

16.如权利要求1所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸是在一个DNA质粒上。

17.如权利要求1所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸是在不同DNA质粒上。

18.如前述权利要求中任一项所述的分离的细胞，其进一步包含

包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第一多肽或具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽；以及

包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第二多肽或具有与SEQ ID NO：3至少约80%序列同一性的多肽。

19.如权利要求18所述的分离的细胞，其中所述第二多肽与所述第一多肽的比率为至少约8:2。

20.如权利要求18所述的分离的细胞，其中所述第二多肽与所述第一多肽的比率为至少约9:1。

21.如前述权利要求中任一项所述的分离的细胞，其进一步包括包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：2至少约80%序列同一性的多肽。

22.如权利要求21所述的分离的细胞，其中包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的所述多肽的表达水平是内源性弗林蛋白酶的表达水平的至少3倍。

23.一种组合物，其包含如权利要求1至22中任一项所述的分离的细胞和细胞培养基。

24.一种制备包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的裂解双链多肽或具有与SEQ ID NO：3至少约80%序列同一性的多肽的方法，其中所述方法包括在分离的细胞中表达：

25.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞选自由细菌细胞、哺乳动物细胞和酵母细胞组成的组。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是选自由CHO、COS、BHK和HEK 293组成的组的细胞类型。

28.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞类型是CHO。

29.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞是选自由K、M和DG44组成的组的CHO细胞亚型。

30.如权利要求25所述的方法，其中所述细胞是细菌细胞。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。

32.如权利要求24至31中任一项所述的方法，其进一步包括在所述细胞中表达选择标记基因。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述选择标记提供对选自由嘌呤霉素、甲氨蝶呤、新霉素和潮霉素组成的组的化合物的抗性。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述选择标记提供对甲氨蝶呤的抗性。

35.如权利要求33所述的方法，其中所述选择标记提供对嘌呤霉素的抗性。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述选择标记为所述细胞提供抗生素抗性。

37.如权利要求24所述的方法，其中所述第一核苷酸或第二核苷酸从染色体外DNA构建体表达。

38.如权利要求24所述的方法，其中所述第一多核苷酸或第二多核苷酸从整合到所述分离的细胞的染色体DNA中的DNA构建体表达。

39.如权利要求24所述的方法，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸是在一个DNA质粒上。

40.如权利要求24所述的方法，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸是在不同DNA质粒上。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述DNA质粒通过聚合物转染来转染至所述分离的细胞中。

42.如权利要求41所述的方法，其中包含所述第二多核苷酸的所述质粒占总转染DNA的约1%至约50%。

43.如权利要求42所述的方法，其中包含所述第二多核苷酸的所述质粒占总转染DNA的约1%至约30%。

44.如权利要求43所述的方法，其中包含所述第二多核苷酸的所述质粒占总转染DNA的约3%。

45.如权利要求43所述的方法，其中包含所述第二多核苷酸的所述质粒占总转染DNA的约10%。

46.如权利要求43所述的方法，其中包含所述第二多核苷酸的所述质粒占总转染DNA的约30%。

47.如权利要求24所述的方法，其进一步包括从所述细胞分离的蛋白质部分，所述蛋白质部分包含具有与SEQ ID NO：3至少约80%序列同一性的多肽。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述蛋白质部分进一步包含具有与SEQ ID NO：1至少约80%序列同一性的多肽。

49.如权利要求48所述的方法，其中SEQ ID NO：3的所述裂解双链多肽与SEQ ID NO：1的所述未裂解多肽的比率为至少约8:2。

50.如权利要求48所述的方法，其中SEQ ID NO：3的所述裂解双链多肽与SEQ ID NO：1的所述未裂解多肽的比率为至少约9:1。

51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中从第二多核苷酸表达的所述多肽的表达水平是内源性弗林蛋白酶的表达水平的至少3倍。

52.一种用如权利要求1所述的分离的细胞或如权利要求24所述的方法制备的双链fXa衍生物的制剂。

53.一种多核苷酸构建体，其包含