RU2346038C2 - Способ ферментативного получения аминокислот и производных аминокислот из семейства фосфоглицератов - Google Patents
Способ ферментативного получения аминокислот и производных аминокислот из семейства фосфоглицератов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2346038C2 RU2346038C2 RU2003122076/13A RU2003122076A RU2346038C2 RU 2346038 C2 RU2346038 C2 RU 2346038C2 RU 2003122076/13 A RU2003122076/13 A RU 2003122076/13A RU 2003122076 A RU2003122076 A RU 2003122076A RU 2346038 C2 RU2346038 C2 RU 2346038C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- yfik
- gene
- plasmid
- amino acids
- fermentation
- Prior art date
Links
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N phosphono 2,3-dihydroxypropanoate Chemical compound OCC(O)C(=O)OP(O)(O)=O KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 14
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 title description 4
- 101100021490 Bacillus subtilis (strain 168) lnrK gene Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 101100117984 Escherichia coli (strain K12) eamB gene Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 38
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 34
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 28
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 101150091570 gapA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 claims description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 claims description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 claims description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 claims 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 claims 1
- TYBWABJIIOVYOR-UHFFFAOYSA-N OCC(C(O)=O)OP(=O)=O Chemical class OCC(C(O)=O)OP(=O)=O TYBWABJIIOVYOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 35
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 33
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 15
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N O-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- JJIHLJJYMXLCOY-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-DL-serine Natural products CC(=O)NC(CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 5
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000008538 L-cysteines Chemical class 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- JCAKCGQZNBEITC-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,3-thiazolidine-2,4-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(C)NC(C(O)=O)CS1 JCAKCGQZNBEITC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 101100498063 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cysB gene Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091022908 Serine O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- HHDDCCUIIUWNGJ-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxypyruvate Chemical compound OCC(=O)C([O-])=O HHDDCCUIIUWNGJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LFLUCDOSQPJJBE-UHFFFAOYSA-N 3-phosphonooxypyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)COP(O)(O)=O LFLUCDOSQPJJBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100052574 Bacillus subtilis (strain 168) ydeD gene Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 101100117976 Escherichia coli (strain K12) eamA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 description 1
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000008550 L-serines Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-L O-phosphonato-L-serine(2-) Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])COP([O-])([O-])=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001486 biosynthesis of amino acids Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 101150058227 cysB gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001944 cysteine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 101150040063 orf gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- -1 respectively Chemical compound 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 150000003548 thiazolidines Chemical class 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L thiosulfate(2-) Chemical compound [O-]S([S-])(=O)=O DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000004764 thiosulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения аминокислот из семейства фосфоглицератов с использованием клеток Escherichia coli, пригодных для ферментативного получения аминокислот и имеющих повышенную активность продукта гена yfiK. Клетки Escherichia coli получают путем трансформации исходных клеток плазмидой, которая содержит ген yfiK и промотор. Изобретение позволяет получать аминокислоты из семейства фосфоглицератов с высокой степенью эффективности. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к способу получения аминокислот и производных аминокислот из семейства фосфоглицератов, таких, например, как О-ацетил-L-серин, N-ацетил-L-серин, L-цистеин, LL-цистин и производные L-цистеина, путем ферментации.
В настоящее время двадцать встречающихся в естественных условиях протеиногенных аминокислот получают преимущественно путем ферментации с использованием микроорганизмов. При этом используется способность микроорганизмов к биосинтезу встречающихся в естественных условиях аминокислот.
Однако у штаммов дикого типа подобные процессы биосинтеза находятся под строгим контролем, обеспечивающим продуцирование аминокислот лишь в таких количествах, которые необходимы для удовлетворения собственных потребностей клетки в таких аминокислотах. Поэтому для эффективного получения аминокислот в промышленном масштабе важно располагать соответствующими микроорганизмами, которые в отличие от микроорганизмов дикого типа способны в результате их жизнедеятельности продуцировать требуемую аминокислоту в существенно больших количествах.
Подобные микроорганизмы, способные к сверхпродуцированию аминокислот, можно создавать классическими методами мутации/отбора и/или современными методами целенаправленной рекомбинации ("метаболическое конструирование"). В последнем случае сначала идентифицируют гены или аллели, которые в результате их изменения, активации или инактивации вызывают сверхпродуцирование аминокислот. Затем такие гены, соответственно аллели вводят методами молекулярной биологии в штамм микроорганизма или инактивируют таким образом, чтобы обеспечить оптимальное сверхпродуцирование аминокислот. Однако действительно эффективного продуцирования микроорганизмами аминокислот часто удается достичь лишь за счет использования нескольких различных мер в их сочетании.
Характерная особенность аминокислот из семейства фосфоглицератов состоит в том, что они в процессе их биосинтеза образуются исходя из 3-фосфоглицериновой кислоты. При этом в ходе естественного метаболизма сначала через образование промежуточных 3-фосфогидроксипирувата и 3-фосфо-L-серина образуется L-серин. В последующем этот L-серин может превращаться в глицин, соответственно через образование промежуточного O-ацетил-L-серина - в L-цистеин.
Из уровня техники уже известны некоторые, описанные ниже гены, соответственно аллели, которые могут использоваться для ферментативного получения аминокислот из семейства фосфоглицератов, прежде всего L-серина и L-цистеина, и применение которых приводит к сверхпродуцированию аминокислот:
- аллели serA, которые описаны в ЕР 0620853 В1 или в ЕР 0931833 А2 и которые кодируют 3-фосфоглицерат-дигидрогеназы, для которых характерно пониженное ингибирование обратной связи L-серином, вследствие чего образование 3-гидроксипирувата оказывается практически не связанным с уровнем серина в клетке;
- аллели cysE, которые описаны в заявке WO 97/15673 (которая включена в настоящее описание в качестве ссылки), в статье Nakamori S. и др., Appl. Env.Microbiol. 64, 1998, cc.1607-1611 (которая включена в настоящее описание в качестве ссылки), или у Takagi Н. и др., FEBS Lett. 452, 1999, cc.323-327, и которые встраивали в штамм микроорганизма, при этом такие аллели cysE кодируют серин-O-ацетилтрансферазы, для которых характерно пониженное ингибирование обратной связи L-цистеином, вследствие чего образование O-ацетил-L-серина, соответственно L-цистеина оказывается практически не связанным с уровнем цистеина в клетке;
- гены оттока, которые описаны в ЕР 0885962 А1, при этом описанный в указанной публикации ген orf предположительно кодирует систему оттока, которая пригодна для выведения из организма антибиотиков и других токсических веществ и которая обусловливает сверхпродуцирование L-цистеина, L-цистина, N-ацетилсерина и/или производных тиазолидина;
- ген cysB, который описан в DE 19949579 С1 и который кодирует центральный генный регулятор пути метаболизма серы и тем самым играет решающую роль в обеспечении процесса биосинтеза цистеина сульфидом.
Из уровня техники известно далее, что описанными выше методами можно также получать производные цистеина. Так, в частности, путем ферментации можно получать LL-цистин в качестве продукта окисления L-цистеина или 2-метилтиазолидин-2,4-дикарбоновую кислоту в качестве продукта конденсации L-цистеина и пирувата. Поскольку L-цистеин является основным источником серы для клетки, описанные методы могут служить отправной точкой для получения самых разнообразных серосодержащих метаболитов (например, L-метионина, (+)-биотина, тиамина и т.д.), которые в контексте настоящего описания обозначаются обобщающим понятием "производные L-цистеина".
Из литературных источников известно далее, что при соответствующем подходе при ферментации в качестве основного ее продукта могут образовываться также такие аминокислоты, как N-ацетил-L-серин (ЕР 0885962 А1), соответственно О-ацетил-L-серин (DE 10107002 А). В свою очередь из содержащего N-ацетил-L-серин ферментационного бульона можно сравнительно просто получить L-серин, как это описано в DE 10219851 А.
В основу настоящего изобретения была положена задача создать рекомбинантный штамм микроорганизма, который обладал бы способностью сверхпродуцировать аминокислоты или производные аминокислот из семейства фосфоглицератов. Еще одна задача изобретения состояла в разработке способа ферментативного получения аминокислот или производных аминокислот из семейства фосфоглицератов с использованием таких рекомбинантных штаммов микроорганизмов.
Первая из указанных выше задач решается согласно изобретению с помощью штамма микроорганизма, пригодного для ферментативного получения аминокислот из семейства фосфоглицератов или их производных и создаваемого из исходного штамма, при этом такой штамм отличается тем, что он по сравнению с исходным штаммом характеризуется повышенной активностью продукта гена yfiK или генного продукта гомолога гена yfiK.
Согласно настоящему изобретению повышение активности продукта гена yfiK имеет место в том случае, когда в результате увеличения количества генного продукта в клетке повышается общая активность в клетке и тем самым, несмотря на практически неизменную удельную активность продукта гена yfiK, активность такого продукта из расчета на одну клетку возрастает.
Ген yfiK Escherichia coli, который был идентифицирован при секвенировании генома (Blattner и др., Science 277, 1997, cc.1453-1462) в виде открытой рамки считывания, кодирует протеин, состоящий из 195 аминокислот. До настоящего времени с геном yfiK не удавалось соотнести какой-либо физиологической функции. Поиск протеинов с гомологией последовательностей в банке данных (с использованием алгоритма FASTA из пакета программ GCG Wisconsin Package, разработанного фирмой Genetics Computer Group (GLG), Мэдисон, шт.Висконсин) также не дал практически никаких результатов, поскольку было выявлено сходство лишь с теми протеинами, функции которых также неизвестны. Единственной отправной точкой для выявления возможной активности продукта гена yfiK является информация, которую можно найти в работе Aleshin и др. (Trends in Biol. Sci., 24, 1999, cc.133-135). В этой работе постулируется существование структурного мотива, наличие которого должно быть характерно для семейства протеинов, способствующих оттоку аминокислот. Поскольку подобный слабый консенсусный мотив встречается также в протеине YfiK, такой протеин YfiK предположительно может представлять собой систему оттока аминокислот. Однако для специалиста в данной области на основе таких сведений абсолютно невозможно сделать вывод о конкретном аминокислотном субстрате протеина YfiK. Тот факт, что продукт гена yfiK оказывает положительное влияние на продуцирование аминокислот из семейства фосфоглицератов, является неожиданным прежде всего постольку, поскольку в Escherichia coli в качестве генного продукта YdeD уже был охарактеризован протеин, способствующий оттоку аминокислот из семейства фосфоглицератов (DaBler и др., Mol. Microbiol., 36, 2000, cc.1101-1112), а существование второй системы является полностью неожиданным. Интерес представляет также отсутствие структурного сходства между продуктами генов yfiK и ydeD.
Ген yfiK и генный продукт YfiK (протеин YfiK) характеризуются последовательностями SEQ ID No.1, соответственно SEQ ID No.2. В контексте настоящего изобретения к гомологам гена yfiK относят те гены, идентичность последовательностей которых по данным анализа с использованием алгоритма BESTFIT (пакет программ GCG Wisconsin Package фирмы Genetics Computer Group (GLG), Мэдисон, шт.Висконсин) превышает 30%. Наиболее предпочтительной является идентичность последовательностей, превышающая 70%.
Равным образом к гомологам протеина YfiK следует отнести те протеины, идентичность последовательностей которых по данным анализа с использованием алгоритма BESTFIT (пакет программ GCG Wisconsin Package фирмы Genetics Computer Group (GLG), Мэдисон, штат Висконсин) превышает 30%. Наиболее предпочтительной является идентичность последовательностей, превышающая 70%.
В соответствии с этим под гомологами гена yfiK подразумеваются также аллельные варианты гена yfiK и прежде всего те функционально активные варианты, которые можно получить из представленной в SEQ ID No.1 последовательности путем делеции, инсерции или замены нуклеотидов, при этом, однако, соответствующий генный продукт должен сохранять ферментативную активность.
Предлагаемые в изобретении микроорганизмы, которые обладают повышенной по сравнению с исходным штаммом активностью продукта гена yfiK, можно получать стандартными методами молекулярной биологии.
В качестве исходного штамма в принципе можно использовать все организмы, которые способны к биосинтезу аминокислот из семейства фосфоглицератов и которые допускают возможность применения к ним методов рекомбинации и их культивирования путем ферментации. Такими микроорганизмами могут служить грибы, дрожжи или бактерии. Предпочтительны при этом бактерии, относящиеся к филогенетической группе Eubacteria, наиболее предпочтительны микроорганизмы из семейства Enterobacteriaceae и прежде всего вида Escherichia coli.
Повышение активности продукта гена yfiK в предлагаемом в изобретении микроорганизме достигается, например, за счет усиления экспрессии гена yfiK. При этом можно увеличивать количество копий гена yfiK в микроорганизме и/или повышать экспрессию гена yfiK с помощью соответствующих промоторов. Под усиленной экспрессией при этом преимущественно подразумевается экспрессия гена yfiK, которая по меньшей мере в два раза превышает экспрессию, характерную для исходного штамма.
Увеличивать количество копий гена yfiK в микроорганизме можно с помощью известных специалисту методов. Так, например, ген yfiK можно клонировать в плазмидных векторах, способных многократно увеличивать количество копий на одну клетку (например, в плазмидных векторах pUC19, pBR322, pACYC184 для Escherichia coli), и затем встраивать в микроорганизм. В другом варианте ген yfiK можно многократно интегрировать в хромосому микроорганизма. Для такой интеграции можно использовать известные системы с темперированными бактериофагами или интеграционные плазмиды либо осуществлять интеграцию с помощью гомологичной рекомбинации (см., например, Hamilton и др., J.Bacteriol., 171, 1989, cc.4617-4622).
Увеличивать количество копий гена yfiK предпочтительно путем его клонирования в плазмидных векторах под контролем промотора. Наиболее предпочтительным является увеличение количества копий в Escherichia coli путем клонирования гена yfiK в плазмиде, являющейся производной плазмиды pACYC, такой, например, как плазмида pACYC184-LH (которая в соответствии с Будапештским договором была депонирована 18.08.95 в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг, под регистрационным номером DSM 10172).
В качестве контролирующей области для экспрессии кодируемого плазмидой гена yfiK могут служить встречающиеся в естественных условиях промоторная и операторная области гена.
Однако усиленной экспрессии гена yfiK можно прежде всего достичь также с помощью других промоторов. Соответствующие промоторные системы, которыми, например, для Escherichia coli являются конститутивный GAPDH-промотор гена gapA или индуцибельные lac-, tac-, trc-, lambda-, ara- или tet-промоторы, хорошо известны в данной области (Makrides S.C., Microbiol. Rev., 60, 1996, cc.512-538). Подобные конструкции можно по известным методам использовать в составе плазмид или встраивать в хромосому.
Помимо этого усиленная экспрессия может достигаться при наличии в соответствующей конструкции расположенных в оптимальной последовательности сигналов инициации трансляции, таких, например, как сайт связывания рибосомы или инициирующий кодон гена, либо в результате замены редко встречающихся кодонов на основе данных о "наиболее часто встречающихся кодонах" на более часто встречающиеся кодоны.
Штаммы микроорганизмов, имеющие указанные модификации, являются предпочтительными объектами настоящего изобретения.
Клонировать ген yfiK в плазмидных векторах можно, например, путем специфической амплификации с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, действие которых распространяется на весь ген yfiK, и последующего лигирования с фрагментами векторной ДНК.
Предпочтительными векторами, используемыми для клонирования гена yfiK, являются плазмиды, которые уже содержат промоторы, обеспечивающие усиленную экспрессию, например, содержат конститутивный GAPDH-промотор гена gapA Escherichia coli.
В соответствии с этим изобретение относится также к плазмиде, которая отличается тем, что она содержит ген yfiK совместно с промотором.
Особо предпочтительны далее векторы, которые уже содержат ген/аллель, использование которого приводит к сверхпродуцированию аминокислот из семейства фосфоглицератов, например, содержат ген cysEX (WO 97/15673). Подобные векторы позволяют создавать предлагаемые в изобретении штаммы микроорганизмов, обладающие высокой способностью к сверхпродуцированию аминокислот, непосредственно из любого штамма микроорганизма, поскольку такая плазмида уменьшает ингибирование обратной связи пути метаболизма цистеина в микроорганизме.
В соответствии с этим изобретение относится также к плазмиде, которая отличается тем, что она содержит генетический элемент, обусловливающий нарушение регуляции пути метаболизма цистеина, а также ген yfiK совместно с промотором.
Содержащие ген yfiK плазмиды можно встраивать в микроорганизмы традиционными методами трансформации (например, электропорации) и осуществлять отбор несущих плазмиду клонов, например, по признаку устойчивости к антибиотикам.
В соответствии с этим изобретение относится также к способу создания предлагаемых в нем штаммов микроорганизмов, который отличается тем, что в исходный штамм встраивают предлагаемую в изобретении плазмиду.
Аминокислоты из семейства фосфоглицератов получают с использованием предлагаемых в изобретении штаммов микроорганизмов в ферментере по хорошо известным методам.
В соответствии с этим изобретение относится также к способу получения аминокислот из семейства фосфоглицератов, который отличается тем, что для ферментации используют предлагаемый в изобретении штамм микроорганизма и образовавшуюся аминокислоту выделяют из сбраживаемой среды.
Выращивать штамм микроорганизма в ферментере можно путем непрерывного культивирования, периодического культивирования или предпочтительно периодического культивирования с подпиткой. В процессе ферментации наиболее предпочтительно непрерывно добавлять источник углерода.
В качестве источника углерода предпочтительно использовать сахара, сахароспирты или органические кислоты. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве источников углерода наиболее предпочтительно использовать глюкозу, лактозу или глицерин.
Источник углерода предпочтительно добавлять в такой форме, чтобы его содержание в ферментере в процессе ферментации составляло от 0,1 до 50 г/л. Наиболее предпочтительное содержание источника углерода в ферментере составляет от 0,5 до 10 г/л.
В качестве источника азота при осуществлении предлагаемого в изобретении способа предпочтительно использовать аммиак, аммонийные соли или протеиновые гидролизаты. При использовании аммиака в качестве корректирующего средства для стабилизации значения рН такой источник азота следует регулярно добавлять в процессе ферментации.
В качестве других добавок к культуральной среде можно добавлять соли таких элементов, как фосфор, хлор, натрий, магний, азот, калий, кальций и железо, а также в следовых количествах (т.е. в микромолярных концентрациях) соли таких элементов, как молибден, бор, кобальт, марганец, цинк и никель.
Помимо этого к культуральной среде можно добавлять органические кислоты (например, в виде ацетата, цитрата), аминокислоты (например, изолейцин) и витамины (например, B1, B6).
В качестве комплексных источников питательных веществ можно использовать, например, дрожжевой экстракт, жидкость, образующуюся после замачивания зерен кукурузы до набухания, соевую муку или солодовый экстракт.
Температура инкубации для мезофильных микроорганизмов составляет предпочтительно от 15 до 45°С, наиболее предпочтительно от 30 до 37°С.
Процесс ферментации предпочтительно проводить в аэробных условиях роста микроорганизмов. Вводить кислород в культуральную среду, содержащуюся в ферментере, можно подачей в него сжатого воздуха или чистого кислорода.
Значение рН сбраживаемой среды в процессе ферментации составляет предпочтительно от 5,0 до 8,5, наиболее предпочтительно 7,0. При необходимости получения предлагаемым в изобретении способом О-ацетил-L-серина значение рН сбраживаемой среды наиболее предпочтительно поддерживать в пределах от 5,5 до 6,5.
Для получения L-цистеина и его производных в процессе ферментации необходимо добавлять источник серы. В этом случае предпочтительно использовать сульфаты или тиосульфаты.
Микроорганизмы, с использованием которых проводят ферментацию в соответствии с описанным выше способом, в периодическом процессе или в периодическом процессе с подпиткой после фазы роста в течение 10-150 ч с высокой эффективностью выделяют в культуральную среду аминокислоты из семейства фосфоглицератов.
Ниже изобретение более подробно рассмотрено на примерах.
Пример 1: Клонирование гена yfiK
Ген yfiK из штамма Escherichia coli W3110 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции. При этом в качестве специфических праймеров использовали следующие олигонуклеотиды:
yfiK-fw (SEQ. ID. NO:3):
5'-GGA ATT CAT TAA TGA ТСС АТА АСС ССА ААС СТА ТС-3' и
yfiK-rev (SEQ. ID. NO:4):
5'-GCC TTA ATT AAG TAG CAA GTT ACT AAG CGG AAG-3'.
Полученный в результате фрагмент ДНК расщепляли рестриктазами Asnl и PaCl, очищали с помощью электрофореза на агарозном геле и выделяли (набор для гель-экстракции Qiaquick Gel Extraction Kit фирмы Qiagen, Гильден, Германия). Клонирование осуществляли путем лигирования с расщепленным рестриктазами NdeI/PacI вектором pACYC184-cysEX-GAPDH, который подробно описан в ЕР 0885962 А1. Этот вектор содержит ген cysEX, который кодирует серинацетилтрансферазу с пониженным ингибированием обратной связи L-цистеином и расположенный на 3'-конце этого гена cysEX конститутивный GAPDH-промотор гена gapA. Описанный подход позволяет поместить ген yfiK за GAPDH-промотором таким образом, чтобы транскрипция могла инициироваться из этого положения. Полученный вектор, который обозначили как pG13, схематично изображен на прилагаемом к описанию чертеже. После проверки правильности конструкции ею трансформировали штамм Escherichia coli W3110 и осуществляли отбор соответствующих трансформантов с использованием тетрациклина. Штамм бактерии Escherichia coli W3110/pG13, который в соответствии с Будапештским договором был депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), D-38142, Брауншвейг) под регистрационным номером DSM 15095, использовали в приведенных ниже примерах в качестве штамма-продуцента для получения аминокислот из семейства фосфоглицератов. В качестве сравнительного штамма, сравнение с которым позволяет продемонстрировать эффект от повышенной экспрессии гена yfiK, был выбран штамм W3110/pACYC184-cysEX, который подробно также описан в ЕР 0885962 А1, но который в отличие от pG13 не содержит последовательности GAPDH-промотор-yfiK.
Пример 2: Получение предварительной культуры штамма-продуцента
Для получения предварительной культуры для ферментации в 20 мл среды LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl), которая дополнительно содержала 15 мг/л тетрациклина, вносили штамм W3110/pG13, соответственно штамм W3110/pACYC184-cysEX и инкубировали в шюттель-аппарате при 30°С и 150 об/мин. Через 7 ч всю смесь переносили в 100 мл среды SM1 (12 г/л K2HPO4, 3 г/л KH2PO4, 5 г/л (NH4)2SO4, 0,3 г/л MgSO4×7H2O, 0,015 г/л CaCl2×2H2O, 0,002 г/л FeSO4×7H2O, 1 г/л Na3-цитрата×2Н2O, 0,1 г/л NaCl, 1 мл/л раствора микроэлементов, содержащего 0,15 г/л Na2MoO4×2H2O, 2,5 г/л Na3ВО3, 0,7 г/л CoCl2×6H2O, 0,25 г/л CuSO4×5H2O, 1,6 г/л MnCl2×4Н2O, 0,3 г/л ZnSO4×7H2O), дополненную 5 г/л глюкозы, 0,5 мг/л витамина B1 и 15 мг/л тетрациклина. Дальнейшую инкубацию проводили в течение 17 ч при 30°С и 150 об/мин.
Пример 3: Ферментативное получение О-ацетил-L-серина
В качестве ферментера использовали аппарат Biostat М фирмы Braun Biotech (Мельзунген, Германия) с максимальной вместимостью для культуральной среды, равной 2 л. В ферментер загружали 900 мл среды SM1, дополненной 15 г/л глюкозы, 0,1 г/л триптона, 0,05 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 мг/л витамина B1 и 15 мг/л тетрациклина, и в эту среду вносили описанную в примере 2 предварительную культуру (с оптической плотностью при 600 нм, равной примерно 3). В процессе ферментации температуру регулированием устанавливали на 32°С и значение рН поддерживали на постоянном уровне в 6,0 добавлением 25%-ного раствора аммиака. Культуру барботировали обеззараженным (стерилизованным) сжатым воздухом с расходом 1,5 единицы объема на единицу объема среды в минуту и перемешивали мешалкой, вращавшейся с частотой 200 об/мин. После снижения степени насыщения среды кислородом до 50% частоту вращения мешалки повышали с помощью регулятора до 1200 об/мин для поддержания степени насыщения среды кислородом на этом 50%-ном уровне (степень насыщения кислородом измеряли с помощью pO2-зонда, откалиброванного на 100%-ное насыщение при 900 об/мин). После снижения концентрации глюкозы в ферментере с первоначальных 15 г/л до примерно 5-10 г/л добавляли 56%-ный раствор глюкозы. При этом глюкозу добавляли с расходом 6-12 мл/ч, поддерживая ее концентрацию на постоянном уровне в пределах от 0,5 до 10 г/л. Концентрацию глюкозы определяли с помощью анализатора глюкозы фирмы YSI (Йеллоуспрингс, шт.Огайо, США). Продолжительность ферментации составляла 28 ч. По истечении этого времени брали пробы культуральной среды и клетки отделяли от нее центрифугированием. Образовавшуюся в результате центрифугирования надосадочную жидкость культуры анализировали с помощью ЖХВР с обращенной фазой на колонке типа LUNA 5 µ С18(2) (фирма Phenomenex, Ашаффенбург, Германия) при скорости потока 0,5 мл/мин. В качестве элюента использовали разбавленную фосфорную кислоту (0,1 мл концентрированной фосфорной кислоты на л). В таблице 1 представлены данные о содержании основных метаболитов в надосадочной жидкости культуры. Этими метаболитами являются О-ацетил-L-серин и N-ацетил-L-серин, который в условиях, варьирующихся от нейтральных до щелочных, образуется в возрастающих по мере перехода от нейтральных к щелочным значениям рН количествах из О-ацетил-L-серина в результате изомеризации.
| Таблица 1 | ||
| Штамм | Содержание аминокислоты [г/л] | |
| О-ацетил-L-серин | N-ацетил-L-серин | |
| W3110/pACYC 184-cysEX | 1,8 | 1,5 |
| W3110/pG13 (cysEX-yfiK) | 7,4 | 3,0 |
Пример 4: Ферментативное получение N-ацетил-L-серина
N-ацетил-L-серин получали аналогично примерам 2 и 3. Единственное отличие состояло в том, что значение рН в процессе ферментации поддерживали на уровне 7,0. Соблюдение этого условия способствует изомеризации O-ацетил-L-серина в N-ацетил-L-серин, который в этом случае являлся основным продуктом. Ферментацию проводили в течение 48 ч.
| Таблица 2 | |
| Штамм | Содержание аминокислоты [г/л] |
| N-ацетил-L-серин | |
| W3110/pACYC 184-cysEX | 5,8 |
| W3110/pG 13 (cysEX-yfiK) | 9,2 |
Пример 5: Ферментативное получение L-цистеина и его производных
L-цистеин получали аналогично примерам 2 и 3. Единственное отличие состояло в том, что значение рН в процессе ферментации поддерживали на уровне 7,0 и культуральную среду подпитывали тиосульфатом. При этом через 2 ч добавляли 30%-ный раствор Na-тиосульфата с расходом 3 мл/ч. Продолжительность ферментации составляла 48 ч. Процесс образования L-цистеина контролировали колориметрически в соответствии с тестом, описанным у Gaitonde (Gaitonde M.K., Biochem. J., 104, 1967, cc.627-633). При этом следует учитывать, что такой тест не позволяет проводить различий между L-цистеином и описанным в ЕР 0885962 А1 продуктом конденсации L-цистеина и пирувата (представляющим собой 2-метилтиазолидин-2,4-дикарбоновую кислоту). Присутствие LL-цистина, который образуется в результате окисления из L-цистеина, равно как и присутствие самого этого L-цистеина можно обнаружить в этом тесте путем восстановления дитиотреитолом (ДТТ) в разбавленном растворе при рН 8,0.
| Таблица 3 | |
| Штамм | Содержание аминокислоты [г/л] |
| L-цистеин+его производные | |
| W3110/pACYC 184-cysEX | 4,6 |
| W3110/pG 13 (cysEX-yfiK) | 7,5 |
Claims (14)
1. Клетка Escherichia coli, пригодная для ферментативного получения аминокислот из семейства фосфоглицератов, полученная в результате трансформации исходных клеток плазмидой, которая содержит ген yfiK и промотор, и характеризующаяся по сравнению с исходной клеткой повышенной активностью продукта гена yfiK.
2. Клетка по п.1, отличающаяся увеличенным количеством копий гена yfiK или повышенной экспрессией продукта гена yfiK за счет использования соответствующих промоторов или сигналов трансляции.
3. Клетка по п.2, отличающаяся тем, что промотор выбран из группы, включающей конститутивный GAPDH-прмотор гена gapA и индуцибельные lac-, tac-, trc-, lambda-, ara- и tet-промоторы.
4. Клетка по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что она представляет собой клетку, у которой повышенная активность продукта гена yfiK обусловлена увеличением количества копий гена yfiK в плазмиде, представляющей собой производную плазмиды pACYC.
5. Плазмида, обеспечивающая повышенную экспрессию белка YfiK в Escherichia coli и отличающаяся тем, что она содержит ген yfiK совместно с промотором.
6. Плазмида по п.5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит генетический элемент, обусловливающий нарушение регуляции пути метаболизма цистеина.
7. Способ создания клеток Escherichia coli по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что в исходный штамм встраивают плазмиду по п.5 или 6.
8. Способ получения аминокислоты из семейства фосфоглицератов, отличающийся тем, что для ферментации используют клетки Escherichia coli по любому из пп.1-4 и образовавшуюся аминокислоту выделяют из сбраживаемой среды.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что клетки Escherichia coli выращивают в ферментере путем непрерывного культивирования, периодического культивирования или предпочтительно периодического культивирования с подпиткой.
10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что в процессе ферментации непрерывно добавляют источник углерода.
11. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют сахара, сахароспирты или органические кислоты.
12. Способ по любому из пп.8-11, отличающийся тем, что источник углерода добавляют в такой форме, чтобы его содержание в ферментере в процессе ферментации составляло от 0,1 до 50 г/л, наиболее предпочтительно от 0,5 до 10 г/л.
13. Способ по любому из пп.8-12, отличающийся тем, что в качестве источника азота используют аммиак, аммонийные соли или протеиновые гидролизаты.
14. Способ по любому из пп.8-13, отличающийся тем, что ферментацию проводят в аэробных условиях роста клеток микроорганизма.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10232930A DE10232930A1 (de) | 2002-07-19 | 2002-07-19 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
| DE10232930.3 | 2002-07-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003122076A RU2003122076A (ru) | 2005-02-27 |
| RU2346038C2 true RU2346038C2 (ru) | 2009-02-10 |
Family
ID=29762075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003122076/13A RU2346038C2 (ru) | 2002-07-19 | 2003-07-18 | Способ ферментативного получения аминокислот и производных аминокислот из семейства фосфоглицератов |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040038352A1 (ru) |
| EP (1) | EP1382684B1 (ru) |
| JP (1) | JP4173777B2 (ru) |
| KR (1) | KR100546733B1 (ru) |
| CN (1) | CN1330750C (ru) |
| AT (1) | ATE312192T1 (ru) |
| CA (1) | CA2433485A1 (ru) |
| DE (2) | DE10232930A1 (ru) |
| DK (1) | DK1382684T3 (ru) |
| ES (1) | ES2252593T3 (ru) |
| RU (1) | RU2346038C2 (ru) |
| TW (1) | TWI330199B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732227C1 (ru) * | 2016-12-29 | 2020-09-14 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий О-фосфосерин, и способ получения О-фосфосерина или L-цистеина с использованием этого микроорганизма |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10232930A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| US8669093B2 (en) * | 2003-09-30 | 2014-03-11 | Mitsui Chemicals, Inc. | Biocatalyst for production of D-lactic acid |
| US8114626B2 (en) * | 2004-02-10 | 2012-02-14 | Trustees Of Dartmouth College | Yeast strain and method for using the same to produce nicotinamide riboside |
| JP5332237B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2013-11-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| DE602009000714D1 (de) * | 2008-03-06 | 2011-03-24 | Ajinomoto Kk | L-Zystein-produzierendes Bakterium und Verfahren zur Herstellung von L-Zystein |
| JP5521347B2 (ja) * | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP5359409B2 (ja) * | 2009-03-12 | 2013-12-04 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| KR100987062B1 (ko) * | 2009-10-26 | 2010-10-11 | 림버스산업 주식회사 | 배수시트 교체가 용이한 교량 신축이음장치 및 이의 시공방법 |
| WO2011065469A1 (ja) | 2009-11-30 | 2011-06-03 | 味の素株式会社 | Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法 |
| RU2460793C2 (ru) * | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| WO2012036151A1 (ja) | 2010-09-14 | 2012-03-22 | 味の素株式会社 | 含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法 |
| JP2014087259A (ja) | 2011-02-22 | 2014-05-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| EP2695940B1 (en) | 2011-04-01 | 2016-11-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-cysteine |
| JP2014131487A (ja) | 2011-04-18 | 2014-07-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システインの製造法 |
| DE102011075656A1 (de) | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
| DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
| DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| DE102012216527A1 (de) | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| CA2905112A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloids (bia) producing microbes, and methods of making and using the same |
| KR101773755B1 (ko) | 2013-05-13 | 2017-09-01 | 아지노모토 가부시키가이샤 | Ｌ-아미노산의 제조법 |
| DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| JP6459962B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-01-30 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP6519476B2 (ja) | 2013-10-23 | 2019-05-29 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| WO2015066642A1 (en) * | 2013-11-04 | 2015-05-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same |
| CN107614688B (zh) | 2015-05-04 | 2023-02-28 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 产生苄基异喹啉生物碱(bia)前体的微生物及其制备和使用方法 |
| EP3294865B1 (en) | 2015-05-08 | 2023-04-12 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Methods of producing epimerases and benzylisoquinoline alkaloids |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| JP7199417B2 (ja) | 2017-08-03 | 2023-01-05 | アンテイア インコーポレイテッド | 遺伝子操作されたベンジルイソキノリンアルカロイドエピメラーゼおよびベンジルイソキノリンアルカロイドの生成方法 |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| US12246056B2 (en) | 2018-11-07 | 2025-03-11 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for the production of cysteine |
| BR112021014194A2 (pt) | 2019-02-22 | 2021-12-28 | Ajinomoto Kk | Método para a produção de um l-aminoácido |
| BR112021017870A2 (pt) | 2019-04-05 | 2021-12-07 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido |
| CN110317766B (zh) * | 2019-05-23 | 2020-08-28 | 浙江工业大学 | 一种高产l-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用 |
| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
| US20230124898A1 (en) | 2020-04-03 | 2023-04-20 | Wacker Chemie Ag | Biocatalyst as a core component of an enzyme-catalyzed redox system for the biocatalytic reduction of cystine |
| WO2021259491A1 (de) | 2020-06-26 | 2021-12-30 | Wacker Chemie Ag | Verbesserte cystein produzierende stämme |
| WO2023280382A1 (de) | 2021-07-05 | 2023-01-12 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur enzymatischen oxidation von sulfinsäuren zu sulfonsäuren |
| EP4463466A1 (de) | 2022-03-01 | 2024-11-20 | Wacker Chemie AG | Verbesserte cystein produzierende stämme |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19726083A1 (de) * | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
| RU2175351C2 (ru) * | 1998-12-30 | 2001-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот |
| DE10232930A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
-
2002
- 2002-07-19 DE DE10232930A patent/DE10232930A1/de not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-07-10 ES ES03015546T patent/ES2252593T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-10 DE DE50301836T patent/DE50301836D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-10 DK DK03015546T patent/DK1382684T3/da active
- 2003-07-10 AT AT03015546T patent/ATE312192T1/de active
- 2003-07-10 EP EP03015546A patent/EP1382684B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-16 US US10/620,487 patent/US20040038352A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-17 CA CA002433485A patent/CA2433485A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-18 JP JP2003199397A patent/JP4173777B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-18 KR KR1020030049274A patent/KR100546733B1/ko active IP Right Grant
- 2003-07-18 CN CNB031786677A patent/CN1330750C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-18 RU RU2003122076/13A patent/RU2346038C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-07-18 TW TW092119756A patent/TWI330199B/zh not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-09 US US11/351,137 patent/US20060148041A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DASSLER T et.al. Identification of major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cysteine pathway. Mol.Microbiol. 2000 Jun, 36(5), 1101-12. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732227C1 (ru) * | 2016-12-29 | 2020-09-14 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий О-фосфосерин, и способ получения О-фосфосерина или L-цистеина с использованием этого микроорганизма |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004049237A (ja) | 2004-02-19 |
| TW200402471A (en) | 2004-02-16 |
| EP1382684B1 (de) | 2005-12-07 |
| US20060148041A1 (en) | 2006-07-06 |
| EP1382684A1 (de) | 2004-01-21 |
| DE50301836D1 (de) | 2006-01-12 |
| DK1382684T3 (da) | 2006-03-06 |
| DE10232930A1 (de) | 2004-02-05 |
| KR20040010256A (ko) | 2004-01-31 |
| TWI330199B (en) | 2010-09-11 |
| KR100546733B1 (ko) | 2006-01-26 |
| CA2433485A1 (en) | 2004-01-19 |
| US20040038352A1 (en) | 2004-02-26 |
| RU2003122076A (ru) | 2005-02-27 |
| CN1330750C (zh) | 2007-08-08 |
| ATE312192T1 (de) | 2005-12-15 |
| ES2252593T3 (es) | 2006-05-16 |
| JP4173777B2 (ja) | 2008-10-29 |
| CN1487079A (zh) | 2004-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2346038C2 (ru) | Способ ферментативного получения аминокислот и производных аминокислот из семейства фосфоглицератов | |
| RU2536250C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий о-фосфосерин, и способ получения l-цистеина или его производных из о-фосфосерина с его использованием | |
| RU2280687C2 (ru) | Клетка микроорганизма, плазмидный вектор, способ создания клетки микроорганизма и способ получения l-метионина | |
| RU2663726C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий о-фосфосерин, и способ получения о-фосфосерина или l-цистеина с использованием этого микроорганизма | |
| SK4972002A3 (en) | Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation | |
| RU2275425C2 (ru) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина | |
| US8802399B2 (en) | Method for production of natural L-cysteine by fermentation | |
| US9074230B2 (en) | Method for producing L-cystine by fermentation under controlled oxygen saturation | |
| RU2723714C2 (ru) | Способ и микроорганизм для ферментативного продуцирования метионина с улучшенным выходом метионина | |
| RU2458981C2 (ru) | Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae | |
| US20140342399A1 (en) | Microorganism and method for overproduction of gamma-glutamylcysteine and derivatives of this dipeptide by fermentation | |
| CA2372133A1 (en) | Process for preparing 0-acetyl-l-serine by fermentation | |
| WO2024223833A1 (en) | Genetically modified microorganism for producing ectoine | |
| JP6258329B2 (ja) | Ｌ−システインおよび該アミノ酸の誘導体の発酵生産方法 | |
| RU2814546C2 (ru) | Способ продуцирования серосодержащей аминокислоты или ее производного |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200719 |