CN110305862B - 一种从浓香型白酒酒醅中提取总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，包括以下步骤：脱腐处理、PBS处理、提取、去除蛋白质、沉淀RNA、清洗RNA和溶解RNA。本发明提取之前进行脱腐处理和PBS处理，减少了大量杂质干扰，进一步通过SDS提取液中酸性水饱和酚的提取效果与SDS的裂解效果相结合有效提取RNA，且β‑巯基乙醇、酸性水饱和酚可共同抑制RNA酶的活性，再借助酸性水饱和酚、氯仿‑异戊醇混合液，使蛋白质变性、沉淀，从而去除蛋白质，最后所得总RNA浓度高、纯度高、完整性好，可用于后续分子生物学实验。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法。
背景技术
白酒作为我国优势传统酿造食品，是粮食精深加工行业及固态酿造产业的典型代表之一，对促进农民增产增收、企业增效、国家增税具有重要意义。浓香型白酒作为四大基本香型白酒之一，处于主导地位，其中酒醅是白酒酿造过程中微生物发酵的主要载体和白酒呈香物质的直接来源。目前对于酒醅中微生物的研究，主要集中在以16S rDNA为基础的微生物群落多样性研究，尽管从DNA水平上已发现酒醅中存在成百上千种微生物，但无法检测其中微生物的活性状态。此外，绝大多数(≈90％)微生物在现有实验条件下很难实现纯培养，进而无法确定上述微生物在白酒酿造中的功能及其对白酒酿造的具体贡献。较之于DNA水平上的微生物研究，以RNA为基础的转录组学研究能更真实地反应微生物在白酒酿造环境中的活性微生物状态，是研究复杂生态体系中的微生物生理功能、物质和能量代谢、代谢关联性及发酵机制的必要手段。
目前关于RNA的提取方法有Trizol法、SDS法、CTAB法和试剂盒法等，Trizol法和试剂盒法提取RNA试验操作简单，是动物组织、细菌、植物等样品提取RNA的首选方法，但对于富含多糖和多酚的材料，尤其是对酒醅这类成分复杂的环境样品不太适用，以Trizol法提取RNA时会存在严重的污染，而试剂盒法提取的RNA则浓度过低、费用较高。同样，采用CTAB法也存在操作复杂耗时、污染严重等不足之处。SDS法虽然试剂简单易配制，但其无法抑制内源性RNase的活性，在提取过程中RNA降解严重，提取效果不佳。同时，上述RNA提取方法均未考虑到样品的复杂性和特殊性，没有进行前期脱腐和除杂处理或是处理太过简单，所以在用于酒醅RNA提取时，所获得的微生物细胞裂解率低，所获RNA不能准确反映原始样品的物种丰度而且产量偏低、污染严重，无法用于后续RT-PCR、cDNA文库建立以及宏转录组学分析等分子生物学实验。因此，寻找一种操作简便、成本低廉且适合于提取酒醅总RNA的方法，提取纯度高和完整性好的RNA，对于利用分子生物学手段研究酒醅中的微生物多样性、功能基因及表达等具有重要意义。
公开号为CN 106047865A的中国专利申请公开了一种从中国白酒发酵酒醅中提取总RNA的方法，该发明针对白酒酒醅样品的特殊性，通过联合月桂酸钠(Sodium Laurate，SL)抽提法以及异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(Trizol)，能在2小时内快速提取群落微生物的总RNA。公开号为CN106480018A的中国专利申请公开了一种RNA提取试剂，由月桂酸钠缓冲液、Trizol提取液和β-巯基乙醇按20：20：1的体积比混合而成；同时该发明提供利用RNA提取试剂提取清香型白酒发酵酒醅总RNA的提取方法，与传统Trizol法相比，该方法在提取发酵酒醅总RNA过程中，加入了月桂酸钠缓冲液和β-巯基乙醇，有效的抑制了酚类物质的氧化，解决了发酵酒醅中腐殖酸、腐殖质及糖类物质的影响，建立了清香型白酒发酵酒醅总RNA的提取方法。虽然上述专利公开了一些酒醅总RNA提取的方法，能够满足一定的需要，但仍存在一定的缺陷：(1)利用上述方法所需的酒醅样品量大，但提取的总RNA含量和纯度(OD260/280)却偏低、电泳检测条带不清晰；(2)利用液氮研磨较难将大样品块彻底打碎，且所需条件苛刻、成本较高。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
(1)脱腐处理：取7g酒醅于离心管中，加入3-8mL 0.8-1.2mol/L的CaCl2溶液和3-8mL 4-6％PVP溶液，涡旋混匀，离心，弃上清；沉淀中加入5-15mL0.04-0.06mol/L的草酸钠溶液，涡旋混匀，离心，弃上清；
(2)PBS处理：步骤(1)处理得到的沉淀中加入10-15mL 0.08-0.12mol/L PBS缓冲液悬浮，加入3-6颗大玻璃珠，涡旋振荡，离心，取上清至新的离心管中，剩余沉淀再洗涤一次，将两次的上清混合，离心，弃去上清，收集细胞沉淀，然后转移至新的离心管中；
(3)提取：步骤(2)处理得到的细胞沉淀中加入0.4-0.6g小玻璃珠，再加入260-330uL SDS提取液，涡旋振荡，然后离心，取上清至新的离心管中；继续在沉淀中加入260-330uL SDS提取液，涡旋振荡，然后离心，取上清和前一步中的上清混合；
(4)去除蛋白质：向步骤(3)得到的上清中加入490-510uL酸性水饱和酚，涡旋混匀，离心，取上清；上清中加入490-510uL氯仿-异戊醇混合液，涡旋混匀，离心，取上清；
(5)沉淀RNA：步骤(4)得到的上清中加入1.8-2.2倍体积的PEG-NaCl混合液，混匀，低温静置1.5-2.5h，离心，弃上清；
(6)清洗RNA：步骤(5)得到的沉淀中加入180-220uL的65-75％乙醇清洗沉淀，离心，弃上清，吹干沉淀；
(7)溶解RNA：在步骤(6)沉淀中加入50uL RNase-free water溶解RNA，低温保存。
优选地，步骤(2)所述的PBS缓冲液悬浮液由NaH2PO4溶液、Na2HPO4溶液和去离子水配制而成。
优选地，步骤(2)所述的大玻璃珠粒径为0.5-0.8cm。
优选地，步骤(3)所述的小玻璃珠由粒径0.4-0.6mm的玻璃珠和粒径为0.1-0.2mm的玻璃珠按重量比1.8-2.2：1混合而成。
优选地，步骤(3)所述的SDS提取液的配制方法为：0.08-0.12g SDS，480-520uLTris-HCl、0.8-1.2mL EDTANa2、90-110uL MgCl2、590-610uL酸性水饱和酚、8-12uLβ-巯基乙醇与无菌水混匀，定容至10mL。
优选地，所述的Tris-HCl浓度为1mol/L，pH为5.0；所述的EDTANa2浓度为0.1mol/L，pH为8.0；所述的MgCl2浓度为1mol/L。
优选地，所述的酸性水饱和酚pH为4.7-5.5。
优选地，步骤(4)中所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为20-30：1。
优选地，步骤(5)所述的PEG-NaCl由NaCl溶液、聚乙二醇和无菌水配制而成。
优选地，所述的PEG-NaCl混合液中聚乙二醇的重量含量为25-35％，NaCl的浓度为1.5-1.8mol/L。
本发明的积极有益效果：
1.本发明步骤(1)CaCl2溶液与酒醅中腐殖质反应生成沉淀可以有效去除腐殖质；PVP溶液可以与多糖多酚形成不可溶的沉淀，在抽提之前就可以把多糖多酚沉淀掉；草酸钠溶液螯合酒醅中多余的钙离子和其他金属离子。步骤(2)在提取前对样品进行PBS缓冲液预处理收集细胞沉淀，去除了样品中除微生物以外的大量杂质如多糖、酸类及固体粮食等。因此，本发明在总RNA提取前排除了酒醅中更多杂质的干扰，有利于后续提取总RNA，有效提高RNA提取质量。
2.本发明步骤(3)中SDS使核蛋白与核酸复合物分离，SDS提取液中含有酸性水饱和酚，有利于RNA被分配于水相，而DNA在有机相，从而达到分离获得RNA的目的，且β-巯基乙醇的加入不仅可以防止酚氧化，其二硫键被打开后还可以将蛋白质的四级或三级结构破坏，通过离心分离，可更佳有效的去除蛋白质，并且β-巯基乙醇、酸性水饱和酚还共同抑制RNase的活性，防止RNA降解，有效提取RNA；步骤(4)酸性水饱和酚和氯仿-异戊醇混合液结合使用，还能使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中将蛋白质分离除去。
3.本发明步骤(5)使用聚乙二醇-氯化钠(PEG-NaCl)进行RNA沉淀，在沉淀前核酸一般带负电，钠离子与之中和，可消除同性电荷的相斥，更易沉淀核酸，而PEG可诱导水溶液中大分子的聚集，所以PEG与NaCl两者结合可使RNA聚集而更易发生沉淀，与使用异丙醇或者乙醇进行沉淀相比，不会将多糖和酚类物质共沉淀下来，进一步排除了酒醅中残余多糖和酚类的干扰，沉淀效果好，无杂质污染。
4.本发明酒醅量多且体积大，步骤(2)中使用大玻璃珠将其破碎，破碎完全，使细胞充分从酒醅里分离出来；细胞体积小，重量少，步骤(3)中使用小玻璃珠破碎法，小玻璃珠破碎法是一种有效的物理裂解方法，可最大限度的裂解细胞，得到高产量的目的RNA，且使用涡旋仪进行涡旋振荡破碎，具有时间短、操作简便及费用低廉的优点。
5.本发明提取之前进行脱腐处理和PBS处理，减少了大量杂质干扰，进一步通过SDS提取液中酸性水饱和酚的提取效果与SDS的裂解效果相结合有效提取RNA，且β-巯基乙醇、酸性水饱和酚可共同抑制RNA酶的活性，再借助酸性水饱和酚、氯仿-异戊醇混合液，使蛋白质变性、沉淀，从而去除蛋白质，所提取RNA的浓度≥627.1ng/uL，且OD260/280和OD260/230≥1.84，所得总RNA浓度高、纯度高、无杂质污染；电泳图中有两条完整的28S和18S核糖体RNA条带，无降解，所得总RNA完整性好，总RNA质量好，便于后续分析实验。
说明书附图
图1为本发明实施例1-3和对比例1-5的方法提取到的RNA进行电泳检测结果图；
其中，泳道1-3分别代表本发明实施例1-3方法所得的RNA，泳道4-8分别代表对比例1-5方法所得的RNA。
图2为本发明实施例1-3和对比例1-5的方法提取到的RNA进行RT-PCR后的电泳检测结果图；
其中，泳道1为阴性对照，泳道2-4分别代表实施例1-3，泳道5-9分别代表对比例1-5。
具体实施方式
下面结合一些具体实施方式，对本发明进一步说明。
预先配制所需溶液：
0.1mol/L PBS缓冲液：21.15mL 1mol/L NaH2PO4和28.85mL 1mol/L Na2HPO4，用去离子水定容至500mL，120℃灭菌25分钟。
SDS提取液：0.1g SDS，500uL Tris-HCl(1mol/L，pH5.0)、1mL EDTANa2(0.1mol/L，pH8.0)、100uL MgCl2(1mol/L)、600uL酸性水饱和酚(pH为4.7-5.5)、10uLβ-巯基乙醇，与适量无菌水混匀，定容至10mL。
PEG-NaCl：3.2mL NaCl(5mol/L)，3g聚乙二醇(PEG-6000)，与适量无菌水混匀，定容至10mL；
所述的PEG-NaCl混合液中聚乙二醇的重量含量为30％，NaCl的浓度为1.6mol/L。
实施例1
酒醅样品取自河南仰韶酒业有限公司。
一种从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
(1)脱腐处理：取7g酒醅于50mL离心管中，加入5mL 1mol/L的CaCl2溶液和5mL 5％PVP溶液，涡旋混匀，8000rpm离心5min，弃上清；沉淀中加入10mL 0.05mol/L的草酸钠溶液，涡旋混匀，8000rpm离心5min，弃上清；
(2)PBS处理：步骤(1)处理得到的沉淀中加入12mL 0.1mol/L PBS缓冲液悬浮，加入3颗大玻璃珠(d＝0.6cm)，涡旋振荡5min，500rpm离心5min，取上清至新的50mL离心管中，剩余沉淀再洗涤一次，两次的上清混合后8000rpm离心3min，弃去上清，收集细胞沉淀，然后转移至2mL离心管中；
(3)提取：步骤(2)处理得到的细胞沉淀中加入0.5g小玻璃珠(0.5mm：0.1mm＝2:1)，再加入300uL SDS提取液，涡旋振荡5min，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清至新的离心管中；继续在沉淀中加入300uL SDS提取液，涡旋振荡，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清和前一步中的上清混合；
(4)去除蛋白质：向步骤(3)上清液中加入500uL酸性水饱和酚(pH为4.7-5.5)，涡旋混匀，15000rpm，4℃，2min离心，取上清；上清中加入500uL氯仿-异戊醇混合液(体积比氯仿：异戊醇＝24：1)，涡旋混匀，15000rpm，4℃，2min离心，取上清；
(5)沉淀RNA：步骤(4)得到的上清中加入2倍体积的PEG-NaCl，混匀，低温静置2h，15000rpm，4℃离心10min，弃上清；
(6)清洗RNA：步骤(5)得到的沉淀中加入200uL 70％乙醇清洗沉淀，15000rpm，4℃，5min离心；
(7)溶解RNA：弃掉乙醇，并吹干沉淀，加入50uL RNase-free water溶解RNA；
(8)检测RNA：将步骤(7)得到的RNA样品置于冰盒中，使用NanoDrop2000和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性，然后-80℃保存备用。
实施例2
酒醅样品取自河南省宋河酒业股份有限公司。
一种从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
(1)脱腐处理：取7g酒醅于50mL离心管中，加入6mL 0.8mol/L的CaCl2溶液和4mL6％PVP溶液，涡旋混匀，8000rpm离心5min，弃上清；沉淀中加入8mL 0.06mol/L的草酸钠溶液，涡旋混匀，8000rpm离心5min，弃上清；
(2)PBS处理：步骤(1)处理得到的沉淀中加入10mL 0.12mol/L PBS缓冲液悬浮，加入4颗大玻璃珠(d＝0.8cm)，涡旋振荡5min，500rpm离心5min，取上清至新的50mL离心管中，剩余沉淀再洗涤一次，两次的上清混合后8000rpm离心3min，弃去上清，收集细胞沉淀，然后转移至2mL离心管中；
(3)提取：步骤(2)处理得到的细胞沉淀中加入0.4g小玻璃珠(0.6mm：0.2mm＝1.8:1)，再加入330uL SDS提取液，在涡旋仪上4000rpm涡旋振荡，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清至新的离心管中；继续在沉淀中加入330uL SDS提取液，在涡旋仪上4000rpm涡旋振荡，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清和前一步中的上清混合；
(4)去除蛋白质：向步骤(3)上清液中加入490uL酸性水饱和酚(pH为4.7-5.5)，涡旋混匀，15000rpm，4℃，2min离心，取上清；上清中加入490uL氯仿-异戊醇混合液(体积比氯仿：异戊醇＝24：1)，涡旋混匀，15000rpm，4℃，2min离心，取上清；
(5)沉淀RNA：步骤(4)得到的上清中加入2.2倍体积的PEG-NaCl，混匀，低温静置2h，15000rpm、4℃离心10min，弃上清；
(6)清洗RNA：步骤(5)得到的沉淀中加入180uL 75％乙醇清洗沉淀，15000rpm，4℃，5min离心；
(7)溶解RNA：弃掉乙醇，并吹干沉淀，加入50uL RNase-free water溶解RNA；
(8)检测RNA：将步骤(7)得到的RNA样品置于冰盒中，使用NanoDrop2000和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性，然后-80℃保存备用。
实施例3
酒醅样品取自河南省百泉春酒业有限公司。
一种从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
(1)脱腐处理：取7g酒醅于50mL离心管中，加入4mL 1.2mol/L的CaCl2溶液和6mL4％PVP溶液，涡旋混匀，8000rpm离心5min，弃上清；沉淀中加入12mL 0.04mol/L的草酸钠溶液，涡旋混匀，8000rpm离心5min，弃上清；
(2)PBS处理：步骤(1)处理得到的沉淀中加入15mL 0.08mol/L PBS缓冲液悬浮，加入5颗大玻璃珠(d＝0.5cm)，涡旋振荡5min，500rpm离心5min，取上清至新的50mL离心管中，剩余沉淀再洗涤一次，两次的上清混合后8000rpm离心3min，弃去上清，收集细胞沉淀，然后转移至2mL离心管中；
(3)提取：步骤(2)处理得到的细胞沉淀中加入0.6g小玻璃珠(0.4mm：0.2mm＝2.2:1)，再加入260uL SDS提取液，在涡旋仪上4000rpm涡旋振荡5min，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清至新的离心管中；继续在沉淀中加入260uL SDS提取液，在涡旋仪上4000rpm涡旋振荡5min，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清和前一步中的上清混合；
(4)去除蛋白质：向步骤(3)上清液中加入510uL酸性水饱和酚(pH为4.7-5.5)，涡旋混匀，15000rpm，4℃，2min离心，取上清；上清中加入510uL氯仿-异戊醇混合液(体积比氯仿：异戊醇＝24：1)，涡旋混匀，15000rpm，4℃，2min离心，取上清；
(5)沉淀RNA：步骤(4)得到的上清中加入1.8倍体积的PEG-NaCl，混匀，低温静置2h，15000rpm、4℃离心10min，弃上清；
(6)清洗RNA：步骤(5)得到的沉淀中加入220uL 65％乙醇清洗沉淀，15000rpm，4℃，5min离心；
(7)溶解RNA：弃掉乙醇，并吹干沉淀，加入50uL RNase-free water溶解RNA；
(8)检测RNA：将步骤(7)得到的RNA样品置于冰盒中，使用NanoDrop2000和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性，然后-80℃保存备用。
对比实施例1
本实施例方法与实施例1基本相同，相同之处不重述，有些不同的是：采用Trizol抽提，将实施例1步骤(3)中的SDS提取液换成Trizol，具体如下：
(3)提取：步骤(2)处理得到的细胞沉淀中加入0.5g小玻璃珠(0.5mm：0.1mm＝2:1)，再加入300uL Trizol，涡旋振荡5min，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清至新的离心管中；继续在沉淀中加入300uL Trizol，涡旋振荡5min，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清和前一步中的上清混合。
对比实施例2
本实施例方法与实施例1基本相同，相同之处不重述，有些不同的是：采用月桂酸钠抽提液提取，将步骤(3)中的SDS提取液换成月桂酸钠抽提液，具体如下：
(3)提取：步骤(2)处理得到的细胞沉淀中加入0.5g小玻璃珠(0.5mm：0.1mm＝2：1)，再加入300uL月桂酸钠抽提液，涡旋振荡5min，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清至新的离心管中；继续在沉淀中加入300uL月桂酸钠抽提液，涡旋振荡5min，然后15000rpm，4℃，2min离心，取上清和前一步中的上清混合；
所述的月桂酸钠抽提液的组成为：25mL月桂酸钠缓冲液[2.5mL Tris-HCl(1mol/L，pH8.0)，0.5mL NaCl(5mol/L)，1mL EDTANa2(0.5mol/L，pH8.0)，0.25g月桂酸钠，加无菌水定容至25mL]，15mL Trizol，1.5mLβ-巯基乙醇，0.5mL二硫苏糖醇。
对比实施例3
酒醅样品取自河南仰韶酒业有限公司，使用常规CTAB法提取酒醅总RNA，具体如下：
(1)称取7g样品于50mL离心管中，用15mL灭菌后的0.1mol/L PBS缓冲液悬浮，加入3颗大玻璃珠(d＝0.6cm)，漩涡振荡5min；500rpm离心5min，取上清，再用PBS缓冲液重复洗涤2次，离心后收集上清；全部上清于9000rpm离心3min，弃去上清，收集细胞沉淀；用1mL0.1mol/L PBS缓冲液溶解细胞沉淀，混匀后转到2mL离心管中，9000rpm离心3min，弃去上清；
(2)在沉淀中加入0.8ml CTAB提取液(等体积的磷酸钾缓冲液与10％CTAB溶液配制)，再加入0.5g小玻璃珠(重量比0.5mm：0.1mm＝2:1)，在FastPrep匀浆仪上以6m/s的速度破碎45s；
(3)16000rpm，4℃，5min离心，取上清；
(4)上清中加入0.5ml苯酚-氯仿-异戊醇混合液(苯酚、氯仿、异戊醇体积比25：24：1)，涡旋混匀，16000rpm，4℃，5min离心，取上清；
(5)上清中加入0.5ml的氯仿-异戊醇混合液(氯仿、异戊醇体积比24：1)，涡旋混匀，16000rpm，4℃，5min离心，取上清；
(6)上清中加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，低温静置2h；
(7)18000rpm，4℃，10min离心，弃上清；
(8)200uL 70％乙醇清洗沉淀，16000rpm，5min；
(9)弃掉液体，并吹干沉淀，加入50uL RNase-free water溶解；
(10)检测RNA：RNA样品置于冰盒中，使用NanoDrop2000和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性，然后-80℃保存备用。
对比实施例4
酒醅样品取自河南仰韶酒业有限公司，使用常规Trizol法提取酒醅总RNA，具体方法如下：
(1)称取7g样品于50mL离心管中，用15mL灭菌后的0.1mol/L PBS缓冲液悬浮，加入3颗大玻璃珠，漩涡振荡5min，500rpm离心5min，取上清，再用PBS缓冲液重复洗涤2次，离心后收集上清，全部上清于9000rpm离心3min，弃去上清，收集细胞沉淀；用1mL 0.1mol/L PBS缓冲液溶解沉淀，混匀后转到2mL离心管中，9000rpm离心3min，弃去上清；
(2)沉淀中加入300uL 20mg/mL溶菌酶，混匀后于37℃作用10min；
(3)接着缓慢加入1mL Trizol试剂，涡旋振荡5min，然后4℃，10000rpm离心10min，取上清；
(4)上清中加入200μL氯仿，涡旋振荡15s后，室温放置2min，4℃，10000rpm离心10min，取上清；
(5)在上清中再次加入200μL氯仿，涡旋振荡15s后，室温放置2min，4℃，10000rpm离心10min，取上清；
(6)上清中加入0.5ml异丙醇，-20℃放置20min，4℃，10000rpm，离心10min，弃上清；
(7)加入200uL 75％乙醇洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心5min，弃上清；
(8)风干沉淀，加入50uL RNase-free water溶解RNA；
(9)检测RNA：RNA样品置于冰盒中，使用NanoDrop2000和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性，然后-80℃保存备用。
对比实施例5
酒醅样品取自河南仰韶酒业有限公司，使用常规SDS法提取酒醅总RNA，具体如下：
(1)称取7g样品于50mL离心管中，用15mL灭菌后的0.1mol/L PBS缓冲液悬浮，加入3颗大玻璃珠，漩涡振荡5min，500rpm离心5min，取上清，再用PBS缓冲液重复洗涤2次，离心后收集上清，全部上清于9000rpm离心3min，弃去上清，收集细胞沉淀；用1mL 0.1mol/L PBS缓冲液溶解沉淀，混匀后转到2mL离心管中，9000rpm离心3min，弃去上清；
(2)向沉淀中加1mL SDS抽提缓冲液(50mmo/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，3％SDS，pH8.0，和本发明实施例1-3的SDS提取液不同)，涡旋振荡15min，将混合物移入冰预冷的10mL玻璃匀浆器中，充分匀浆后，将混合物移入新离心管中，12000r/min，4℃离心5min，收集上清液至离心管中；
(3)上清中加入终浓度2mol/L的醋酸钠，冰上静置10min，12000r/min，4℃离心20min，收集上清液入新离心管中；
(4)上清中加入0.5ml异丙醇，-20℃沉淀1h，12000r/min，4℃离心20min，弃上清；
(5)加入200uL 70％乙醇洗涤沉淀，12000r/min，4℃离心20min，弃去上清，室温干燥沉淀5min，加入50μL DEPC处理的蒸馏水重溶核酸；
(6)检测RNA：RNA样品置于冰盒中，使用NanoDrop2000和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性，然后-80℃保存备用。
对本发明实施例1-3和对比例1-5的方法提取到的RNA进行电泳检测，检测结果见图1。将本发明实施例1-3以及对比实施例1-5得到的总RNA进行浓度和纯度检测，检测结果见下表1。
表1总RNA浓度和纯度检测结果
从表1可以看出，本发明方法所提取RNA的浓度≥627.1ng/uL，且OD260/280和OD260/230≥1.84，所得总RNA浓度高、纯度高、无杂质污染；从图1可以看到RNA电泳检测具有两条完整的28S和18S核糖体RNA条带，所得总RNA完整性好，便于后续分子生物学实验。
从表1和图1可以看出，对比实施例1使用Trizol和对比实施例2使用月桂酸钠抽提液代替本发明方法中的SDS提取液，电泳条带弥散不成型，5S条带过亮，提取出来的RNA有降解情况发生，且OD260/230过低，说明糖酸酚类杂质污染严重，提取效果均不佳；对比实施例3使用常规的CTAB法对于酒醅样品无法提取出RNA；对比实施例4常规Trizol法提取的RNA虽然浓度高，但电泳条带弥散且不完整，杂质污染严重；对比实施例5常规SDS法提取的RNA浓度低，OD260/280和OD260/230均小于1.8，蛋白质和糖酸酚类杂质污染严重，不满足后续实验要求。
分别对本发明实施例1-3和对比实施例1-5提取的总RNA使用Recombinant DNaseI(RNase-free)去除DNA，然后以去除DNA后的总RNA为模板，用PrimeScriptTMⅡ 1st StrandcDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反转录合成cDNA第一链，再以cDNA为模板，使用细菌引物515F和806R进行扩增，对扩增产物进行电泳检测，检测结果见图2。
从图2可以看到本发明提取的RNA经过RT-PCR后电泳的条带清晰完整，提取的总RNA质量好，可满足RT-PCR等分子生物学实验。对比实施例1使用Trizol代替本发明SDS提取液的方法和对比实施例4使用常规Trizol法所提取的RNA进行RT-PCR后电泳条带微弱，反转录后的cDNA浓度低导致扩增效果不佳，无法用于后续分子生物学实验分析；对比实施例2使用月桂酸钠抽提液代替本发明SDS提取液的方法、对比实施例3使用常规CTAB法和对比实施例5使用常规SDS法所提取的RNA均未反转录成功。
Claims (7)
1.一种从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脱腐处理：取7g酒醅于离心管中，加入3-8mL 0.8-1.2mol/L的CaCl2溶液和3-8mL 4-6％PVP溶液，涡旋混匀，离心，弃上清；沉淀中加入5-15mL0.04-0.06mol/L的草酸钠溶液，涡旋混匀，离心，弃上清；
(2)PBS处理：步骤(1)处理得到的沉淀中加入10-15mL 0.08-0.12mol/LPBS缓冲液悬浮，加入3-6颗大玻璃珠，涡旋振荡，离心，取上清至新的离心管中，剩余沉淀再洗涤一次，将两次的上清混合，离心，弃去上清，收集细胞沉淀，然后转移至新的离心管中；
(3)提取：步骤(2)处理得到的细胞沉淀中加入0.4-0.6g小玻璃珠，再加入260-330uLSDS提取液，涡旋振荡，然后离心，取上清至新的离心管中；继续在沉淀中加入260-330uLSDS提取液，涡旋振荡，然后离心，取上清和前一步中的上清混合；
(4)去除蛋白质：向步骤(3)得到的上清中加入490-510uL酸性水饱和酚，涡旋混匀，离心，取上清；上清中加入490-510uL氯仿-异戊醇混合液，涡旋混匀，离心，取上清；
(5)沉淀RNA：步骤(4)得到的上清中加入1.8-2.2倍体积的PEG-NaCl混合液，混匀，低温静置1.5-2.5h，离心，弃上清；
(6)清洗RNA：步骤(5)得到的沉淀中加入180-220uL的65-75％乙醇清洗沉淀，离心，弃上清，吹干沉淀；
(7)溶解RNA：在步骤(6)沉淀中加入50uL RNase-free water溶解RNA，低温保存；
步骤(2)所述的大玻璃珠粒径为0.5-0.8cm；
步骤(3)所述的小玻璃珠由粒径0.4-0.6mm的玻璃珠和粒径为0.1-0.2mm的玻璃珠按重量比1.8-2.2：1混合而成；
步骤(3)所述的SDS提取液的配制方法为：0.08-0.12g SDS，480-520uL Tris-HCl、0.8-1.2mL EDTANa2、90-110uL MgCl2、590-610uL酸性水饱和酚、8-12uLβ-巯基乙醇与无菌水混匀，定容至10mL。
2.根据权利要求1所述的从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PBS缓冲液由NaH2PO4溶液、Na2HPO4溶液和去离子水配制而成。
3.根据权利要求1所述的从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，其特征在于，所述的Tris-HCl浓度为1mol/L，pH为5.0；所述的EDTANa2浓度为0.1mol/L，pH为8.0；所述的MgCl2浓度为1mol/L。
4.根据权利要求1所述的从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，其特征在于，所述的酸性水饱和酚pH为4.7-5.5。
5.根据权利要求1所述的从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为20-30：1。
6.根据权利要求1所述的从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，其特征在于，步骤(5)所述的PEG-NaCl由NaCl溶液、聚乙二醇和无菌水配制而成。
7.根据权利要求6所述的从浓香型白酒酒醅中提取总RNA的方法，其特征在于，所述的PEG-NaCl混合液中聚乙二醇的重量含量为25-35％，NaCl的浓度为1.5-1.8mol/L。
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