RU2413768C2 - Способ определения днк-гидролизующей активности молекул и устройство для его осуществления - Google Patents
Способ определения днк-гидролизующей активности молекул и устройство для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2413768C2 RU2413768C2 RU2008137068/10A RU2008137068A RU2413768C2 RU 2413768 C2 RU2413768 C2 RU 2413768C2 RU 2008137068/10 A RU2008137068/10 A RU 2008137068/10A RU 2008137068 A RU2008137068 A RU 2008137068A RU 2413768 C2 RU2413768 C2 RU 2413768C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- molecules
- reaction mixture
- activity
- hydrolyzing
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 37
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 7
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 5
- 239000002110 nanocone Substances 0.000 claims description 3
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 6
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical class C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 239000002055 nanoplate Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical class S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к области биохимии и физики. Предложен способ определения ДНК-гидролизующей активности молекул и устройство для его осуществления. Способ предусматривает адсорбирование реакционной смеси, содержащей ДНК и тестируемые вещества, на рабочем электроде, модифицированном углеродными наноматериалами. Затем регистрируют и сравнивают величины сигналов окисления ДНК в составе реакционной смеси до выдерживания реакционной смеси (контроль) и после выдерживания реакционной смеси (опыт). Увеличение сигнала окисления ДНК свидетельствует о наличии ДНК-гидролизующей активности у тестируемой молекулы. Изобретение позволяет упростить и сократить продолжительность определения ДНК-гидролизующей активности молекул, повысить избирательность и чувствительность анализа при уменьшении его стоимости. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил.
Description
Предлагаемое изобретение относится к области физики и может быть использовано для анализа материалов с помощью биохимических электродов.
ДНК-гидролизующие молекулы - молекулы, способные расщеплять высокомолекулярную дезоксирибонуклеиновую кислоту (далее по тексту - ДНК) на фрагменты. Расщепление ДНК нарушает ее первичную структуру и приводит к развитию заболеваний у живых организмов. Важными ДНК-гидролизующими молекулами являются ферменты: ДНКазы, ДНК-гидролизующие антитела (абзимы), фосфодиэстеразы, которые содержатся в крови и других физиологических жидкостях. Активность этих ферментов изменяется при патологии, поэтому активность этих ферментов служит важным показателем состояния здоровья человека. Отклонение ДНК-гидролизующей активности ферментов от нормы свидетельствует о наличии, степени и течении заболевания [1].
Известен способ оценки активности ДНК-гидролизующих ферментов [2], основанный на спектрофотометрическом определении продуктов гидролиза ДНК - по увеличению оптического поглощения ее (ДНК) раствора. Недостатками способа [2] являются низкая чувствительность, из-за чего невозможно определение слабой степени гидролиза ДНК, а также низкая специфичность вследствие мешающего влияния белков на спектрофотометрическое определение ДНК. Из-за -этих недостатков способ [2] обладает низкой разрешающей способностью.
По содержанию к предлагаемому изобретению наиболее близок известный способ оценки ДНК-гидролизующей активности антител к ДНК [3], используемый, в том числе, для диагностики аутоиммунных заболеваний. Способ прототип-[3] основан на электрофоретическом анализе в теле продуктов гидролиза ДНК, различающихся по молекулярной массе. Недостатками известного способа [3] являются трудоемкость и значительная продолжительность электрофоретического анализа, низкая чувствительность, сложность количественного определения ДНК-гидролнзующей активности, а также необходимость использования большого перечня реактивов и материалов, например буферных растворов сложного состава, гелей, токсичных красителей.
Целью предлагаемого изобретения является упрощение и сокращение продолжительности определения ДНК-гидролизующей активности молекул, повышение избирательности, чувствительности, повышение производительности труда при анализе, повышение достоверности и точности результатов, уменьшение стоимости анализа.
Цель достигают тем, что ДНК-гидролизующую активность молекул определяют электрохимически, адсорбируя реакционную смесь, состоящую из ДНК и ДНК-гидролизующих молекул, на рабочем электроде, модифицированном углеродными наноматериалами, регистрируя и сравнивая величины сигналов окисления ДНК в составе реакционной смеси до выдерживания реакционной смеси на рабочем электроде (контроль) и после выдерживания реакционной смеси (опыт). Увеличение сигнала окисления ДНК свидетельствует о наличии ДНК-гидролизующей активности у молекул. ДНК-гидролизующую активность молекул определяют в составе биологических материалов. ДНК-гидролизующую активность определяют у молекул, выделенных из биологических материалов. ДНК-гидролизующую активность определяют у небиологических молекул. Для электрохимического определения активности ДНК-гидролизующих молекул используют электрохимический анализатор, содержащий электрохимическую ячейку с рабочим электродом, модифицированным углеродными наноматериалами, противоэлектродом и электродом сравнения, погруженными в электролит и соединенными с регистрирующим устройством. Используют электрод, модифицированный нанотрубками. Используют электрод, модифицированный нановолокнами. Используют электрод, модифицированный наноконусами.
Предлагаемое изобретение реализуют, например, следующим образом. Используют электрохимический анализатор, блок-схема которого показана на фиг.1, где 1 - регистрирующее устройство, например потенциостат; 2 электрохимическая ячейка, содержащая электролит 3, например фосфатно-солевой буферный раствор; 4 - электрод сравнения, например хлоридсеребряный; 5 - противоэлектрод, например никелевый; 6 - рабочий электрод, например стеклоуглеродный, модифицированный, например, углеродными нанотрубками. Электроды 4, 5, 6 электрохимической ячейки 2 погружены в электролит 3 и соединены, например электропроводами с регистрирующим устройством 1.
До начала измерения из стандартного электрода (на фиг.1 не показан), например стеклоуглеродного, изготавливают рабочий электрод 6. Для этого стандартный электрод модифицируют, например, многослойными углеродными нанотрубками (далее по тексту - УНТ), подвергнутыми химическому окислению, например, в смеси азотной и серной кислот. Для модификации рабочую поверхность стандартного электрода покрывают, например, с помощью автоматической пипетки суспензией УНТ и удаляют растворитель, например, высушиванием суспензии на воздухе. Таким образом завершают изготовление рабочего электрода 6.
Для определения активности ДНК-гидролизующих ферментов используют субстрат - высокомолекулярную ДНК. ДНК растворяют в фосфатно-солевом буферном растворе до концентрации (ДНК) 1 мг/мл. Далее туда (в раствор ДНК в буфере) добавляют раствор ДНК-гидролизующего фермента, активность которого необходимо определить, и получают реакционную смесь. Реакционную смесь выдерживают, например, 1 ч при 37°С. Таким путем осуществляют гидролиз ДНК.
Далее рабочий электрод 6 погружают в реакционную смесь и выдерживают в контакте с реакционной смесью, например, в течение 1 мин. Это приводит к адсорбции ДНК и продуктов ее гидролиза на рабочем электроде 6. Далее рабочий электрод 6 с адсорбированной ДНК переносят в электрохимическую ячейку 2, например трехэлектродную, с электролитом 3, не содержащим электроактивных веществ, то есть веществ, не окисляющихся и не восстанавливающихся на электроде под действием потенциала. Ячейку 2 подсоединяют к регистрирующему устройству 1, например потенциостату, и при потенциале +1 В регистрируют величину тока окисления (далее по тексту - сигнала) ДНК, адсорбированной на рабочем электроде 6.
Наличие и степень ДНК-гидролизующей активности фермента в реакционной смеси определяют путем сравнения величин регистрируемых сигналов до выдерживания реакционной смеси (контроль) и после выдерживания (опыт). Разность между сигналом ДНК в опыте и сигналом ДНК в контроле является количественной мерой ДНК-гидролизующей активности реакционной смеси и, следовательно, активности исследуемого ДНК-гидролизующего фермента.
С использованием стандартных растворов ДНК-гидролизующего фермента с известной активностью (концентрацией) строят калибровочный график зависимости регистрируемого сигнала от ДНК-гидролизующей активности фермента, по которому определяют ДНК-гидролиэующую активность исследуемого фермента. Указанным образом определяют ДНК-гидролизующую активность ферментов как в составе биологических материалов, так и выделенных из них (биологических материалов),
Осуществление предлагаемого способа приведенным примером не ограничивается. Например, в зависимости от потребности и цели исследования используют стандартные электроды, изготовленные из различных материалов, например металлов, полупроводников, полимеров, композитов. Модификацию стандартного электрода выполняют с использованием различных материалов, например однослойных и/или многослойных углеродных нанотрубок, нановолокон, наноконусов, нанопластин, фуллеренов. Для модификации электрода используют нанотрубки, подготовленные способами, отличными от приведенного примера, например, окислением в атмосфере кислорода, озона, суспендированием в присутствии поверхностно-активных веществ. Измерения проводят с помощью различных, в том числе известных, средств измерения тока, например полярографов.
Предлагаемый способ позволяет определять ДНК-гидролизующую активность очищенных ферментов, например ДНКаз, абзимов, фосфодиэстераз, а также цельных физиологических жидкостей, например слюны, слезной жидкости, сыворотки и плазмы крови, лимфы, пота, спермы. С помощью предлагаемого способа определяют ДНК-гидролизующую активность молекул небиологического происхождения, например загрязнителей окружающей среды, генотоксических ксенобиотиков и антибиотиков.
В основе предлагаемого изобретения лежит использование явления зависимости производимого ДНК электрохимического сигнала окисления от молекулярной массы (линейного размера) ДНК.
Авторами установлено, что низкомолекулярные фрагменты ДНК на рабочем электроде производят больший сигнал, чем высокомолекулярная ДНК, а относительное увеличение сигнала прямо пропорционально изменению молекулярной массы (размера) ДНК. Это объясняет схема, представленная на фиг.2; где 1 - поверхность электрода, модифицированного наноматериалами, например УНТ; 2 - ДНК до (А) и после (Б) гидролиза. Поскольку ДНК окисляется на электроде в адсорбированном состоянии, то уменьшение размера ДНК в результате гидролиза приводит к увеличению количества точек адсорбции ДНК на электроде, что сопровождается увеличением сигнала ДНК. Таким образом, предлагаемый способ позволяет зафиксировать даже небольшие значения ДНК-гидролизующей активности, не определяемые прототипом. Этим подтверждается факт существенного увеличения чувствительности предлагаемого способа по сравнению с прототипом. Кроме того, при применении предлагаемого способа для определения ДНК-гидролизующей активности на сигнал не влияет (то есть не вносит помехи и не искажает сигнал) присутствие белков в реакционной смеси. Этим обеспечиваются высокие избирательность, разрешающая способность и чувствительность предлагаемого способа по сравнению с прототипом и другими известными способами.
Примеры применения способа
1. Определение ДНК-гидролизующей активности молекул небиологической природы с помощью заявленного изобретения.
С помощью заявленного изобретения оценена ДНК-гидролизующая активность молекул небиологической природы - активных форм кислорода (АФК), полученных химически в реакции Фентона [4]:
Fe2++Н2O2+H+→Fе3++ОН-+•OН
АФК генерировали в 0.01 М натрийфосфатном буферном растворе (рН 6,5), содержащем сульфат железа (II), ЭДТА и пероксид водорода до конечных концентраций 20 мкМ, 40 мкМ и 100 мкМ соответственно. Реактив предварительно выдерживали 15 мин при комнатной температуре.
Образовавшиеся АФК (•ОН) инкубировали с нативной ДНК эритроцитов цыплят в течение 15 мин. Электрохимический сигнал окисления ДНК регистрировали до (контроль, пунктирная линия, фиг.3) и после (сплошная линия, фиг.3) выдерживания ДНК с АФК (опыт). После обработки сигнал окисления ДНК увеличивается (фиг.3), так как АФК вызывают расщепление (гидролиз) ДНК [1].
Подобным образом оценивают ДНК-гидролизующую активность любых небиологических молекул, поскольку действие ДНК-гидролизующих молекул приводит к расщеплению ДНК, а с помощью заявленного изобретения можно детектировать даже небольшие изменения в размере молекул ДНК.
2. С помощью заявленного способа определена ДНК-гидролизующая активность молекул в составе сыворотки крови. Известно, что ДНК-гидролизующая активность крови обусловлена работой ферментов - ДНКаз, антител к ДНК и фосфодиэстераз [1]. Исследованы электрохимические свойства компонентов крови, способных оказать мешающее влияние на определение ДНК. Установлено, что сыворотка крови производит пик окисления при потенциале около +0.8 В. Пик обусловлен адсорбцией и окислением сывороточных белков и, вероятно, небелковых компонентов крови. При потенциале окисления ДНК (+1,0 В) сыворотка не окисляется, что позволяет определять ДНК и продукты ее гидролиза в присутствии сыворотки крови.
Отсутствие пиков компонентов крови при потенциале +1,0 В также свидетельствует об отсутствии помех для анализа расщепления ДНК со стороны внеклеточной ДНК крови. Это связано с тем, что концентрация внеклеточной ДНК в крови и других биологических жидкостях обычно менее 60 нг/мл [5]. В такой концентрации внеклеточная ДНК не может оказывать мешающего влияния на анализ используемой в качестве ДНК (концентрация около 0,5 мг/мл).
Обнаружено (фиг.4), что белки крови блокируют поверхность сенсора, что затрудняет диффузию нативной (высокомолекулярной) ДНК к электроду и ее последующее определение (пунктирная линия, фиг.4). После расщепления ДНК сывороткой крови фрагменты ДНК проникают через слой адсорбированных на электроде белков, генерируя сигнал окисления (сплошная линия, фиг.4). При этом сигнал прямо пропорционален степени расщепления ДНК. В качестве примера показана электрофореграмма проб нативной ДНК и ДНК после гидролиза сывороткой крови (фиг.5), а также величина тока окисления этих же проб ДНК на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками.
Результаты (фиг.3, 4, 5) демонстрируют высокую селективность заявленного способа. Благодаря высокой селективности способ позволяет определять ДНК-гидролизующую активность крови даже на фоне высоких концентраций мешающих компонентов. Установлено, что другие более простые по составу биологические жидкости, например слюна и моча, также не производят сигнал при потенциале окисления ДНК на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками. Это однозначно свидетельствует о применимости способа для анализа ДНК-гидролиэующей активности любых известных биологических материалов, например крови, мочи, слюны.
3. Предлагаемое изобретение применено для определения активности фермента ДНКазы I. С помощью предлагаемого способа авторами установлено, что расщепление ДНК под действием ДНКазы I сопровождается увеличением сигнала окисления ДНК (I, µА) во времени (t, мин) (фиг.6). При этом сигнал линейно зависит от времени ДНКазной реакции (степени гидролиза ДНК) и, следовательно, от активности ДНКазы I в растворе. Это позволяет по величине сигнала проводить количественное определение активности ДНКазы I и других ДНК-гидролизующих молекул с существенно более высокой достоверностью, чем при использовании прототипа,
Преимуществами предложенного способа по сравнению с прототипом являются также существенно меньшие трудоемкость и скорость измерения (продолжительность анализа по предлагаемому способу - 10 мин, по прототипу - около 120 мин), большая избирательность и чувствительность, отсутствие необходимости использования дорогостоящих материалов и токсичных красителей.
Полученные с использованием предлагаемого изобретения данные применимы в различных областях деятельности, например в медицине, фармакологии, ветеринарии, а также в фундаментальных научных исследованиях.
Предложенный способ адаптируют и применяют для получения различных технических решений, например для создания одноразовых тестов на основе тест-полосок, используемых, например, в медицине, фармакологии, ветеринарии для диагностики и прогнозирования течения заболеваний человека и животных.
Техническим результатом изобретения является простота и доступность осуществления способа, его высокая чувствительность, избирательность, быстрота определения ДНК-гидролизующей активности молекул то есть увеличение достоверности и точности результатов, сопровождающееся повышением производительности и качества труда.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ оценки ДНК-гидролизующей активности молекул имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве диагностического оборудования, в деятельности организаций здравоохранения и животноводства, экологических организаций и посредством использования стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
Использованные источники
1. А.Г.Барановский, В.Н.Буиева, Г.А.Невинский. Биохимия. 2004. Т. 69. вып.6. С.723-741.
2. L.Ripoll', P.Reinert et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1996, V.37. P.987-991
3. Реферат к описанию изобретения по заявке №2006130509 на получение Патента РФ.
4. Cadet, J, Hydroxyl radicals and DNA base damage / J. Cadet, T.Delatour, T.Douki [et al.] // Mutat. Res. - 1999. - V.424. - P.9-21.
5. Tamkovich, S.N. Circulating DNA in the blood and its application in medical diagnosis / S.N.Tamkovich, V.V.Vlassov, P.P.Laktionov // Molecular Biology. - 2008. - V.42. - №1. - P.9-19.
Claims (8)
1. Способ определения ДНК-гидролизующей активности молекул, отличающийся тем, что определение осуществляют электрохимически, адсорбируя реакционную смесь, состоящую из ДНК и ДНК-гидролизующих молекул, на рабочем электроде, модифицированном углеродными наноматериалами, регистрируя и сравнивая величины сигналов окисления ДНК в составе реакционной смеси до выдерживания реакционной смеси (контроль) и после выдерживания реакционной смеси (опыт), где увеличение сигнала окисления ДНК свидетельствует о наличии ДНК-гидролизующей активности у молекул.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ДНК-гидролизующую активность молекул определяют в составе биологических материалов.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ДНК-гидролизующую активность определяют у молекул, выделенных из биологических материалов.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ДНК-гидролизующую активность определяют у небиологических молекул.
5. Устройство для реализации способа по п.1, представляющее собой электрохимический анализатор для определения ДНК-гидролизующих молекул, содержащий электрохимическую ячейку с рабочим электродом, модифицированным углеродными наноматериалами, противоэлектродом и электродом сравнения, погруженными в электролит и соединенными с регистрирующим устройством.
6. Устройство по п.5, отличающееся тем, что используют электрод, модифицированный нанотрубками.
7. Устройство по п.5, отличающееся тем, что используют электрод, модифицированный нановолокнами.
8. Устройство по п.5, отличающееся тем, что используют электрод, модифицированный наноконусами.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008137068/10A RU2413768C2 (ru) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Способ определения днк-гидролизующей активности молекул и устройство для его осуществления |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008137068/10A RU2413768C2 (ru) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Способ определения днк-гидролизующей активности молекул и устройство для его осуществления |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008137068A RU2008137068A (ru) | 2010-03-20 |
| RU2413768C2 true RU2413768C2 (ru) | 2011-03-10 |
Family
ID=42137025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008137068/10A RU2413768C2 (ru) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Способ определения днк-гидролизующей активности молекул и устройство для его осуществления |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2413768C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2507512C2 (ru) * | 2012-04-06 | 2014-02-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина" | Способ изготовления модифицированного электрода для электрохимического анализа (варианты) |
-
2008
- 2008-09-15 RU RU2008137068/10A patent/RU2413768C2/ru active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PEDANO M ET AL.: "Adsorption and electrooxidation of nucleic acids at carbon nanotubes paste electrodes". Electrochemistry Communications, 2004, v.6, n.1, p.10-16. * |
| АБДУЛЛИН И. и др. Электроды, модифицированные углеродными нанотрубками, для электрохимических ДНК-сенсоров. - Журн. аналит.химии, 2007, т.62, №6, с.667-671. БОНДАРЬ А.В. и др. Оценка структурного состояния ДНК с помощью электрохимических биосенсоров. Ученые записки КГУ серия "Естественные науки, 2007, т.149, №4, c.106-111. НИКИТИНА И.И. и др. Электрохимические ДНК-сенсоры на основе углеродных нанотрубок. Ученые записки КГУ, серия "Физико-математические науки", 2007, т.149, №3, c.121-137. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2507512C2 (ru) * | 2012-04-06 | 2014-02-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина" | Способ изготовления модифицированного электрода для электрохимического анализа (варианты) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008137068A (ru) | 2010-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Guilbault et al. | Enzyme electrodes based on the use of a carbon dioxide sensor. Urea and L-tyrosine electrodes | |
| JP5022033B2 (ja) | 電気化学的特性のアッセイのための方法および装置 | |
| Brahman et al. | DNA-functionalized electrochemical biosensor for detection of vitamin B1 using electrochemically treated multiwalled carbon nanotube paste electrode by voltammetric methods | |
| Parnianchi et al. | Highly selective and sensitive molecularly imprinting electrochemical sensing platform for bilirubin detection in saliva | |
| JP2008128803A (ja) | 電位差式センサ及び分析用素子 | |
| CN107923865A (zh) | 利用电化学检测方法的过敏原检测装置 | |
| CN106399457B (zh) | 基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质及其抑制剂的方法 | |
| CN110044993A (zh) | 一种基于外切酶ⅲ辅助目标物循环与主客体识别的汞离子电传感分析检测方法 | |
| Eksin | An electrochemical assay for sensitive detection of Acinetobacter baumannii gene | |
| CN110044987B (zh) | 二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法及其电化学检测肌钙蛋白的方法 | |
| Baluta et al. | Point-of-Care Testing: Biosensor for Norepinephrine Determination | |
| RU2413768C2 (ru) | Способ определения днк-гидролизующей активности молекул и устройство для его осуществления | |
| Pan et al. | Determination of carbamazepine: a comparison of the differential pulse voltammetry (DPV) method and the immunoassay method in a clinical trial | |
| CN214374840U (zh) | 检测血液凝固特性的装置 | |
| RU2390009C2 (ru) | Способ оценки депуринизации нуклеиновых кислот и устройство для его осуществления | |
| Dou et al. | Electrochimical determination of uric acid, xanthine and hypoxanthine by poly (xylitol) modified glassy carbon electrode | |
| RU2460767C1 (ru) | Способ оценки метаболической активности клеток и устройство для его осуществления | |
| Liang et al. | Low-potential determination of hydrogen peroxide, uric acid and uricase based on highly selective oxidation of p-hydroxyphenylboronic acid by hydrogen peroxide | |
| CN102621216A (zh) | 用双放大效应分子印迹电化学传感器检测微量土霉素的方法 | |
| WO2016190727A1 (en) | An electrochemical dna biosensor for gender and variety identification | |
| CN112326747A (zh) | 一种快速、超灵敏的atp检测方法及其应用 | |
| CN111856042A (zh) | 检测血液凝固特性的装置和其应用 | |
| Karunakaran et al. | Electrochemical Biosensors for Point-of-care Applications. | |
| Piedras et al. | Electrochemical Biosensor Development for Uric Acid Detection | |
| RU2823521C1 (ru) | Устройство для количественной оценки содержания глюкозы в физиологических жидкостях |