RU2295963C1 - Method for producing immunostimulator - Google Patents
Method for producing immunostimulator Download PDFInfo
- Publication number
- RU2295963C1 RU2295963C1 RU2005132190/15A RU2005132190A RU2295963C1 RU 2295963 C1 RU2295963 C1 RU 2295963C1 RU 2005132190/15 A RU2005132190/15 A RU 2005132190/15A RU 2005132190 A RU2005132190 A RU 2005132190A RU 2295963 C1 RU2295963 C1 RU 2295963C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- centrifugation
- distilled water
- supernatant
- timosin
- rpm
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 12
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 16
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims description 14
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims description 14
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 4
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 abstract description 2
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 abstract 1
- PRNVHVUEIITLRV-UHFFFAOYSA-N 7-chloro-4-hydroxy-n-methyl-5-phenyl-3h-1,4-benzodiazepin-2-imine;hydron;chloride Chemical compound Cl.C=12C=C(Cl)C=CC2=NC(=NC)CN(O)C=1C1=CC=CC=C1 PRNVHVUEIITLRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Chemical class 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 1
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 1
- 229910000737 Duralumin Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при выделении гормональных веществ с биологической активностью в иммунологических процессах, в частности при получении иммуностимулятора «Тимозин Т».The invention relates to medicine and can be used in the allocation of hormonal substances with biological activity in immunological processes, in particular upon receipt of the immunostimulant "Timosin T".
Препараты, которые могут быть использованы для стимулирования иммунного ответа, например, у животных продуцентов, сельскохозяйственных животных и человека, для производства иммунных сывороток, могут быть получены, в частности:Drugs that can be used to stimulate the immune response, for example, in animal producers, farm animals and humans, for the production of immune sera, can be obtained, in particular:
- из органов и тканей крупного рогатого скота [пат. РФ 2089204, А 61 К 35/48, опубл. 1997.09.10.]- from organs and tissues of cattle [US Pat. RF 2089204, A 61 K 35/48, publ. 1997.09.10.]
- из молоки лососевых рыб [патент РФ №2091073, А 61 К 35/60, опубл. 1997.09.27],- from salmon milk [RF patent No. 2091073, A 61 K 35/60, publ. 1997.09.27],
- из нервной ткани морских гидробионтов [патент РФ №2222337, А 61 К 35/60, 2004.01.27].- from the nervous tissue of marine aquatic organisms [RF patent No. 2222337, A 61 K 35/60, 2004.01.27].
В качестве сырья используют обезжиренную и депигментированную биомассу Spirulina platensis [пат. РФ 2125464, А 61 К 35/80, 1999.01.27], ганглии кальмара [патент РФ 2091072, А 61 К 35/50, 1997.09.27], и даже миндалины человека [пат. РФ №1522485, А 61 К 35/30, 1994.11.15].As raw materials use fat-free and depigmented biomass Spirulina platensis [US Pat. RF 2125464, A 61 K 35/80, 1999.01.27], squid ganglia [RF patent 2091072, A 61 K 35/50, 1997.09.27], and even human tonsils [US Pat. RF №1522485, A 61 K 35/30, 1994.11.15].
Известен способ выделения иммуностимулятора - «Тимозина», согласно которому свежий тимус крупного рогатого скота, взятый со льда, гомогенизируют в физрастворе, а затем центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают и нагревают до 80°С и после удаления осадка фильтруют через мелкоячейные фильтры (0,45 μ), после обработки ацетоном, фильтрования к повторного осаждения при помощи (NH4)2SO4 при рН 4,0, пропускают через хроматографическую колонку и получают чистый тимозин (5-я фракция) [Golstein A., Guna A., Zatz M., Hardi M., White A., "Purification and biological activity of the timus gland", Proc. Natl. Acad. USA, 69, 1800, 1972].There is a known method of isolating an immunostimulant - "Timosin", according to which fresh cattle thymus taken from ice is homogenized in saline and then centrifuged. The supernatant is collected and heated to 80 ° C and, after removal of the precipitate, it is filtered through fine-mesh filters (0.45 μ), after treatment with acetone, filtration and reprecipitation with (NH 4 ) 2 SO 4 at pH 4.0, passed through chromatographic column and pure thymosin is obtained (5th fraction) [Golstein A., Guna A., Zatz M., Hardi M., White A., "Purification and biological activity of the timus gland", Proc. Natl. Acad. USA, 69, 1800, 1972].
Аналогично описанному выше выделяют иммуностимулятор из тимуса телят или молодняка рогатого скота, где после очистки сырья его замораживают и измельченное сырье экстрагируют 5-6 объемами 3%-ного раствора уксусной кислоты, содержащего хлористый цинк при соотношении хлористого цинка и уксусной кислоты 1:1000 в течение 48-72 ч, затем отделяют надосадочную жидкость и выделяют целевой продукт осаждением пятью объемами ацетона при t=(-3)-(-5)°C. Полученный осадок экстрагируют водой при рН 6-7 и комнатной температуре в течение 1-3 ч. [Патент РФ 1112606, кл. А 61 К 38/22, опубл. 1996.08.20].As described above, an immunostimulant is isolated from the thymus of calves or young cattle, where after cleaning the raw material it is frozen and the crushed raw material is extracted with 5-6 volumes of a 3% solution of acetic acid containing zinc chloride at a ratio of zinc chloride and acetic acid of 1: 1000 over 48-72 h, then the supernatant is separated and the target product is isolated by precipitation with five volumes of acetone at t = (- 3) - (- 5) ° C. The resulting precipitate was extracted with water at pH 6-7 and room temperature for 1-3 hours [RF Patent 1112606, class. A 61 K 38/22, publ. 1996.08.20].
К недостаткам способов следует отнести то, что они не позволяют получить максимальное количество целевого продукта, обладающего достаточной биологической активностью.The disadvantages of the methods include the fact that they do not allow to obtain the maximum amount of the target product with sufficient biological activity.
Согласно способу, описанному в патенте СССР №1442064, иммуностимулятор получают из тимуса теленка, который измельчают до кашицы, к ней добавляют апирогеннную бидистиллированную воду и в проточном нагревателе осаждают высокомолекулярные составные части 10 мин при 80°С. Затем кашицу охлаждают и центрифугируют. К надосадку добавляют для непрерывной ультрафильтрации апирогенную воду. Ультрафильтрат подвергают электродиализу 2 ч при 30°С, напряжении 12 В, максимальной силе тока 40 А. Выход экстракта составляет 1,6-1,54% [Патент СССР №1442064, кл. А 61 К 38/22, опубл. 1988.11.30].According to the method described in USSR patent No. 1442064, an immunostimulant is obtained from the calf thymus, which is crushed to gruel, pyrogen-free bidistilled water is added to it, and high molecular weight components are precipitated in a flow heater for 10 min at 80 ° C. Then the pulp is cooled and centrifuged. Pyrogen-free water is added to the supernatant for continuous ultrafiltration. The ultrafiltrate is subjected to electrodialysis for 2 hours at 30 ° C, a voltage of 12 V, a maximum current of 40 A. The yield of the extract is 1.6-1.54% [USSR Patent No. 1442064, cl. A 61 K 38/22, publ. 1988.11.30].
Однако полученный таким образом иммуномодулятор не позволяет получить вещество, в котором подфракции с иммуностимулирующим и ингибирующим действием были бы выделены раздельно, и, как показали проведенные авторами исследования, в его составе содержатся компоненты, проявляющие как иммуностимулирующие, так и ингибирующие свойства.However, the immunomodulator obtained in this way does not allow one to obtain a substance in which subfractions with an immunostimulating and inhibitory effect would be isolated separately, and, as shown by the authors of the study, it contains components that exhibit both immunostimulating and inhibitory properties.
В способе получения иммуностимуляторов, взятом нами за прототип, в качестве сырья, используют вилочковую железу тюленя 10-15 дневного возраста, из которой подготавливают клеточную массу путем гомогенизации ее в физрастворе и обработки в гомогенизаторе с последующей полной дезинтеграцией оставшихся клеток ультразвуком, из полученного материала далее выделяют полипептиды путем последовательных операций центрифугирования, удаления осадка, нагрева надосадочной жидкости до +80°С, охлаждения до комнатной температуры с последующим центрифугированием, выдержки полученного сулернатанта при минусовой температуре, смешивания его в соотношении 1:5 с охлажденным до минусовой температуры ацетоном с последующим центрифугированием и отделением осадка, растворения осадка при соотношении 1:9-1:10 в 10 мМ растворе фосфорнокислого натрия при рН 7,0-7,2, смешивания в соотношении 4:1 с насыщенным раствором сернокислого аммония с последующим центрифугированием, подкисления полученного супернанта 10% раствором уксусной кислоты до рН 4,0-4,2, смешивания в соотношении 1:1 с 50% раствором сернокислого аммония с последующим центрифугированием, полного растворения полученного осадка в 10 мМ ТРИС - HCL буфере, при рН - 8,0-8,2, лиофилизации, повторного растворения полученного материала в 10 мМ ТРИС - HCL буфере, пропускания раствора через хроматографическую колонку и лиофилизации (5-я фракция), при этом при центрифугировании поддерживают температуру обрабатываемых материалов от 0 до -4°С.In the method of producing immunostimulants we have taken as a prototype, the thymus of a 10-15 day old seal is used as raw material, from which the cell mass is prepared by homogenizing it in saline and processing in a homogenizer, followed by complete disintegration of the remaining cells with ultrasound, from the material obtained polypeptides are isolated by sequential centrifugation, sediment removal, heating the supernatant to + 80 ° C, cooling to room temperature, followed by centrifuges by exposure, holding the obtained sulphonate at minus temperature, mixing it in a ratio of 1: 5 with acetone cooled to minus temperature, followed by centrifugation and separation of the precipitate, dissolving the precipitate at a ratio of 1: 9-1: 10 in a 10 mM sodium phosphate solution at pH 7, 0-7.2, mixing in a 4: 1 ratio with a saturated solution of ammonium sulfate, followed by centrifugation, acidifying the obtained supernant with a 10% solution of acetic acid to pH 4.0-4.2, mixing in a ratio of 1: 1 with a 50% solution of sulfate amm followed by centrifugation, complete dissolution of the precipitate obtained in 10 mM TRIS-HCL buffer, at pH 8.0-8.2, lyophilization, re-dissolution of the obtained material in 10 mM TRIS-HCL buffer, passing the solution through a chromatographic column and lyophilization ( 5th fraction), while centrifuging maintains the temperature of the processed materials from 0 to -4 ° C.
Полученный после последней лиофилизации материал вновь полностью растворяют в ТРИС-HCL буфере и пропускают через жидкостный хроматограф высокого давления в градиенте метанола 5-55%, выделяя из получаемых подфракций компоненты с иммуностимулирующими и ингибирующими свойствами, после чего суммарные фракции раздельно лиофилизуют.The material obtained after the last lyophilization was again completely dissolved in TRIS-HCL buffer and passed through a high pressure liquid chromatograph in a methanol gradient of 5-55%, isolating components with immunostimulating and inhibitory properties from the obtained subfractions, after which the total fractions were separately lyophilized.
Выход вещества 5-ой фракции составляет 280 мг на 1 кг сырья. Недостатком способа прототипа является наличие операций, приводящих к значительной потере вещества и соответственно низкому выходу продукта, кроме этого применение ацетона, метанола и солевых ТРИС буферов не позволяет использовать иммуностимулятор в парентеральной терапии больных [Патент РФ 2149006, А 61 К 35/26, опубл. 2000,05,20].The yield of substance of the 5th fraction is 280 mg per 1 kg of raw material. The disadvantage of the prototype method is the presence of operations leading to a significant loss of substance and, accordingly, a low yield of the product, in addition, the use of acetone, methanol and TRIS salt buffers does not allow the use of an immunostimulant in parenteral therapy of patients [RF Patent 2149006, A 61 K 35/26, publ. 2000.05.20].
Задача, решаемая настоящим изобретением - повышение выхода иммуностимулятора с высокой биологической активностью, расширение сферы его применения и упрощение процесса.The problem solved by the present invention is to increase the output of an immunostimulant with high biological activity, expanding its scope and simplifying the process.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения иммуностимулятора из вилочковой железы тюленя, включающем подготовку клеточной массы путем измельчения, гомогенизации сырья и последующей дезинтеграции клеток ультразвуком, центрифугирование, обработку полученной надосадочной жидкости сернокислым аммонием, повторное центрифугирование, полученный при этом супернатант подкисляют до рН 4-4,2, далее центрифугируют, образовавшийся осадок растворяют и раствор подвергают хроматографированию с последующей лиофилизацией суммарных фракций продукта, при этом процесс ведут при 4-5°С, а в качестве сырья используют вилочковую железу тюленя 1-2 месячного возраста, сырье гомогенизируют в дистиллированной воде в течение 5-6 мин при 8000 об/мин гомогенизатора. Обработку сернокислым аммонием ведут из расчета 1:3-3,5 по объему до 50% насыщения, супернатант подкисляют пропусканием углекислого газа, а осадок после подкисления и центрифугирования растворяют в дистиллированной воде до насыщенного состояния раствора, последний пропускают через хроматографическую колонку с сефадексом G-50, уравновешенную дистиллированной водой, при этом все операции центрифугирования ведут в течение не более 15 мин при 3000 об/мин.The problem is solved in that in a method for producing an immunostimulant from a thymus gland of a seal, which includes preparing the cell mass by grinding, homogenizing the raw material and then disintegrating the cells with ultrasound, centrifuging, processing the resulting supernatant with ammonium sulfate, repeated centrifugation, the resulting supernatant is acidified to pH 4 -4.2, then centrifuged, the precipitate formed is dissolved and the solution is chromatographed, followed by lyophilization of the total product, the process is carried out at 4-5 ° C, and the thymus of a seal of 1-2 months of age is used as a raw material, the raw material is homogenized in distilled water for 5-6 minutes at 8000 rpm of a homogenizer. Ammonium sulfate treatment is carried out at a rate of 1: 3-3.5 by volume up to 50% saturation, the supernatant is acidified by passing carbon dioxide, and the residue after acidification and centrifugation is dissolved in distilled water to a saturated state of the solution, the latter is passed through a chromatographic column with Sephadex G- 50, balanced with distilled water, while all centrifugation operations are carried out for no more than 15 minutes at 3000 rpm.
Способ получения иммуностимулятора «Тимозина Т» можно представить следующими стадиями:A method of obtaining an immunostimulant "Timosin T" can be represented by the following stages:
1. Грубая переработка сырья.1. Rough processing of raw materials.
2. Добавление к биомассе дистиллированной воды.2. Adding distilled water to the biomass.
3. Гомогенизация биомассы.3. Homogenization of biomass.
4. Ультразвуковая дезинтеграция клеток.4. Ultrasonic disintegration of cells.
5. Центрифугирование для удаления оставшихся волокон ткани.5. Centrifugation to remove remaining tissue fibers.
6. Насыщение раствора белков сернокислым аммонием до 50%.6. Saturation of a solution of proteins with ammonium sulfate up to 50%.
7. Центрифугирование для удаления флотирующих в солевой плотности жира и липопротеидов.7. Centrifugation to remove fat and lipoproteins floating in salt density.
8. Подкисление раствора белков углекислым газом до рН 4,0.8. The acidification of the protein solution with carbon dioxide to a pH of 4.0.
9. Центрифугирование для получения осадка полипептидов.9. Centrifugation to obtain a precipitate of polypeptides.
10. Растворение осадка полипептидов в воде до насыщенного состояния10. Dissolution of the precipitate of polypeptides in water to a saturated state
11. Хроматографическое выделение «Тимозина Т».11. Chromatographic isolation of "Timosin T".
12. Контроль активности иммуностимулятора.12. Monitoring the activity of the immunostimulant.
13. Фильтрация,стерилизация и лиофилизация препарата.13. Filtration, sterilization and lyophilization of the drug.
Стадии с 1 по 11 проводятся при температуре не выше +4°С.
Изобретение иллюстрируется фиг.1-5.The invention is illustrated in figures 1-5.
На фиг.1 - типичная хромотограмма выделения «Тимозина Т».Figure 1 is a typical chromatogram of the allocation of "Timosin T".
На фиг.2 показано действие «Тимозина Т» на цитотоксическую активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров к линии опухолевых клеток К562.Figure 2 shows the effect of "Timosin T" on the cytotoxic activity of peripheral blood mononuclear cells of healthy donors to the K562 tumor cell line.
На фиг.3 показано влияние «Тимозина Т» на пролиферативную активность мононуклеарных клеток здоровых доноров.Figure 3 shows the effect of "Timosin T" on the proliferative activity of mononuclear cells of healthy donors.
На фиг.4 показано влияние «Тимозина Т» на митогенез мононуклеарных клеток здоровых доноров.Figure 4 shows the effect of "Timosin T" on the mitogenesis of mononuclear cells of healthy donors.
На фиг.5 представлен индекс стимуляции митогенеза «Тимозином Т».Figure 5 presents the mitogenesis stimulation index "Timosin T".
ПримерExample
Вилочковые железы тюленей 1-2 месячного возраста в количестве 1 кг пропускали через электромясорубку. Полученную биомассу смешивали с 3 л дистиллированной воды и помещали в гомогенизатор на 5 мин при 8000 об/мин. После этого проводили дезинтеграцию (дробление) клеток, порциями по 100 мл, которые охлаждаются во время процесса дезинтеграции на ледяной бане, поддерживая температуру 0°С. Дезинтеграцию проводили на ультразвуковой установке при максимальной ее мощности по 120 с в режиме 100 с воздействия и 20 с перерыва для предупреждения нагрева биомассы, затем проводили центрифугирование при 3000 об/мин 15 мин при +4°С, осадок из остатков волокон соединительной ткани отбрасывали и получали надосадочную жидкость (НОЖ) 1-ю фракцию.The thymus glands of seals of 1-2 months of age in the amount of 1 kg were passed through an electric meat grinder. The resulting biomass was mixed with 3 L of distilled water and placed in a homogenizer for 5 min at 8000 rpm. After that, the cells were disintegrated (crushed), in 100 ml portions, which were cooled during the disintegration process in an ice bath, maintaining the temperature at 0 ° С. Disintegration was carried out on an ultrasonic unit with a maximum power of 120 s for 100 s each and an interval of 20 s to prevent biomass heating, then centrifugation was performed at 3000 rpm for 15 min at + 4 ° C, the precipitate from the remnants of the connective tissue fibers was discarded and received the supernatant (VAF) 1st fraction.
К НОЖ добавляли сухой сернокислый аммоний до 50% насыщения из расчета 313 г на 1 л НОЖ и вновь проводили центрифугирование при тех же параметрах, и после удаления флотирующих в солевой плотности жира и липопротеидов, получали 2-ю фракцию. Раствор полипептидов подкисляли путем пропускания через раствор полипептидов углекислого газа, до рН=4,0-4,2, с последующим отделением осадка полипептидов центрифугированием, получали 3-ю фракцию.Dry ammonium sulfate was added to the KNO to 50% saturation at the rate of 313 g per 1 liter of KNO and centrifugation was again carried out at the same parameters, and after removal of fat and lipoproteins floating in salt density, a 2nd fraction was obtained. The solution of the polypeptides was acidified by passing carbon dioxide through the solution of polypeptides to pH = 4.0-4.2, followed by centrifugation of the polypeptide precipitate, and a third fraction was obtained.
Осадок растворяли в дистиллированной воде до насыщенного состояния. Раствор полипептидов подвергали хроматографированию (фиг.1) на колонке с сефадексом G-50 уравновешенной дистиллированной водой, при скорости 8 мл / 15 мин. Хроматограмма была всегда представлена двумя пиками: 1 пик балластные белки, 2 пик выходил в зоне рибонуклеазы (масса 13700 Д) это 4-я фракция, представляющий собой «Тимозин Т».The precipitate was dissolved in distilled water to a saturated state. The polypeptide solution was chromatographed (FIG. 1) on a Sephadex G-50 column with equilibrated distilled water at a rate of 8 ml / 15 min. The chromatogram was always represented by two peaks: 1 peak, ballast proteins, 2 peak exited in the ribonuclease zone (13700 D mass); this is the 4th fraction, which is Timosin T.
Раствор «Тимозина Т» (4-я фракция) в концентрации 1 мг/мл пропускали в стерильных условиях через фильтр, разливали в стерильные флаконы по 1 мл и подвергали лиофилизации, закрывали стерильными пробками с дюралевым колпачком. (Фильтрация - стерилизация проводилась через фильтр Cellulose Acetate 0,2 мкм фирмы Sartorius W Germany. Флаконы с раствором Тимозина замораживали в жидком азоте, помещали в колбу лиофильной сушки и проводили лиофилизацию при -50°С и вакууме 10 мкм Hg.A solution of Timosin T (4th fraction) at a concentration of 1 mg / ml was passed under sterile conditions through a filter, poured into sterile 1 ml vials and subjected to lyophilization, closed with sterile plugs with a duralumin cap. (Filtration - sterilization was carried out through a Cellulose Acetate 0.2 μm filter from Sartorius W Germany. Vials with Timosin solution were frozen in liquid nitrogen, placed in a lyophilized drying flask and lyophilized at -50 ° C and a vacuum of 10 μm Hg.
Выход вещества 4-ой фракции (Тимозина), после хроматографии, по предлагаемому способу составляет 1000 мг на 1 кг сырья.The yield of substance of the 4th fraction (Timosin), after chromatography, according to the proposed method is 1000 mg per 1 kg of raw material.
На фиг.2 представлена диаграмма воздействия «Тимозина Т» и иммуностимулятора, полученного по способу прототипа «Тимозин Р» на цитотоксическую активность мононуклеарных клеток здоровых доноров к линии опухолевых клеток К562, где виден примерно одинаковый дозазависимый эффект, а при концентрации вещества 100 мкг/мл эффект нашего препарата выше, чем у прототипа.Figure 2 presents a diagram of the effects of "Timosin T" and an immunostimulant obtained by the method of the prototype "Timosin P" on the cytotoxic activity of healthy donor mononuclear cells to the K562 tumor cell line, where approximately the same dose-dependent effect is seen, and at a substance concentration of 100 μg / ml the effect of our drug is higher than that of the prototype.
На фиг.3 видно, что влияние «Тимозина Т» и препарата прототипа «Тимозина Р» в дозах от 1 мкг/мл до 100 мкг/мл на пролиферативную активность мононуклеарных клеток здоровых доноров в среднем одинаково.Figure 3 shows that the effect of "Timosin T" and the preparation of the prototype "Timosin R" in doses from 1 μg / ml to 100 μg / ml on the proliferative activity of healthy blood donor mononuclear cells is on average the same.
На фиг.4 и 5 показано влияние «Тимозина Т» и препарата прототипа «Тимозина Р» на митогенез и индекс стимуляции митогенеза мононуклеарных клеток здоровых доноров, где видно, что в дозе 100 мкг/мл эффект нашего препарата превосходит действие прототипа.Figures 4 and 5 show the effect of Timosin T and the preparation of the prototype Timosin R on mitogenesis and mitogenesis stimulation index of healthy donor mononuclear cells, where it can be seen that at a dose of 100 μg / ml the effect of our drug is superior to the prototype.
Также в таблицах 1-3 представлены данные по эффективности действия «Тимозина Т».Also in tables 1-3 presents data on the effectiveness of the action of "Timosin T".
Как следует из результатов тестовых испытаний иммуностимулятор, полученный по предлагаемому способу, обладает более высокой активностью с дозазависимым эффектом, чем препарат, выделенный по способу-прототипу.As follows from the results of test tests, the immunostimulant obtained by the proposed method has a higher activity with a dose-dependent effect than the drug isolated by the prototype method.
Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным, за счет изменения технологической цепочки, позволяет выделять до 1000 мг иммуностимулятора из 1 кг сырья (при 280 мг по способу-прототипу) с более высокой биологической активностью. В результате исключения из способа получения «Тимозина Т» органических растворителей ацетона, метанола и ТРИС солевых буферных растворов возможно использование «Тимозина Т» в парентеральном лечении больных.Thus, the proposed method in comparison with the known, due to changes in the technological chain, allows you to allocate up to 1000 mg of an immunostimulant from 1 kg of raw materials (at 280 mg according to the prototype method) with higher biological activity. As a result of the exclusion from the method of producing “Timosin T” of organic solvents of acetone, methanol and TRIS salt buffers, it is possible to use “Timosin T” in parenteral treatment of patients.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005132190/15A RU2295963C1 (en) | 2005-10-18 | 2005-10-18 | Method for producing immunostimulator |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005132190/15A RU2295963C1 (en) | 2005-10-18 | 2005-10-18 | Method for producing immunostimulator |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2295963C1 true RU2295963C1 (en) | 2007-03-27 |
Family
ID=37999079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005132190/15A RU2295963C1 (en) | 2005-10-18 | 2005-10-18 | Method for producing immunostimulator |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2295963C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8143218B2 (en) | 1998-07-30 | 2012-03-27 | Regenerx Biopharmaceuticals, Inc. | Treatment of skin, and wound repair, with thymosin beta 4 |
| RU2533253C2 (en) * | 2008-12-18 | 2014-11-20 | Апосайенс Аг | Pharmaceutical preparation containing supernatant of blood mononuclear cell culture |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0080518A1 (en) * | 1981-11-26 | 1983-06-08 | Ollendiek, Heinrich, Dr. med. | Thymus extraction process |
| FR2583982A1 (en) * | 1985-07-02 | 1987-01-02 | Peda G Le | MEDICINAL PRODUCT OBTAINED FROM THYMUS AND METHOD OF OBTAINING THE SAME |
| SU1218521A1 (en) * | 1980-06-16 | 1994-06-30 | В.Г. Морозов | Method of obtaining polypeptides |
| SU1112606A1 (en) * | 1982-04-27 | 1996-08-20 | Ленинградское производственное объединение мясной промышленности им. С.М.Кирова | Method of preparing immunostimulating agent from thymus gland |
| RU2149006C1 (en) * | 1998-06-19 | 2000-05-20 | Внуков Владислав Анатольевич | Method for producing immunomodulator agents |
-
2005
- 2005-10-18 RU RU2005132190/15A patent/RU2295963C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1218521A1 (en) * | 1980-06-16 | 1994-06-30 | В.Г. Морозов | Method of obtaining polypeptides |
| EP0080518A1 (en) * | 1981-11-26 | 1983-06-08 | Ollendiek, Heinrich, Dr. med. | Thymus extraction process |
| SU1112606A1 (en) * | 1982-04-27 | 1996-08-20 | Ленинградское производственное объединение мясной промышленности им. С.М.Кирова | Method of preparing immunostimulating agent from thymus gland |
| FR2583982A1 (en) * | 1985-07-02 | 1987-01-02 | Peda G Le | MEDICINAL PRODUCT OBTAINED FROM THYMUS AND METHOD OF OBTAINING THE SAME |
| RU2149006C1 (en) * | 1998-06-19 | 2000-05-20 | Внуков Владислав Анатольевич | Method for producing immunomodulator agents |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8143218B2 (en) | 1998-07-30 | 2012-03-27 | Regenerx Biopharmaceuticals, Inc. | Treatment of skin, and wound repair, with thymosin beta 4 |
| RU2533253C2 (en) * | 2008-12-18 | 2014-11-20 | Апосайенс Аг | Pharmaceutical preparation containing supernatant of blood mononuclear cell culture |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5048673B2 (en) | A kind of extract that prevents or treats thrombotic diseases | |
| SU1442064A3 (en) | Method of producing extract possessing immunomodulating action from animal raw material | |
| CN87104312A (en) | Plant extract of oleander and its preparation method and application | |
| US20070010430A1 (en) | Proteoglycan isolated from cartilaginous fish and process for producing the same | |
| RU2041717C1 (en) | Biologically active remedy, method for its producing, preparation containing the mentioned remedy and its application method | |
| JPH0247966B2 (en) | ||
| US4239498A (en) | Method of preparing thymic factors and composition | |
| JPH03503530A (en) | Human tumor therapeutic drug and its manufacturing method | |
| WO2009088314A1 (en) | Method for producing a biologically active complex exhibiting neuroregenerative and neuroprotective activity | |
| RU2295963C1 (en) | Method for producing immunostimulator | |
| RU2275924C2 (en) | Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof | |
| CN106432407A (en) | Method for extracting bio-polypeptides | |
| CN106729601A (en) | Placental lipo-glucosaminoglycan, polypeptide bigeminy immunopotentiator and preparation method thereof | |
| RU2041715C1 (en) | Biologically active remedy, method for its producing, preparation containing the mentioned remedy and method for applying the preparation | |
| RU2149006C1 (en) | Method for producing immunomodulator agents | |
| CN101167755B (en) | Preparation method and application of centipede polysaccharide protein complex with anti-tumor activity | |
| US5114722A (en) | Medicament from peyer's patches | |
| RU2562581C1 (en) | Method of producing biologically active agent from sea cucumber, having general tonic and immunomodulating properties | |
| RU2560845C1 (en) | Method for producing low-molecular activated embryonic complex (nika-em) | |
| US5840342A (en) | Shark liver extract for stimulating the immune system | |
| SU1158201A1 (en) | Method of obtaining stimulator from mammalia spleen | |
| CN102212109B (en) | Bone polypeptide compound separated from ossotide injection and application thereof | |
| RU2038087C1 (en) | Method for obtaining a substance influencing proliferation and differentiation of human keratinocytes from pig skin | |
| RU2155068C1 (en) | Method of preparing substance stimulating antigen-nondepending differentiation of b-lymphocytes | |
| RU2320354C2 (en) | Method for obtaining hemopoiesis-affecting immunostimulating thymic polypeptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161019 |