RU2121844C1 - Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка - Google Patents
Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2121844C1 RU2121844C1 RU96105216A RU96105216A RU2121844C1 RU 2121844 C1 RU2121844 C1 RU 2121844C1 RU 96105216 A RU96105216 A RU 96105216A RU 96105216 A RU96105216 A RU 96105216A RU 2121844 C1 RU2121844 C1 RU 2121844C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- activity
- preparing
- carbohydrate
- antitumor
- tumor cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000237515 Chlamys nipponensis Species 0.000 title abstract 2
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000237516 Mizuhopecten yessoensis Species 0.000 claims abstract description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 241000237509 Patinopecten sp. Species 0.000 claims description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 7
- 235000020637 scallop Nutrition 0.000 claims description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 14
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 abstract description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 102100027562 39S ribosomal protein L36, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000650297 Homo sapiens 39S ribosomal protein L36, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Приморский гребешок Patinopecten yessoensis облучают ультрафиолетовым излучением в дозе 8,2-8,6 кДж/м2 с последующим его содержанием в естественной среде обитания в течение 22-26 ч. После этого мантию моллюска извлекают из раковины, измельчают, гомогенизируют, затем экстрагируют физраствором, диализуют и лиофилизируют. Способ обеспечивает получение препарата, обладающего противоопухолевой и иммуностимулирующей активностью. 5 табл.
Description
Изобретение относится к биоорганической химии и касается получения биологически активных препаратов из животного сырья.
Как установлено, большинство из известных низкомолекулярных противоопухолевых препаратов являются высокотоксичными иммунодепрессантами, при этом угнетающее иммуногенез действие этих агентов обусловлено повреждением лимфоидной ткани. Напротив, высокомолекулярные полисахариды и гликопротеины, полученные экстракцией из высших растений, грибов, бактерий, водорослей, дрожжей, лишайников и других природных объектов, имеют низкую токсичность и проявляют активность, особенно против имплантируемых твердых опухолей. Однако спектр их противоопухолевых свойств узок, а активность индуцируется организмом в ответ на воздействие биологически активного вещества. Большинство из этих препаратов не показывает прямой цитотоксичности против культивируемых клеток опухоли, что является одной из причин того, почему исследования в этой области не проводились так активно, как это должно было быть [1].
Идеальный противоопухолевый препарат должен был бы обладать избирательной токсичностью по отношению к опухолевым клеткам, но не повреждать при этом клеток лимфоидной системы, которые необходимы для мобилизации защитных сил организма, а также усиливать иммунитет, т.е. проявлять иммуностимулирующую активность.
Известен способ получения противоопухолевого препарата из моллюсков, представляющего собой смесь водорастворимых макромолекулярных гликопротеидов [2]. Сущность способа заключается в том, что из жидкости, оставшейся при варке моллюсков, обычно отбрасываемой как отход, получают концентрат или сухой порошок и из него выделяют целевую гликопротеидную фракцию. Препарат, полученный данным способом, не проявляет иммуностимулирующую активность.
В качестве прототипа выбран способ получения противоопухолевого вещества из приморского гребешка Patinopecten yessoensis, заключающийся в извлечении органов моллюска из раковины, их варке в течение 30 минут, измельчении и гомогенизации в воде в течение 15 минут при 0oC с последующим измельчением на ультразвуковой установке. Полученную смесь центрифугируют, затем супернатант подвергают ультрафильтрации и собирают фракции с молекулярным весом более 300000. Последующая ультрафильтрация фильтрата позволяет получить фракции с молекулярным весом 10000-300000. После сублимационной сушки получают вещество с выходом 0,085% от сырого веса исходного материала. Полученное вещество представляет собой гликопротеид, обладающий противоопухолевой активностью по отношению к имплантируемым мышам опухолям.
Недостатком известного способа является практически полное отсутствие токсичности полученного препарата против опухолевых клеток и отсутствие какого-либо заметного эффекта на иммунную систему организма, вследствие чего рекомендуется повышать эффективность препарата одновременным стимулированием иммунной активности другими средствами, Указанные недостатки снижают достоинства способа.
Задача изобретения - разработать способ, который обеспечил бы получение углевод-белкового комплекса с более высокой противоопухолевой активностью, обладающего также иммуностимулирующей активностью.
Поставленная задача решена тем, что в способе получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка Patinopecten yessoensis, включающем извлечение органов моллюска из раковины, измельчение, гомогенизацию, центрифугирование и выделение целевого продукта, предварительно моллюска облучают ультрафиолетовым излучением в дозе 8,2-8,6 кДж/м2 с последующим его содержанием в естественной среде обитания в течение 22-26 ч, а после гомогенизации осуществляют экстракцию целевого продукта физраствором с последующим его диализом и лиофилизацией.
Полученный препарат, по данным хроматографии и анализа, представляет собой смесь высокомолекулярных водорастворимых гликопротеиновых соединений с молекулярной массой 10-100000 (по данным электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), содержанием углеводов 1-15%, обладающую высокой противоопухолевой и иммуностимулирующей активностями.
В концентрации 0,05 мг/мл он на 55% подавляет рост опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха in vitro по сравнению с 3% в контроле (необлученный гребешок). При концентрации 0,5 мг/мл ингибирование роста опухолевых клеток достигает 85%, причем этот вид активности связан с лизисом опухолевых клеток. При введении в организм мыши в дозе 10 мг препарат усиливает функциональную активность макрофагов, выражающуюся в подавлении на 95% роста опухолевых клеток карциномы Эрлиха, культивируемых in vitro совместно с извлеченными макрофагами. При этом активность препарата, полученного из необлученных моллюсков, в аналогичных испытаниях на 45% ниже.
Препараты, полученные из облученных и контрольных животных, проявляют в этом тесте прямо противоположные свойства: первые - иммуностимуляторов, активирующих макрофаги, вторые - иммунодепрессантов, угнетающих активность макрофагов по отношению к опухолевым клеткам. В концентрации 1-5 мг/мл препараты, полученные из облученных животных, проявляют митогенную активность, что проявляется в стимуляции лимфоцитов в реакции бласттрансформации, средний индекс стимуляции составляет 1,9. Препараты из контрольных необлученных животных угнетают пролиферацию лимфоцитов (средний индекс стимуляции - 0,3).
В указанном диапазоне доз излучения биологическая активность полученных препаратов достигает наибольшей величины. Выбор времени инкубации облученных животных диктовался теми же причинами.
В отличие от пути, по которому поиск средств противоопухолевой защиты сводится к обширному скринингу многочисленных классов веществ синтетического и природного происхождения, в предлагаемом способе для тех же целей используются соединения, образующиеся в процессе естественной защиты организма от повреждающего воздействия излучения.
Предлагаемый способ позволяет получить из доступных видов морского сырья - не используемых в пищу органов промысловых моллюсков (мантия) - препарат, обладающий противоопухолевой и иммуностимулирующей активностями, который может быть использован для стимуляции защитных сил организма при новообразованиях.
Существенное отличие способа состоит в облучении моллюска и непременном обеспечении его жизнедеятельности в течение нескольких часов. Облучение изолированных органов моллюска не приводит к увеличению активности получаемого гликопротеинового препарата.
Способ иллюстрируется следующим примером.
Пример.
Створки раковин приморского гребешка Patinopecten yessoensis закрепляют в полуоткрытом состоянии и через образовавшийся зазор облучают тело животного светом бактерицидной лампы с длиной волны излучения 254 нм на расстоянии 15 см от источника света в воздушной среде в течение 5 мин, что соответствует дозе облучения 8,4 кДж/м2. Облученных и контрольных необлученных животных содержат в естественной среде обитания в течение 24 ч, после чего вскрывают раковины, извлекают мантии, промывают последовательно пресной и дистиллированной водой, измельчают, взвешивают (1,0 кг) и гомогенизируют с 0,9%-ным охлажденным раствором хлорида натрия (соотношение экстрагируемый материал : экстрагент = 1 : 5) в течение 5 мин, затем добавляют 0,9%-ный раствор хлорида натрия в соотношении исходный материал : экстрагент = 1 : 5. Экстракцию проводят при температуре 4-6oC в течение 9-12 ч, периодически перемешивая смесь, после чего отделяют твердые частицы центрифугированием в течение 30-40 мин при 20000 об/мин. Нерастворившийся материал отбрасывают, а осветленный супернатант диализуют через целлофан против дистиллированной воды при температуре 4-6oC до полного удаления хлорид-иона. Диализат центрифугируют при 20000 об/мин и высушивают на лиофильной сушке. Полученный углевод-белковый препарат представляет собой легкий, слегка окрашенный, легко растворимый в воде, буферных и солевых растворах порошок. Выход составляет 1,2% от веса исходного материала.
Выделенный аналогичным способом препарат из контрольного образца служил базой сравнения.
Химический состав опытного и контрольного образцов препарата представлен в табл. 1.
Существенные отличия в составе суммарных экстрактов выявляются при исследовании на аналитической центрифуге. Так, при ультрацентрифугировании в течение 18 мин при 50000 об/мин в физрастворе обнаруживается четко регистрируемый пик в полученном препарате при отсутствии такового в контроле.
Однако самые большие различия обнаруживаются при определении физиологической активности. Противоопухолевая активность полученных препаратов определялась по ингибированию роста опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха в опытах in vitro и in vivo.
Опухолевые клетки асцитной карциномы Эрлиха извлекались шприцeм из перитональной полости мыши-опухоленосителя и суспендировались в культуральной среде RPMJ 1640, дополненной 10%-ной телячьей эмбриональной сывороткой, пенициллином (100 ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл). Жизнеспособность клеток определялась с помощью трипанового синего и составляла во всех опытах не менее 90%. В стерильные пробирки вносилось по 1•105 опухолевых клеток в 1 мл культуральной среды, добавлялись растворы испытуемых веществ и 125J-дезоксиуридин, 0,04МБК (удельная активность препарата 40000 ТБК/моль), после чего пробы инкубировались 4 ч при 37oC в атмосфере влажного воздуха с 5% CO2. По окончании инкубации невключившаяся радиоактивность отмывалась охлажденным 0,9%-ным NaCl, смесь центрифугировалась при 900 об/мин в течение 10 мин, надосадочная жидкость удалялась и радиоактивность осадков подсчитывалась на γ-счетчике.
Уровень радиоактивности осадка служил мерой роста опухолевых клеток. Результаты определений представлены в табл. 2.
Исследование цитостатической активности препарата в зависимости от дозы излучения при инкубации животных в течение 24 ч показало, что максимальное ингибирование опухолевого роста наблюдается в интервале доз 8,2-8,6 кДж/м2, что в условиях эксперимента соответствует 4,5-5,5-минутному времени облучения. При увеличении дозы облучения наблюдается значительный спад цитостатической активности вплоть до практически полной ее потери. При дозах ниже 8,2 кДж/м2 наблюдалась аналогичная картина (табл. 3).
В опытах in vivo определялась опосредованная макрофагами цитостатическая активность препаратов по отношению к опухолевым клеткам. Мышам линии CBA в брюшную полость вводилось известное количество исследуемого вещества в 2 мл физиологического раствора, контрольным - 2 мл физраствора. Через определенные промежутки времени после инъекции мыши умерщвлялись цервикальной дисклокацией, фиксировались на доске и в перитонеальную полость вводилось по 3 мл культуральной среды 199 со 100 ед/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, а также воздух. После массажа брюшной полости в течение 2-3 мин шприцeм отбирались перитонеальные экссудаты, переносились в чашки Петри, где инкубировались при 37oC в течение 1 ч в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% CO2. Не прилипшие клетки снимались с чашек Петри путем трехкратного промывания культуральной средой. Популяция прилипших макрофагов снималась резиновым скребком и использовалась в эксперименте. В стерильные пробирки, разделенные на три серии (а, б, в) вносилось: а) 1•105 опухолевых клеток и 2•106 активированных исследуемым препаратов макрофагов, б) 1•105 опухолевых клеток, в) 2•106 активированных макрофагов. Контролем служили пробы, содержавшие: а) 1•105 опухолевых клеток и 2•106 интактных (не активированных) макрофагов, б) 2•106 интактных макрофагов. Объем смеси в каждой пробирке составлял 1 мл. Пробы инкубировались в культуральной среде, дополненной 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, при 37oC в течение 18-20 ч в атмосфере влажного воздуха с CO2. За 4 ч до окончания инкубации в пробирки вносилось по 0,15 МБК 3H-тимидина. Включение метки в пробах прерывалось путем помещения их на лед и добавкой 5 мл охлажденного физиологического раствора, клетки ресуспендировались и осаждались центрифугированием при 900 об/мин в течение 10 мин. Надосадочные жидкости сливались, после чего к каждой пробе добавлялось по 0,2 мл 0,3N NaOH, смеси нагревались при 70oC в течение 1,5 ч. После охлаждения, аликвоты (50-200 мкл) жидкости из каждой пробирки наносились на пронумерованные диски из фильтровальной бумаги, диски просушивались, затем последовательно проводились через охлажденный 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, промывались дважды этиловым спиртом, эфиром, высушивались и помещались в толуольный сцинтиллятор для подсчета радиоактивности на β-счетчике. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток определялось по формуле:
% ингибирования = (Nоп.кл+Nм-Nсм / Nоп.кл)100,
где
Nоп.кл - скорость счета опухолевых клеток, имп/мин,
Nм - скорость счета макрофагов, имп/мин,
Nсм - скорость счета опухолевых клеток с макрофагами, имп/мин.
% ингибирования = (Nоп.кл+Nм-Nсм / Nоп.кл)100,
где
Nоп.кл - скорость счета опухолевых клеток, имп/мин,
Nм - скорость счета макрофагов, имп/мин,
Nсм - скорость счета опухолевых клеток с макрофагами, имп/мин.
Результаты эксперимента представлены в табл. 4.
Как видно из данных табл. 4, макрофаги, активированные экстрактом облученного гребешка, практически полностью ингибируют опухолевый рост. Экстракты необлученного гребешка оказывают иммунодепрессантное действие и подавляют активность макрофагов в противоопухолевой защите. Таким образом, этот эксперимент доказывает иммуностимулирующие свойства препарата, полученного по предлагаемому способу, и его существенные отличия от прототипа.
Стимуляция лимфоцитов оценивалась в реакции бласттрансформации по общепринятой методике [3]. Препарат, полученный по предлагаемому способу, обладает митогенным действием и в концентрации 1-5 мг/мл стимулирует лимфоциты. Индекс стимуляции составил 1,9 по сравнению с 0,3 по известному способу.
Цитотоксическая активность препаратов оценивалась по окрашиванию трипановым синим клеток асцитной карциномы Эрлиха. Данные определений представлены в табл. 5.
Список литературы
1. Proceeding of the thirol Annual MYT Sea Grant College. Program Zecture and Seminar (ed.by Rita R. et al, W-w-J-Z, 1985, p. 377-388.
1. Proceeding of the thirol Annual MYT Sea Grant College. Program Zecture and Seminar (ed.by Rita R. et al, W-w-J-Z, 1985, p. 377-388.
2. Патент США N 4390468, A 23 J 1/04, C 07 C 7/00, опубл. 28.06.83, "Способ получения противоопухолевого препарата из моллюсков".
3. Патент Японии N 8088/82, A 61 K 35/56, "Антиопухолевое вещество и антиопухолевое средство, эффективным компонентом которого является это вещество.
Claims (1)
- Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка Patinopecten yessoensis, включающий извлечение органов моллюска из раковины, измельчение, гомогенизацию, центрифугирование и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что предварительно моллюска облучают ультрафиолетовым излучением в дозе 8,2 - 8,6 кДж/м2 с последующим его содержанием в естественной среде обитания в течение 22 - 24 ч, а после гомогенизации осуществляют экстракцию целевого продукта физраствором с дальнейшим его диализом и лиофилизацией.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96105216A RU2121844C1 (ru) | 1996-03-18 | 1996-03-18 | Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96105216A RU2121844C1 (ru) | 1996-03-18 | 1996-03-18 | Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96105216A RU96105216A (ru) | 1998-06-10 |
| RU2121844C1 true RU2121844C1 (ru) | 1998-11-20 |
Family
ID=20178188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96105216A RU2121844C1 (ru) | 1996-03-18 | 1996-03-18 | Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2121844C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007041950A1 (fr) * | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Dalian Polytechnic University | Procede d'extraction de du polysaccharide de patinopecten yessoensis |
| EA008645B1 (ru) * | 2004-10-25 | 2007-06-29 | Закрытое Акционерное Общество "Скай Лтд." | Способ получения иммуномодулятора |
| RU2827167C2 (ru) * | 2021-12-30 | 2024-09-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный федеральный университет" (ДВФУ) | Углевод-связывающий белок с антибактериальными свойствами, распознающий кислые галактаны и маннаны, и способ его выделения |
-
1996
- 1996-03-18 RU RU96105216A patent/RU2121844C1/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA008645B1 (ru) * | 2004-10-25 | 2007-06-29 | Закрытое Акционерное Общество "Скай Лтд." | Способ получения иммуномодулятора |
| WO2007041950A1 (fr) * | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Dalian Polytechnic University | Procede d'extraction de du polysaccharide de patinopecten yessoensis |
| RU2827167C2 (ru) * | 2021-12-30 | 2024-09-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный федеральный университет" (ДВФУ) | Углевод-связывающий белок с антибактериальными свойствами, распознающий кислые галактаны и маннаны, и способ его выделения |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2124361C1 (ru) | Способ выделения полисахаридной фракции смолы трагакант из растения рода astragalus, композиция на основе полисахаридной фракции, способ ингибирования роста раковой опухоли, способ ингибирования вирусных инфекций | |
| CN101485655B (zh) | 二氢杨梅素在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用 | |
| Hamrun et al. | Toxicity test of bioactive red alga extract Eucheuma spinosum on shrimp Artemia salina leach | |
| CA1041010A (en) | Process for preparing a curing agent for leukemia | |
| RU2121844C1 (ru) | Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка | |
| KR100990561B1 (ko) | 조류 깃털 및 어류 비늘의 혼합물을 유효성분으로 함유하는세포증식성 질병의 예방 및 치료용 약학적 조성물 | |
| KR20030087724A (ko) | 유해활성산소 및 방사선에 의한 생체손상 억제효과와면역활성 증진효과를 갖는 프로폴리스 함유 복합조성물 및그의 제조방법 | |
| KR100524217B1 (ko) | 알로에 전엽의 이분적 가공방법 | |
| KR100699790B1 (ko) | 댕댕이나무 추출물을 포함하는 간 질환 예방 및 치료효과를 가지는 약제학적 조성물 | |
| JP2003268004A (ja) | エイ軟骨由来コンドロイチン硫酸とその製造方法 | |
| KR101195071B1 (ko) | 별불가사리를 이용한 미백 및 자외선 차단효능을 가지는 수용성 추출물 및 그의 제조방법 | |
| RU2562581C1 (ru) | Способ получения биологически активного средства из голотурий, обладающего общеукрепляющими и иммуномодулирующими свойствами | |
| KR100440863B1 (ko) | 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약추출물 | |
| CN106110312A (zh) | 乌司他丁在制备治疗胆囊癌药物中的用途 | |
| US5840342A (en) | Shark liver extract for stimulating the immune system | |
| KR20010101065A (ko) | 표고버섯 균사체 추출물 유래의 ｌａｋ 활성증강물질 및이를 함유하는 ｌａｋ 활성증강용 제제 | |
| RU2276157C2 (ru) | Полисахарид с иммуностимулирующей активностью, способ его получения и применение | |
| CN115737572B (zh) | 一种胎盘粉及其制备方法 | |
| RU2295963C1 (ru) | Способ получения иммуностимулятора | |
| WO1991001741A1 (en) | Extracts of the acanthospermum hispidum plant | |
| RU2118533C1 (ru) | Средство для лечения облученных млекопитающих | |
| KR100449655B1 (ko) | 조혈 및 면역기능 증강 및 방사선 방호용 기능성 식품 | |
| CN101485791B (zh) | 显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用 | |
| WO2002043740A1 (fr) | Procede de fabrication d'un produit antiviral immunotropique | |
| KR20010089498A (ko) | 표고버섯 균사체 추출물을 함유하는 ｌａｋ 활성스크리닝물질 및 이를 사용한 ｌａｋ 활성스크리닝법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080319 |