RU2064304C1

RU2064304C1 - Method of preparing bipartial vaccine against myxomatosis and viral hemorrhagic disease in rabbit

Info

Publication number: RU2064304C1
Application number: RU92014927A
Authority: RU
Inventors: А.А. Шевченко; В.П. Князев; А.И. Неверовский; Л.В. Шевченко; Н.В. Малоголовкина; В.В. Зиновьев; М.А. Лавров; Л.В. Бузун
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии
Priority date: 1992-12-28
Filing date: 1992-12-28
Publication date: 1996-07-27

Abstract

FIELD: biotechnology, vaccines. SUBSTANCE: method involves the use of two main components: living vaccine virus of rabbit myxomatosis grown on the primary-trypsinized chick fibroblast cell culture at activity not below 10^4,0 ИД 50/sm³ and inactivated liver suspension prepared after infection with virulent virus of rabbit hemorrhagic disease. Components were mixed at equal parts, stabilized with protective medium at ratio 10:1 and lyophilized. EFFECT: simplified method of vaccine preparing. 4 tbl

Description

Изобретение относится к области технологии, в частности, к способу изготовления бивалентной лиофилизированной вакцины против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов и может быть использовано в научных и производственных лабораториях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности. The invention relates to the field of technology, in particular, to a method for the manufacture of a bivalent freeze-dried vaccine against myxomatosis and viral hemorrhagic disease of rabbits and can be used in scientific and production laboratories involved in the design of biological products, as well as in enterprises of the biological industry.

Известны поливалентные инактивированные вакцины, комбинированные с вирусом геморрагической болезни кроликов, которые с успехом опробованы в Китае. Сюда входят бивалентные вакцины против геморрагической болезни кроликов (ГБК) и пастереллеза; ГБК и бордетеллеза. Lin X.C. Chin.J.Anim.Peltry infec. Dis, 1987, 2,2-10, Huah J.C.E. Chin. J.Vet.Med. 1988, 12(7), 14-15; Tony C. J. Schuam J. Anim, Sci. Vet. Med. 1987, 4,9-10. Имеющиеся отрывочные данные китайских исследователей реферативного характера не позволяют судить о технологии приготовления бивалентной вакцины. В нашей стране подобных исследований не обнаружено. Multivalent inactivated vaccines are known, combined with the rabbit hemorrhagic disease virus, which have been successfully tested in China. This includes bivalent vaccines against rabbit hemorrhagic disease (HBH) and pasteurellosis; GBK and bordetellosis. Lin X.C. Chin. J. Anim. Peltry infec. Dis, 1987, 2.2-10, Huah J.C.E. Chin. J. Vet.Med. 1988, 12 (7), 14-15; Tony C. J. Schuam J. Anim, Sci. Vet. Med. 1987, 4.9-10. Available fragmentary data of Chinese researchers of an abstract nature do not allow us to judge the technology for the preparation of a bivalent vaccine. No similar studies have been found in our country.

Задача изготовление ареактогенной бивалентной лиофилизированной вакцины против миксоматоза и ВГБК, обладающей стабильными свойствами при хранении. The challenge is the manufacture of an areactogenic bivalent lyophilized vaccine against myxomatosis and HBV, which has stable storage properties.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для изготовления бивалентной лиофилизированной вакцины используют два основных компонента: в качестве первого используют живой вакцинный вирус миксоматоза кроликов, выращенный в первично-трипсинизированной культуре клеток куриных фибробластов с активностью не ниже 10^4,0ИД 50/см³. В качестве второго компонента 30% инактивированная при 60^oC в течение 5 часов суспензия печени кроликов, полученная после заражения вирулентным ВГБК. Оба компонента смешивают в равных частях 1:1. Стабилизируют защитной средой в соотношении 10:1. Лиофилизацию проводят после замораживания при температуре минус 50^oC, выдерживают материал при температуре от минус 50 до 0^oC в течение 31 32 ч, затем от 0^oC до +20^oC в течение 6 8 ч при вакууме 75 85 микрон, досушивают в течение 3 4 ч.The essence of the proposed method lies in the fact that for the manufacture of a bivalent freeze-dried vaccine, two main components are used: as the first, a live rabbit myxomatosis vaccine virus grown in a primary trypsinized chicken fibroblast cell culture with an activity of at least 10 ^4.0 ID 50 / cm ³ . As the second component, 30% rabbit liver suspension, inactivated at 60 ^° C. for 5 hours, obtained after infection with virulent HBVC. Both components are mixed in equal parts 1: 1. Stabilize the protective environment in a ratio of 10: 1. Lyophilization is carried out after freezing at a temperature of minus 50 ^o C, the material is kept at a temperature from minus 50 to 0 ^o C for 31 32 hours, then from 0 ^o C to +20 ^o C for 6 8 hours at a vacuum of 75 85 microns, dried within 3 to 4 hours

Осуществление способа. The implementation of the method.

Для изготовления бивалентной вакцины против миксоматоза и ВГБК готовят отдельно вирусное сырье, для чего 2 3-х суточную первично-трипсинизированную культуру клеток куриных фибробластов (КФ) заражают вакцинным вирусом микроматоза кроликов штамм "В-82" с активностью не ниже 10^4,0ИД 50/см³ в дозе 0,5ИД 50 вируса на клетку. Затем проводят адсорбцию вируса при температуре 34^oC в течение 3 ч. После контакта добавляют поддерживающую среду и инкубируют зараженную культуру при температуре 34^oC в течение 60 ч. После замораживания при температуре минус 20^oC в течение 10 ч вирусное сырье размораживают. Результаты представлены в таблице 1.For the manufacture of a bivalent vaccine against myxomatosis and HBVC, viral raw materials are prepared separately, for which a 2 3-day primary trypsinized chicken fibroblast (CF) cell culture is infected with the B-82 strain of rabbit microaromatosis vaccine virus with activity of at least 10 ^4.0 ID 50 / cm ³ at a dose of 0.5 ID 50 virus per cell. Then the virus is adsorbed at a temperature of 34 ^° C for 3 hours. After contact, a support medium is added and the infected culture is incubated at a temperature of 34 ^° C for 60 hours. After freezing at a temperature of minus 20 ^° C for 10 hours, the viral feed is thawed. The results are presented in table 1.

Из таблицы 1 видно, что при заражении культуры клеток КФ в дозе 0,5 lg ИД 50 на клетку с последующей адсорбцией вируса при температуре 34^oC в течение 3 ч и инкубирование зараженной культуры в течение 60 часов способствует максимальному накоплению вируса (4,5 lg ИД 50/см³). Второй компонент бивалентной вакцины получают от кроликов массой 3,0 кг, зараженных ВГБК. Спустя 24 48 ч, от павших животных отбирают печень, замораживают, измельчают и готовят 30%-ную суспензию на физиологическом растворе (pH 7,2), экстрагируют вирус в течение 20 ч при 6^oC, декантируют надосадок, а к осадку добавляют физиологический раствор 1:2 и повторно экстрагируют в течение 20 ч при периодическом перемешивании (заявка N 5052003 от 17.08.92). Оба компонента бивалентной вакцины смешивают в равных частях (1:1), и к смеси компонентов добавляют стабилизатор в соотношении 10:1, разливают по 2,0 см³ в ампулы, замораживают при минус 60^oC в течение 10 ч. Результаты представлены в таблице 2.From table 1 it can be seen that upon infection of a culture of CF cells at a dose of 0.5 lg ID 50 per cell, followed by adsorption of the virus at a temperature of 34 ^o C for 3 hours and incubation of the infected culture for 60 hours contributes to the maximum accumulation of the virus (4.5 lg ID 50 / cm ³ ). The second component of the bivalent vaccine is obtained from rabbits weighing 3.0 kg infected with HBV. After 24 to 48 hours, the liver was taken from the fallen animals, frozen, crushed and a 30% suspension in physiological saline was prepared (pH 7.2), the virus was extracted for 20 hours at 6 ^° C, the supernatant was decanted, and physiological was added to the sediment. a solution of 1: 2 and re-extracted for 20 hours with periodic stirring (application N 5052003 from 08/17/92). Both components of the bivalent vaccine are mixed in equal parts (1: 1), and a stabilizer in the ratio of 10: 1 is added to the mixture of components, poured into 2.0 cm ³ into ampoules, frozen at minus 60 ^o C for 10 hours. The results are presented in table 2.

Из таблицы 2 видно, что объемное соотношение компонентов вакцины (1:1) и добавление стабилизатора к смеси компонентов в соотношении (10:1) позволяет сохранить активность компонентов бивалентной вакцины на исходном уровне в течение 6 месяцев (срок наблюдения). From table 2 it is seen that the volume ratio of the components of the vaccine (1: 1) and the addition of a stabilizer to the mixture of components in the ratio (10: 1) allows you to keep the activity of the components of the divalent vaccine at the initial level for 6 months (observation period).

При лиофилизации материал выдерживают при температуре от минус 50^oC до 0^oC в течение 32 ч, затем от 0^oC до 21^oC в течение 8 ч при вакууме 85 микрон, досушивают в течение 4 ч. Результаты эффективности режимов лиофилизации представлены в таблице 3.During lyophilization, the material is maintained at a temperature of minus 50 ^o C to 0 ^o C for 32 hours, then from 0 ^o C to 21 ^o C for 8 hours at a vacuum of 85 microns, dried for 4 hours. The results of the effectiveness of the lyophilization regimes are presented in table 3.

Бивалентная вакцина против миксоматоза в ВГБК, полученная по предлагаемому способу, активна, безвредна, ареактогенна для кроликов с 30-дневного возраста. The bivalent vaccine against myxomatosis in HBVC obtained by the proposed method is active, harmless, areactogenic for rabbits from 30 days of age.

Бивалентную вакцину применяют как внутримышечно и подкожно в объеме 0,2 см³. Иммунитет формируется на 7 8 сутки после вакцинации против двух инфекций продолжительностью не менее 6 месяцев (срок наблюдения).The bivalent vaccine is administered intramuscularly and subcutaneously in a volume of 0.2 cm ³ . Immunity is formed on the 7-8th day after vaccination against two infections lasting at least 6 months (observation period).

Бивакцина стабильно сохраняет свои иммунобиологические свойства в процессе хранения в течение 6 месяцев (срок наблюдения) при температуре 6^oC. Результаты представлены в таблице 4.Bivaccine stably retains its immunobiological properties during storage for 6 months (observation period) at a temperature of 6 ^o C. The results are presented in table 4.

Из таблицы 4 видно, что бивалентная вакцина против миксоматоза и ВГБК через 6 месяцев хранения (срок наблюдения) после однократной иммунизации кроликов в объеме 0,2 0,5 см³ при разных способах введения (внутримышечное, подкожное, внутрикожное), не вызывает поствакцинальных осложнений и обеспечивает 100% защиту вакцинированных кроликов при полной гибели животных в контроле.From table 4 it is seen that the bivalent vaccine against myxomatosis and HBV after 6 months of storage (observation period) after a single immunization of rabbits in the amount of 0.2 0.5 cm ³ with different methods of administration (intramuscular, subcutaneous, intradermal), does not cause post-vaccination complications and provides 100% protection for vaccinated rabbits with the complete death of animals in the control.

Таким образом, изготовленная по предложенному способу бивалентная вакцина позволяет обеспечить защиту, после однократной привязки, от двух болезней (миксоматоза и ВГБК). Лиофилизация бивалентной вакцины с предложенной защитной средой позволяет обеспечить стабильность препарата при хранении. Результаты исследований подтверждены актом комиссионных испытаний (акт прилагается). Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым. Thus, the bivalent vaccine made according to the proposed method allows protecting, after a single binding, from two diseases (myxomatosis and HBV). Lyophilization of the bivalent vaccine with the proposed protective environment allows to ensure the stability of the drug during storage. The research results are confirmed by the act of commission tests (the act is attached). The proposed method is simple to implement, affordable and is industrially applicable.

Claims

A method of manufacturing a bivalent vaccine against myxomatosis and viral hemorrhagic rabbit disease, which consists in growing the rabbit myxomatosis vaccine virus in chicken fibroblast cell culture with an activity of at least 10 ^4.0 ID 50 / cm ³ , freeze-thaw, mix with inactivated liver suspension rabbits infected with a virulent virus of hemorrhagic rabbit disease in a ratio of 1: 1, stabilize the mixture with a protective medium at a ratio of 10: 1, pack and lyophilize after freezing at minus 5 5 ± 5 ^o C for 10 ± 2 h by holding the material at a temperature of minus 50 ± 5 ^o C to 0 ^o C for 31 ± 1 h and then from 0 ^o C to plus 20 ± 1 ^o C for 6 ± 1 h under vacuum 10 ± 0.5 Pa and dried for 3 ± 1 h.