RU2177035C2 - Способ выделения геномной днк из клеток микроорганизмов - Google Patents
Способ выделения геномной днк из клеток микроорганизмов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2177035C2 RU2177035C2 RU2000104075A RU2000104075A RU2177035C2 RU 2177035 C2 RU2177035 C2 RU 2177035C2 RU 2000104075 A RU2000104075 A RU 2000104075A RU 2000104075 A RU2000104075 A RU 2000104075A RU 2177035 C2 RU2177035 C2 RU 2177035C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- dna
- buffer solution
- suspended
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 16
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 13
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 abstract 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 11
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 9
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 9
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 3
- -1 lauroyl sarcosyl Chemical group 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 244000251953 Agaricus brunnescens Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- BNIYQCLQHWERAB-UHFFFAOYSA-N S1C(C=CC=CC=C1)C(=O)O.NC(=N)N Chemical compound S1C(C=CC=CC=C1)C(=O)O.NC(=N)N BNIYQCLQHWERAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228417 Sarocladium strictum Species 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010056929 lyticase Proteins 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии. Для выделения препаратов ДНК, пригодных для ПЦР, исследуемый образец (клетки дрожжей, грибов и грамположительных микробов) суспендируют в буферном растворе, содержащем соль хаотроп (гуанидинтиоцианат или гуанидинхлорид), восстановитель дисульфидных связей (2-меркаптоэтанол), хелатирующий агент (ЭДТА) и детергент (саркозил) в соответствующих концентрациях, при соотношении буферного раствора к объему клеток микроорганизмов, превышающем 5:1. Суспензию нагревают при температуре кипения воды в течение 3-7 мин, затем клетки осаждают центрифугированием. Супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий геномную ДНК, прочно ассоциированную с клеточными оболочками микроорганизмов, дважды промывают водой и суспендируют в дистиллированной воде или в ТЕ. Полученную суспензию используют непосредственно для ПЦР. Изобретение решает задачу упрощения, удешевления процесса и сокращения времени обработки. 2 з. п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к методам выделения ДНК, и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для получения образцов ДНК из клеток дрожжей, грибов, грамположительных микробов и других микроорганизмов с прочной клеточной стенкой, для последующей ПЦР-амплификации специфических фрагментов микробных ДНК.
Подготовка биологического материала для ПЦР-амплификации предполагает 1) разрушение клеток и освобождение внутриклеточной ДНК, а также 2) по крайней мере, частичную очистку ДНК от белковых, липидных, полисахаридных и прочих примесей, способных ингибировать ДНК-полимеразную реакцию.
Известен способ выделения ДНК, основанный на использовании лизоцима, додецилсульфата натрия, ЭДТА в качестве индукторов лизиса клеточной стенки, с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК изопропанолом [1].
Для разрушения клеточных стенок дрожжей с целью получения образцов высокомолекулярных ДНК наиболее часто используют литические ферменты (зимолиазу, литиказу и др.) [2-3]. Иногда применяют комбинированные подходы (например, клетки дрожжей обрабатывают литическими ферментами в сочетании с замораживанием и оттаиванием [3] или осуществляют механическую деструкцию грибного мицелия и дрожжей с помощью высокоскоростных дезинтеграторов в присутствии хаотропных агентов [4] ). При выделении ДНК клетки дрожжей разрушают также с помощью мелких стеклянных шариков [5]. Описаны также методы разрушения клеток грамположительных микроорганизмов и дрожжей (и выделения из этих клеток ДНК) с помощью обработки последних 3% SDS [6,7].
Вышеперечисленные методы выделения ДНК, однако, достаточно трудоемки, дороги и занимают много времени.
Известен наиболее близкий к заявленному способ выделения ДНК [8], основанный на использовании буферных растворов, содержащих высокие концентрации солей-хаотропов типа гуанидинтиоцианата, способных лизировать оболочки многих грамотрицательных микробов.
Способ осуществляют следующим образом.
Исследуемую пробу (биологический материал, содержащий клетки грамотрицательных микробов, культуру клеток животных и человека, образцы крови, сыворотку крови и т.д.) вносят в буфер, содержащий гуанидинтиоцианат, ЭДТА, тритон Х100 и сорбент нуклеиновых кислот - SiO2. Суспензию инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют. Супернатант выбрасывают, а осадок сорбента с НК промывают дважды отмывающим буфером, содержащим гуанидинтиоцианат, два раза 70% этанолом и 1 раз ацетоном. После удаления ацетона НК элюируют с сорбента путем инкубации с ТЕ буфером при 56oC в течение 10 мин. После этого элюат (супернатант) с ДНК пригоден для постановки ПЦР.
Недостатками прототипа являются:
1. Невозможность использования клеток грамположительных микроорганизмов, дрожжей и грибов, обладающих клеточной стенкой, устойчивой к действию солей- хаотропов.
1. Невозможность использования клеток грамположительных микроорганизмов, дрожжей и грибов, обладающих клеточной стенкой, устойчивой к действию солей- хаотропов.
2. Длительность и значительная трудоемкость выполнения способа.
3. Многокомпонентность используемых растворов и высокая стоимость применяемых реактивов.
Изобретение решает задачу упрощения, удешевления процесса и сокращения времени обработки.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе выделения геномной ДНК из клеток микроорганизмов, включающем обработку клеток буферным раствором, содержащим соль-хаотроп, для выделения ДНК используют микроорганизмы с прочной клеточной стенкой, а обработку проводят при нагревании клеточной суспензии (реакционной смеси) на кипящей водяной бане в течение 3-7 мин.
Установлено, что с помощью буферных растворов, содержащих высокие концентрации солей-хаотропов, из клеток дрожжей и других микроорганизмов с прочной клеточной стенкой можно экстрагировать практически все белки, липиды, полисахариды, значительную часть РНК и все низкомолекулярные соединения. Причем экстракция вышеперечисленных компонентов может быть осуществлена в широком диапазоне температур, включая температурный диапазон, при котором не происходит плавление (денатурация) ДНК. Скорость процесса при этом сильно зависит от температуры. Так, при 100oC процесс завершается в течение нескольких минут (при этой температуре ДНК денатурирует и частично фрагментирует); при 37-45oC процесс завершается в течение нескольких часов, причем ДНК остается интактной двухцепочечной [9].
В присутствии высокой концентрации солей-хаотропов происходит пермеабилизация клеточной оболочки, солюбилизация мембранных структур, полная денатурация всех клеточных белков (в том числе РНКаз и ДНКаз) и полная депротеинизация хромосомных ДНК. В то время как белки, липиды и другие компоненты дифундируют из клетки, хромосомная ДНК из-за своей большой длины (длина хромосомных ДНК во много раз превышает линейные размеры клетки) остается внутри клеточной оболочки.
Другими словами, денатурированная геномная ДНК, получаемая в процессе экстракции солями-хаотропами при температурах выше температуры плавления ДНК, прочно ассоциирована с клеточными оболочками.
Как оказалось, клеточные оболочки с денатурированной ДНК можно непосредственно использовать в ПЦР без предварительной обработки литическими ферментами.
Способ осуществляют следующим образом.
Клетки микроорганизмов выращивают в жидких или на агаризованных питательных средах различного состава. Преимущественно используют богатые питательные среды. Биомассу клеток (конец логарифмической фазы роста) собирают центрифугированием и отмывают от питательной среды холодным буфером с pH, близким к нейтральному и содержащим ЭДТА (от 10 до 50 mM). Клетки суспендируют в буфере для экстракции со значением pH, близким к 8.0, содержащим соль-хаотроп (6-8 М гуанидинхлорид или 4М гуанидинтиоцианат), детергент (0,5% саркозил) и восстановитель дисульфидных связей (10-100 mM меркаптоэтанол). При этом соотношение объема экстракционного буфера к объему клеточного осадка должно превышать 5:1. Оптимальным для дрожжей является соотношение 5:1; для грамположительных микроорганизмов - 20:1.
Для получения образцов денатурированной ДНК для ПЦР-амплификации полученные клеточные суспензии инкубируют на водяной бане (100oC) в течение 3-7 мин (преимущественно 5 мин). Клетки осаждают центрифугированием и дважды промывают дистиллированной (или деионизованной) водой при комнатной температуре. Полученные клеточные оболочки с ДНК суспендируют в стерильной дистиллированной воде (конечная концентрация клеточных оболочек составляет 1х108 - 1х109 в 1 мкл) и используют в ПЦР. В опыт берут 1-2 мкл клеточной суспензии на 50 мкл смеси для ПЦР.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Пример 1. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из дрожжей Shizosaccharomyces pombe.
Клетки дрожжей выращивают в жидкой среде YPD (1,0% дрожжевого экстракта, 2,0% бактопептона, 2,0% глюкозы, pH 5,3) или на чашках с агаризованной средой YPD при 30oC.
Биомассу дрожжей объемом 25-30 мкл суспендируют в 200 мкл экстракционного буфера I (4М гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина), либо в таком же количестве буфера II (4М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозила) в 1,5 мл центрифужных пробирках Eppendorf.
Клеточную суспензию кипятят на водяной бане в течение 5 мин.
Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.
Клеточный осадок суспендируют в 1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.
Проводят повторную промывку клеточного осадка 1000 мкл деионизованной воды.
Клеточный осадок после второй промывки суспендируют в 200 мкл стерильной деионизованной воды.
1-2 мкл клеточной суспензии (т.е. клеточных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq-полимеразу).
Проводят ПЦР. Режим ПЦР - с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.
Пример 2. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из дрожжей Pichia pastoris. (аналитический вариант)
Клетки дрожжей P. pastoris выращивают в жидкой среде YPD вышеприведенного состава или на чашках с агаризованной средой YPD при 30oC.
Клетки дрожжей P. pastoris выращивают в жидкой среде YPD вышеприведенного состава или на чашках с агаризованной средой YPD при 30oC.
Биомассу дрожжей (106-108 клеток) суспендируют в 50 мкл экстракционного буфера Iа (4М гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,5% лауроилсаркозина) в 1,5 мл центрифужных пробирках Eppendorf. Минимальное количество биомассы для анализа - образующий видимый для глаза осадок при центрифугировании.
Клеточную суспензию кипятят на водяной бане в течение 3 мин.
Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.
Клеточный осадок суспендируют в 200 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.
Проводят повторную промывку клеточного осадка 200 мкл деионизованной воды.
Клеточный осадок после второй промывки суспендируют в 5-10 мкл стерильной деионизованной воды.
1-2 мкл клеточной суспензии (т.е. клеточных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq-полимеразу).
Проводят ПЦР. Режим ПЦР - с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.
Пример 3. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из дрожжей Pichia pastoris (препаративный вариант).
Клетки дрожжей P. pastoris выращивают в жидкой среде YPD вышеприведенного состава или на чашках с агаризованной средой YPD при 30oC.
Биомассу дрожжей (25-30 мкл) суспендируют в 50 мкл экстракционного буфера III (6М гуанидинхлорид, 30 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,5% лауроилсаркозина) в 1,5 мл центрифужных пробирках Eppendorf.
Клеточную суспензию кипятят на водяной бане в течение 7 мин.
Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.
Клеточный осадок суспендируют в 1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.
Проводят повторную промывку клеточного осадка 1000 мкл деионизованной воды.
Клеточный осадок после второй промывки суспендируют в 100-200 мкл стерильной деионизованной воды.
1-2 мкл клеточной суспензии (т.е. клеточных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и Taq-полимеразу.
Проводят ПЦР. Режим ПЦР - с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.
Вся процедура подготовки образцов для ПЦР занимает около 15 мин. Причем одновременно можно анализировать несколько десятков образцов (клонов).
Как следует из данных проведенного анализа, в ходе ПЦР-амплификации образуются специфические фрагменты ДНК, которые по своему размеру и структуре полностью соответствуют генам P. pastoris и S. pombe, ограниченных использованными нами праймерами.
При амплификации гена AOXI использовали стандартные праймеры: 5' AOXl sequencing primer - 5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3' и 3' AOXl sequencing primer - 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC 3'. [10].
При амплификации гена rpc 19+ Sz. pombe использовали праймеры: прямой (oGVS324) - 5' CGGGATCCACTTTAGACATGGCGGC 3' и обращенный (oGVS325) - 5' GGGAATTCATAACCAAATTTATCCATC 3' [11].
Пример 4. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из клеток Staphilococcus aureus.
Клетки грамположительных бактерий Staphilococcus aureus выращивают в полноценной жидкой (например, L-бульон, мясопептонный бульон) или на агаризованной среде (L-агар, мясопептонный агар) при 37oC в течение ночи.
Биомассу клеток объемом 10-20 мкл, полученную центрифугированием жидкой суспензии или снятую с чашки стерильной микробиологической петлей, суспендируют в 200 мкл экстракционного буфера 1 (4М гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина) либо в таком же количестве буфера II (4М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозила) в 1,5 мл центрифузных пробирках Eppendorf.
Клеточную суспензию кипятят на водяной бане в течение 5 мин.
Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.
Клеточный осадок суспендируют в 500-1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.
Проводят повторную промывку клеточного осадка 1000 мкл деионизованной воды.
Клеточный осадок после второй промывки суспендируют в 200 мкл стерильной деионизованной воды. Суспензию клеточных оболочек хранят в замороженном (-20oC) состоянии.
1-2 мкл клеточной суспензии (т.е. клеточных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq-полимеразу).
Проводят ПЦР. Режим ПЦР - с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.
Пример 5. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из мицеллия грибов- шампиньонов.
Для экспериментов культивируемые грибы-шампиньоны Agaricus bisporus приобретали на рынке. Образующие плодовые тела грибы-шампиньоны являются совершенными грибами и относятся к базидиомицетам. Биомассу (мицелий) берут независимо от ножки (Stipe), шляпки (Pilius) и пластинки (Lamellae).
Биомассу (30-40 мкг мицелия) переносят в 1,5 мл центрифужные пробирки Eppendorf и приливают к ней 200 мкл экстракционного буфера I (4М гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0.1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина) либо такое же количество буфера II (4М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина). С помощью специального пластикового пестика Eppendorf мицелий тщательно растирают в течение 1-2 мин и получают гомогенную суспензию. Полученную суспензию кипятят на водяной бане в течение 5 мин.
Мицелий осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.
Мицелиальный осадок суспендируют в 1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.
Проводят повторную промывку мицелиального осадка 1000 мкм деионизованной воды.
Мицелиальный осадок после второй промывки суспендируют в 200 мкл стерильной деионизованной воды. Суспензию хранят при -20oC.
1-2 клеточной суспензии (т.е. мицелиальных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq-полимеразу).
Проводят ПЦР. Режим ПЦР - с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.
Пример 6. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из мицелия несовершенных грибов Acremonium strictum W.Gams.
Мицелий A. stricturn выращивают на чашках с агаризованной средой YPD при 29oС в течение семи суток. На богатой среде (YPD) спорообразование отсутствует.
Биомассу (мицелий) вместе со слоем агара снимают стерильным скальпелем с площади ~1 см2 и переносят в 200 мкл экстракционного буфера I (4М гуанидинтиоцианат, 50мМ трис-HCl, pH 8.0, 5мМ ЭДТА, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина) либо в такое же количестве буфера II (4М гуанидинтиоцината, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозила) в 1,5 мл центрифужных пробирках Eppendorf. Мицелий вместе с остатками агаризованной среды тщательно растирают с помощью пластикового пестика Eppendorf. Супернатант с растворенным агаром выбрасывают, а осадок суспендируют в 200 мкл свежего буфера I или II.
Полученную суспензию кипятят на водяной бане в течение 5 мин.
Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.
Осадок мицелия суспендируют в 1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.
Проводят повторную промывку мицелиального осадка 1000 мкмл деионизованной воды.
Мицелиальный садок после второй промывки суспендируют в 200 мкл стерильной деионизованной воды. Суспензию хранят при -20oC.
1-2 мкл полученной суспензии (т.е. мицелиальных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq- полимеразу).
Проводят ПЦР. Режим ПЦР - с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.
Таким образом, использование солей-хаотропов позволяет осуществить депротеинизацию и очистку ДНК внутри инертной клеточной оболочки и обойтись без литических ферментов и органических растворителей, без механических дезинтеграторов, стеклянных шариков, жидкого азота и т.д., и в течение 15 мин получить образцы ДНК для ПЦР-амплификации.
Источники информации
1. Marmur. J.A. J. Mol. Biol. 1961. 3: 208-218.
1. Marmur. J.A. J. Mol. Biol. 1961. 3: 208-218.
2. Mann W., J.Jeffery. Anal. Biochem. 1989. 178(1): 82-87.
3. Philippsen P., A. Stolz., C.Scherf. Methods in Enzymology. 1991. 194: 169-182.
4. Muller P.M., K.E.Werner, M.Kasai, A.Francesconi, S.J. Chanock, T.J. Walsh. J. Clim. Microbiol. 1998. 36(6): 1625-1629.
5. Hoffman C.S., F.Winston. Gene. 1987. 57(2-3):267-272.
6. Bollet C., M.J.Gevaudan, X. de Lamballerie, C.Zandotti, P. de Micco. Nucl. Acid. Res. 1991.19:1955.
7. Polaina J., A.C.Adam. Nucleic Acid Res. 1991.19(19): 5443.
8. US 5234809, (BOOM; WILLEM, R. (AMSTERDAM; NL); ADRIAANSE; HENRIETTE M. A. (ARNHEM, NL); KIEVITS; TIM (THE HAGUE, NL); LENS; PETER F. (AMSTERDAM, NL)), 10.08.1993, C 12 G 01/68.
10. In: Pichia Expression Kit. A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris. Invitrogen Co. 1997. P.29.
11. Шпаковский Г.В., Е.К.Шематорова. Биоорган. Химия. 1998. 24(12): 933- 937.
Claims (3)
1. Способ выделения геномной ДНК из клеток микроорганизмов, включающий обработку клеток буферным раствором и нагревание реакционной смеси при температуре кипения воды, отличающийся тем, что обработку осуществляют буферным раствором, содержащим соль хаотроп, в качестве которой используют производные гуанидиния в концентрации 4-8М, проводят нагревание реакционной смеси в течение 3-7 мин, затем из реакционной смеси выделяют геномную ДНК, прочно ассоциированную с клеточными оболочками микроорганизмов.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение буферного раствора к объему клеток микроорганизмов превышает 5:1.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения геномной ДНК используют грамположительные микроорганизмы, или дрожжи, или грибы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000104075A RU2177035C2 (ru) | 2000-02-21 | 2000-02-21 | Способ выделения геномной днк из клеток микроорганизмов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000104075A RU2177035C2 (ru) | 2000-02-21 | 2000-02-21 | Способ выделения геномной днк из клеток микроорганизмов |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000104075A RU2000104075A (ru) | 2001-12-10 |
| RU2177035C2 true RU2177035C2 (ru) | 2001-12-20 |
Family
ID=20230818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000104075A RU2177035C2 (ru) | 2000-02-21 | 2000-02-21 | Способ выделения геномной днк из клеток микроорганизмов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2177035C2 (ru) |
-
2000
- 2000-02-21 RU RU2000104075A patent/RU2177035C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗБАРСКИЙ Н.Б. и др. Химия и биохимия нуклеиновых кислот. - Л.: Медицина, 1968, с.115. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7893251B2 (en) | Methods for selective isolation of nucleic acids from microbial cells present in samples containing higher eukaryotic cells and/or tissues | |
| Norgard et al. | Factors affecting the transformation of Escherichia coli strain χ1776 by pBR322 plasmid DNA | |
| US20200239871A1 (en) | Method, lysis solution and kit for selectively depleting animal nucleic acids in a sample | |
| JP3928973B2 (ja) | 細胞成分を単離する方法、装置及び試薬 | |
| WO2018161374A1 (zh) | 一种用于体外蛋白质合成的蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法 | |
| CN102250876A (zh) | 从生物材料中分离纯化rna的方法 | |
| Kuhad et al. | Improving the yield and quality of DNA isolated from white-rot fungi | |
| KR100486179B1 (ko) | 핵산을 분리하고 정제하기 위한 세포 용해 조성물, 방법 및 키트 | |
| Kim et al. | Simple and reliable DNA extraction method for the dark pigmented fungus, Cercospora sojina | |
| RU2177035C2 (ru) | Способ выделения геномной днк из клеток микроорганизмов | |
| ABD‐ELSALAM et al. | A modified DNA extraction minipreparation protocol for Fusarium isolates | |
| CN114703173B (zh) | 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 | |
| Danilevich et al. | A new approach to the isolation of genomic DNA from yeast and fungi: preparation of DNA-containing cell envelopes and their use in PCR | |
| CN110305862B (zh) | 一种从浓香型白酒酒醅中提取总rna的方法 | |
| RU2185440C2 (ru) | Способ выделения геномной днк из клеток микроорганизмов | |
| CN106010981A (zh) | 一株亚硝酸盐降解菌 | |
| RU2807254C1 (ru) | Универсальный способ выделения ДНК и лизирующая смесь для его осуществления | |
| US20090068707A1 (en) | Plasmid dna preparations and methods for producing same | |
| JP5599013B2 (ja) | 血液検体からの微生物核酸の抽出方法 | |
| KR100456284B1 (ko) | 미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법 | |
| RU2410428C1 (ru) | Способ получения фракции из клеток e.coli, обладающей протеолитической активностью | |
| RU2804528C1 (ru) | Способ получения образцов геномной ДНК из клеток микроорганизмов с прочной клеточной стенкой | |
| WO2021046364A1 (en) | Genelight cultures and extracts and applications thereof | |
| RU2317995C2 (ru) | Способ получения ассоциированной с клеточными оболочками денатурированной геномной днк дрожжей или грамположительных бактерий | |
| RU2237719C2 (ru) | Способ получения липополисахаридов |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120222 |