RU2315807C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОРЛЕЙЦИНА И НОРВАЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ВСЕ СИНТАЗЫ АЦЕТОГИДРОКСИКИСЛОТ ИНАКТИВИРОВАНЫ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОРЛЕЙЦИНА И НОРВАЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ВСЕ СИНТАЗЫ АЦЕТОГИДРОКСИКИСЛОТ ИНАКТИВИРОВАНЫ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2315807C2 RU2315807C2 RU2004127011/13A RU2004127011A RU2315807C2 RU 2315807 C2 RU2315807 C2 RU 2315807C2 RU 2004127011/13 A RU2004127011/13 A RU 2004127011/13A RU 2004127011 A RU2004127011 A RU 2004127011A RU 2315807 C2 RU2315807 C2 RU 2315807C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- norleucine
- bacterium
- norvaline
- ahas
- amino acids
- Prior art date
Links
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 title claims abstract description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 8
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 47
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 45
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 42
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 26
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 25
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 19
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 11
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 9
- 229930182852 proteinogenic amino acid Natural products 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 43
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 31
- 102100027328 2-hydroxyacyl-CoA lyase 2 Human genes 0.000 description 25
- 101710103719 Acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 25
- 101710182467 Acetolactate synthase large subunit IlvB1 Proteins 0.000 description 25
- 101710171176 Acetolactate synthase large subunit IlvG Proteins 0.000 description 25
- 101710176702 Acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 25
- 101710147947 Acetolactate synthase small subunit 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 25
- 101710095712 Acetolactate synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 25
- 101710196435 Probable acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 25
- 101710181764 Probable acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 25
- 101710104000 Putative acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 17
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 11
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 11
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 6
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 5
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150025049 leuB gene Proteins 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 2-oxobutanoate Chemical compound CCC(=O)C([O-])=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100034229 Citramalyl-CoA lyase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108020004687 Malate Synthase Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 108010048295 2-isopropylmalate synthase Proteins 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 101150081723 leuC gene Proteins 0.000 description 3
- 101150019665 leuD gene Proteins 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010028984 3-isopropylmalate dehydratase Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100123410 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) hacA gene Proteins 0.000 description 2
- 101100123415 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) hacB1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 101100181662 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) leuC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100288829 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) leuD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- -1 glucose and sucrose Chemical class 0.000 description 2
- 101150020087 ilvG gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 101150087199 leuA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- DJXMNZLSBCANRG-SSDOTTSWSA-N (2s)-2-azaniumyl-2-thiophen-2-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)[C@@](N)(C)C1=CC=CS1 DJXMNZLSBCANRG-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FMUMEWVNYMUECA-LURJTMIESA-N (2s)-2-azaniumyl-5-methylhexanoate Chemical compound CC(C)CC[C@H](N)C(O)=O FMUMEWVNYMUECA-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JVQYSWDUAOAHFM-BYPYZUCNSA-N (S)-3-methyl-2-oxovaleric acid Chemical compound CC[C@H](C)C(=O)C(O)=O JVQYSWDUAOAHFM-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(=N)NN=O.O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- KEZRWUUMKVVUPT-UHFFFAOYSA-N 4-azaleucine Chemical compound CN(C)CC(N)C(O)=O KEZRWUUMKVVUPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFGVJLGVINCWDP-UHFFFAOYSA-N 5,5,5-trifluoroleucine Chemical compound FC(F)(F)C(C)CC(N)C(O)=O XFGVJLGVINCWDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710102786 ATP-dependent leucine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 101710109578 Acetolactate synthase 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710184601 Acetolactate synthase 2, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 241000272522 Anas Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101001055194 Brassica napus Acetolactate synthase 3, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101100343729 Buchnera aphidicola subsp. Rhopalosiphum padi leuL gene Proteins 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 101100128639 Escherichia coli (strain K12) ivbL gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 101710201625 Leucine-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101001135788 Pinus taeda (+)-alpha-pinene synthase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- ZAYJDMWJYCTABM-UHFFFAOYSA-N beta-hydroxy leucine Natural products CC(C)C(O)C(N)C(O)=O ZAYJDMWJYCTABM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 101150018621 cra gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 101150025027 fruR gene Proteins 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066849 ilvL gene Proteins 0.000 description 1
- 101150003892 ilvM gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012001 immunoprecipitation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 1
- 101150057315 leuL gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108478 leuO gene Proteins 0.000 description 1
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 101150093219 uhpA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- ZAYJDMWJYCTABM-WHFBIAKZSA-N β-hydroxyleucine Chemical compound CC(C)[C@H](O)[C@H](N)C(O)=O ZAYJDMWJYCTABM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения непротеиногенных аминокислот, таких как норлейцин и норвалин, с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, у которой все синтазы ацетогидроксикислот (AHASы) инактивированы. Изобретение позволяет получать норлейцин и норвалин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу продукции непротеиногенных аминокислот, таких как норлейцин и норвалин, с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой все синтазы ацетогидроксикислот (AHASы) инактивированны.
Предшествующий уровень техники
Известно, что норлейцин в бактериальной клетке является аналогом метионина (Lawrence, J.Bacteriol., 109, 8-11 (1972)). Была показана его способность встраиваться в белки вместо метионина (Barker, D. and Bruton, С., J.Mol. Biol., 133, 217-31 (1979), Munier, R. and Cohen, G., Biochim. Biophys. Acta., 31, 378-90 (1959); Bogosyan, G. et al., J.Biol. Chem., 264,1, 531-539, (1989); патент США 5622845; патент США 5599690). Также известно, что конкурентное ингибирование внутриклеточной утилизации метионина за счет поступающего извне норлейцина останавливает рост Е.coli (Harris, J. S. and Kohn, H. I., J. Pharmacol., 73, 383-400 (1941)). При добавлении норлейцина наблюдалось повышение скорости роста метионинового ауксотрофа Е.coli в среде, содержащей метионин в концентрации, близкой к оптимальной (Lampen, J. О. and Jones, M. J., Arch. Biochem. Biophys., 13,47-53 (1947)).
Описан способ получения норлейцина с использованием штамма Е.coli с высоким уровнем синтеза богатых лейцином белков, выращиваемого в ферментационной среде с низкой концентрацией аминокислот (патент США 5622845).
Был получен мутантный штамм S. marcescens с дерепрессированными ферментами пути биосинтеза лейцина, на основе которого в дальнейшем был отобран изолейцинзависимый мутант, не имеющий активности треониндегидратазы. Далее, на основе этого двойного мутанта был отобран изолейцин-независимый (не содержащий активности треониндегидратазы) мутант с устойчивой к ингибированию по типу обратной связи альфа-изопропилмалатсинтазой. Полученный мутант был способен накапливать норлейцин.
Было предложено, что норлейцин образуется из пирувата или 2-кетобутирата (вместо субстрата пути биосинтеза лейцина - 2-кетоизовалерата) (Фиг.1) в Serratia marcesens (Kisumi et al., J.Biochem., 1976, 80, 333-339) и Е.coli (Bogosyan, G., et al., J.Biol. Chern., 264,1,531-539 (1989)).
Описан способ получения белков, содержащих непротеиногенные аминокислоты путем культивирования микроорганизма-продуцента белка, в частности Е.coli, в культуральной жидкости, содержащей непротеиногенные аминокислоты, включая норлейцин и норвалин (патент США 4879223).
Включение норлейцина в продукты рекомбинантных генов может также осуществляться путем культивирования клеток, экспрессирующих ген, кодирующих целевой продукт в среде, содержащей норлейцин, или являющихся ауксотрофами по лейцину и/или метионину. Таким образом, эта методика может использоваться для получения аналогов норлейцина - IL-2, GCSF, гамма-интерферона и альфа-консенсус интерферона (патент США 5599690). Но в настоящее время нет данных о накоплении норлейцина и норвалина с использованием штаммов Е.coli, в которых отсутствуют активности AHAS.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 показана схема биосинтеза норлейцина и норвалина, включающая процесс удлинения углеродной цепи кетокислот.
На Фиг.2 показана предполагаемая схема биосинтеза непротеиногенных аминокислот в штамме Е.coli, в котором отсутствует активность AHAS. KIV - 2-кетоизовалериат; PYR - пируат; KB - 2-кетобутират; KV - 2-кетовалериат; KIC - 2-кетоизокапроат; КС - 2-кетокапроат; IPMS - изопропилмалатсинтаза; IPMI - изопропилмалатизомераза; IPMD - изопропилмалатдегидрогеназа.
На Фиг.3 показано относительное расположение праймеров ilvBN1 и ilvBN2 на плазмиде pACYC184.
На Фиг.4 показана схема конструирования хромосомного фрагмента ДНК, содержащего инактивированный оперон ilvBN.
На Фиг.5 показана плазмида pMW118-ilvIH.
На Фиг.6 показана плазмида pBR-leuABCD.
На Фиг.7 показано разделение на ВЖКХ: а) стандартной смеси аминокислот; b) стандартной смеси аминокислот, содержащей 0.06 мМ норвалина и норлейцина; с) ферментационный бульон.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является предоставление штаммов-продуцентов непротеиногенных аминокислот и предоставление способа получения таких непротеиногенных аминокислот с использованием указанных штаммов.
Данная цель была достигнута путем установления того факта, что инактивация AHAS может повысить продукцию непротеиногенных аминокислот, таких как норлейцин и норвалин. Далее, было показано, что усиленная экспрессия leuABCD оперона повышает продукцию непротеиногенных аминокислот штаммами с инактивированными АНАЗами. Таким образом было совершено настоящее изобретение.
Настоящее изобретение представляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к продукции непротеиногенных аминокислот, таких как норлейцин и норвалин.
Целью настоящего изобретения является создание бактерии-продуцента непротеиногенных аминокислот семейства Enterobacteriaceae, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что все синтазы ацетогидроксикислот (AHASы) инктивированы.
Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, где непротеиногенными аминокислотами являются норлейцин и/или норвалин.
Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой синтазы ацетогидроксикислот включают в себя AHAS I, кодируемую генами UvBN, AHAS II, кодируемую генами UvGM, и AHAS III, кодируемую генами UvIH.
Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия оперона leuABCD усилена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения непротеиногенных аминокислот, при этом указанный метод включает:
- выращивание указанной бактерии в питательной среде, которая не содержит L-лейцин, но содержит L-валин в концентрации, лимитирующей рост бактерии, с целью продукции и накопления непротеиногенных аминокислот в питательной среде, и
- выделение полученной непротеиногенной аминокислоты из культуральной жидкости.
Также целью настоящего изобретения является создание описанного выше способа, в котором непротеиногенной аминокислотой является норлейцин и/или норвалин.
Детально настоящее изобретение будет описано ниже.
Наилучший способ осуществления изобретения.
1. Бактерия согласно настоящему изобретению.
Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент непротеиногенной аминокислоты, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что все AHASы в клетке инактивированы.
Термин "непротеиногенные аминокислоты" согласно настоящему изобретению означает аминокислоты, отличные от 20 основных протеиногенных аминокислот (L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспартат, L-цистеин, L-глутамат, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин). Такие непротеиногенные аминокислоты могут быть синтезированы из 2-кето-предшественника ферментами пути биосинтеза L-лейцина, кодируемого leuABCD опероном. Примером "непротеиногенной аминокислоты" согласно настоящему изобретению являются норвалин, синтезируемый из 2-кетовалериата, и норлейцин, синтезируемый из 2-кетовалериата через 2-кетокалроат. Другим примером непротеиногенной аминокислоты" согласно настоящему изобретению являются гомолейцин, синтезируемый из 2-кетоизокапроата и гомоизолейцин, синтезируемый из 2-кето-3-метилвалериата с помощью ферментов пути биосинтеза L-лейцина (смотри, например, Jakubowski, U. and Goldman, E., Microbiological reviews, v.56, No. 3, р.412-429 (1992)). Другие химические гомологи вышеупомянутых аминокислот также являются частью настоящего изобретения.
Согласно настоящему изобретению термин "бактерия-продуцент непротеиногенной аминокислоты" означает бактерию, обладающую способностью к продукции и накоплению непротеиногенной аминокислоты в питательной среде, в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции непротеиногенной аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия-продуцент непротеиногенной аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции полезного метаболита и накоплению метаболита в ферментационной среде в количествах больших, чем природный или родительский штамм E. coli, такой как штамм E. coli К-12, W3110 или MG1655. Предпочтительно, этот термин означает бактерию, которая способна к продукции и накоплению непротеиногенной аминокислоты в ферментационной среде в количествах не менее, чем 10 мг/л, более предпочтительно, не менее, чем 50 мг/л целевой аминокислоты.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Erwinia, Providencia и Serratia. Род Escherichia предпочтителен.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1) могут быть упомянуты.
Термин "AHAS инактивирована" означает, что ген, кодирующий AHAS, модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует мутантный белок со значительно сниженным уровнем активности, в частности с уровнем активности, не измеряемым традиционно используемыми для этого приборами, или такой ген кодирует полностью неактивный белок. Также возможно, что модифицированная область ДНК не способна к экспрессии гена естественным образом, из-за делеции части этого гена, сдвига рамки считывания этого гена, или модификации областей, прилегающих к оперону, включая последовательности, контролирующие экспрессию оперона, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы) и т.д.
AHASы согласно настоящему изобретению включают в себя AHAS I, II и III.
AHAS I (ацетогидроксибутаноатсинтаза I / ацетолактатсинтаза I), AHAS II (ацетогидроксибутаноатсинтаза II / ацетолактатсинтаза II) и AHAS III (ацетолактатсинтаза III / ацетогидроксибутаноатсинтаза III) катализируют две реакции, продуктом которых являются 2-ацето-2-гидроксибутират, образующийся из пирувата и 2-оксобутаноата, и ацетолактат, образующийся из пирувата.
AHAS I кодируется генами ilvBN (ilvBN оперон), AHAS II кодируется генами ilvGM (UvGM оперон) и AHAS III кодируется генами UvIH(ilvIH оперон).
Ген UvB (номера нуклеотидов с 3850411 по 3848723 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1) и ген HvN (номера нуклеотидов с 3848719 по 3848429 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1) расположены между генами uhpA и ivbL на хромосоме штамма E. coli К-12 и кодируют каталитическую и регуляторную субъединицы AHASbi I соответственно.
Ген ilvG (состоит из двух нуклеотидных последовательностей с 3948183 по 3949163 и с 3949162 по 3949827 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1) и ген ilvM (номера нуклеотидов с 3949824 по 3950087 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1) расположены между генами ilvL и ilvE на хромосоме штамма Е.coli К-12 и кодируют большую и малую субъединицы AHASы II соответственно.
Ген ilvl (номера нуклеотидов с 85630 по 87354 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарньм номером NC_000913.1) и ген ilvH (номера нуклеотидов с 87357 по 87848 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1) расположены между генами leuO и fruR на хромосоме штамма Е.coli К-12 и кодируют большую и малую субъединицы AHASы III соответственно.
Инактивация указанного гена может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации и/или инсерционно-делеционный мутагенез (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также известной как "Red-зависимая интеграция".
Мутантный белок, активность которого значительно снижена, или полностью неактивный белок также могут быть получены, например, с помощью сайт-специфичного мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотные остатки, расположенные в консервативных областях AHAS. Выравнивание аминокислотных последовательностей AHAS нескольких видов и данные о структурно-функциональной корреляции представлены в обзоре Duggleby, R.G. и Pang, S.S. (J.Biochem. Mol. Biol., 33, No. 1,1-36 (2000)). Установлено, например, что в AHAS из Е.coli глутамат в 47 позиции играет каталитическую роль. Таким образом, мутация в этой позиции может оказаться критической для ферментативной активности AHAS из Е.coli.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть в дальнейшем модифицирована таким образом, что экспрессия лейцинового оперона leuABCD усилена. Оперон leuABCD включает в себя гены leuA, leuB, leuC и leuD. В указанном опероне, ген leuA кодирует α-изопропилмалатсинтазу, ген leuB кодирует β-изопропилмалатдегидрогеназу, гены leuC и leuD кодируют изопропилмалатизомеразы.
Ген leuA (номера нуклеотидов с 83529 по 81958 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1), ген leuB (номера нуклеотидов с 81958 по 80867 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1), ген leuC (номера нуклеотидов с 80864 по 79464 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1) и ген leuD (номера нуклеотидов с 79453 по 78848 в базе данных GenBank, последовательность с инвентарным номером NC_000913.1) расположены между геном leuL и открытой рамкой считывания yabMOW на хромосоме штамма Е.coli К-12.
Примерами методик, используемых для усиления экспрессии генов, особенно методик, используемых для повышения количества белковых молекул в бактериальной клетке, являются методики изменения регуляторной последовательности ДНК, регулирующей экспрессию гена, кодирующего белок, и увеличения количества копий гена в клетке, но не ограничиваются ими.
Изменение регуляторной последовательности ДНК, регулирующей экспрессию гена, может быть достигнуто путем помещения ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, pr или pl промоторы фага лямбда.
Кроме того, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью повышения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт-кодоном, в значительной степени влияет на транслируемость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт кодону (Gold et al., Annu. Rev.Microbiol., 35,365-403,1981; Hui et al., EMBO J., 3,623-629, 1984).
Кроме того, для повышения уровня транскрипции целевого гена в хромосому может быть введен энхансер. Введение ДНК, содержащей либо ген, либо промотор в хромосомную ДНК, описано, например в выложенной патентной заявке Японии 1-215280 (1989).
С другой стороны, к методам увеличения числа копий гена относится клонирование целевого гена на многокопийном векторе с образованием рекомбинантной ДНК, с последующим введением полученной рекомбинантной ДНК в микроорганизм. Для этой цели предпочтительно использовать многокопийные векторы. Примеры многокопийных векторов включают в себя векторы pBR322, pUC19, pBluescript KS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMWl 19, pET22b и подобные им, но не ограничиваются ими. Используемый здесь термин «многокопийный вектор» используется для векторов, количество которых достигает 15-30 копий на клетку. В качестве метода трансформации может быть использован любой описанный к настоящему времени метод. Например, в настоящем изобретении может быть использован метод обработки клеток-реципиентов с помощью хлорида кальция для увеличения проницаемости ДНК через клеточную мембрану, описанный для Escherichia coli К-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Усиление экспрессии гена может быть также достигнуто путем введения множественного числа копий указанного гена в хромосомы бактерии, например, методом гомологичной рекомбинации, Ми интеграции и подобными им методами. Например, один раунд Ми интеграции позволяет встроить в бактериальную хромосому до трех копий интегрируемого гена.
Описанные выше методики, использующие сильный промотор или энхансер могут быть скомбинированы с методиками, основанными на увеличении количества копий или экспрессии целевого гена.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем усиления экспрессии оперона leuABCD бактерии, в которой уже инактивированы все АНАSы. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации всех AHAS в бактерии, уже наследственно обладающей усиленной экспрессией оперона leuABCD. В частности, любой известный штамм-продуцент L-лейцина может быть использован в качестве родительского для придания ему способности к продукции непротеиногенных аминокислот, таких как норлейцин и норвалин.
Примерами бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и способных к продукции L-лейцина, являются штаммы Е.coli, такие как Н-9068 (АТСС 21530), Н-9070 (FERM ВР-4704) и Н-9072 (FERM ВР-4706), устойчивые к 4-азалейцину или 5,5,5-трифлуоролейцину (патент США 5744331), штаммы Е.coli, в которых отсутствует ингибирование изопропилмалатсинтазы L-лейцином по типу обратной связи (Европейский патент ЕР 1067191), штамм Е.coli АЛ 1478, устойчивый к α-2-тиенилаланину и β-гидроксилейцину (патент США 5763231), штамм Е.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121) и подобные им.
Методы получения плазмидных ДНК, расщепления и дотирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им являются традиционными методами, хорошо известными специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
2. Способ согласно настоящему изобретению.
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения непротеиногенных аминокислот, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, не содержащей L-лейцина, но содержащей L-валин в концентрации, лимитирующей рост бактерии, с целью продукции и накопления аминокислоты в питательной среде и выделения аминокислоты из культуральной жидкости. Более конкретно, способом согласно настоящему изобретению является способ получения норлейцина и/или норвалина, включающий этапы выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, не содержащей L-лейцина, но содержащей L-валин в концентрации, лимитирующей рост бактерии, с целью продукции и накопления норлейцина и/или норвалина в питательной среде, и выделения норлейцина и/или норвалина из культуральной жидкости.
Штаммы, дефицитные по AHASам, не способны расти в отсутствие валина и изолейцина в ферментационной среде (ауксотрофность по валину и изолейцину). Ферментационная среда не должна содержать L-лейцин, чтобы избежать репрессии лейцинового оперона (leuABCD оперон). Недостаток L-лейцина, необходимый для роста клеток, компенсируется присутствием L-валина, который частично деаминируется в 2-кетоизовалериат - предшественник L-лейцина. С другой стороны, для комплементации ауксотрофности по L-изолейцину, в ферментационную среду необходимо добавить значительное количество L-изолейцина.
Термин "валин в концентрации, лимитирующей рост бактерии" означает, что концентрации валина, добавленного в ферментационную среду, недостаточно для полного покрытия потребности в валине у растущей биомассы в отсутствие биосинтеза валина. Таким образом, рост данного штамма будет ограничен доступностью валина.
Согласно настоящему изобретению, этапы выращивания, выделения и очистки непротеиногенной аминокислоты из среды и подобные им могут быть произведены в соответствии с традиционными способами ферментации, в которых аминокислоту получают с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислоты могут быть выделены и очищены методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.
Наилучший способ осуществления изобретения.
Более детально настоящее изобретение будет описано ниже со ссылками на Примеры.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированными генами всех апетолактатсинтетаз.
В отличие от других природных штаммов Е.coli, штамм Е.coli К-12 содержит мутацию с полярным эффектом - сдвиг рамки считывания в гене ilvG (Lawther, R. P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:922-925,1981), Таким образом, для получения штамма, в котором все AHASы инактивированы, на основе штамма Е.coli К-12 необходимо инактивировать только два оперона, ilvBN и ilvIH.
1. Деления оперона ilvBN.
Делеция оперона ilvBN была осуществлена с применением методики, впервые разработанной Datsenko и Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), так называемой "Red-зависимой интеграцией". В соответствии с указанной методикой, были синтезированы ПЦР праймеры ilvBNl (SEQ ID NO: 1) и ilvBN2 (SEQ ID NO: 2), гомологичные как областям хромосомы, примыкающим к оперону ilvBN, так и гену, сообщающему устойчивость к хлорамфениколу на плазмиде, используемой в качестве матрицы. Плазмида pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., Великобритания) (GenBank/EMBL инвентарный номер Х06403) использовалась в качестве матрицы для ПЦР. Использовались следующие условия для ПЦР: денатурация в течение 3 мин при 95°С; температурный профиль для начальных двух циклов: 1 мин при 95°С, 30 сек при 34°С, 40 сек при 72°С; температурный профиль для последующих 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.
Полученный ПЦР продукт длиной в 935 п.о. (SEQ ID NO: 3) был очищен в агарозном геле и использовался для электропорации штамма Е.coli - Е.coli К 12 (ВКПМ В-7), содержащего плазмиду pKD46 с температурочувствительной репликацией. Плазмида pKD46 (Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97:12:6640-45) содержит 2,154 п.о. (31088-33241) фрагмент ДНК фага Х (GenBank инвентарный номер J02459), и содержит гены λ Red системы гомологичной рекомбинации (гены λ, β, ехо) под контролем индуцируемого арабинозой промотора РaraB. Плазмида pKD46 необходима для интеграции ПЦР продукта в хромосому штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7).
Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночная культура Е.coli K12 (ВКПМ В-7), выращенная при 30°С в LB среде с добавками ампициллина (100 мг/л), была разведена в 100 раз в 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) с ампициллином и L-арабинозой (1 мМ). Полученную культуру выращивали с аэрацией при 30°С до OD600≈0.6, после чего получали электрокомпетентные клетки путем 100-кратной концентрации и трехкратной отмывки ледяной деионизированной Н2О. Электропорацию осуществляли с использованием 70 мкл клеток и примерно «100 нг ПЦР продукта. После электропорации клетки инкубировались в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевались на чашки с L-агаром и выращивались при 37°С для отбора CmR рекомбинантов. Далее, для удаления плазмиды pKD46, производили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии тестировались на чувствительность к ампициллину.
2. Подтверждение делений оперона ilvBNc помощью ПЦР.
Мутанты, содержащие делецию оперона ilvBN, маркированного геном устойчивости к Cm, проверяли с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры ilvBNC3 (SEQ ID NO: 4) и ilvBNC4 (SEQ ID NO: 5) использовались для проверочного ПЦР. Для ПЦР проверки использовались следующие условия: денатурация в течение 3 мин при 94 °С; температурный профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 53°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Длина ПЦР продукта, полученного в данной реакции с использованием хромосомной ДНК родительского штамма ilvBN+В-7 в качестве матрицы, составляла 2137 п.о. (Фиг. 4). Длина ПЦР продукта, полученного в данной реакции с использованием хромосомной ДНК мутантного штамма В-7 ΔilvBN::cat, составляла 1080 п.о. (Фиг.4, SEQ ID NO: 6).
3. Деления оперона ilvIH.
Делеция оперона ilvIH производилась таким же образом, как и делеция оперона ilvBN, описанная в Части 1 данного Примера. В соответствии с методикой, были синтезированы ПЦР праймеры ilvIHI1 (SEQ ID NO: 7) и ilvIHI2 (SEQ ID NO: 8), гомологичные как фрагментам хромосомы, прилегающим к оперону UvIH, так и гену, сообщающему устойчивость к канамицину из плазмиды-матрицы. Плазмида pACYC 177 (NBL Gene Sciences Ltd., Великобритания) (GenBank/EMBL инвентарный номер Х06402) использовали в качестве матрицы для ПЦР. Использовались следующие условия для ПЦР: денатурация в течение 3 мин при 95°С; температурный профиль для начальных двух циклов: 1 мин при 95°С, 30 сек при 34°С, 40 сек при 72°С; температурный профиль для последующих 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.
Полученный ПЦР продукт, длиной 1370 п.о. (SEQ ID NO: 9) был очищен в агарозном геле и использован для электропорации штамма Е.coli B-7ΔilvBN::cat, содержащего температурочувствительную плазмиду pKD46, содержащую гены λ Red системы гомологичной рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем индуцируемого арабинозой промотора РaraB. Рекомбинанты, устойчивые к канамицину были отобраны после электропорации и проверены с помощью ПЦР с использованием локус-специфичных праймеров ilvIHC3 (SEQ ID NO: 10) и ilvIHC4 (SEQ ID NO: 11). Для ПЦР проверки использовались следующие условия: денатурация в течение 3 мин при 94°С; температурный профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 53°С, 1 мин 20 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Длина ПЦР продукта, полученного в данной реакции с использованием хромосомной ДНК родительского штамма ilvBN+ B-7ΔilvBN::cat в качестве матрицы, составляла 2486 п.о. Длина ПЦР продукта, полученного в данной реакции с использованием хромосомной ДНК мутантного штамма В-7 ΔilvBN::cat ΔilvIH::KmR, составляла 1475 п.о. (SEQ ID NO:12). В результате был получен штамм В-7ΔilvBN::cat ΔilvIH::KmR, названный NS1118. Штамм NS1118 является ауксотрофом по изолейцину и валину.
Пример 2. Продукция и экскреция норлейцина и норвалина у штамма Е.coli NS1118.
Штаммы Е.coli К-12 (ВКПМ В-7) и NS118 выращивали в течение 18 часов при 37°С на чашках с L-агаром. Затем клетки, собранные примерно с 0.5 см2 поверхности чашки, переносили в ферментационную среду (2 мл) и выращивались в течение 72 часов при 32°С. Накопленные в среде количества норвалина и норлейцина измерялись с помощью ВЖКХ. Для подробного описания процесса измерений смотри Пример 6. Полученные результаты представлены в Таблице 1.
Состав ферментационной среды (г/л):
| Глюкоза | 60.0 |
| (NH4)2SO4 | 18.0 |
| КН2PO4 | 2.0 |
| MgSO4×7H2O | 1.0 |
| СаСО3 | 25.0 |
| Тиамин | 0.02 |
| Таблица 1. | |||
| Штамм | Добавки* | Норвалин, г/л | Норлейцин, г/л |
| В7 | - | <0.1 | <0.1 |
| NS1118 | Ile, Val | 0.9 | 1.9 |
| NS1118 | Ile, Val, Leu | <0.1 | <0.1 |
| NS1118 | Ile, Val** | <0.1 | <0.1 |
| * Ile - 100 мкг/мл, Val - 100 мкг/мл, Leu - 100 мкг/мл, ** Val - 500 мкг/мл | |||
Как видно из Таблицы 1, штамм Е.coli NS 1118, в котором все AHASы инактивированы, в отличие от природного родительского штамма В-7, продуцирует и выделяет в ферментационную среду норвалин и норлейцин. Добавление лейцина прекращает продукцию и выделение непротеиногенных аминокислот, преимущественно из-за ингибирования изопропилмалатсинтазы.
Добавление валина в лимитирующих рост концентрациях необходимо для продукции непротеиногенных аминокислот. В данном случае, отсутствие ацетолактата приводит к увеличению пула 2-кетобутирата. Лимит по валину выражается в отсутствии 2-кетоизовалериата, что, в свою очередь, провоцирует ослабление синтеза лейцина. Лимит по лейцину дерепрессирует лейциновый оперон. 2-кетобутират используется изопропилмалатсинтазой как альтернативный субстрат (вместо 2-кетоизоалериата) и в дальнейшем используеся для синтеза норвалина и норлейцина с помощью других ферментов, кодируемых лейциновым опероном (Фиг.1). Повышение концентрации валина в исходной ферментационной среде также прекращает синтез норлейцина и норвалина за счет увеличения соотношения кетоизовалериат/2-кетобутират.
Таким образом, для синтеза таких непротеиногенных аминокислот необходимы специфичные условия роста: отсутствие лейцина и присутствие валина в ферментационной среде. Также валин должен присутствовать в концентрациях, лимитирующих рост бактерии.
Пример 3. Клонирование AHASIII.
Оперон ilvIH клонировали в вектор pMW118 в виде ПЦР фрагмента длиной 2764 п.о. Хромосома штамма MG1655 использовалась как матрица для ПЦР. В качестве праймеров использовались синтетические олигонуклеотиды ilvIHL58 (SEQ ID NO: 13) и ilvIHR60 (SEQ ID NO: 14). Праймер ilvIHL58 содержит введенный в 5'-конец сайт рестрикции Sad, и праймер ilvIHR60 содержит введенный в 5'-конец сайт рестрикции Xbal. Использовались следующие условия для ПЦР: денатурация в течение 3 мин при 94°С; температурный профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 57°С, 2 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Полученный ПЦР продукт длиной в 2778 п.о. был очищен в агарозном геле, обработан рестриктазами SacI и Xbal и клонирован в вектор pMW118, предварительно обработанный теми же рестриктазами. В качестве реципиента для клонирования использовался штамм NS1118. Полученная плазмида pMWl 18-ilvIH (Фиг.5) комплементирует фенотип AHAS" штамма NS 1118.
Пример 4. Клонирование лейцинового оперона.
Оперон leuABCD был клонирован в вектор pBR322 методом «shotgun». Для этой цели хромосома штамма MG1655 был обработана рестриктазой MfeI, затуплена фрагментом Кленова и лигирована с плазмидой pBR322, предварительно обработанной EcoRV. Штамм Е.coli leu::Тn10 (ВКПМ В-6038) был использован в качестве реципиента для клонирования. В результате была получена плазмида pBR-leuABCD, содержащая фрагмент хромосомы в 6.9 т.п.о. с опероном leuABCD (Фиг.6).
Пример 5. Продукция и экскреция норлейцина и норвалина у производных штамма NS1118.
Штамм Е.coli NS1118 и его производные выращивались в течение 18 часов при 37°С на чашках с L-агаром, в случае плазмидных штаммов, содержащих ампициллин (100 мкг/мл). Затем клетки, собранные примерно с 0.5 см2 поверхности чашки, переносили в ферментационную среду (2 мл. Пример 2) и выращивались в течение 72 часов при 32°С. Накопленные в среде количества норвалина и норлейцина измерялись с помощью ВЖКХ. Для подробного описания процесса измерений смотри Пример 6. Полученные результаты представлены в Таблице 2.
| Таблица 2 | |||
| Штамм | Добавки* | Норвалин, г/л | Норлейцин, г/л |
| NS118 | lle, Val | 0.9 | 1.9 |
| NS118/pMW118-ilvIH | - | 0.01 | <0.01 |
| NS118/pBR-leuABCD | lle, Val | 0.78 | 3.9 |
| *Ile - 100 мкг/мл, Val - 100 мкг/мл | |||
Как видно из Таблицы 2, восстановление активности AHAS путем введения плазмиды pMW118-ilvIH, содержащей гены UvIH (кодирующие AHAS III), блокирует продукцию и выделение норвалина и норлейцина штаммом NS1118, дефицитным по AHAS-активности. Амплификация природного лейцинового оперона, входящего в состав плазмиды pBR-leuABCD, повышает уровень накопления норлейцина в ферментационной среде.
Пример 6. Условия хроматографического анализа норвалина и норлейцина в культуральной жидкости по окончанию ферментации.
Для анализа использовался метод Waters AccQ-Tag®. Метод AccQ-Tag заключается в предколоночной модификации аминокислот для последующего их определения. Использовалась градиентная система ВЖКХ Alliance 2690 gradient system (Waters Corp.), оснащенная флуоресцентным детектором 1100 серии (Agilent Technologies) и соединенная с ПК, на котором установлено программное обеспечение для обработки хроматограмм "ChemStation A.08.04" (Agilent Technologies). Использовались следующие установки детектора: длина волны возбуждения атомов - 250 нм, длина волны излучения - 395нм. Для всех измерений использовалась петля инжектора объемом 5 мкл. Колонка для анализа аминокислот Waters AccQ-Tag Amino Acid Analysis Column оснащена предколонкой, разделяющей производные аминокислот, полученные в результате реакции дериватизации этих аминокислот с Accq-fluor. Колонку термостатировали в колоночной печи при 37°С. Скорость подвижной фазы составляла 1 мл/мин. Использовался следующий состав подвижной фазы: (В) водный буфер "Waters AccQ-Tag Eluent А", (С) ацетонитрил HPLC-очистки и (D) вода Mili-Q.
Градиентная программа для хроматографического анализа аминокислот приведена в Таблице 3. Профили хроматографического анализа аминокислот представлены на Фиг.7.
| Таблица 3 | |||||
| Шаг | Время, мин | Элюент В, % | Элюент С, % | Элюент D, % | Профиль градиента |
| 1 | 0 | 100,0 | 0,0 | 0 | 0 |
| 2 | 0,50 | 99,0 | 1,0 | 0 | 11 |
| 3 | 18,00 | 95,0 | 5,0 | 0 | 6 |
| 4 | 19,00 | 91,0 | 9,0 | 0 | 6 |
| 5 | 29,50 | 83,0 | 17,0 | 0 | 6 |
| 6 | 33,00 | 73,0 | 22,0 | 5 | 11 |
| 7 | 36,00 | 0,0 | 60,0 | 40 | 11 |
| 8 | 39,00 | 100,0 | 0,0 | 0 | 11 |
| 9 | 48,00 | 100,0 | 0,0 | 0 | 11 |
| Кривая 6 - линейная функция; кривая 11 - ступенчатая функция. | |||||
Claims (4)
1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент норлейцина и норвалина, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что все синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) инактивированы.
2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что синтазы ацетогидроксикислот выбраны из группы, состоящей из AHAS I, кодируемой генами ilvBN, AHAS II, кодируемой генами ilvGM, и AHAS III, кодируемой генами ilvIH.
3. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что экспрессия оперона leuABCD в указанной бактерии усилена.
4. Способ получения норлейцина и норвалина, включающий стадии выращивания бактерии по любому из пп.1-3 в среде, которая не содержит L-лейцин, но содержит L-валин в концентрации, лимитирующей рост бактерии, и выделения полученной непротеиногенной аминокислоты из культуральной жидкости.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004127011/13A RU2315807C2 (ru) | 2004-09-10 | 2004-09-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОРЛЕЙЦИНА И НОРВАЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ВСЕ СИНТАЗЫ АЦЕТОГИДРОКСИКИСЛОТ ИНАКТИВИРОВАНЫ |
| US11/218,787 US20060057685A1 (en) | 2004-09-10 | 2005-09-06 | Method for producing abnormal amino acids using a bacterium of the Enterobacteriaceae family having all acetohydroxy acid synthases inactivated |
| JP2005260878A JP2006075166A (ja) | 2004-09-10 | 2005-09-08 | 全てのアセトヒドロキシ酸合成酵素が不活化された腸内細菌科細菌を用いて異常アミノ酸を生産する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004127011/13A RU2315807C2 (ru) | 2004-09-10 | 2004-09-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОРЛЕЙЦИНА И НОРВАЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ВСЕ СИНТАЗЫ АЦЕТОГИДРОКСИКИСЛОТ ИНАКТИВИРОВАНЫ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004127011A RU2004127011A (ru) | 2006-02-20 |
| RU2315807C2 true RU2315807C2 (ru) | 2008-01-27 |
Family
ID=36034525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004127011/13A RU2315807C2 (ru) | 2004-09-10 | 2004-09-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОРЛЕЙЦИНА И НОРВАЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ВСЕ СИНТАЗЫ АЦЕТОГИДРОКСИКИСЛОТ ИНАКТИВИРОВАНЫ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060057685A1 (ru) |
| JP (1) | JP2006075166A (ru) |
| RU (1) | RU2315807C2 (ru) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0509056A (pt) * | 2004-03-31 | 2007-08-21 | Ajinomoto Kk | bactéria pertencendo ao gênero bacillus ou ao gênero escherichia, e, métodos para produzir um nucleosìdeo de purina, para produzir um nucleotìdeo de purina e para produzir ácido 5'-guanìlico |
| RU2355763C2 (ru) | 2006-09-13 | 2009-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот |
| KR101233666B1 (ko) | 2010-09-30 | 2013-02-15 | 대상 주식회사 | 박테리아 변이 균주를 이용한 이소루신 생산 |
| EP4296368A1 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-27 | Arkeon GmbH | Method for producing amino acids with methanogenic microorganisms in a bioreactor |
| EP4296367A1 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-27 | Arkeon GmbH | Method for fermentatively producing norvaline |
| EP4296369A1 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-27 | Arkeon GmbH | Method for producing amino acids in a bioreactor |
| EP4296354A1 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-27 | Arkeon GmbH | Method for producing amino acids in a bioreactor with methanogenic microorganisms |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0737752A3 (en) * | 1988-02-17 | 1996-10-23 | The Upjohn Company | Fermentation media and methods for controlling norleucine content in polypeptides |
| US5698418A (en) * | 1988-02-17 | 1997-12-16 | Pharmacia & Upjohn Company | Fermentation media and methods for controlling norleucine in polypeptides |
| RU2209246C2 (ru) * | 2000-01-26 | 2003-07-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Малая субъединица изозима iii и изозим iii синтетазы ацетогидроксикислот из escherichia coli, фрагмент днк (варианты), штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-валина (варианты) и способ получения l-валина |
| RU2245919C2 (ru) * | 2002-09-06 | 2005-02-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислоты, штамм escherichia coli tdh7δ mlc::cat/pprt614-продуцент l-треонина |
| RU2273666C2 (ru) * | 2003-02-26 | 2006-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот методом ферментации смеси глюкозы и пентоз |
-
2004
- 2004-09-10 RU RU2004127011/13A patent/RU2315807C2/ru active
-
2005
- 2005-09-06 US US11/218,787 patent/US20060057685A1/en not_active Abandoned
- 2005-09-08 JP JP2005260878A patent/JP2006075166A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006075166A (ja) | 2006-03-23 |
| US20060057685A1 (en) | 2006-03-16 |
| RU2004127011A (ru) | 2006-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7476531B2 (en) | Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia | |
| EP2186881B1 (en) | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA | |
| EP1217076B1 (en) | Method of producing a target substance by fermentation | |
| EP0877090A1 (en) | Process for producing l-amino acids | |
| RU2245919C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты, штамм escherichia coli tdh7δ mlc::cat/pprt614-продуцент l-треонина | |
| EP1856269B1 (en) | A METHOD FOR PRODUCING A NON-AROMATIC L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING EXPRESSION OF THE csrA GENE ATTENUATED | |
| EP1740694B1 (en) | L-tryptophan-producing bacterium and a method for producing l-tryptophan | |
| CN101402935B (zh) | 使用肠杆菌科的细菌产生氨基酸的方法 | |
| EP1838850B1 (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family having a pathway of glycogen biosynthesis disrupted | |
| EP1649032A1 (en) | Process for the preparation of l-threonine | |
| RU2315807C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОРЛЕЙЦИНА И НОРВАЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ВСЕ СИНТАЗЫ АЦЕТОГИДРОКСИКИСЛОТ ИНАКТИВИРОВАНЫ | |
| RU2395580C2 (ru) | Способ конструирования бактерии-продуцента (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина, бактерия-продуцент (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина и способ продукции (2s,3r,4s)-гидрокси-l-изолейцина или его соли | |
| RU2276686C2 (ru) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-аргинина и способ получения l-аргинина | |
| CN1293184C (zh) | 生产l－亮氨酸的方法 | |
| EP1806409A1 (en) | Method for producing aromatic L-Amino acid using bacterium belonging to the Genus Methylophilus | |
| RU2215784C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) | |
| RU2264457C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ ESCHERICHIA, СОДЕРЖАЩЕЙ НЕАКТИВНЫЙ ГЕН gadB | |
| RU2304166C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ltaE | |
| JP4019706B2 (ja) | 発酵法による目的物質の製造法 | |
| CN1997747A (zh) | 使用属于埃希氏菌属的细菌产生l－苏氨酸的方法 | |
| US20060252133A1 (en) | Process for the preparation of l-threonine |