CN102621216A - 用双放大效应分子印迹电化学传感器检测微量土霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用双放大效应分子印迹电化学传感器检测微量土霉素的方法。当待测分子土霉素与电极表面的土霉素分子印迹膜上葡萄糖氧化酶标记的土霉素进行竞争取代时，普鲁士蓝催化过氧化氢在铂电极上的电化学信号发生变化，据此建立了一种测定痕量土霉素的电化学分析方法。差分脉冲伏安法对待测液进行扫描，扫描电压0.5～-0.3V，土霉素在0～1×10-7mol/L和1×10-7～1×10-6mol/L浓度范围内与峰电流减少值Δi呈良好的线性关系。本发明克服了已有技术在检测时存在过于复杂等诸多缺点，更好地提高了灵敏度和选择性，对于低浓度土霉素的检测易于自动化。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用双放大效应(膜放大和酶放大)分子印迹技术与电化学传感器联用快速测定微量土霉素的方法。
背景技术
由于其质优价廉、广谱抗菌活性的特点，四环素类兽药在养殖业中的应用非常广泛。土霉素为四环素类抗生素，即是畜禽中广泛应用的广谱抗菌药之一。在畜禽粪便、土壤和废水等环境中经常可以检测到兽药残留，而在四环素类兽药抗生素中以土霉素的检出率较高。另外土霉素作为临床应用最久的抗生素之一，若长期食用会增加人体的抗药性，对人体产生毒副作用，可在肝组织中富集，造成肝损伤。因此有必要在前有的基础上提高灵敏度来研究一种对土霉素具有高选择性的检测方法。分子印迹是近年发展起来的一种对模板分子具有高选择性和高灵敏度的技术。已报道的印迹传感器虽已引入了相关的酶放大技术，但对微量土霉素的检测仍不够灵敏，且需要电子媒介体，使检测步骤繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种用双放大效应分子印迹电化学传感器检测微量土霉素的方法。
构思如下：普鲁士蓝(prussian blue，PB)由于其对过氧化氢的电还原有很好的催化活性和选择性，因此称之为“人工过氧化物酶”。PB对过氧化氢的还原发生催化作用是因为Fe3+的还原物Fe2+与过氧化氢发生了化学氧化反应，反应生成的Fe3+在电极上重新还原，使得还原剂Fe2+得以再生，因而出现了催化电流。当在电极表面电聚合得到稳定的普鲁士蓝分子印迹膜时，就可以通过该膜直接对待测液中的过氧化氢进行检测，不需要电子媒介体，方便测定。另外，引入酶放大效应，可以很好地提高检测的灵敏度。电化学信号的改变即是通过待测液中的土霉素竞争取代分子印迹膜上已孵化的葡萄糖氧化酶标记的土霉素来达到的。待测液中的土霉素浓度越大，竞争能力越强，使得电极表面的酶标土霉素量减少，即葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生的过氧化氢量减少，从而检测到普鲁士蓝催化过氧化氢产生的电化学信号减弱。这样即可达到间接地检测土霉素的目的。
本发明涉及双放大效应的分子印迹酶标增敏技术。当待测分子土霉素与电极表面的土霉素分子印迹膜上葡萄糖氧化酶标记的土霉素进行竞争取代时，普鲁士蓝催化过氧化氢在铂电极上的电化学信号发生变化，峰电流与待测土霉素的浓度在0～1×10-7mol/L和1×10-7～1×10-6mol/L范围内呈良好的线性关系。
具体步骤如下：
(1)铂电极的处理：
将铂电极依次用1.0～0.05μm的氧化铝粉进行表面抛光处理，然后依次在体积百分比浓度为50％的硝酸、无水乙醇和纯水中浸泡洗涤，取出后超声洗涤5min。
(2)土霉素分子印迹电化学传感器的制备：
将步骤(1)处理干净的铂电极置于含5.0mmol/L聚吡咯(PPY)、2.0mmol/LFeCl3、2.0mmol/L K3[Fe(CN)6]、0.3mmol/L土霉素(OTC)、0.1mol/L KCl和0.1mol/L HCl的混合溶液中，在0.36V电沉积30～50s，然后在-0.1～0.4V间于50mV/s的扫描速率循环扫描10～30圈。用蒸馏水冲洗该铂电极，并置于室温下晾干；再将该铂电极于含0.1mol/L KCl的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中施加-0.05V的电位5～15min后，在-0.05～0.36V间扫描5～20圈，用蒸馏水冲洗干净后在室温下晾干，得土霉素分子印迹电化学传感器；
(3)检测方法：
在15mL小烧杯中加入含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)10mL作为检测体系；将步骤(2)制得的土霉素分子印迹电化学传感器置于葡萄糖氧化酶标记土霉素溶液中孵化15～20min，取出土霉素分子印迹电化学传感器并冲洗其表面，得到孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器；然后将已孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL 0～1.0×10-7mol/L和1.0×10-7～1.0×10-6mol/L浓度范围内的土霉素标准溶液中进行竞争吸附，10min后接入检测体系，选用电化学工作站进行差分脉冲伏安扫描，扫描电压0.5～-0.3V；
(4)标准工作曲线的绘制：
在15mL小烧杯中加入10mL含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为检测体系；将步骤(3)制得的已孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL土霉素标准溶液中竞争吸附，10min后接入检测体系，选用电化学工作站进行差分脉冲伏安扫描；土霉素在0～1×10-7mol/L和1×10-7～1×10-6mol/L浓度范围内与峰电流减少值Δi呈良好的线性关系：Δi(μA)＝-111.12C-0.4209，线性相关系数r＝0.9972；Δi(μA)＝-48.412C-6.977，线性相关系数r＝0.9985。
(5)待测样品中土霉素含量的测定：
在15mL小烧杯中加入含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)10mL作为检测体系；将步骤(3)制得的孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL土霉素溶液中竞争吸附，10min后接入检测体系，利用电化学工作站进行差分脉冲伏安扫描，扫描电压0.5～-0.3V，得到峰电流值i。根据校正曲线计算出土霉素的浓度C。
本发明克服了已有技术在检测时存在过于复杂等诸多缺点，更好地提高了灵敏度和选择性，对于低浓度土霉素的检测易于自动化。
附图说明
图1为本发明实施例铂电极上土霉素分子印迹膜在含0.1mol/L氯化钾的磷酸盐缓冲溶液中的差分脉冲伏安图。
图中：a为裸铂电极；b为非分子印迹电化学传感器；c为孵化后的分子印迹电化学传感器；d为已在土霉素标准溶液中竞争后的分子印迹电化学传感器。
图2为本发明实施例土霉素含量与差分脉冲伏安法峰电流的关系图。
具体实施方式
实施例：
(1)铂电极的处理：
将铂电极依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉进行表面抛光处理，然后依次在体积百分比浓度为50％的硝酸、无水乙醇和纯水中浸泡洗涤，取出后超声洗涤5min。
(2)土霉素分子印迹电化学传感器的制备：
将步骤(1)处理干净的铂电极置于含5.0mmol/L聚吡咯(PPY)、2.0mmol/LFeCl3、2.0mmol/L K3[Fe(CN)6]、0.3mmol/L土霉素(OTC)、0.1mol/L KCl和0.1mol/L HCl的混合溶液中，在0.36V电沉积40s，然后在-0.1～0.4V间于50mV/s的扫描速率循环扫描20圈。用蒸馏水冲洗该电极，并置于室温下晾干。再将该铂电极于含0.1mol/L KCl的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中施加-0.05V的电位10min后，在-0.05～0.36V间扫描10圈，用蒸馏水冲洗干净后在室温下晾干，得土霉素分子印迹电化学传感器；
(3)检测方法：
在15mL小烧杯中加入含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)10mL作为检测体系；将步骤(2)制得的土霉素分子印迹电化学传感器置于葡萄糖氧化酶标记土霉素溶液中孵化18min，取出土霉素分子印迹电化学传感器并冲洗其表面，得到孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器；然后将已孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL 5.0×10-7mol/L土霉素标准溶液中进行竞争吸附，10min后接入检测体系，用电化学工作站进行差分脉冲伏安扫描，扫描电压0.5～-0.3V；
(4)标准工作曲线的绘制：
在15mL小烧杯中加入10mL含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为检测体系；将步骤(3)制得的已孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL土霉素标准溶液中竞争吸附，10min后接入检测体系，选用电化学工作站进行差分脉冲伏安扫描。土霉素在0～1×10-7mol/L和1×10-7～1×10-6mol/L浓度范围内与峰电流变化值Δi呈良好的线性关系：Δi(μA)＝-111.12C-0.4209，线性相关系数r＝0.9972；Δi(μA)＝-48.412C-6.977，线性相关系数r＝0.9985。
(5)牛奶样品中土霉素含量的测定
用于样品检测的牛奶购于超市，但未检出土霉素，故采用加标回收实验。在15mL小烧杯中加入含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)10mL作为检测体系。将步骤(3)制得的已孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL土霉素溶液中竞争吸附，10min后接入检测体系，利用电化学工作站进行差分脉冲伏安扫描，扫描电压0.5～-0.3V，得到峰电流值i。根据校正曲线计算出土霉素的浓度C。计算回收率，结果如表1所示。
表1加标回收试验数据
Claims (1)
1.一种用双放大效应分子印迹电化学传感器检测微量土霉素的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)铂电极的处理：
将铂电极依次用1.0～0.05μm的氧化铝粉进行表面抛光处理，然后依次在体积百分比浓度为50％的硝酸、无水乙醇和纯水中浸泡洗涤，取出后超声洗涤5min；
(2)土霉素分子印迹电化学传感器的制备：
将步骤(1)处理干净的铂电极置于含5.0mmol/L聚吡咯、2.0mmol/L FeCl3、2.0mmol/L K3[Fe(CN)6]、0.3mmol/L土霉素、0.1mol/L KCl和0.1mol/L HCl的混合溶液中，在0.36V电沉积30～50s，然后在-0.1～0.4V间于50mV/s的扫描速率循环扫描10～30圈；用蒸馏水冲洗该铂电极，并置于室温下晾干；再将该铂电极于含0.1mol/L KCl的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液中施加-0.05V的电位5～15min后，在-0.05～0.36V间扫描5～20圈，用蒸馏水冲洗干净后在室温下晾干，得土霉素分子印迹电化学传感器；
(3)检测方法：
在15mL小烧杯中加入含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液10mL作为检测体系；将步骤(2)制得的土霉素分子印迹电化学传感器置于葡萄糖氧化酶标记土霉素溶液中孵化15～20min，取出土霉素分子印迹电化学传感器并冲洗其表面，得到孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器；然后将已孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL 0～1.0×10-7mol/L和1.0×10-7～1.0×10-6mol/L浓度范围内的土霉素标准溶液中进行竞争吸附，10min后接入检测体系，选用电化学工作站进行差分脉冲伏安扫描，扫描电压0.5～-0.3V；
(4)标准工作曲线的绘制：
在15mL小烧杯中加入10mL含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液；将步骤(3)制得的已孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL土霉素标准溶液中竞争吸附，10min后接入检测体系，选用电化学工作站进行差分脉冲伏安扫描；土霉素在0～1×10-7mol/L和1×10-7～1×10-6mol/L浓度范围内与峰电流减少值Δi呈良好的线性关系：Δi(μA)＝-111.12C-0.4209，线性相关系数r＝0.9972；Δi(μA)＝-48.412C-6.977，线性相关系数r＝0.9985；
(5)待测样品中土霉素含量的测定：
在15mL小烧杯中加入含0.1mol/L氯化钾的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液10mL；将步骤(3)制得的孵化完全的土霉素分子印迹电化学传感器浸入10mL土霉素溶液中竞争吸附，10min后接入检测体系，利用电化学工作站对待测液进行差分脉冲伏安扫描，扫描电压0.5～-0.3V，得到峰电流值i；根据校正曲线计算出土霉素的浓度C。
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