RU2275924C2 - Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof - Google Patents
Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2275924C2 RU2275924C2 RU2004124910/15A RU2004124910A RU2275924C2 RU 2275924 C2 RU2275924 C2 RU 2275924C2 RU 2004124910/15 A RU2004124910/15 A RU 2004124910/15A RU 2004124910 A RU2004124910 A RU 2004124910A RU 2275924 C2 RU2275924 C2 RU 2275924C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptides
- extraction
- carried out
- target product
- precipitate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 34
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 230000003925 brain function Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000010606 normalization Methods 0.000 title abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 29
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 24
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 15
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 73
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 29
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 abstract description 4
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 23
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 12
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 4
- 208000036632 Brain mass Diseases 0.000 description 3
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 238000012371 Aseptic Filling Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 101150092110 gfh1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 206010021118 Hypotonia Diseases 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 208000002038 Muscle Hypertonia Diseases 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000003443 Unconsciousness Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 231100001133 acute intoxication condition Toxicity 0.000 description 1
- 231100000570 acute poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000007177 brain activity Effects 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000001627 cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N ctk5a5089 Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000036640 muscle relaxation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940053973 novocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000012346 open field test Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-UHFFFAOYSA-L potassium sodium tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000005092 sublimation method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 208000018726 traumatic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006442 vascular tone Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается выделения биологически активных веществ из органов животных. Выделенный целевой продукт может использоваться в медицине, фармацевтике и ветеринарии как фармацевтическое средство, способное нормализовать функции головного мозга.The invention relates to the pharmaceutical industry and relates to the allocation of biologically active substances from animal organs. The selected target product can be used in medicine, pharmaceuticals and veterinary medicine as a pharmaceutical agent that can normalize brain function.
Известно несколько способов получения биологически активного пептидного препарата из тканей различных участков головного мозга. Все они предусматривают операции гомогенизации ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка и выделение из него целевого продукта (см., например [1], [2], [3], [4[, [5]). Способы различаются условиями проведения операций и веществами, которые используются в процессе проведения операций.Several methods are known for producing a biologically active peptide preparation from tissues of various parts of the brain. All of them include operations of tissue homogenization, acid extraction, separation of the precipitate and isolation of the target product from it (see, for example, [1], [2], [3], [4 [, [5]). The methods differ in the conditions of operations and substances that are used in the process of operations.
В заявке на изобретение РФ №96102207 ([4]) в способ включены также операции замораживания и размораживания сырья.In the application for the invention of the Russian Federation No. 96102207 ([4]) the method also includes operations of freezing and thawing of raw materials.
Известен способ получения препарата [6] из коры головного мозга убойных животных, обладающего восстанавливающей активностью при нарушении функций головного мозга, который включает все указанные выше операции. Исходное сырье (ткань, содержащая серое вещество полушарий головного мозга) обрабатывают ацетоном при температуре от -10 до -4°С и соотношении ткани мозга и ацетона 1:5 в течение 18-30 ч, далее проводят операции гомогенизации и экстрагирования гомогената 2-4%-ным раствором уксусной кислоты в течение 48-72 ч при рН 3,5-4,5 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,6-1,2 г/л и при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:(8-4), центрифугирования, осаждения биологически активных веществ ацетоном при температуре от -3 до -5°С и соотношении супернатанта и ацетона 1:(7-5) и ионообменной хроматографии полученного осадка на катионите "Биокарб". В результате ионообменной хроматографии получают фракцию, содержащую щелочные полипептиды, которые обладают стимулирующим (или восстанавливающим при снижении активности мозга) действием на клетки коры головного мозга.A known method of obtaining the drug [6] from the cerebral cortex of slaughter animals, which has restoring activity in violation of the functions of the brain, which includes all of the above operations. The feedstock (tissue containing gray matter of the cerebral hemispheres) is treated with acetone at a temperature of -10 to -4 ° C and a ratio of brain tissue to acetone of 1: 5 for 18-30 hours, then homogenization and extraction of homogenate 2-4 are carried out % solution of acetic acid for 48-72 hours at a pH of 3.5-4.5 in the presence of zinc chloride at a concentration of 0.6-1.2 g / l and with a ratio of homogenate and acetic acid solution of 1: (8- 4), centrifugation, deposition of biologically active substances with acetone at a temperature of from -3 to -5 ° C and the ratio of super atant and acetone 1: (7-5) and ion-exchange chromatography of the obtained precipitate on Biocarb cation exchange resin. As a result of ion exchange chromatography, a fraction is obtained containing alkaline polypeptides that have a stimulating (or restoring with decreasing brain activity) effect on the cells of the cerebral cortex.
Однако описанный известный способ не позволяет извлечь из коры головного мозга кислые и нейтральные полипептиды и получить биологически активные вещества, обладающие другим действием (например, противосудорожной активностью).However, the described known method does not allow to extract acidic and neutral polypeptides from the cerebral cortex and to obtain biologically active substances with a different effect (for example, anticonvulsant activity).
Наиболее близким решением к предлагаемому является способ по патенту РФ №2104702 [7]. В соответствии с патентом ткань головного мозга замораживают при -40°С, измельчают, экстрагируют раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка 30-48 ч при 10-15°С, обрабатывают ацетоном, после высушивания надосадка порошок растворяют в дистиллированной воде рН 5,5-6,5 при 18-22°С, удаляют вещества с мол. м. более 15000 Да. В результате получают фармацевтическое средство, содержащее в качестве активного начала выделенный целевой продукт в виде комплекса биологически активных полипептидов с мол.м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5.The closest solution to the proposed one is the method according to the patent of the Russian Federation No. 2104702 [7]. In accordance with the patent, brain tissue is frozen at -40 ° C, crushed, extracted with acetic acid solution in the presence of zinc chloride for 30-48 hours at 10-15 ° C, treated with acetone, after drying the supernatant, the powder is dissolved in distilled water, pH 5.5 -6.5 at 18-22 ° C, remove substances from mol. m. more than 15,000 Yes. The result is a pharmaceutical agent containing, as an active principle, an isolated target product in the form of a complex of biologically active polypeptides with a mol.m. from 500 to 15000 Yes and an isoelectric point of 3.5-9.5.
Однако в результате многочисленных опытов были выявлены недостатки данного способа, устранение которых позволило повысить процент выхода готовой продукции из обработанного сырья и повысить ее качество.However, as a result of numerous experiments, the disadvantages of this method were identified, the elimination of which allowed to increase the percentage of finished products from processed raw materials and to improve their quality.
Задача предлагаемого решения состоит в повышении качества и процента выхода целевого продукта.The objective of the proposed solution is to improve the quality and percentage of yield of the target product.
Сущность заявляемого способа получения препарата состоит в том, что кору больших полушарий головного мозга убойных животных замораживают, замороженную ткань гомогенизируют, проводят экстракцию гомогената раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:5, сепарируют, обрабатывают надосадочную жидкость ацетоном, промывают образовавшийся осадок ацетоном, высушивают осадок, проводят экстракцию полипептидов из высушенного порошка водой для инъекций с последующей фильтрацией, стерилизацией и лиофилизацией целевого продукта, но в отличие от известных способов часть операций изменена. Для производства используют кору головного мозга скота до 12-месячного возраста. Операцию замораживания ткани мозга осуществляют при температуре не выше -18°С. Замороженную кору головного мозга используют не ранее чем через 2 месяца и не позднее чем через 8 месяцев. Экстракцию полипептидов из высушенного порошка осуществляют водой для инъекций в два этапа. На первом этапе экстрагирование высушенного осадка проводят водой для инъекций при рН 5,5-6,5 и температуре 18-22°С в течение 30 минут, полученный экстракт отделяют от осадка центрифугированием, после отделения экстракта из оставшегося осадка проводят повторное экстрагирование полипептидов в течение 20 мин при тех же условиях, первичный и вторичный экстракты объединяют и подвергают дальнейшей обработке.The essence of the proposed method for producing the drug is that the cerebral cortex of slaughtered animals is frozen, the frozen tissue is homogenized, the homogenate is extracted with a solution of acetic acid containing zinc chloride at a concentration of 1.2 g / l at a weight ratio of homogenate and acetic acid solution 1 : 5, they are separated, the supernatant is treated with acetone, the precipitate formed is washed with acetone, the precipitate is dried, polypeptides are extracted from the dried powder with water for injection. tions followed by filtration sterilization and lyophilization the desired product, but in contrast to known methods of the operations is changed. For production, cattle cerebral cortex is used up to 12 months of age. The operation of freezing brain tissue is carried out at a temperature not exceeding -18 ° C. Frozen cerebral cortex is used no earlier than after 2 months and no later than after 8 months. The extraction of the polypeptides from the dried powder is carried out with water for injection in two stages. At the first stage, the extraction of the dried precipitate is carried out with water for injection at pH 5.5-6.5 and a temperature of 18-22 ° C for 30 minutes, the obtained extract is separated from the precipitate by centrifugation, after separation of the extract from the remaining precipitate, polypeptides are repeatedly extracted for 20 min under the same conditions, the primary and secondary extracts are combined and subjected to further processing.
Фармацевтическое средство для нормализации функций головного мозга содержит в качестве активного начала целевой продукт, полученный предложенным способом и представляющий собой комплекс биологически активных полипептидов с мол.м. 500-15000 Дальтон, изоэлектрической точкой 3,5-9,5 и максимумом поглощения в УФ-спектре при длине волны 275±6 нм.A pharmaceutical agent for normalizing brain functions contains, as an active principle, the target product obtained by the proposed method and which is a complex of biologically active polypeptides with mol.m. 500-15000 Daltons, an isoelectric point of 3.5-9.5 and a maximum absorption in the UV spectrum at a wavelength of 275 ± 6 nm.
Таким образом, в заявляемом способе, в отличие от известного, часть операций изменена и введены новые операции выделения целевого продукта. Для производства используют кору головного мозга скота до 12-месячного возраста. Операцию замораживания ткани мозга осуществляют при температуре не выше -18°С. Замороженную кору головного мозга используют не ранее чем через 2 месяца и не позднее чем через 8 месяцев. Экстракцию полипептидов из высушенного порошка осуществляют водой для инъекций в две стадии. На первой стадии экстракцию проводят при рН 5,5-6,5 и температуре 18-22°С 30 минут. После отделения экстракта проводят вторую стадию экстрагирования полипептидов из осадка водой для инъекций при тех же условиях в течение 20 минут.Thus, in the inventive method, in contrast to the known, part of the operations is changed and new operations of isolating the target product are introduced. For production, cattle cerebral cortex is used up to 12 months of age. The operation of freezing brain tissue is carried out at a temperature not exceeding -18 ° C. Frozen cerebral cortex is used no earlier than after 2 months and no later than after 8 months. The extraction of the polypeptides from the dried powder is carried out with water for injection in two stages. In the first stage, the extraction is carried out at a pH of 5.5-6.5 and a temperature of 18-22 ° C for 30 minutes. After separation of the extract, a second stage of extraction of the polypeptides from the precipitate with water for injection is carried out under the same conditions for 20 minutes.
Использование предлагаемого режима замораживания обеспечивает более глубокое промораживание тканей мозга, способствующее более эффективному уничтожению вредных микробов и микроорганизмов, которые могут находиться в сырье. Подобный режим замораживания легче проконтролировать, что позволит повысить качество сырья. Кроме того, он соответствует современному обеспечению холодильными установками скотобоен.Using the proposed freezing mode provides a deeper freezing of brain tissue, contributing to a more effective destruction of harmful microbes and microorganisms that may be in the raw material. Such a freezing mode is easier to control, which will improve the quality of raw materials. In addition, it corresponds to the modern supply of slaughterhouses with refrigeration units.
Таким образом, подобный режим замораживания позволяет получить сырье для производства целевого продукта в большем объеме, так как производств с морозильными камерами в этих пределах замораживания больше, чем производств с камерами глубокого замораживания.Thus, such a freezing regime allows obtaining raw materials for the production of the target product in a larger volume, since there are more productions with freezers within these freezing limits than productions with deep-freezing chambers.
Проведение экстракции полипептидов в два этапа обеспечивает существенное повышение процента выхода целевого продукта. Как показали испытания, на первой стадии экстрагирования нужный комплекс полипептидов мог быть получен только в объеме не более 8%, а после второго этапа экстрагирования количество нужных полипептидов увеливается до 37%.The extraction of polypeptides in two stages provides a significant increase in the percentage of yield of the target product. As tests have shown, in the first stage of extraction, the desired complex of polypeptides could be obtained only in a volume of no more than 8%, and after the second stage of extraction, the number of desired polypeptides increases to 37%.
Целевой продукт представляет собой лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета и содержит комплекс биологически активных полипептидов. При добавлении растворителя препарат умеренно растворим в воде, 0,9%-ном растворе NaCl, 0,25-0,5%-ном растворе новокаина. Раствор препарата прозрачен. Цвет раствора не превышает эталон 56 (ГФХ1, с.194-197).The target product is a lyophilized powder of white or white with a yellowish tint and contains a complex of biologically active polypeptides. When a solvent is added, the drug is sparingly soluble in water, 0.9% NaCl, 0.25-0.5% novocaine. The solution of the drug is clear. The color of the solution does not exceed standard 56 (GFH1, p.194-197).
Изобретение иллюстрируется примером конкретного выполнения способа. Исходное количество головного мозга 1 кг. Ткань мозга очищают от сгустков крови, жировой клетчатки, промывают водой и укладывают на поддон слоем не выше 40-50 мм. В течение часа сырье должно поступить на заморозку. Указанная высота слоя сырья должна обеспечить однородность промораживания. Замораживают сырье при температуре не выше -18°С и хранят не менее 2-х месяцев при температуре также не выше -18°С, но не более 8-ми месяцев, что обеспечивает глубину промерзания и эффективность уничтожения вредных элементов и повышает качество сырья.The invention is illustrated by an example of a specific implementation of the method. The initial amount of the brain is 1 kg. The brain tissue is cleaned of blood clots, fatty tissue, washed with water and laid on a pallet with a layer of no higher than 40-50 mm. Within an hour, the raw materials should be frozen. The specified height of the layer of raw materials should ensure uniformity of freezing. Raw materials are frozen at a temperature not higher than -18 ° C and stored for at least 2 months at a temperature also not higher than -18 ° C, but not more than 8 months, which ensures the freezing depth and the efficiency of destruction of harmful elements and improves the quality of raw materials.
Далее сырье подвергают гомогенизации до получения гомогенной массы с помощью мясорубки (измельчителя или дробилки) и проводят экстракцию 3%-ным раствором уксусной кислоты (рН 3,5), содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении измельченной массы и раствора уксусной кислоты 1:5. Массу постоянно перемешивают при охлаждении до t= от 7 до 16°С в течение 48 ч. Такой режим обеспечивает полноту извлечения биологически активных веществ. По окончании процесса экстрагирования дают осесть основной массе диспергированной ткани, а экстракт подают на сепаратор.Next, the raw material is subjected to homogenization to obtain a homogeneous mass using a meat grinder (grinder or grinder) and extraction is carried out with a 3% solution of acetic acid (pH 3.5) containing zinc chloride at a concentration of 1.2 g / l at a mass ratio of ground mass and acetic acid solution 1: 5. The mass is constantly stirred while cooling to t = from 7 to 16 ° C for 48 hours. This mode ensures the completeness of the extraction of biologically active substances. At the end of the extraction process, the bulk of the dispersed tissue is settled and the extract is fed to a separator.
На сепараторе происходит освобождение экстракта от балластных веществ. Используется режим сепаратора от 1000 до 2000 об/мин.On the separator, the extract is released from the ballast substances. The separator mode is used from 1000 to 2000 rpm.
Осветленный и очищенный на сепараторе экстракт поступает в реактор, где его обрабатывают ацетоном при t=-3-5°C и массовом соотношении экстракта и ацетона 1:5. Смесь перемешивают и оставляют на 4 часа для формирования осадка.The extract clarified and purified on a separator enters the reactor, where it is treated with acetone at t = -3-5 ° C and the mass ratio of the extract and acetone is 1: 5. The mixture is stirred and left for 4 hours to form a precipitate.
Полученный осадок промывают охлажденным ацетоном до тех пор, пока осадок не приобретет светло-серый или белый цвет (примерно 2-4 раза), что зависит от наличия жира в сырье. Затем осадок протирают через металлическое сито, сушат при t=35°C до остаточной влажности не более 10% и получают порошок.The resulting precipitate is washed with chilled acetone until the precipitate acquires a light gray or white color (approximately 2-4 times), which depends on the presence of fat in the feed. Then the precipitate is wiped through a metal sieve, dried at t = 35 ° C to a residual moisture content of not more than 10% and a powder is obtained.
Порошок засыпают в 200 мл очищенной воды или воды для инъекций (рН 6,5) при t=18-22°С и в течение 30 мин смесь перемешивают. Происходит экстракция полипептидов из порошка. Жидкая составляющая смеси содержит нужный комплекс пептидов, но как показали исследования, их удельный вес составляет всего 8%. Для увеличения выхода целевого продукта проводят второй этап экстрагирования полипептидов из порошка. С этой целью полученный в результате экстракт отделяют от осадка центрифугированием, переливают его в емкость, а из осадка проводят вторую стадию экстрагирования. Осадок заливают водой для инъекций при t=18-22°С и перемешивают в течение 20 мин. Фильтрат, полученный в результате этой дополнительной операции, содержит около 37% нужных пептидов. Первичный и вторичный экстракты объединяют и подвергают их операциям очистки.The powder is poured into 200 ml of purified water or water for injection (pH 6.5) at t = 18-22 ° C and the mixture is stirred for 30 minutes. The extraction of polypeptides from the powder occurs. The liquid component of the mixture contains the desired complex of peptides, but studies have shown that their specific gravity is only 8%. To increase the yield of the target product, the second stage of extraction of the polypeptides from the powder is carried out. For this purpose, the resulting extract is separated from the precipitate by centrifugation, poured into a container, and the second extraction stage is carried out from the precipitate. The precipitate is poured with water for injection at t = 18-22 ° C and stirred for 20 minutes. The filtrate obtained as a result of this additional operation contains about 37% of the desired peptides. The primary and secondary extracts are combined and subjected to their purification operations.
Объединенный экстракт очищают от высокомолекулярных белков с молекулярной массой более 15000 Да методом ультрафильтрации на мембранах. В очищенный раствор добавляют глицин (аминоуксусную кислоту) для стабилизации раствора и предотвращения гидролиза. Далее проводят операцию стерилизующей фильтрации путем пропускания раствора через мембрану с отверстиями не более 0,22 мм, чем достигается удаление микроорганизмов.The combined extract is purified from high molecular weight proteins with a molecular weight of more than 15,000 Yes by ultrafiltration on membranes. Glycine (aminoacetic acid) is added to the purified solution to stabilize the solution and prevent hydrolysis. Next, a sterilizing filtration operation is carried out by passing the solution through a membrane with openings of not more than 0.22 mm, thereby removing microorganisms.
Очищенный раствор разливают по флаконам без крышек или с негерметично закрепленными крышками и замораживают до t=-45-55°С, снижая температуру постепенно в течение 24 часов от +20°С до -55°С. Далее следует операция сублимационной сушки (на современном оборудовании обе операции совмещены), и получается целевой продукт в виде порошка. Флаконы с порошком герметизируют.The purified solution is poured into vials without caps or with leaking caps and frozen to t = -45-55 ° C, lowering the temperature gradually over 24 hours from + 20 ° C to -55 ° C. Then follows the operation of freeze-drying (on modern equipment, both operations are combined), and the target product is obtained in the form of a powder. Powder vials are sealed.
Для сравнения известного и заявляемого способов предлагаем рассмотреть примеры производства целевого продукта указанными способами.To compare the known and the claimed methods, we propose to consider examples of the production of the target product by these methods.
Известный способ (прототип).A known method (prototype).
Для производства одной серии продукта при известном способе для экстракции в одну стадию используется объем воды для инъекций V=30 литров, при закладке порошка 120 г/л необходимо 3,6 кг порошка. Экстракцию проводят при рН 5,5-6,5 и температуре Т=18-22°С в течение 1 часа. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием. Проведя все последующие технологические операции (ультрафильтрацию, стерилизующую фильтрацию), в результате получают объем конечного раствора V=26 литров с содержанием основного вещества (комплекс биологически активных полипептидов) от 16 до 17 мг/мл. Далее проводят асептический розлив раствора и сублимационную сушку. Теоретический выход при дозе розлива на флакон 0,6 мл - 43000 флаконов с лиофильно высушенным порошком с номинальным содержанием основного вещества (около 10 мг/флакон).For the production of one series of the product with the known method for extraction in one stage, the volume of water for injection V = 30 liters is used, when laying the powder 120 g / l, 3.6 kg of powder is required. The extraction is carried out at a pH of 5.5-6.5 and a temperature of T = 18-22 ° C for 1 hour. The extract is separated from the precipitate by centrifugation. Having carried out all subsequent technological operations (ultrafiltration, sterilizing filtration), the result is a final solution volume of V = 26 liters with a basic substance content (complex of biologically active polypeptides) from 16 to 17 mg / ml. Next, aseptic filling of the solution and freeze-drying is carried out. The theoretical yield at a dose of 0.6 ml per bottle is 43,000 bottles with freeze-dried powder with a nominal content of the main substance (about 10 mg / bottle).
Заявляемый способ.The inventive method.
Для производства одной серии продукта процесс экстракции осуществляют в две стадии. При этом распределяют общий объем воды для инъекций. Для первой стадии используется объем воды для инъекций V=23 литрам. При закладке порошка 120 г/л необходимо 2,76 кг порошка. Процесс экстракции проводят при Т=18-22°С в течение 30 минут. По окончании первой стадии экстракции проводят процесс центрифугирования, т.е. стандартную операцию отделения экстракта. Образовавшийся экстракт сливают в емкость для продукта, а из осадка проводят вторую стадию экстракции водой для инъекций V=7 литрам при Т=18-22°С в течение 20 минут. После центрифугирования полученный экстракт объединяют с экстрактом, образовавшимся на первой стадии. Проведя процессы ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации, получают объем конечного раствора V=26 литров с содержанием основного вещества (комплекс биологически активных полипептидов) от 19 до 21 мг/мл (в прототипе от 16 до 17 мг/мл). Далее проводят асептический розлив и процесс сублимации. Теоретический выход при дозе розлива 0,5 мл составляет 52000 флаконов с лиофильно высушенным целевым продуктом с номинальным содержанием того же количества основного вещества (около 10 мг/флакон).For the production of one series of product, the extraction process is carried out in two stages. In this case, the total volume of water for injection is distributed. For the first stage, the volume of water for injection V = 23 liters is used. When laying a powder of 120 g / l, 2.76 kg of powder is needed. The extraction process is carried out at T = 18-22 ° C for 30 minutes. At the end of the first extraction stage, a centrifugation process is carried out, i.e. standard extract separation operation. The resulting extract is poured into a container for the product, and the second stage of extraction with water for injection V = 7 liters at T = 18-22 ° C for 20 minutes is carried out from the precipitate. After centrifugation, the extract obtained is combined with the extract formed in the first stage. Having completed the processes of ultrafiltration and sterilizing filtration, the volume of the final solution is V = 26 liters with the content of the main substance (complex of biologically active polypeptides) from 19 to 21 mg / ml (in the prototype from 16 to 17 mg / ml). Next, aseptic filling and the sublimation process are carried out. The theoretical yield at a filling dose of 0.5 ml is 52,000 bottles with freeze-dried target product with a nominal content of the same amount of the main substance (about 10 mg / bottle).
Анализируя результаты, можно отметить, что заявленным способом можно получить из меньшего количества порошка (израсходовано меньше на 0,840 кг) на 9000 флаконов с лиофильно высушенным целевым продуктом больше, чем известным способом. При этом положительным эффектом является тот факт, что для обеспечения номинальной концентрации биологически активных полипептидов во флаконе (около 10 мг), доза розлива целевого продукта, полученного заявленным способом, равна 0,5 мл во флакон против 0,6 мл во флакон продукта, полученного известным способом. Уменьшение дозы позволяет снизить время сушки и энергозатраты на удаление лишней влаги.Analyzing the results, it can be noted that the claimed method can be obtained from a smaller amount of powder (less spent by 0.840 kg) per 9000 bottles with freeze-dried target product more than the known method. A positive effect is the fact that to ensure a nominal concentration of biologically active polypeptides in a vial (about 10 mg), the dose of the target product obtained by the claimed method is 0.5 ml per vial versus 0.6 ml per vial of the product obtained in a known manner. Reducing the dose allows you to reduce the drying time and energy consumption to remove excess moisture.
Целевой продукт представляет собой порошок в количестве 3000-3600 мг белого или белого с желтоватым оттенком цвета. Цвет 1%-ного раствора препарата не превышает эталон 56 (ГФХ1).The target product is a powder in an amount of 3000-3600 mg of white or white with a yellowish tint. The color of a 1% solution of the drug does not exceed the standard 56 (GFH1).
Далее проводят контроль параметров полученного продукта.Next, control the parameters of the resulting product.
Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к 1%-ному раствору препарата 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Сохранение прозрачности раствора подтверждает отсутствие в нем высокомолекулярных белковых компонентов.Testing for the absence of high molecular weight protein components is carried out by adding to a 1% solution of the drug a 10% solution of trichloroacetic acid. Preserving the transparency of the solution confirms the absence of high molecular weight protein components.
Для определения в препарате пептидных связей к 1 мл 1%-ного раствора препарата добавляют биуретовый реактив в количестве 4 мл. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате полипептидных связях. Для приготовления биуретового реактива 0,75 г меди сульфата и 3,0 л натрия (калия) виннокислого растворяют в 250 мл воды. К полученному раствору добавляют 150 мл 10%-ного раствора NaOH и 1 г калия иодида. Затем объем раствора доводят водой до 1000 мл.To determine peptide bonds in a preparation, a 1 ml biuret reagent is added to 1 ml of a 1% solution of the preparation. Staining the solution with violet color indicates the polypeptide bonds present in the preparation. To prepare the biuret reagent 0.75 g of copper sulfate and 3.0 l of sodium (potassium) tartrate are dissolved in 250 ml of water. To the resulting solution was added 150 ml of a 10% solution of NaOH and 1 g of potassium iodide. Then the volume of the solution was adjusted with water to 1000 ml.
Для определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гельхроматографии, изоэлектрического фокусирования и их модификации.To determine the polypeptides and their fractions in the preparation, the methods of ultraviolet spectrophotometry, gel chromatography, isoelectric focusing and their modification are used.
Ультрафиолетовый спектр препарата в воде снимают в области длин волн от 250 до 350 нм. Содержимое 5 флаконов (в одном флаконе вместимостью 5 мл содержится 10 мг биологически активного вещества) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до водной метки. На спектрофотометре снимают УФ-спектр раствора препарата в воде, который дает максимум поглощения при 275±6 нм.The ultraviolet spectrum of the drug in water is recorded in the wavelength region from 250 to 350 nm. The contents of 5 vials (one vial with a capacity of 5 ml contains 10 mg of biologically active substance) is dissolved in a 100 ml volumetric flask and the volume of the solution is adjusted to a water mark. The UV spectrum of a solution of the drug in water is recorded on a spectrophotometer, which gives a maximum absorption at 275 ± 6 nm.
Для характеристики компонентов препарата, полученного заявляемым способом, по заряду и изоэлектрическим точкам (pI) проводят исследование методом изоэлектрического фокусирования. Для этого препарат растворяют в 8 М мочевине, содержащей 3% NP-40 и 10% бета-меркаптоэтанола, и наносят в концентрации 50 мг/мл на пластину Ampholine PAG plate с диапазоном рН 3,5-9,5. Фракционирование препарата проводят на приборе "Multiphor" (LKB, Швеция) в течение 12 ч при напряжении 200 В и t=3°C. Далее гель окрашивают кумасси ярко-синим R-250 и денситометрируют при длине волны 600 нм. Исследование методом изоэлектрического фокусирования показывает, что в состав препарата, полученного заявляемым способом, входят полипептиды с pl от 3,5 до 9,5.To characterize the components of the drug obtained by the claimed method, according to charge and isoelectric points (pI), a study is carried out by isoelectric focusing method. For this, the drug is dissolved in 8 M urea containing 3% NP-40 and 10% beta-mercaptoethanol and applied at a concentration of 50 mg / ml on an Ampholine PAG plate with a pH range of 3.5-9.5. The fractionation of the preparation was carried out on a Multiphor device (LKB, Sweden) for 12 hours at a voltage of 200 V and t = 3 ° C. Next, the gel is stained with Coomassie bright blue R-250 and densitometric at a wavelength of 600 nm. The study by isoelectric focusing shows that the composition of the drug obtained by the claimed method includes polypeptides with pl from 3.5 to 9.5.
Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 ("Pharmacia", Швеция). Для калибровки колонки используют Peptide Molecuar Weight Kit MS III ("Serva", Германия). Установлено, что препарат, полученный заявляемым способом, методом гель-хроматографии может быть разделен на 3 фракции, содержащие полипептиды с мол.м. от 500 до 15000 Дальтон.The molecular weight of the polypeptides included in the preparation is determined by gel chromatography on Sephadex G-25 and G-50 (Pharmacia, Sweden). Peptide Molecuar Weight Kit MS III (Serva, Germany) was used to calibrate the column. It was found that the drug obtained by the claimed method by gel chromatography can be divided into 3 fractions containing polypeptides with mol.m. 500 to 15,000 Daltons.
Таким образом, проведенные испытания подтвердили качественные показатели целевого продукта, аналогичные показателям продукта, полученного по прототипу.Thus, the tests confirmed the quality indicators of the target product, similar to those of the product obtained by the prototype.
Полученный заявляемым способом целевой продукт был проверен на биологическую активность. Биологическую активность продукта оценивают по влиянию на рост нервных элементов или выселяющихся клеток в зоне роста в культуре ткани коры головного мозга куриных эмбрионов. Исследование проводят прижизненно с помощью светового микроскопа. Непосредственно перед испытанием содержимое 1 флакона препарата растворяют в 10 мл питательной среды. Для разведения препарата до концентрации 10 мкг/мл 1 мл полученного раствора переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора питательной средой до метки. 1 мл раствора с концентрацией целевого продукта 10 мкг/мл переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора питательной средой до метки. 20 мл раствора с концентрацией 100 нг/мл переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора питательной средой до метки. Таким образом, получают питательную среду для культивирования культуры ткани, содержащую целевой продукт в концентрации 20 нг/мл. В чашку Петри помещают стекла с коллагеновой подложкой с прикрепленными фрагментами коры головного мозга куриных эмбрионов, заливают приготовленной питательной средой с целевым продуктом в объеме, достаточном для полного покрытия стекол, и культивируют в термостате при температуре (36,7±1)°С в течение (48±2) часов. Параллельно проводят контрольный опыт, внося в чашку Петри с фрагментами культуры ткани питательную среду, не содержащую препарат, в том же объеме.Obtained by the claimed method, the target product was tested for biological activity. The biological activity of the product is evaluated by the effect on the growth of nerve elements or evicted cells in the growth zone in the tissue culture of the cerebral cortex of chicken embryos. The study is carried out in vivo using a light microscope. Immediately before the test, the contents of 1 vial of the drug are dissolved in 10 ml of culture medium. To dilute the drug to a concentration of 10 μg / ml, 1 ml of the resulting solution is transferred into a sterile volumetric flask with a capacity of 100 ml and the volume of the solution is adjusted to the mark with nutrient medium. 1 ml of a solution with a target product concentration of 10 μg / ml was transferred into a 100 ml volumetric flask and the volume of the solution was adjusted to the mark with nutrient medium. 20 ml of a solution with a concentration of 100 ng / ml is transferred into a volumetric flask with a capacity of 100 ml and the volume of the solution is adjusted to the mark with nutrient medium. Thus, a culture medium for tissue culture is obtained containing the target product at a concentration of 20 ng / ml. Glasses with a collagen substrate with attached fragments of the cerebral cortex of chicken embryos are placed in a Petri dish, filled with the prepared nutrient medium with the target product in an amount sufficient to completely cover the glasses, and cultivated in an incubator at a temperature of (36.7 ± 1) ° С for (48 ± 2) hours. In parallel, a control experiment is carried out, introducing into the Petri dish with tissue culture fragments a nutrient-free medium in the same volume.
Для количественной оценки влияния продукта на рост ткани коры головного мозга применяют морфометрический метод.To quantify the effect of the product on the growth of cerebral cortex tissue, the morphometric method is used.
Интенсивность роста ткани коры головного мозга оценивают по величине индекса площади (ИП), который рассчитывается как отношение площади всего фрагмента ткани коры головного мозга, включая периферическую зону роста, к исходной площади фрагмента ткани.The growth rate of the tissue of the cerebral cortex is estimated by the value of the area index (PI), which is calculated as the ratio of the area of the entire tissue fragment of the cerebral cortex, including the peripheral growth zone, to the initial area of the tissue fragment.
За условную единицу площади принимают квадрат окуляр-сетки микроскопа (сторона квадрата при увеличении 3,5×10 равна 150 мкм). Значение ИП выражают в процентах, принимая контрольное значение ИП за 100%.For a conventional unit of area, the square of the microscope eyepiece grid is taken (the side of the square with an increase of 3.5 × 10 is 150 microns). The PI value is expressed as a percentage, taking the reference PI value as 100%.
Препарат считают биологически активным, если ИП ткани коры головного мозга после культивирования с добавлением целевого продукта в концентрации 20 нг/мл не менее чем на 20% больше ИП в контрольной группе, без целевого продукта (Таблица 1).The drug is considered biologically active if the PI of the tissue of the cerebral cortex after cultivation with the addition of the target product at a concentration of 20 ng / ml is not less than 20% more than the PI in the control group, without the target product (Table 1).
Определение биологической активности
Препарат: Целевой продукт, полученный заявленным способом.Table 1
Determination of biological activity
Preparation: The target product obtained by the claimed method.
Результат: увеличение ИП на (2,7-2,1):2,1×100=29%Result: increase in PI by (2.7-2.1): 2.1 × 100 = 29%
Для наглядного подтверждения роста нервных элементов в зоне роста культуры ткани прилагаются фотографические снимки.To visually confirm the growth of nerve elements in the growth zone of tissue culture, photographs are attached.
Для более полной характеристики полученного целевого продукта по заявленному способу были проведены сравнительные испытания с продуктом, полученным по способу, описанному в прототипе. Сравнительные характеристики представлены в таблице 2.For a more complete characterization of the obtained target product according to the claimed method, comparative tests were conducted with the product obtained by the method described in the prototype. Comparative characteristics are presented in table 2.
Представленные в таблице 2 данные демонстрируют, что полученный заявленным способом целевой продукт имеет аналогичные качественные и количественные характеристики, а по некоторым параметрам заявленный продукт превосходит известный.The data presented in table 2 demonstrate that the target product obtained by the claimed method has similar qualitative and quantitative characteristics, and in some parameters the claimed product exceeds the known one.
В процессе работы проводились экспериментальные исследования общей токсичности (острой, подострой и хронической) заявленного целевого продукта. Изучение возможного токсического действия препарата на организм было выполнено ФГУН «Институт токсикологии» в соответствии со следующими нормативными документами:In the process, experimental studies of the general toxicity (acute, subacute and chronic) of the claimed target product were carried out. The study of the possible toxic effects of the drug on the body was carried out by the Institute of Toxicology Federal State Institution of Health in accordance with the following regulatory documents:
«Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств», части 1, 3 (Официальное издание Фармакологического комитета, М., 1985);“Guidance materials on the experimental and clinical study of new drugs”, parts 1, 3 (Official publication of the Pharmacological Committee, M., 1985);
«Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)» (РД 64-126-91, М., 1992);"Rules for the preclinical safety assessment of pharmacological agents (GLP)" (RD 64-126-91, M., 1992);
«Правила доклинической оценки исследований безопасности и эффективности фармакологических веществ» (М., Минздрав РФ, «Ремедиум», 2000, 7-17);“Rules for preclinical assessment of studies of safety and efficacy of pharmacological substances” (M., Ministry of Health of the Russian Federation, “Remedium”, 2000, 7-17);
«Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ»(там же, с.18-24)."Guidelines for the study of the general toxic effects of pharmacological substances" (ibid., P. 18-24).
Цель исследований состояла в определении переносимых токсических доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма животных, а также зависимости токсических эффектов от дозы и длительности применения.The purpose of the research was to determine the tolerable toxic doses of the drug, assess the degree and nature of pathological changes in various organs and systems of the animal organism, as well as the dependence of toxic effects on the dose and duration of use.
Для определения показателей острой токсичности целевой продукт растворяли в воде для инъекций и вводили белым мышам и крысам обоего пола внутримышечно (в/м) в возрастающих дозах по методу Литчфилда-Уилкоксона. Расчеты средних летальных доз проводили по методу В.Б.Прозоровского (Фармакология и токсикология, 1978, №4, с.497-502). Для достижения больших доз препарата введение осуществляли повторно с интервалом 20-30 минут в течение 4 часов. Контрольные животные получали аналогичные по объемам введения растворителя - воды для инъекций.To determine indicators of acute toxicity, the target product was dissolved in water for injection and was administered to white mice and rats of both sexes intramuscularly (IM) in increasing doses according to the Litchfield-Wilcoxon method. Calculations of the average lethal doses were carried out according to the method of V. B. Prozorovsky (Pharmacology and Toxicology, 1978, No. 4, pp. 497-502). To achieve large doses of the drug, administration was repeated at intervals of 20-30 minutes for 4 hours. Control animals received a similar injection volume of solvent - water for injection.
Период наблюдения составлял 14 дней. Регистрируемые показатели: летальность, время гибели, симптоматика отравления, ежедневное наблюдение общего состояния и поведения, взвешивание до введения, на 7 и 14 дни наблюдения, объемы потребления корма и воды (для этого животные помещались в обменные клетки итальянской фирмы «Texnoplast»), вскрытие и макроскопическое исследование всех погибавших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия грызунов осуществлялась передозировкой эфира), определение массовых коэффициентов внутренних органов.The observation period was 14 days. Recorded indicators: mortality, time of death, symptoms of poisoning, daily observation of the general condition and behavior, weighing before administration, on days 7 and 14 of observation, volumes of feed and water consumption (for this the animals were placed in metabolic cages of the Italian company Texnoplast), autopsy and a macroscopic study of all the dead and surviving animals at the end of the study (rodent euthanasia was carried out with an overdose of ether), determination of mass coefficients of internal organs.
Токсичность целевого продукта при в/м введении мышам-самцамTable 3
The toxicity of the target product with a / m introduction to male mice
ЛД50=1064±100 мг/кгLD 50 = 1064 ± 100 mg / kg
Токсичность целевого продукта при в/м введении мышам-самкамTable 4
The toxicity of the target product with a / m introduction to female mice
ЛД50=1190±75 мг/кгLD 50 = 1190 ± 75 mg / kg
Проведенные экспериментальные исследования показали, что целевой продукт при остром введении экспериментальным животным практически не оказывает токсического действия.Experimental studies have shown that the target product with acute administration to experimental animals has virtually no toxic effects.
Результаты токсикометрии, данные некропсии и наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационном периоде острого отравления позволяют отнести препарат к IV классу малотоксичных лекарственных веществ. Состояние переживших острую интоксикацию животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности целевого продукта в дозах, превышающих терапевтические в тысячи раз. Терапевтический индекс препарата составляет порядка 3000 (разовая доза для человека 0,15 мг/кг, а ЛД50 для мышей при в/м введении - порядка 1000 мг/кг).The results of toxicometry, data of necropsy and observation of experimental animals in the post-toxic period of acute poisoning make it possible to classify the drug as class IV low-toxic drugs. The condition of the animals that survived acute intoxication indicates good tolerance and harmlessness of the target product in doses exceeding therapeutic by a factor of thousands. The therapeutic index of the drug is about 3000 (a single dose for a person is 0.15 mg / kg, and LD 50 for mice with i / m administration is about 1000 mg / kg).
Учитывая малую токсичность, показанную в эксперименте при определении острой токсичности, рекомендации нормативных документов Фармакологического комитета и правил GLP для оценки хронической токсичности был выбран период 3 месяца.Given the low toxicity shown in the experiment when determining acute toxicity, recommendations of the regulatory documents of the Pharmacological Committee and GLP rules for the assessment of chronic toxicity was chosen for a period of 3 months.
В опытах на грызунах (крысы обоего пола) целевой продукт вводился в/м ежедневно на протяжении 90 дней в 3 дозах: в 10 раз большей терапевтической для человека - 1,5 мг/кг; максимальной 150 мг/кг (в 1000 раз большей терапевтической для человека, не вызывает гибели у крыс при однократном введении) и промежуточной - 15 мг/кг.In experiments on rodents (rats of both sexes), the target product was administered intramuscularly daily for 90 days in 3 doses: 10 times more therapeutic for humans - 1.5 mg / kg; a maximum of 150 mg / kg (1000 times greater than therapeutic for humans, does not cause death in rats with a single injection) and an intermediate - 15 mg / kg.
Исследования проводились в соответствии с экспериментальной программой:The studies were carried out in accordance with the experimental program:
Животные - крысы самки, крысы самцы.Animals - female rats, male rats.
Путь введения - внутримышечный.The route of administration is intramuscular.
Дозы: 1 доза - 1,5 мг/кг; 2 доза - 15 мг/кг; 3 доза - 150 мг/кг.Doses: 1 dose - 1.5 mg / kg; 2 dose - 15 mg / kg; 3 dose - 150 mg / kg.
Частота введения - в течение 90 дней.The frequency of administration is within 90 days.
Растворитель - вода для инъекций.The solvent is water for injection.
Число животных - 1 доза - 20 самцов, 20 самок;The number of animals - 1 dose - 20 males, 20 females;
2 доза - 20 самцов, 20 самок;2 doses - 20 males, 20 females;
3 доза - 20 самцов, 20 самок.3 dose - 20 males, 20 females.
Общее количество - 160, из них 40 - контрольная группа.The total number is 160, of which 40 are the control group.
В процессе эксперимента проводили оценку следующих показателей: общее состояние, взвешивание, потребление воды, гематологические, биохимические исследования, физиологические исследования, макроскопическое исследование и взвешивание внутренних органов, гистологические исследования.During the experiment, the following indicators were evaluated: general condition, weighing, water consumption, hematological, biochemical studies, physiological studies, macroscopic examination and weighing of internal organs, histological studies.
По итогам исследования было установлено, что целевой продукт у крыс обоих полов в/м один раз в сутки в течение 90 дней в дозах 1,5; 15; 150 мг/кг не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата.According to the results of the study, it was found that the target product in rats of both sexes is IM once a day for 90 days in doses of 1.5; fifteen; 150 mg / kg does not affect the appearance, general condition and behavior of animals, does not adversely affect the biochemical parameters of blood and the basic physiological functions of the body, does not cause pathomorphological changes, which indicates good tolerance and harmlessness of the drug.
Таким образом, целевой продукт, полученный предлагаемым способом, соответствует всем параметрам фармацевтического препарата, полученного способом, предложенным в прототипе. Однако предлагаемый способ обеспечивает более высокий процент выхода готового целевого продукта. А предложенный режим замораживания и ограничение по возрасту животных, мозг которых используется в качестве сырья, исключает наличие в нем вирусов тяжелых заболеваний, а также способствует более эффективному уничтожению вредных микробов и микроорганизмов, что обеспечивает повышение качества сырья и, в конечном итоге, качества получаемой продукции.Thus, the target product obtained by the proposed method meets all the parameters of a pharmaceutical preparation obtained by the method proposed in the prototype. However, the proposed method provides a higher percentage of output of the finished target product. And the proposed freezing regime and age restriction of animals whose brain is used as raw material excludes the presence of serious diseases viruses in it, and also contributes to more efficient destruction of harmful microbes and microorganisms, which ensures an increase in the quality of raw materials and, ultimately, the quality of the products obtained .
Фармацевтическое средство, выполненное на основе заявляемого способа, содержит в качестве активного начала целевой продукт, полученный предложенным способом, и фармацевтически приемлемый компонент. Заявленное фармацевтическое средство представляет собой комплекс биологически активных полипептидов с мол.м. 500-15000 Дальтон, изоэлектрической точкой 3,5-9,5 и максимумом поглощения в УФ спектре при длине волны 275±6 нм.A pharmaceutical agent based on the proposed method contains, as an active principle, the target product obtained by the proposed method and a pharmaceutically acceptable component. The claimed pharmaceutical agent is a complex of biologically active polypeptides with mol.m. 500-15000 Daltons, an isoelectric point of 3.5-9.5 and a maximum absorption in the UV spectrum at a wavelength of 275 ± 6 nm.
Для подтверждения биологической активности заявленного фармацевтического средства и его способности нормализации функций головного мозга были проведены исследования по изучению фармакологической активности на разных моделях.To confirm the biological activity of the claimed pharmaceutical agent and its ability to normalize brain functions, studies have been conducted to study the pharmacological activity in different models.
Модель 1. Острая черепно-мозговая травма (ОЧМТ).Model 1. Acute craniocerebral trauma (BMI).
Для моделирования черепно-мозговой травмы использовалась специальная установка, состоящая из металлической трубки длиной 0,5 м, диаметром 2 см и стального шарика весом 0,03 кг. Для фиксации головы крысы помещались в стандартные домики из плексигласа, в передней части которых находилось отверстие, соответствующее диаметру трубки. Травма наносилась при падении шарика на теменную область черепа животных. После нанесения травмы у крыс наблюдались мышечная релаксация, кратковременная потеря сознания, сопорозное состояние и кратковременные судороги. В течение 30-40 минут у крыс сохранялась атаксия, а рефлекторные реакции были нарушены в течение 1,5-3 часов.To simulate a head injury, a special installation was used, consisting of a metal tube 0.5 m long, 2 cm in diameter and a steel ball weighing 0.03 kg. To fix the head, rats were placed in standard plexiglass houses, in front of which there was an opening corresponding to the diameter of the tube. Injury was caused when the ball fell on the parietal region of the skull of animals. After injury in rats, muscle relaxation, short-term loss of consciousness, soporotic state and short-term cramps were observed. For 30-40 minutes, ataxia persisted in the rats, and reflex reactions were impaired for 1.5-3 hours.
Целевой продукт, полученный заявленным способом, начинали вводить в/м со следующего дня после острой травмы в дозах 1,5 мг/кг 1 раз в день на протяжении 7 дней.The target product obtained by the claimed method, began to be entered in / m from the day after acute injury in doses of 1.5 mg / kg 1 time per day for 7 days.
Об эффективности лечения судили по клинической картине, динамике массы тела, относительной массы головного мозга (таблица 5), функциональному состоянию центральной нервной системы (таблица 6), показателям тканевого дыхания, активности метаболических процессов в головном мозге и гистологической картине мозга.The effectiveness of treatment was judged by the clinical picture, the dynamics of body weight, relative brain mass (table 5), the functional state of the central nervous system (table 6), tissue respiration, metabolic activity in the brain and histological picture of the brain.
Масса тела и относительная масса мозга экспериментальных животных после острой травмы и лечения целевым продуктомTable 5
Body mass and relative brain mass of experimental animals after acute injury and treatment with the target product
В таблице 6 показано состояние при ОЧМТ функций центральной нервной системы (нарушения процессов обучения, памяти, возбуждения и торможения) без лечения и после применения целевого продукта.Table 6 shows the state of the central nervous system functions during disturbances in the brain injury (impaired learning, memory, agitation and inhibition) without treatment and after application of the target product.
Показатели функционального состояния центральной нервной системы (СПП, УРПИ, тест открытого поля) экспериментальных животных при ОЧМТ и лечении целевым продуктомTable 6
Indicators of the functional state of the central nervous system (SPP, passive passive avoidance reaction, open field test) of experimental animals with occlusion and treatment with the target product
УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания.Notes: NGN is a sum-subliminal indicator;
Passive avoidance reaction - a conditioned reflex of passive avoidance.
Из данных таблицы 6 видно, что применение целевого продукта, полученного заявленным способом, способствовало нормализации функций центральной нервной системы.From the data of table 6 it can be seen that the use of the target product obtained by the claimed method, contributed to the normalization of the functions of the central nervous system.
Данные таблицы 7 показывают, что в результате ОЧМТ тонус мышц увеличивался, а величина реакции на механическое раздражение заметно снижалась, что свидетельствует о нарушениях сопряжения рефлекторных процессов в центральной и периферической нервных системах. Применение целевого продукта способствует нормализации периферической нервной системы и мышц.The data in table 7 show that, as a result of the occlusion, muscle tone increased, and the magnitude of the response to mechanical stimulation decreased markedly, which indicates impaired conjugation of reflex processes in the central and peripheral nervous systems. The use of the target product contributes to the normalization of the peripheral nervous system and muscles.
Величина физической выносливости крыс по продолжительности висения (мин) в тесте статической силовой нагрузки собственным весомTable 7
The value of the physical endurance of rats by the duration of hanging (min) in the test of static power load own weight
Вывод: Представленные результаты свидетельствуют о высокой эффективности фармацевтического средства, полученного заявленным способом, при лечении последствий острой черепно-мозговой травмы. Это позволяет рекомендовать его к применению в острый и подострый периоды травматической энцефалопатии.Conclusion: The results presented indicate the high efficiency of the pharmaceutical agent obtained by the claimed method in the treatment of the effects of acute traumatic brain injury. This allows us to recommend it for use in acute and subacute periods of traumatic encephalopathy.
Модель 2. Нарушение мозгового кровообращения.Model 2. Disturbance of cerebral circulation.
Для проведения экспериментальных работ были использованы крысы линии Вистар, самцы в возрасте 3-4 месяца, массой от 185 до 275 г.For experimental work, Wistar rats were used, males aged 3-4 months, weighing 185 to 275 g.
Для проведения исследований было сформировано 2 группы, экспериментальная группа включала 10 животных, в контрольной группе 12 животных.For research, 2 groups were formed, the experimental group included 10 animals, in the control group 12 animals.
В течение 5 дней до начала эксперимента животным контрольной группы вводили 0,9% физиологический раствор внутримышечно, животным экспериментальной группы вводили внутримышечно целевой продукт 1,5 мг/кг.Within 5 days before the start of the experiment, the animals of the control group were injected with 0.9% saline intramuscularly, the animals of the experimental group were injected intramuscularly with the target product of 1.5 mg / kg.
Одновременно производился контроль: масса тела крыс до начала приема препарата и после 5-дневного периода (таблица 8), артериальное давление в бедренной артерии наркотизированных уретаном крыс и частота сердечных сокращений в начале эксперимента (таблица 9).At the same time, control was performed: rat body weight before taking the drug and after a 5-day period (table 8), blood pressure in the femoral artery of urethane anesthetized rats and heart rate at the beginning of the experiment (table 9).
Динамика массы тела экспериментальных животных представлена в таблице 8.The body weight dynamics of experimental animals are presented in table 8.
Изменение массы тела у крыс линии Вистар в процессе применения целевого продуктаTable 8
The change in body weight in Wistar rats during the application of the target product
Достоверных изменений массы тела при применении целевого продукта не отмечено.Significant changes in body weight when using the target product is not marked.
Системное артериальное давление (АД) измерялось прямым инвазивным методом в бедренной артерии наркотизированных уретаном (125 мг/100 г массы тела) крыс посредством электроманометра, АД регистрировалось на ленте самописца.Systemic blood pressure (BP) was measured by a direct invasive method in the femoral artery anesthetized with urethane (125 mg / 100 g body weight) of the rats using an electrometer, blood pressure was recorded on a recorder tape.
Частота сердечных сокращений (ЧСС), уд/минут рассчитывалась по кривой артериального давления для каждой крысы, затем эти данные обрабатывались статистически для каждой группы животных (таблица 9).Heart rate (HR), beats / min, was calculated from the blood pressure curve for each rat, then these data were processed statistically for each group of animals (table 9).
Артериальное давление и частота сердечных сокращений у наркотизированных уретаном крыс, получавших целевой продукт в течение 5 дней перед экспериментомTable 9
Blood pressure and heart rate in urethane-anesthetized rats treated with the desired product for 5 days before the experiment
Из данных таблицы 9 видно, что достоверных различий между контрольной и группой, получавшей целевой продукт, по артериальному давлению нет. Частота сердечных сокращений находилась в пределах нормы.From the data of table 9 it is seen that there are no significant differences between the control and the group receiving the target product in terms of blood pressure. Heart rate was within normal limits.
На следующий день после окончания курса терапии животное взвешивали, наркотизировали внутрибрюшинным введением уретана в дозе 125 мг/100 г массы тела и проводили хирургическую операцию: трахеотомию, выделение и катетеризацию бедренной артерии для прямой регистрации артериального давления (АД), трепанацию теменной части области черепа с последующим удалением твердой мозговой оболочки. Животное фиксировали на специально сконструированном станке и помещали под модифицированный микроскоп, позволяющий сканировать значительную поверхность мозга. Пережатие артерии (окклюзия) проводилось на прямолинейном участке артерии. Эффективность пережатия артерии контролировали визуально. Наблюдению подверглись прямолинейные участки артерий дистальнее места окклюзии перед окклюзией, через 30 и 60 с после восстановления кровотока в данном участке.The day after the end of the course of therapy, the animal was weighed, anesthetized with an intraperitoneal injection of urethane at a dose of 125 mg / 100 g body weight and a surgical operation was performed: tracheotomy, isolation and catheterization of the femoral artery for direct registration of blood pressure (BP), trepanation of the parietal part of the skull region with subsequent removal of the dura mater. The animal was fixed on a specially designed machine and placed under a modified microscope, allowing you to scan a significant surface of the brain. Artery clamping (occlusion) was performed on a rectilinear section of the artery. The effectiveness of artery clamping was monitored visually. The straight sections of arteries distal to the site of occlusion before occlusion were observed, 30 and 60 seconds after restoration of blood flow in this area.
Для оценки изменения степени участия миогенного механизма регуляции в поддержании сосудистого тонуса под влиянием целевого продукта важно оценить вклад вазолидации артерий в общую картину постокклюзионных реакций сосудов мягкой оболочки головного мозга. Для решения вопроса о способности сосудов к ауторегуляции кровотока при прекращении (кратковременном пережатии артерии) и последующем восстановлении кровотока следовало оценить динамику изменения просвета артерий, поэтому наблюдения проводились в течение 1 минуты и показатели снимались на 30-ю и 60-ю секунды после прекращения окклюзии. Данные эксперимента представлены в таблице 10.To assess the change in the degree of participation of the myogenic regulation mechanism in maintaining vascular tone under the influence of the target product, it is important to evaluate the contribution of arterial vasolidation to the overall picture of post-occlusion reactions of the vessels of the soft membrane of the brain. To solve the problem of the ability of blood vessels to autoregulate blood flow upon termination (short-term clamping of the artery) and subsequent restoration of blood flow, the dynamics of changes in the lumen of the arteries should be evaluated, therefore, observations were made for 1 minute and indicators were taken at 30 and 60 seconds after the termination of occlusion. The experimental data are presented in table 10.
В контрольной группе доля расширенных артерий и степень их расширения во всех генерациях примерно одинаковы и через 30 с и через 60 с после окклюзии.In the control group, the proportion of dilated arteries and the degree of their expansion in all generations are approximately the same both after 30 s and 60 s after occlusion.
На фоне введения целевого продукта наблюдалась другая картина. Через 30 секунд после окклюзии степень расширения артерий всех четырех генераций была достоверно в 2,5 раза больше по сравнению с контролем. Доля таковых артерий была достоверно в 1,5 раза больше по сравнению с контролем. Через 60 секунд после окклюзии степень расширения артерий всех генераций практически не изменилась (достоверно выше в 2,5 раза, чем в контроле). Доля расширенных артерий немного уменьшилась (достоверно в 1,5 раза по сравнению со сроком наблюдения 30 секунд), однако оставалась выше в 1,5-2 раза по сравнению с таковым показателем в контрольной группе.Against the background of the introduction of the target product, a different picture was observed. 30 seconds after occlusion, the degree of expansion of the arteries of all four generations was significantly 2.5 times greater compared to the control. The proportion of such arteries was significantly 1.5 times greater compared to the control. 60 seconds after occlusion, the degree of expansion of the arteries of all generations remained virtually unchanged (significantly 2.5 times higher than in the control). The proportion of dilated arteries decreased slightly (significantly 1.5 times compared with the observation period of 30 seconds), but remained 1.5-2 times higher compared to that in the control group.
По итогам проведенных исследований можно сделать следующее заключение: целевой продукт, полученный заявленным способом, обеспечивает стойкое достоверное расширение сосудов всех генераций, не подавляет миогенный тонус артерий. Фармацевтическое средство на основе заявленного способа в равной степени положительно влияет на тонус магистральных и периферических мозговых артерий. На основании этого можно заключить, что указанное средство улучшает кровоток магистральных и периферических сосудов и может применяться в качестве лекарственного средства для профилактики и терапии нарушений мозгового кровообращения.Based on the results of the studies, the following conclusion can be made: the target product obtained by the claimed method provides stable reliable expansion of blood vessels of all generations, does not suppress the myogenic tone of arteries. A pharmaceutical agent based on the claimed method equally positively affects the tone of the main and peripheral cerebral arteries. Based on this, we can conclude that this tool improves the blood flow of the main and peripheral vessels and can be used as a medicine for the prevention and treatment of cerebrovascular disorders.
Таким образом, фармацевтическое средство, выполненное на основе целевого продукта, полученного заявляемым способом, обеспечивает нормализацию функций головного мозга и может найти широкое применение в лечебной практике.Thus, a pharmaceutical product based on the target product obtained by the claimed method provides normalization of brain functions and can be widely used in medical practice.
Источники информацииInformation sources
1. Патент РФ N 2082429, кл. А 61 К 38/16, 1992 г.1. RF patent N 2082429, class. A 61 K 38/16, 1992
2. Патент РФ N 2074726, кл. А 61 К 35/30, 1993.2. RF patent N 2074726, cl. A 61 K 35/30, 1993.
3. Заявка на изобретение РФ N 96107657, кл. А 61 К 35/30.3. Application for the invention of the Russian Federation N 96107657, class. A 61 K 35/30.
4. 3аявка на изобретение РФ N 96102207, кл. А 61 К 35/30.4. 3 application for the invention of the Russian Federation N 96102207, class. A 61 K 35/30.
5. Патент РФ N 2128511, кл. А 61 К 35/30, 1997 г.5. RF patent N 2128511, cl. A 61 K 35/30, 1997
6. Патент РФ №1298979, кл. А 61 К 35/30, 1984 г.6. RF patent No. 1298979, cl. A 61 K 35/30, 1984
7. Патент РФ №2104702, кл. А 61 К 35/30, 1996 г.7. RF patent №2104702, cl. A 61 K 35/30, 1996
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004124910/15A RU2275924C2 (en) | 2004-08-04 | 2004-08-04 | Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004124910/15A RU2275924C2 (en) | 2004-08-04 | 2004-08-04 | Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004124910A RU2004124910A (en) | 2006-01-27 |
| RU2275924C2 true RU2275924C2 (en) | 2006-05-10 |
Family
ID=36047637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004124910/15A RU2275924C2 (en) | 2004-08-04 | 2004-08-04 | Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2275924C2 (en) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2348421C2 (en) * | 2007-03-13 | 2009-03-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава" (ГОУ ВПО "НИЖГМА РОСЗДРАВА") | Brain cortex motoneurons growth stimulator for growing mammal and method of application thereof |
| WO2009088314A1 (en) * | 2007-12-29 | 2009-07-16 | Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Method for producing a biologically active complex exhibiting neuroregenerative and neuroprotective activity |
| WO2012087180A1 (en) * | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorders of an ischaemic or haemorrhagic nature |
| RU2669692C1 (en) * | 2017-08-14 | 2018-10-15 | Павел Андреевич Канаев | Method for producing complex of biologically active peptides with neurotropic activity |
| RU2726854C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-16 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727167C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727159C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727154C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727162C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727586C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-22 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2801151C1 (en) * | 2022-08-15 | 2023-08-02 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Method of obtaining biologically active protein-polypeptide hydrolyzate from brain tissues |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2657784A1 (en) * | 1990-02-05 | 1991-08-09 | Pasteur Institut | CEREBRAL ENDOGENIC FACTOR, PROCESS FOR OBTAINING THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC APPLICATIONS. |
| RU2104702C1 (en) * | 1996-10-16 | 1998-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" | Method of preparing the biologically active polypeptide complex normalizing brain functions from animal raw, pharmacological composition and its using |
| RU2128511C1 (en) * | 1997-02-28 | 1999-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "НИР" | Method of preparing drug used in sicknesses associated with central nervous system functional damages |
| RU2161501C1 (en) * | 2000-06-29 | 2001-01-10 | Санкт-Петербургская Общественная Организация "Санкт-Петербургский Институт Биорегуляции И Геронтологии Сзо Рамн" | Method of preparing peptides showing tissue-specific activity and pharmaceutical composition based on thereof |
| RU2163129C1 (en) * | 2000-06-29 | 2001-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" | Method of preparing animal-origin complex of biologically-active polypeptides exhibiting antioxidant and geroprotection activities, pharmacological agent, and method for utilization thereof |
-
2004
- 2004-08-04 RU RU2004124910/15A patent/RU2275924C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2657784A1 (en) * | 1990-02-05 | 1991-08-09 | Pasteur Institut | CEREBRAL ENDOGENIC FACTOR, PROCESS FOR OBTAINING THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC APPLICATIONS. |
| RU2104702C1 (en) * | 1996-10-16 | 1998-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" | Method of preparing the biologically active polypeptide complex normalizing brain functions from animal raw, pharmacological composition and its using |
| RU2128511C1 (en) * | 1997-02-28 | 1999-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "НИР" | Method of preparing drug used in sicknesses associated with central nervous system functional damages |
| RU2161501C1 (en) * | 2000-06-29 | 2001-01-10 | Санкт-Петербургская Общественная Организация "Санкт-Петербургский Институт Биорегуляции И Геронтологии Сзо Рамн" | Method of preparing peptides showing tissue-specific activity and pharmaceutical composition based on thereof |
| RU2163129C1 (en) * | 2000-06-29 | 2001-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" | Method of preparing animal-origin complex of biologically-active polypeptides exhibiting antioxidant and geroprotection activities, pharmacological agent, and method for utilization thereof |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2348421C2 (en) * | 2007-03-13 | 2009-03-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава" (ГОУ ВПО "НИЖГМА РОСЗДРАВА") | Brain cortex motoneurons growth stimulator for growing mammal and method of application thereof |
| WO2009088314A1 (en) * | 2007-12-29 | 2009-07-16 | Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Method for producing a biologically active complex exhibiting neuroregenerative and neuroprotective activity |
| WO2012087180A1 (en) * | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorders of an ischaemic or haemorrhagic nature |
| RU2477637C2 (en) * | 2010-12-24 | 2013-03-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Method of treating acute ischemic and hemorrhagic cerebrovascular disease |
| EA025027B1 (en) * | 2010-12-24 | 2016-11-30 | Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorder of an ischaemic and haemorrhagic nature |
| RU2669692C1 (en) * | 2017-08-14 | 2018-10-15 | Павел Андреевич Канаев | Method for producing complex of biologically active peptides with neurotropic activity |
| RU2726854C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-16 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727167C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727159C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727154C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727162C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2727586C1 (en) * | 2019-09-17 | 2020-07-22 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Polypeptide composition having property of normalizing cerebral functions |
| RU2801151C1 (en) * | 2022-08-15 | 2023-08-02 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Method of obtaining biologically active protein-polypeptide hydrolyzate from brain tissues |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004124910A (en) | 2006-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2155063C1 (en) | Tetrapeptide stimulating functional activity of neurons, pharmacological agent based on thereof and method of its use | |
| RU2275924C2 (en) | Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof | |
| RU2104702C1 (en) | Method of preparing the biologically active polypeptide complex normalizing brain functions from animal raw, pharmacological composition and its using | |
| Azizi et al. | Improvement of functional recovery of transected peripheral nerve by means of chitosan grafts filled with vitamin E, pyrroloquinoline quinone and their combination | |
| RU2445106C1 (en) | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system disorders of cardiovascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune genesis | |
| WO1990012584A1 (en) | Preparation with an anti-inflammatory, lactogenous and stimulating action, and method of obtaining it | |
| WO2009088314A1 (en) | Method for producing a biologically active complex exhibiting neuroregenerative and neuroprotective activity | |
| CN112639076A (en) | Methods and compositions for promoting cell growth and tissue repair | |
| EP1283047B1 (en) | Method for producing a bioactive substance from blood serum | |
| EA024733B1 (en) | Biologically active protein/polypeptide complex stimulating nervous tissue regeneration, and method for producing same | |
| RU2477637C2 (en) | Method of treating acute ischemic and hemorrhagic cerebrovascular disease | |
| RU2460736C1 (en) | Protein-polypeptide complex (ppc) possessing tissue specific repair and rejuvenating action on skin tissue, method for preparing protein-polypeptide complex possessing tissue specific repair and rejuvenating action on skin tissue, and pharmaceutical composition of ppc possessing antihypoxic, immunomodulatory, tissue specific repair and rejuvenating action on skin tissue and mucous membranes, with rejuvenating effect | |
| Hadjiconstantinou et al. | Treatment with GM1 ganglioside increases rat spinal cord indole content | |
| IL194346A (en) | Tripeptide having a stimulating effect on the regeneration of neurons and pharmaceutical composiions comprising it | |
| RU2485132C2 (en) | Protein-polypeptide complex possessing antihypoxic, tissue-specific reparative action on central and peripheral nervous systems, method for preparing it, and pharmaceutical composition thereof | |
| Taghian et al. | The effect of aerobic training with royal jelly consumption on health related anthropometric markers in an experimental autoimmune encephalomyelitis model | |
| RU2095067C1 (en) | Method of stimulation of repair and trophic processes in organism tissues | |
| RU2701566C1 (en) | Protein-peptide complex having a protective action on the state of tissues of the posterior eye - scleral shell, retina, pigment epithelium, choroid | |
| CN102212109B (en) | Bone polypeptide compound separated from ossotide injection and application thereof | |
| Yang et al. | Insulin with chondroitinase ABC treats the rat model of acute spinal cord injury | |
| RU2771678C1 (en) | Biologically active substance and pharmaceutical composition in the form of sterile aqueous dispersion for conjunctival in the form of drops and subjunctival, para -, retrobulbar injection administration in the conducted therapies of vascular and dysmetabolic ophthalmological diseases | |
| CN117143351B (en) | Zn-MOF for treating spinal cord injury and its preparation method and application | |
| EA003301B1 (en) | Method for preparing a medicament from brain tissue of animal embryo and pharmaceutical composition based thereon | |
| EP4022039B1 (en) | Activated mesenchymal stem cells for use in treating limb ischemia | |
| RU2302871C1 (en) | Brain functions normalizing agent and a method for preparation thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120805 |
|
| BF4A | Cancelling a publication of earlier date [patents] |
Free format text: PUBLICATION IN JOURNAL SHOULD BE CANCELLED |