RU2301677C1 - Biotransplant for treatment of degenerative and traumatic disease of cartilage tissue and method for its preparing - Google Patents
Biotransplant for treatment of degenerative and traumatic disease of cartilage tissue and method for its preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2301677C1 RU2301677C1 RU2005138223/15A RU2005138223A RU2301677C1 RU 2301677 C1 RU2301677 C1 RU 2301677C1 RU 2005138223/15 A RU2005138223/15 A RU 2005138223/15A RU 2005138223 A RU2005138223 A RU 2005138223A RU 2301677 C1 RU2301677 C1 RU 2301677C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- carrier
- biograft
- tissue
- cartilage
- cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Изобретение касается получения биотрансплантата на основе комбинации стволовых и/или прогениторных клеток человека и матрицы-носителя, состоящей из синтетических и/или биологических веществ, для повышения регенераторных и репаративных свойств хрящевой и соединительной ткани при травматических и дегенеративных заболеваниях суставного хряща.The invention relates to the production of a biograft based on a combination of human stem and / or progenitor cells and a carrier matrix consisting of synthetic and / or biological substances, to increase the regenerative and reparative properties of cartilage and connective tissue in case of traumatic and degenerative diseases of articular cartilage.
Заболевания, сопровождающиеся травматическими и дегенеративными изменениями в хрящевой ткани, являются не до конца решенной проблемы современной медицины [1, 3-8, 16, 17]. Основной проблемой лечения данных патологий служит отсутствие или недостаточный регенеративный потенциал хрящевой ткани, прогрессивно снижающийся с возрастом. В настоящее время в широкой клинической практике отсутствуют технологии, позволяющие восполнить недостаток утраченной в результате патологического процесса хрящевой ткани [2, 9-11].Diseases accompanied by traumatic and degenerative changes in the cartilage tissue are not a fully resolved problem of modern medicine [1, 3-8, 16, 17]. The main problem in the treatment of these pathologies is the absence or insufficient regenerative potential of cartilage, which progressively decreases with age. Currently, in wide clinical practice there are no technologies that make up for the lack of cartilage tissue lost as a result of the pathological process [2, 9-11].
В последнее десятилетие крупнейшими мировыми научно-исследовательскими центрами созданы фармакологические препараты для восстановления хрящевой ткани в клинической практике для лечения дегенеративных и травматологических заболеваний хрящевой ткани суставов [12]. Этому обстоятельству предшествовали изучение in vitro культуры ходробластов, которые показали, что при культивировании не изменяется фенотип (отсутствие дедифференцировки в более ранние формы), не происходит трансформация генома, в том числе и экспрессия онкогенов [7]. При культивировании культуры ходробластов на биосовместимых материалах происходит их дифференцировка в хондроциты с формированием нормального по структуре внеклеточного матрикса, идентичного естественному [13, 5]. Эксперименты на лабораторных животных показали, что тканеинженерные конструкции, полученные из ходробластов и биоматериалов, восстанавливают нормальную структуру поврежденного хряща, без какой либо тенденции к неоплазии (формирования злокачественных и доброкачественных опухолей из хрящевой ткани) [13, 14, 5]. Более чем 5-летние клинические исследования 1-го и 2-го уровня показали клиническую эффективность тканеинженерных конструкций, содержащие аллогенные или аутогенные ходробласты.In the last decade, the world's largest research centers have created pharmacological preparations for the restoration of cartilage in clinical practice for the treatment of degenerative and traumatological diseases of the cartilage tissue of the joints [12]. This circumstance was preceded by an in vitro study of the culture of hodroblasts, which showed that during cultivation the phenotype does not change (lack of dedifferentiation to earlier forms), genome transformation does not occur, including oncogen expression [7]. When cultivating a culture of hodroblasts on biocompatible materials, they are differentiated into chondrocytes with the formation of an extracellular matrix normal in structure, identical to the natural one [13, 5]. Experiments in laboratory animals have shown that tissue-engineering structures obtained from hodroblasts and biomaterials restore the normal structure of damaged cartilage, without any tendency to neoplasia (the formation of malignant and benign tumors from cartilaginous tissue) [13, 14, 5]. More than 5-year clinical trials of the 1st and 2nd levels have shown the clinical effectiveness of tissue-engineering constructs containing allogeneic or autologous hodroblasts.
Биотрансплантат, состоящий из малодифференцированных клеток и матрицы носителя (тканеинженерная конструкция), трансплантируемый в зону патологического очага, позволит добиться восстановления утраченной ткани в результате включения трансплантируемых клеток в репаративные процессы наряду с имеющимися в месте пересадки малодифференцированными клетками реципиента, оказывая индуктивные и стимулирующие влияния на них, а также за счет их собственной активной деятельности (пролиферация, дифференцировка, синтез внеклеточного матрикса, что приведет к уменьшению или исчезновению клинических симптомов и выздоровлению.A biotransplant consisting of poorly differentiated cells and a carrier matrix (tissue engineering construct) transplanted into the area of the pathological focus will allow restoration of lost tissue as a result of inclusion of the transplanted cells in the reparative processes along with the poorly differentiated cells of the recipient at the transplant site, having inductive and stimulating effects on them , as well as due to their own vigorous activity (proliferation, differentiation, synthesis of extracellular matrix, Th o will lead to a decrease or disappearance of clinical symptoms and recovery.
Разработка и внедрение предлагаемых биотрансплантатов - тканеинженерных конструкций, содержащих человеческие аллогенные или аутогенные ходробласты, позволит повысить эффективность лечения дегенеративных заболеваний и травматических повреждений различных типов хрящевой ткани, например суставного хряща, трахеи или межпозвонковых дисков, в том числе при неэффективности стандартного лечения, что также явится важным вкладом в лечение данной патологии. Практическое применение указанных тканеинженерных конструкций обусловит снижение экономических затрат на лечение, потерь, связанных с нарушениями трудо- и работоспособности, сокращение сроков госпитализации и обращаемости за медицинской помощью.The development and implementation of the proposed biografts - tissue-engineering structures containing human allogeneic or autologous hodroblasts, will increase the effectiveness of the treatment of degenerative diseases and traumatic injuries of various types of cartilage, such as articular cartilage, trachea or intervertebral discs, including the failure of standard treatment, which will also be an important contribution to the treatment of this pathology. The practical application of these tissue-engineering designs will result in a reduction in the economic costs of treatment, losses associated with impaired work and working capacity, and a reduction in the time required for hospitalization and medical treatment.
Задачей изобретения является создание тканеинженерной конструкции, пригодной для органотипической регенерации и репарации хрящевой ткани, что способствует созданию унифицированного способа восстановления трехмерных дефектов хрящевой тканей и повышению эффективности лечения больных с различными заболеваниями и травмами опорно-двигательного аппарата.The objective of the invention is to provide a tissue-engineering structure suitable for organotypic regeneration and repair of cartilage, which helps to create a unified method for the restoration of three-dimensional defects of cartilage and increase the effectiveness of treatment of patients with various diseases and injuries of the musculoskeletal system.
Данный биотрансплантат можно производить серийно в промышленном производстве.This biograft can be mass-produced in industrial production.
Для решения данной задачи разработан биотрансплантат на основе макромолекулярной объемной, трехмерной матрицы, включающий, по меньшей мере, один компонент структуры, по меньшей мере, один компонент активации.To solve this problem, a biograft based on a macromolecular volumetric three-dimensional matrix has been developed, comprising at least one structure component, at least one activation component.
Макромолекулярная объемная, трехмерная структура - матрица-носитель - может быть выполнена из хитозана, коллагенов различных типов и происхождения, альгината и им подобных веществ с добавлением таких компонентов, как гиалуроновая кислота, хондроэтин сульфат. Матрица носитель может быть выполнена в различных формах, например в виде геля, губок, пленок или иных трехмерных моделей. Вещества, входящие в матрицу-носитель служат для поддержания компонентов активации в трехмерном пространстве, фиксируя их на себе и удерживая их от рассеивания. Матрица-носитель может дополнительно содержать белки внеклеточного матрикса, например коллагены различных типов (I-XIX), энтегрин, фибронектин и ламинин и др. Указанные белки внеклеточного матрикса способствуют процессам миграции, дифференцировки, пролиферации и активизации основных функций компонента активации, что, в свою очередь, позволяет добиваться ускорения процессов регенерации хрящевой ткани.The macromolecular volumetric, three-dimensional structure — the carrier matrix — can be made of chitosan, collagens of various types and origin, alginate and the like with the addition of components such as hyaluronic acid, chondroetin sulfate. The carrier matrix can be made in various forms, for example, in the form of a gel, sponges, films or other three-dimensional models. The substances included in the carrier matrix serve to maintain the activation components in three-dimensional space, fixing them on themselves and keeping them from scattering. The carrier matrix may additionally contain extracellular matrix proteins, for example, various types of collagens (I-XIX), integrin, fibronectin and laminin, etc. These extracellular matrix proteins contribute to the processes of migration, differentiation, proliferation and activation of the main functions of the activation component, which, in its In turn, it allows accelerating the processes of cartilage tissue regeneration.
В состав носителя также дополнительно могут быть введены антисептики, такие как ионы серебра, меди или золота и других микро- и макроэлементов, и антибиотики широкого спектра действия, в концентрациях не токсичных для клеток, что позволяет значительно уменьшить вероятность возникновения воспалительного процесса в пораженной ткани.Antiseptics, such as silver, copper or gold ions and other micro and macro elements, and broad-spectrum antibiotics in concentrations not toxic to cells can also be added to the carrier composition, which can significantly reduce the likelihood of an inflammatory process in the affected tissue.
Матрица-носитель представляет собой композит, получаемый путем объединения необходимых для конкретной ситуации компонентов. Например, в следующих пропорциях: базовое вещество (гель хитозана, альгината, коллагена или их производных, содержащий от 0,5% до 20% сухого вещества в зависимости от клинической или экспериментальной задачи) может быть в виде самостоятельного компонента или в различных сочетаниях, например: 3% гель хитозана - 70% объема базового вещества / 15% гель альгината - 30% объема; 2% гель коллагена - 80% объема / 15% гель хитозана - 20% объема; 5% гель хитозана - 50% объема / 1% гель коллагена - 50% объема; концентрации базового вещества и процентное содержание компонентов зависит от клинической или экспериментальной задачи. Композитные добавки (гиалуроновая кислота, хондроэтин сульфаты) вносятся в базовое вещество путем обычного смешивания в различных пропорциях: базовое вещество от 90% до 99% объема, композитные добавки от 1% до 10%, в зависимости от клинической или экспериментальной задачи. Благодаря различным формам, придаваемым матрице-носителю, ее структуре, наличию армирующих небиодеградирующих компонентов, возникает возможность доставлять и переносить живые клетки в область дефекта хрящевой ткани любой конфигурации, глубины и размера.The carrier matrix is a composite obtained by combining the components necessary for a particular situation. For example, in the following proportions: the base substance (gel of chitosan, alginate, collagen or their derivatives containing from 0.5% to 20% dry matter depending on the clinical or experimental task) can be in the form of an independent component or in various combinations, for example : 3% gel of chitosan - 70% of the volume of the base substance / 15% gel of alginate - 30% of the volume; 2% collagen gel - 80% of the volume / 15% chitosan gel - 20% of the volume; 5% chitosan gel - 50% of the volume / 1% collagen gel - 50% of the volume; the concentration of the base substance and the percentage of components depends on the clinical or experimental task. Composite additives (hyaluronic acid, chondroetin sulfates) are introduced into the base substance by conventional mixing in various proportions: base substance from 90% to 99% of the volume, composite additives from 1% to 10%, depending on the clinical or experimental task. Due to the various forms attached to the carrier matrix, its structure, the presence of reinforcing non-biodegradable components, it becomes possible to deliver and transfer living cells to the area of the cartilage tissue defect of any configuration, depth and size.
Биодеградируемая часть матрицы-носителя может быть получена простым смешиванием всех его компонентов, необходимых для каждого конкретного случая, регламентируемого клинической или экспериментальной задачей. При необходимости к основным компонентам носителя вносят матриксные белки, факторы роста, антибиотики и/или антисептики, причем количество добавок может варьироваться в зависимости от клинической или экспериментальной задачи и объема выходящего продукта, например в качестве матриксных белков могут быть использованы фибронектин, и/или ламинин, и/или иные белки внеклеточного матрикса в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, а предпочтительно от 1 до 5 мкг/мл, в качестве биологически активных веществ факторы роста фибробластов и/или трансформирующий фактор роста α и β и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами и/или фактор роста гепатоцитов в концентрациях от 1-300 нг/мл, а предпочтительно от 1 до 100 нг/мл или иные; в качестве асептических средств может быть использован гентамицин в концентрации от 0,08 до 0,4 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,1 до 0,2 мг/мл и/или пенициллин (или его производные), стрептомицин (или его производные) любые другие антибиотики широкого спектра действия. По завершении процесса изготовления носителя, в него вносят компонент активации.The biodegradable part of the carrier matrix can be obtained by simply mixing all of its components necessary for each specific case, regulated by a clinical or experimental task. If necessary, matrix proteins, growth factors, antibiotics and / or antiseptics are added to the main components of the carrier, and the amount of additives may vary depending on the clinical or experimental task and the volume of the output product, for example, fibronectin and / or laminin can be used as matrix proteins , and / or other extracellular matrix proteins in a concentration of from 0.1 to 100 μg / ml, and preferably from 1 to 5 μg / ml, as biologically active substances, fibroblast growth factors and / or transform s growth factor α and β and / or growth factors secreted by platelets and / or hepatocyte growth factor at concentrations ranging from 1-300 ng / ml, and preferably from 1 to 100 ng / ml or different; gentamicin in a concentration of from 0.08 to 0.4 mg / ml gel, and preferably from 0.1 to 0.2 mg / ml and / or penicillin (or its derivatives), streptomycin (or its derivatives) any other broad-spectrum antibiotics. Upon completion of the manufacturing process of the medium, an activation component is introduced into it.
Компонентом активации процесса органотипической регенерации и/или репарации хрящевой ткани в тканеинженерной конструкции (биотрансплантате) могут служить аутогенные или аллогенные клетки мезенхимального происхождения, которые являются камбиальными малодифференцированными клетками соединительной ткани (поперечно-полосатая и гладкая мускулатура, жировая ткань, кость, хрящевая ткань т.п.). Клетки, используемые для создания тканеинженерной конструкции, представляют собой мезенхимальные стромальные клетки, находящиеся на различных стадиях дифференцировки (мультипотентные, стволовые клетки), на которых, в свою очередь, они еще могут быть дифференцированы в хондробластическом направлении. Описанные клетки могут быть выделены из аутогенных или донорских тканей, таких как костный мозг, надкостница, надхрящница, кость, хрящ, жировая ткань и др., и культивируются in vitro для увеличения их количества, изменения фенотипа (если это необходимо).The activation component of the process of organotypic regeneration and / or repair of cartilage tissue in a tissue engineering construct (biograft) can be autogenous or allogeneic cells of mesenchymal origin, which are cambial poorly differentiated connective tissue cells (striated and smooth muscles, adipose tissue, bone, cartilage tissue. P.). The cells used to create the tissue engineering construct are mesenchymal stromal cells that are at different stages of differentiation (multipotent, stem cells), at which, in turn, they can still be differentiated in the chondroblastic direction. The described cells can be isolated from autologous or donor tissues, such as bone marrow, periosteum, perichondrium, bone, cartilage, adipose tissue, etc., and cultured in vitro to increase their number, change the phenotype (if necessary).
В качестве одного из основных компонентов активации могут быть использованы хондробласты (Патент RU 2160112, 12.10.2000).Chondroblasts can be used as one of the main components of activation (Patent RU 2160112, 12.10.2000).
Источниками культуры хондробластов являются гиалиновая, волокнистая, эластичная хрящевая ткань любой локализации, пульпозные ядра межпозвоночных дисков взрослого человека или эмбрионов человека на сроках беременности после 8 недель.Sources of chondroblast culture are hyaline, fibrous, elastic cartilage tissue of any location, pulp nuclei of the intervertebral discs of an adult or human embryos in pregnancy after 8 weeks.
Биотрансплантат получают вне тела живого организма путем объединения, каким-либо способом, компонента активации с матрицей-носителем в пропорциях, регламентируемых экспериментальной или клинической задачей, в результате чего образуется желаемая биологическая единица (биотрансплантат, тканеинженерная конструкция).The biograft is obtained outside the body of a living organism by combining, in some way, the activation component with the carrier matrix in the proportions regulated by the experimental or clinical task, as a result of which the desired biological unit is formed (biotransplant, tissue engineering construct).
При необходимости биотрансплантат может включать в себя пластификатор, обычно в количестве от 0,1 до 10 мас.%. Пластификатор выбирают как правило из группы полиэтиленгликоля, сорбита, глицерина и т.п.If necessary, the biograft may include a plasticizer, usually in an amount of from 0.1 to 10 wt.%. The plasticizer is usually selected from the group of polyethylene glycol, sorbitol, glycerol, etc.
Для удобства фиксации биотрансплантата на раневой поверхности и придания трансплантату необходимой формы заявляемая композиция дополнительно может включать, по крайней мере, один слой полимерной основы, размещенный внутри или на поверхности носителя. Полимерная основа может быть выполнена в виде сетчатого эндопротеза или пленки или в виде перевязочного материала. Указанный сетчатый эндопротез может быть выполнен, например, из биодеградируемого или не биодеградируемого сетчатого материала или его равноценного заменителя по свойствам: биосовместимость и эластичность.For ease of fixation of the biograft on the wound surface and giving the graft the necessary shape, the claimed composition may further include at least one layer of a polymer base, placed inside or on the surface of the carrier. The polymer base can be made in the form of a mesh endoprosthesis or film or in the form of a dressing. The specified mesh endoprosthesis can be performed, for example, from a biodegradable or non-biodegradable mesh material or its equivalent substitute for properties: biocompatibility and elasticity.
При необходимости комплекс может дополнительно иметь сетчатый полимерный слой, расположенный снизу или сверху активного биологического комплекса.If necessary, the complex may additionally have a mesh polymer layer located below or above the active biological complex.
Культура хондробластов человека содержит аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80% и не более 20% примесных клеток.A human chondroblast culture contains at least 80% and no more than 20% impurity cells of aggrecan and collagen II-expressing cells.
Хрящевую ткань отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течение 40-90 минут в растворе, содержащем 0,01-0,1% раствор коллагеназы II типа, 0,05-0,1% раствор проназы Е. Суспензию первичных диссоциированных хондробластов засевают с плотностью не менее 1×106 кл./мл и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 10% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением ростовых добавок и факторов роста.Cartilage tissue is washed, mechanically crushed and subjected to enzymatic disaggregation for 40-90 minutes in a solution containing 0.01-0.1% type II collagenase solution, 0.05-0.1% pronase E. solution A suspension of primary dissociated chondroblasts is seeded with a density of at least 1 × 10 6 cells / ml and cultured in a medium containing DMEM / F12 growth medium, 10% fetal calf serum with the addition of growth additives and growth factors.
Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева - 1×106 кл./мл.The environment is repeatedly changed. Upon reaching the cell culture of the confluent state, passaging is carried out using a trypsin solution to disaggregate the monolayer. Sowing density - 1 × 10 6 cells / ml.
Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% CO2. Пассируют культуру не более двух раз.Cells are cultured for 18-25 days at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . Passport culture no more than two times.
Для приготовления биотрансплантата материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа производится в стерильных условиях ламинарного бокса. Выделенная с помощью хирургических инструментов хрящевая ткань тщательно отмывается от сгустков крови, максимально отделяются все мягкие ткани (кожа, фасции, мышцы, сухожилия, связки) и костная ткань. Полученную хрящевую ткань измельчают до кусочков не менее 1 мм куб. Затем подвергают ферментативной и механической дезагрегации - освобождение клеточных элементов от тканевого матрикса.To prepare the biograft, the material is transferred into a sterile vessel with a solution of Hanks and gentamicin (80 mg / l). Further work is done under sterile conditions in a laminar box. The cartilaginous tissue isolated with the help of surgical instruments is thoroughly washed from blood clots, and all soft tissues (skin, fascia, muscles, tendons, ligaments) and bone tissue are maximally separated. The resulting cartilage tissue is crushed to pieces of at least 1 mm cube. Then subjected to enzymatic and mechanical disaggregation - the release of cellular elements from the tissue matrix.
Способ дезагрегации заключается в использовании 0,1% раствора коллагеназы II типа (Sigma), 0,05% раствора проназы Е (Sigma), в одномоментном инкубировании кусочков хрящевой ткани в течение 40-90 мин в двухкомпонентном (1:1) ферментном растворе, с последующим измельчением путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии. Полученная суспензия трижды отмывается путем центрифугирования при 700 об/мин.The disaggregation method consists in using a 0.1% type II collagenase solution (Sigma), a 0.05% pronase E solution (Sigma), in one-stage incubation of cartilage tissue pieces for 40-90 min in a two-component (1: 1) enzyme solution, followed by grinding by repeated pipetting to obtain a unicellular suspension. The resulting suspension is washed three times by centrifugation at 700 rpm.
Способ культивированияCultivation method
Суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток, полученных из хрящевой ткани, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в среде, содержащей ростовую среду DMEM+F12 (1:1, Gibco BRL), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПП ПанЭко), 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит, НПП ПанЭко), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением ростовых факторов 5-20 нг/мл bFGF (Sigma) и/или 0,1-10 нг/мл TGFβ1 (Sigma). Замену среды производят каждые 3 дня. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния следует пассирование с использованием 0,05% раствора трипсина для дезагрегации монослоя, той же культуральной среды, при плотности посева не менее 10×105 кл./мл. Возможно проведение не более двух пассажей вследствие дедифференцировки и изменения фенотипа (снижение количества аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток) получаемых клеток.A suspension of primary dissociated cartilage cells obtained from cartilage was cultured on uncovered Petri culture plates in media containing DMEM + F12 growth medium (1: 1, Gibco BRL), 10% fetal calf serum (NPE PanEco), 1% ITS ( insulin, transferrin, selenite, NPP PanEco), 50 μg / ml ascorbic acid (Sigma), 10 μg / ml gentamicin, 5 μg / ml amphotericin B with the addition of growth factors 5-20 ng / ml bFGF (Sigma) and / or 0 1-10 ng / ml TGFβ 1 (Sigma). The environment is replaced every 3 days. When the cell culture reaches a confluent state, passaging should be performed using a 0.05% trypsin solution to disaggregate the monolayer of the same culture medium with a culture density of at least 10 × 10 5 cells / ml. It is possible to carry out no more than two passages due to dedifferentiation and phenotype changes (reduction in the number of aggrecan and collagen II-expressing cells) of the resulting cells.
Биотрансплантат содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала или из собственных тканей рецепиента, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.The biograft contains mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from fetal or donor material or from the recipient’s own tissues, while the tissue is disaggregated, the resulting cell suspension is resuspended and cultured on a growth medium containing transferrin, insulin, fibroblast growth factor and heparin before accumulation in the culture mature stromal cells.
В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.The following tissues are used as fetal material: bone marrow, thymus, liver, adipose tissue of human embryos of the 1st trimester of pregnancy.
В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.The following tissues are used as donor material: bone marrow, thymus, liver, adipose tissue.
Для получения аутологичных МСК используют ткани: костный мозг, жировая ткань.To obtain autologous MSCs, tissues are used: bone marrow, adipose tissue.
Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых является стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.Mesenchymal stem cells are mainly derived from donor bone marrow, but there are other sources - skeletal muscle, subcutaneous adipose tissue, fetal organs of hematopoiesis (liver, thymus, spleen). MSCs from fetal organs of hematopoiesis and methods for their preparation are practically not studied. The described methods for growing MSCs from bone marrow and lipoaspirates make it possible to obtain heterogeneous populations of stromal cells, only a small percentage of which are stem cells. The cells of the mature stroma do not possess the property of differentiating into different cell lines and, thus, are therapeutically ineffective. After transplantation, stromal cells migrate mainly to the connective tissue and accumulate there. With standard passage at high inoculum doses, the proportion of mature stromal cells increases rapidly.
Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.The use of a homogeneous (at least 80%) population of pluripotent MSCs as a transplant allows to increase the effectiveness of treatment, increase the reproducibility of the results and avoid undesirable effects.
Мезенхимальные стволовые клетки выделяются из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей. Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.Mesenchymal stem cells are secreted from fetal (bone marrow, thymus, liver, adipose tissue) or donor (bone marrow, adipose tissue, thymus) tissues. To isolate fetal cells using abortive material obtained by artificial termination of pregnancy in healthy women, previously examined for the presence of viral and bacterial infections.
Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей, например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см2 в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO2. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см2 в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см2 и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводит к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.The possibility of using biomaterial is achieved at the following gestational periods: liver - 5-8 weeks, thymus - 18-20 weeks, bone marrow - 17-20 weeks, subcutaneous adipose tissue - 17-19 weeks. If the cells are not extracted from aspirates (bone marrow, lipoaspirate), but from dense tissues, such as the thymus, the organ is preliminarily crushed and enzymatically disaggregated. The suspension is filtered through a fine mesh stainless steel sieve. The cell suspension (aspirate) is diluted 1: 1 with Hanks saline, centrifuged in 1,500 × g mode for 10 minutes and resuspended in DMEM / F12 growth medium containing 15% fetal calf serum, selected for cell growth in low density, 2 mm glutamine. A cell suspension is plated on plastic Petri dishes with a diameter of 100 mm. The seeding density of the primary cell suspension is 1-20 million mononuclear cells per 1 cm 2 depending on the source of excretion. After 1 day, non-adherent cells are removed, the growth medium is replaced. The cultures are incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . After 6 days, growth of heterogeneous cell populations is observed. Once the culture reaches 50% confluency, the monolayer is trypsinized and replanted onto new plates with a density of 10-30 cells per 1 cm 2 in a growth medium additionally containing 10 μg / ml transferrin, 1 μg / ml insulin, 10ng / ml fibroblast growth factor - 2 and 8 U / ml heparin. After 7-10 days, dense colonies of small cells (7-10 microns in diameter) with a large number of mitoses are selected. The selected colonies are seeded in new plates with a density of 20 cells / cm 2 and grown to a state of pre-confluency. The medium is replaced every 2 days. Subsequent passages are made in the same mode. An increase in the seed dose or a change in the composition of the growth medium leads to the rapid accumulation of mature stroma cells in the culture.
Фибробласты получают из кожи фетусов 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов. Кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают и ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе трипсина в течение 40 минут в условиях СО2 инкубатора при температуре 37°С. Липоаспират ферментативно дезагрегируют аналогично. Суспензию клеток разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1000×об/мин, 5 минут, и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина. Суспензию высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 500-1000 тысяч клеток на 1 см2.Fibroblasts are obtained from fetus skin of the 1-2 trimester of pregnancy, adult skin obtained as a result of plastic surgeries or biopsies, lipoaspirates. The skin is washed in Hanks' medium containing an antibiotic and antimycotic, crushed and enzymatically disaggregated in a 0.25% trypsin solution for 40 minutes under conditions of a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C. Lipoaspirate is enzymatically disaggregated similarly. The cell suspension was diluted 1: 1 with Hanks saline, centrifuged at 1000 × rpm, 5 minutes, and resuspended in DMEM / F12 growth medium containing 10% fetal calf serum, 2 mm glutamine. The suspension is plated on plastic Petri dishes with a diameter of 100 mm. The seeding density of the primary cell suspension is 500-1000 thousand cells per 1 cm 2 .
Примером применения биотранспланта является способ лечения дегенеративных и травматических заболеваний хрящевой ткани.An example of the use of a biotransplant is a method of treating degenerative and traumatic diseases of cartilage.
Доступ к суставу осуществляют стандартным методом в зависимости от локализации повреждения. После артротомии осуществляют дебридемент хрящевого дефекта вплоть до здоровой хрящевой ткани. Удаляют рубцы и освобождают субхондральную кость, которая должна быть неповрежденной и не кровоточить. Из надкостницы близлежащей кости выкраивают свободный лоскут несколько больших размеров, чем размер дефекта. Дефект хряща покрывают надкостницей, которая обращена камбиальным слоем. Далее надкостницу подшивают к краям дефекта рассасывающимися нитями 6-0. Сверху шов покрывают фибриновым клеем. Для заполнения дефекта хряща биотрансплантат в необходимом объеме с количеством клеток не менее 10 млн. в мл вводят под надкостницу на дефект хряща. Отверстие после введения биотрансплантата заклеивают фибриновым клеем. Операционную рану ушивают традиционным способом.Access to the joint is carried out by the standard method, depending on the location of the damage. After arthrotomy, a cartilage defect is debridement up to healthy cartilage tissue. Scars are removed and the subchondral bone is released, which should be intact and not bleed. From the periosteum of a nearby bone, a free flap is cut out a few larger sizes than the size of the defect. The cartilage defect is covered with the periosteum, which is facing the cambial layer. Next, the periosteum is hemmed to the edges of the defect with absorbable sutures 6-0. Top seam is covered with fibrin glue. To fill a cartilage defect, a biograft in the required volume with a cell number of at least 10 million per ml is injected under the periosteum to the cartilage defect. The hole after the introduction of the biograft is sealed with fibrin glue. The surgical wound is sutured in the traditional way.
В послеоперационный период необходима полная иммобилизация сустава в течение 2 недель; с 3 по 6 недели разрешается частичная нагрузка на оперированный сустав; с 6 по 12 - щадящая нагрузка; с 12 по 26 - свободный режим движения в суставе и с 26 по 52 недели - движение в суставе без ограничений. Комбинированный биотрансплантат обладает высокими потенциями к пролиферации, дифференцировке, синтезирующих внеклеточный хрящевой матрикс, для использования в качестве биотрансплантата в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии.In the postoperative period, complete joint immobilization within 2 weeks is necessary; from 3 to 6 weeks, a partial load on the operated joint is allowed; from 6 to 12 - sparing load; from 12 to 26 - free mode of movement in the joint and from 26 to 52 weeks - movement in the joint without restrictions. The combined biograft has high potentials for proliferation, differentiation, synthesizing the extracellular cartilage matrix, for use as a biograft in traumatology, orthopedics, and maxillofacial surgery.
Создание этой структуры основывается на следующих основных принципах:The creation of this structure is based on the following basic principles:
1. Трехмерность конструкции, которая достигается использованием предлагаемой матрицы-носителя.1. Three-dimensional design, which is achieved using the proposed matrix carrier.
2. Аутогенность, что достигается использованием аутогенных клеток человека.2. Autogenicity, which is achieved using human autologous cells.
3. Аллогенность, что достигается использованием аллогенных клеток человека.3. Allogeneity, which is achieved using human allogeneic cells.
4. Использование клеток мезодермального и мезенхимального происхождения.4. The use of cells of mesodermal and mesenchymal origin.
5. Удобство трансплантации, фиксации и придание трансплантату необходимой формы, что достигается включением в его состав полимерной основы - матрицы-носителя, и возможность быть дополненным фиксирующим агентом, таким как полимерная пленка или сетчатый эндопротез.5. Convenience of transplantation, fixation and giving the transplant the necessary shape, which is achieved by including in its composition a polymer base - a carrier matrix, and the ability to be supplemented with a fixing agent, such as a polymer film or mesh endoprosthesis.
Данное изобретение предоставляет возможность закрытия объемных, трехмерных дефектов хрящевой ткани единым, унифицированным, многокомпонентным, объемным, трехмерным биотрансплантатом (тканеинженерной конструкцией), что дает право говорить о новом достигаемом техническом результате, очевидном для специалиста в данной области.This invention provides the ability to close volumetric, three-dimensional defects of cartilage tissue with a single, unified, multicomponent, volumetric, three-dimensional biograft (tissue-engineering design), which gives the right to speak of a new achieved technical result that is obvious to a person skilled in this field.
Пример 1.Example 1
Больной Ц. поступил в отделение спинальной хирургии в плановом порядке в связи с жалобами на боль в области поясницы, усиливающуюся при нагрузке с радикулярным синдромом со стороны седалищного нерва справа. При амбулаторном обследовании (ЯМРТ) выявлен остеохондроз позвоночника с межпозвонковой грыжей, пролабирующей в спинно-мозговой канал со сдавливанием нервных корешков на уровне L IV-L V. В отделении выполнена резекция части фиброзного кольца и пульпозного ядра межпозвонкового диска на уровне L IV-L V. Из полученного в результате операции хрящевой ткани межпозвонкового диска были выделены аутологичные хондробласты, которые после культивирования были соединены с носителем, состоящим из геля хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроэтин сульфата, причем количество клеточных единиц составило 30 млн. клеток в 1 мл. Объем полученной тканеинженерной конструкции составлял 5 мл. Конструкция была трансплантирована пациенту в область пульпозного ядра. После проведенного лечения было отмечено, что у пациента отмечалось отсутствие болевого синдрома, по данным МРТ через 3 мес. произошло увеличение высоты межпозвонкового диска, отсутствие грыжевых выпячиваний и изменений со стороны нервных корешков в области бывшего сдавливания. При оценке качества жизни по шкалам пациент отметил улучшение качества жизни, что можно расценивать в совокупности с полученными клинико-инструментальными данными как выздоровление.Patient C. entered the spinal surgery department in a planned manner in connection with complaints of pain in the lumbar region, aggravated by a load with a radicular syndrome from the sciatic nerve on the right. An outpatient examination (NMR) revealed osteochondrosis of the spine with an intervertebral hernia prolapsing into the spinal canal with compression of the nerve roots at the level of L IV-L V. In the department, a part of the fibrous ring and the pulpous nucleus of the intervertebral disk were resected at the level of L IV-L V Autologous chondroblasts were isolated from the cartilaginous tissue of the intervertebral disc, which, after cultivation, were connected to a carrier consisting of chitosan gel, hyaluronic acid, chondroetin sulfate Wherein the number of cell units was 30 Mill. Cells in 1 ml. The volume of the resulting tissue-engineering design was 5 ml. The design was transplanted to the patient in the pulp nucleus. After the treatment, it was noted that the patient had a lack of pain, according to MRI after 3 months. there was an increase in the height of the intervertebral disc, the absence of hernial protrusions and changes from the nerve roots in the area of the former compression. When assessing the quality of life on scales, the patient noted an improvement in the quality of life, which can be regarded in conjunction with the obtained clinical and instrumental data as recovery.
Таким образом, данная методика показала свою эффективность при лечении дегенеративных заболеваний межпозвонковых дисков.Thus, this technique has been shown to be effective in the treatment of degenerative diseases of the intervertebral discs.
Пример 2. Больная Н. поступила в травматологическое отделение в экстренном порядке с жалобами на интенсивную боль в левом коленном суставе, возникшую после падения на льду. При осмотре область сустава отечна, определяется балатация надколенника, резкое ограничение пассивных и активных движений в суставе. При рентгенологическом исследовании выявлен дефект в области внутреннего мыщелка бедренной кости. При пункции сустава получена свежая кровь, при артроскопии выявлен обширный отрыв фрагмента хряща в области медиального мыщелка, свободный фрагмент удален. После стихания острого процесса пациентке выполнена артротомия коленного сустава слева, на операции выявлен вялогранулирующий дефект хрящевой ткани в области внутреннего мыщелка, после кюретирования дна дефекта на область отсутствия хрящевой ткани была наложена тканеинженерная конструкция, состоящая из геля хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроэтин сульфата и аллогенных хондробластов, причем количество клеточных единиц составило 15 млн. клеток в 1 мл. Конструкция была фиксирована коллагеновой пленкой и армирована сеткой Vicril (Ethicon). Послойные швы на рану, гипсовая лонгета. Спустя 2 мес. произведено снятие гипсовой лангеты и контрольное УЗИ левого коленного сустава, на котором в области имевшегося дефекта определяется эхосигнал, сходный со здоровой хрящевой тканью, объемных образований и кратерообразных дефектов на суставной поверхности не выявлено. После чего пациентке проведена реабилитационная лечебная физкультура. Спустя 4 мес. после операции состояние пациентки удовлетворительное, ходит самостоятельно, болей нет, движения в суставе в полном объеме. При контрольном УЗИ левого коленного сустава суставная поверхность гладкая, структура однородная с единичными гиперэхогенными включениями. Констатировано выздоровление.Example 2. Patient N. was admitted to the trauma unit on an emergency basis with complaints of intense pain in the left knee joint that arose after falling on ice. On examination, the joint area is edematous, patellar balancing is determined, a sharp restriction of passive and active movements in the joint. An X-ray examination revealed a defect in the inner condyle of the femur. When the joint was punctured, fresh blood was obtained, arthroscopy revealed an extensive detachment of the cartilage fragment in the medial condyle, the free fragment was removed. After the acute process subsided, the patient underwent an arthrotomy of the knee joint on the left, a sluggish-grained cartilage defect in the internal condyle was revealed during surgery, after cure of the defect bottom, a tissue-engineering structure consisting of chitosan gel, hyaluronic acid, chondroetin sulfate and allopath and the number of cell units was 15 million cells per 1 ml. The design was fixed with a collagen film and reinforced with a Vicril (Ethicon) mesh. Layered seams on the wound, plaster splint. 2 months later the plaster cast was removed and an ultrasound scan of the left knee joint was performed, on which an echo signal similar to healthy cartilaginous tissue was detected in the area of an existing defect, and no volumetric formations and crater-like defects were found on the articular surface. After which the patient underwent rehabilitation physiotherapy exercises. 4 months later after the operation, the patient's condition is satisfactory, walks on her own, no pain, full movement in the joint. With the control ultrasound of the left knee joint, the articular surface is smooth, the structure is homogeneous with single hyperechoic inclusions. Recovered recovery.
Таким образом, получены данные о регенерации обширных внутрисуставных дефектов хрящевой ткани с использованием тканеинженерной конструкции с аллогенными хондробластами.Thus, data were obtained on the regeneration of extensive intraarticular defects in cartilage tissue using a tissue-engineering design with allogeneic chondroblasts.
Литература:Literature:
1. Васильева Л.Ф. Мануальная диагностика и терапия \\ С.-Петербург. - ИКФ "Фолиант", 1999.1. Vasilieva L.F. Manual diagnosis and therapy \\ St. Petersburg. - ICF "Foliant", 1999.
2. Михайлова Л.Н. Репаративная регенерация костной и хрящевой тканей в условиях воздействия различных биомеханических факторов: Автореф. д-ра биол. наук. М., 1988.2. Mikhailova L.N. Reparative regeneration of bone and cartilage tissue under the influence of various biomechanical factors: Abstract. Dr. biol. sciences. M., 1988.
3. Рабинович С.С. Микродискэктомия при поясничных болях // Боль и ее лечение. Медицинский междисциплинарный научно-практический журнал. - 1997, № 7. - С.11-13.3. Rabinovich S.S. Microdisectomy for lumbar pain // Pain and its treatment. Medical interdisciplinary scientific and practical journal. - 1997, No. 7. - S.11-13.
4. Ролик И.С., Галанов В.П. Грыжи межпозвонковых дисков поясничного отдела и их биологическая терапия. // Биологическая медицина, 1999, №1, с.22-31.4. Roller I.S., Galanov V.P. Hernia of the intervertebral disc of the lumbar and their biological therapy. // Biological medicine, 1999, No. 1, p.22-31.
5. Adams SB Jr, Randolph MA, Gill TJ. Tissue engineering for meniscus repair. J Knee Surg. 2005 Jan; 18(1): 25-30.5. Adams SB Jr, Randolph MA, Gill TJ. Tissue engineering for meniscus repair. J Knee Surg. 2005 Jan; 18 (1): 25-30.
6. Atlas SJ, Keller RB, Wu YA, Deyo RA, Singer DE. Long-term outcomes of surgical and nonsurgical management of sciatica secondary to a lumbar disc herniation: 10 year results from the maine lumbar spine study. Spine. 2005 Apr 15; 30(8): 927-35.6. Atlas SJ, Keller RB, Wu YA, Deyo RA, Singer DE. Long-term outcomes of surgical and nonsurgical management of sciatica secondary to a lumbar disc herniation: 10 year results from the maine lumbar spine study. Spine 2005 Apr 15; 30 (8): 927-35.
7. De Boer J, Wang HJ, Van Blitterswijk C. Effects of Wnt signaling on proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng. 2004 Mar - Apr; 10(3-4): 393-401.7. De Boer J, Wang HJ, Van Blitterswijk C. Effects of Wnt signaling on proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng. 2004 Mar - Apr; 10 (3-4): 393-401.
8. Isaacs RE, Podichetty VK, Sandhu FA, Santiago P, Spears JD, Aaronson O, Kelly K, Hrubes М, Fessler RG. Thoracic microendoscopic discectomy: a human cadaver study. Spine. 2005 May 15; 30(10): 1226-31.8. Isaacs RE, Podichetty VK, Sandhu FA, Santiago P, Spears JD, Aaronson O, Kelly K, Hrubes M, Fessler RG. Thoracic microendoscopic discectomy: a human cadaver study. Spine 2005 May 15; 30 (10): 1226-31.
9. Kinner В, Capito RM, Spector М. Regeneration of articular cartilage. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2005; 94: 91-123.9. Kinner B, Capito RM, Spector M. Regeneration of articular cartilage. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2005; 94: 91-123.
10. Kuettner KE, Cole AA. Cartilage degeneration in different human joints. Osteoarthritis Cartilage. 2005 Feb; 13(2): 93-103.10. Kuettner KE, Cole AA. Cartilage degeneration in different human joints. Osteoarthritis Cartilage. 2005 Feb; 13 (2): 93-103.
11. Martin MD, Boxell CM, Malone DG. Pathophysiology of lumbar disc degeneration: a review of the literature. Neurosurg Focus. 2002 Aug 15; 13(2): E1.11. Martin MD, Boxell CM, Malone DG. Pathophysiology of lumbar disc degeneration: a review of the literature. Neurosurg Focus. 2002 Aug 15; 13 (2): E1.
12. Marcacci M, Berruto M, Brocchetta D, Delcogliano A, Ghinelli D, Gobbi A, Kon E, Pederzini L, Rosa D, Sacchetti GL, Stefani G, Zanasi S. Articular cartilage engineering with Hyalograft C: 3-year clinical results. Clin Orthop Relat Res. 2005 Jun; (435): 96-105.12. Marcacci M, Berruto M, Brocchetta D, Delcogliano A, Ghinelli D, Gobbi A, Kon E, Pederzini L, Rosa D, Sacchetti GL, Stefani G, Zanasi S. Articular cartilage engineering with Hyalograft C: 3-year clinical results . Clin Orthop Relat Res. 2005 Jun; (435): 96-105.
13. Redman SN, Oldfield SF, Archer CW. Current strategies for articular cartilage repair. Eur Cell Mater. 2005 Apr 14; 9: 23-32.13. Redman SN, Oldfield SF, Archer CW. Current strategies for articular cartilage repair. Eur Cell Mater. 2005 Apr 14; 9: 23-32.
14. Sakai D, Mochida J, Yamamoto Y, Nomura T, Okuma M, Nishimura K, Nakai T, Ando K, Hotta T. Transplantation ofmesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration. Biomaterials. 2003 Sep; 24(20): 3531-41.14. Sakai D, Mochida J, Yamamoto Y, Nomura T, Okuma M, Nishimura K, Nakai T, Ando K, Hotta T. Transplantation ofmesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration. Biomaterials. 2003 Sep; 24 (20): 3531-41.
15. Shieh SJ, Terada S, Vacanti JP. Tissue engineering auricular reconstruction: in vitro and in vivo studies. Biomaterials. 2004 Apr; 25(9): 1545-57.15. Shieh SJ, Terada S, Vacanti JP. Tissue engineering auricular reconstruction: in vitro and in vivo studies. Biomaterials. 2004 Apr; 25 (9): 1545-57.
16. Turgut M, Akyuz O, Ozsunar Y, Kacar F. Sponge-induced granuloma ("gauzoma") as a complication of posterior lumbar surgery. Neurol Med Chir (Tokyo). 2005 Apr; 45(4): 209-11.16. Turgut M, Akyuz O, Ozsunar Y, Kacar F. Sponge-induced granuloma ("gauzoma") as a complication of posterior lumbar surgery. Neurol Med Chir (Tokyo). 2005 Apr; 45 (4): 209-11.
17. Wenger M, Markwalder TM. A novel surgical treatment of lumbar disc herniation in patients with long-standing degenerative disc disease. J Neurosurg Spine. 2005 May; 2(5): 515-20.17. Wenger M, Markwalder TM. A novel surgical treatment of lumbar disc herniation in patients with long-standing degenerative disc disease. J Neurosurg Spine. 2005 May; 2 (5): 515-20.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005138223/15A RU2301677C1 (en) | 2005-12-09 | 2005-12-09 | Biotransplant for treatment of degenerative and traumatic disease of cartilage tissue and method for its preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005138223/15A RU2301677C1 (en) | 2005-12-09 | 2005-12-09 | Biotransplant for treatment of degenerative and traumatic disease of cartilage tissue and method for its preparing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2301677C1 true RU2301677C1 (en) | 2007-06-27 |
Family
ID=38315453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005138223/15A RU2301677C1 (en) | 2005-12-09 | 2005-12-09 | Biotransplant for treatment of degenerative and traumatic disease of cartilage tissue and method for its preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2301677C1 (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012166903A1 (en) * | 2011-06-02 | 2012-12-06 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and uses for ex vivo tissue culture systems |
| US8647861B2 (en) | 2008-07-16 | 2014-02-11 | Children's Medical Center Corporation | Organ mimic device with microchannels and methods of use and manufacturing thereof |
| RU2593011C1 (en) * | 2015-07-16 | 2016-07-27 | Павел Петрович Лактионов | Biotransplant for joints cartilaginous tissue defects restoring |
| US9725687B2 (en) | 2011-12-09 | 2017-08-08 | President And Fellows Of Harvard College | Integrated human organ-on-chip microphysiological systems |
| RU2629809C2 (en) * | 2012-03-22 | 2017-09-04 | Трб Шемедика Интернасьональ С.А. | Method for tendon or ligament reconstruction |
| RU2645079C2 (en) * | 2011-05-19 | 2018-02-15 | Депуи Синтез Продактс, Инк. | Treatment of degenerative changes in intervertebral discs using cells obtained from human umbilical tissue |
| RU2659842C2 (en) * | 2016-12-27 | 2018-07-04 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Carrier for transplantable cells for replacement of a defect obtained with a head injury |
| RU2819284C2 (en) * | 2022-06-29 | 2024-05-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Method of producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects of subject |
-
2005
- 2005-12-09 RU RU2005138223/15A patent/RU2301677C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8647861B2 (en) | 2008-07-16 | 2014-02-11 | Children's Medical Center Corporation | Organ mimic device with microchannels and methods of use and manufacturing thereof |
| RU2645079C2 (en) * | 2011-05-19 | 2018-02-15 | Депуи Синтез Продактс, Инк. | Treatment of degenerative changes in intervertebral discs using cells obtained from human umbilical tissue |
| WO2012166903A1 (en) * | 2011-06-02 | 2012-12-06 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and uses for ex vivo tissue culture systems |
| US9951313B2 (en) | 2011-06-02 | 2018-04-24 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and uses for ex vivo tissue culture systems |
| US9725687B2 (en) | 2011-12-09 | 2017-08-08 | President And Fellows Of Harvard College | Integrated human organ-on-chip microphysiological systems |
| US10954482B2 (en) | 2011-12-09 | 2021-03-23 | President And Fellows Of Harvard College | Integrated human organ-on-chip microphysiological systems |
| US11773359B2 (en) | 2011-12-09 | 2023-10-03 | President And Fellows Of Harvard College | Integrated human organ-on-chip microphysiological systems |
| US12187997B2 (en) | 2011-12-09 | 2025-01-07 | President And Fellows Of Harvard College | Integrated human organ-on-chip microphysiological systems |
| RU2629809C2 (en) * | 2012-03-22 | 2017-09-04 | Трб Шемедика Интернасьональ С.А. | Method for tendon or ligament reconstruction |
| RU2593011C1 (en) * | 2015-07-16 | 2016-07-27 | Павел Петрович Лактионов | Biotransplant for joints cartilaginous tissue defects restoring |
| RU2659842C2 (en) * | 2016-12-27 | 2018-07-04 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Carrier for transplantable cells for replacement of a defect obtained with a head injury |
| RU2819284C2 (en) * | 2022-06-29 | 2024-05-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Method of producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects of subject |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cancedda et al. | Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone | |
| Stevens et al. | FGF‐2 enhances TGF‐β1‐induced periosteal chondrogenesis | |
| EP2392358B1 (en) | Surgical grafts for repairing chondral defects | |
| US11801331B2 (en) | Composition for cartilage regeneration and preparing thereof | |
| KR20100041027A (en) | Method for preparing three-dimensional scaffold using animal tissue powder and three-dimensional scaffold manufactured by the same method | |
| ES2356678T3 (en) | BIOMATRIZ OF COLLAGEN AND METHOD TO PRODUCE. | |
| WO2005011765A1 (en) | Method of constructing artificial joint | |
| KR20210040908A (en) | Method of Preparing Pellets of Chondrocytes differentiated from human induced pluripotent stem cell and use of the same | |
| RU2301677C1 (en) | Biotransplant for treatment of degenerative and traumatic disease of cartilage tissue and method for its preparing | |
| US11786636B2 (en) | Methods for complex tissue engineering | |
| CN111514374A (en) | A method for promoting cartilage repair based on tissue engineered cartilage constructed by co-culture system | |
| KR101277970B1 (en) | A composition for treatment of cartilage diseases, artificial cartilage, and preparation methods thereof | |
| JP5964956B2 (en) | Preparation of parent cell bank from fetal tissue | |
| US20240091407A1 (en) | Cartilage tissue engineering complex and use thereof | |
| KR20110032433A (en) | Method for preparing cell spheroid, a mixed cell complex for cell transplantation, and method of use thereof | |
| Libera et al. | Cartilage engineering | |
| RU2336841C2 (en) | Method for osteoplasty in experiment | |
| CN101875914B (en) | Inducing liquid for differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into epithelial cells and preparation and application thereof | |
| CN115581811B (en) | Autologous tissue engineering living cell meibomian substitute and preparation method and application thereof | |
| RU2240135C1 (en) | Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity | |
| JP5373427B2 (en) | Use of synovial cells and minced cartilage fragments in cartilage repair | |
| RU2818176C1 (en) | Method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects in patients | |
| US20240091411A1 (en) | Ear cartilage tissue engineering complex and use thereof | |
| RU2335538C2 (en) | Organization of cells similar to tissue and macroscopical designs similar to tissue obtained by means of culture of macromass of cells and method of macromass culture | |
| Benea | Innovative Materials and Techniques for Osteochondral Repair |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131210 |