RU2118524C1

RU2118524C1 - Method of sulfated glycoseaminoglycans preparing

Info

Publication number: RU2118524C1
Application number: RU96113476A
Authority: RU
Inventors: С.Н. Федоров; С.Н. Багров; Е.В. Ларионов
Original assignee: Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза"
Priority date: 1996-07-02
Filing date: 1996-07-02
Publication date: 1998-09-10

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: agriculture animal corneas are placed in a mixture of equal parts of physiological solution and distilled water at ratio to cornea tissue and an aqueous mixture 1:1, frozen three-fold at 0 C, milled to particle size 0.1 x 0.1 mm and ethanol is added to final concentration 1%. Mixture is homogenized, ethanol is added again to final concentration 5% and boiled for 5-10 min. Method provides preparing the end product at high content of sulfated glycoseaminoglycans and practically no containing protein and other inert substances. EFFECT: improved method of preparing. 1 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а конкретно к офтальмологии, и может быть использовано при приготовлении лекарственных форм для лечения заболеваний и повреждений роговицы глаза. The invention relates to medicine, and specifically to ophthalmology, and can be used in the preparation of dosage forms for the treatment of diseases and injuries of the cornea of the eye.

Известен способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из роговой оболочки глаза, включающий обработку роговицы сельскохозяйственных животных водными растворами и этанолом с последующим кипячением (патент N 2056851). Недостатками способа является обработка роговицы ферментами - папаином, что приводит к разрушению первичной структуры остова ткани и частичной потере гликозаминогликанов, при диализе часть гликозаминогликанов остается в осадке, в частности кератан-сульфат. A known method for the allocation of sulfated glycosaminoglycans from the cornea of the eye, including processing the cornea of farm animals with aqueous solutions and ethanol, followed by boiling (patent N 2056851). The disadvantages of the method is the treatment of the cornea with enzymes - papain, which leads to the destruction of the primary structure of the skeleton of the tissue and a partial loss of glycosaminoglycans, during dialysis part of the glycosaminoglycans remains in the sediment, in particular keratan sulfate.

Задачей изобретения является разработка щадящего способа получения сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ). The objective of the invention is to develop a gentle method for producing sulfated glycosaminoglycans (sGAG).

Техническим результатом изобретения является получение конечного продукта с высоким содержанием сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ), практически лишенного белка и других балластных веществ. The technical result of the invention is to obtain the final product with a high content of sulfated glycosaminoglycans (sGAG), practically devoid of protein and other ballast substances.

Технический результат достигается тем, что в способе получения сГАГ, заключающемся в обработке роговицы сельскохозяйственных животных водными растворами и этанолом с последующим кипячением, согласно изобретению роговицы сельскохозяйственных животных помещают в смесь равных частей физраствора и дистиллированной воды в соотношении роговицы и водной смеси 1:1, трехкратно замораживают при 0^oC, измельчают до частиц размером 0,1•0,1 мм, добавляют этанол до концентрации 1%, гомогенизируют, повторно добавляют этанол до конечной концентрации 5%, после чего кипятят в течение 5-10 мин.The technical result is achieved by the fact that in the method of producing sGAG, which consists in treating the cornea of farm animals with aqueous solutions and ethanol, followed by boiling, according to the invention, the corneas of farm animals are placed in a mixture of equal parts of saline and distilled water in a ratio of 1: 1 of the cornea and aqueous mixture, three times frozen at 0 ^o C, crushed to particles with a size of 0.1 • 0.1 mm, add ethanol to a concentration of 1%, homogenize, re-add ethanol to a final concentration of 5%, p after which boil for 5-10 minutes.

Трехкратное замораживание и размораживание тканей в смеси воды и физраствора позволяет осадить практически все гликозаминогликаны, связанные с белком из межуточного вещества, при этом выход их составляет не менее 95%, последующее измельчение тканей и гомогенизация позволяет увеличить выход сГАГ, интимно связанных с коллагеновым остовом стромы роговицы. Three-fold freezing and thawing of tissues in a mixture of water and saline solution allows precipitation of almost all glycosaminoglycans associated with the protein from the interstitial substance, while their yield is at least 95%, subsequent tissue refinement and homogenization can increase the yield of sGAG intimately associated with the collagen skeleton of the corneal stroma .

Проведенные экспериментальные исследования показали, что при данном способе экстрагируется более 96,5% всех сГАГ роговицы. Experimental studies have shown that with this method, more than 96.5% of all corneal sAGH is extracted.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

К свежим роговицам свиней или крупного рогатого скота добавляют раствор, состоящий из равных частей физраствора и дистиллированной воды, перемешивают стеклянной палочкой, после чего смесь помещают в холодильную камеру, после полного замораживания смеси ее оставляют при комнатной температуре до полного размораживания. данный процесс повторяют еще два раза, после последнего размораживания смесь измельчают механическим способом на ультраизмельчателе фирмы "Aiko" Япония, до частиц 0,1•0,1 мм, после чего добавляют 96,6% этанола до концентрации 1%, смесь гомогенизируют ультраизмельчителем, повторно добавляют 96,6% этанола до конечной концентрации 5%, смесь инкубируют в течение 24 ч, после чего кипятят в течение 5-10 мин. A solution consisting of equal parts of saline and distilled water is added to fresh corneas of pigs or cattle, mixed with a glass rod, after which the mixture is placed in a refrigerator, after the mixture is completely frozen, it is left at room temperature until it is completely thawed. this process is repeated two more times, after the last thawing, the mixture is ground mechanically on an Aiko Japan ultra-grinder, to particles 0.1 • 0.1 mm, after which 96.6% ethanol is added to a concentration of 1%, the mixture is homogenized with an ultra-grinder, 96.6% ethanol is re-added to a final concentration of 5%, the mixture is incubated for 24 hours and then boiled for 5-10 minutes.

Полученный таким образом гомогенат центрифугируют, надосадок сливают, лиофилизируют. В полученном порошке определяют содержание сГАГ известным способом, например по Фарндейлу. The homogenate thus obtained is centrifuged, the supernatant is drained, lyophilized. In the obtained powder, the content of sGAG is determined in a known manner, for example, according to Farndale.

Пример 1. Из глаз свиней острой бритвой вырезают роговицы, отступая 4 мм от лимба, помещают в стеклянный сосуд до массы 1 кг, заливают 1 л дистиллированной воды и физраствора, взятых в соотношении 1:1, перемешивают стеклянной палочкой, после чего смесь помещают в холодильную камеру, после полного замораживания смеси ее оставляют при комнатной температуре до полного размораживания, данный процесс повторяют еще два раза, после последнего размораживания смесь измельчают механическим способом до частиц размеров 0,1•0,1 мм, после чего добавляют 20,0 мл 96,6% этанола, смесь гомогенизируют, повторно добавляют 80 мл 96,6% этанола, смесь инкубируют в течение 24 ч, после чего кипятят в течение 5-10 минут. Полученный гомогенат центрифугируют, надосадок сливают, лиофилизируюте Example 1. From the eyes of pigs, a cornea is cut with a sharp razor, retreating 4 mm from the limbus, placed in a glass vessel to a mass of 1 kg, pour 1 liter of distilled water and saline, taken in the ratio 1: 1, stirred with a glass rod, after which the mixture is placed in the refrigerator, after completely freezing the mixture, leave it at room temperature until completely thawed, this process is repeated two more times, after the last thawing, the mixture is ground mechanically to particles of size 0.1 • 0.1 mm, after which 20.0 m is added l of 96.6% ethanol, the mixture is homogenized, 80 ml of 96.6% ethanol are added repeatedly, the mixture is incubated for 24 hours, after which it is boiled for 5-10 minutes. The resulting homogenate is centrifuged, the supernatant is drained, lyophilized

Claims

The method of producing sulfated glycosaminoglycans, which consists in treating the cornea of farm animals with aqueous solutions and a standard followed by boiling, characterized in that the corneas of farm animals are placed in a mixture of equal parts of saline and distilled water in a 1: 1 ratio of the cornea and the aqueous mixture, frozen three times at 0 ^o C, crushed to particles 0.1x0.1 mm in size, add ethanol to a concentration of 1%, homogenize, re-add ethanol to a final concentration of 5%, after which spots for 5 to 10 minutes