RS61493B1

RS61493B1 - Konstrukti multispecifičnih antitela

Info

Publication number: RS61493B1
Application number: RS20210181A
Authority: RS
Inventors: Pallavi Bhatta; Emma Dave; Sam Philip Heywood; David Paul Humphreys
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2021-03-31
Also published as: PL3556777T3; RU2017102193A; HRP20191775T1; SG10201911670QA; ES2866398T3; CY1123932T1; IL249003B; RU2017102193A3; PL3161007T3; ME03539B; PT3556777T; MY176332A; AU2015279128A1; AU2015279128B2; MX2016015952A; SG11201609678YA; CN106459216A; LT3161007T; SI3556777T1; CA2951609A1

Description

Opis

[0001] Ovo otkriće se odnosi na određene konstrukte multi-specifičnih antitela, farmaceutske formulacije koje čine konstrukte, DNK koja kodira konstrukte i vektore koji ih sadrže. Otkriće se takođe odnosi na postupak ekspresije konstrukata, na primer u ćeliji domaćinu i postupke za njihovo formulisanje u vidu farmaceutske kompozicije. Otkriće se takođe odnosi na konstrukte multi-specifičnih antitela i formulacije za upotrebu u lečenju.

[0002] Postoji niz pristupa za generisanje bi-specifičnih antitela, od kojih su mnogi zasnovani na formatu koji su prvobitno opisali Morrison et al (Coloma and Morrison 1997, Nat Biotechnol. 15, 159-163) koji uključuju fuziju jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFv) sa celim antitelima, npr. IgG, ili sa fragmentima Fab antitela, Schoonjans et al., 2000, Journal of Immunology, 165, 7050-7057.

[0003] Mertens et al., 2004, Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, 19, 1, 99-109 opisujue Fab fragment koji je povezan sa dva molekula scFv, poznatim kao “tribody”. WO2013/068571 opisuje Fab fragment povezan sa jednim dsscFv molekulom. US2010/081796 opisuje IgG povezan sa dva dsscFv molekula.

[0004] U slučaju Fab-scFv, VH i VL domeni scFv koji se koriste u takvim bi-specifičnim i tri-specifičnim molekulima se obično drže zajedno pomoću peptidnih linkera. Međutim, za određene kombinacije VH i VL varijabilnih domena, peptidni linkeri nisu u stanju da daju dovoljnu stabilnost scFv, što rezultira „disanjem“ varijabilnog domena i slobodnim međumolekulskim sparivanjem sa varijabilnim domenima, a samim tim i tendencijom ka formirajnu multimera preko njihovog jednolančanog Fv dela. Ovo je prikazano na Slici 1 u kontekstu bispecifičnog molekula.

[0005] Sadašnji pronalazači su re-inženjerisali molekule multi-specifičnog antitela kako bi obezbedili molekule antitela sa ekvivalentnom funkcionalnošću, istovremeno minimizirajući multimerizaciju u fazi ekspresije i/ili posle prečišćavanja. Ovo olakšava povećanje prinosa dobijenog "monomernog" materijala i obezbeđuje molekule odgovarajuće stabilnosti za upotrebu u lečenju nakon prečišćavanja, koncentracije i formulacije.

[0006] Prema tome, u jednoj realizaciji, obezbeđen je molekul multispecifičnog antitela koji sadrži ili se sastoji od: a) polipeptidnog lanca formule (l):

VH-CH1-X-V1;

i

b) polipeptidnog lanca formule (ll):

VL-CL-Y-V2;

u kojima:

VH predstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1 predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer, njegov domen 1;

X predstavlja vezu ili linker;

Y predstavlja vezu ili linker;

V1 predstavlja dsFv ili dsscFv;

VL predstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CL predstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2 predstavlja dsFv ili dsscFv

pri čemu svaki od VH/VL, V1 i V2 formira mesto vezivanja antigena, i

pri čemu samo jedan od VH/VL, V1 ili V2 ima specifičnost za serumski protein nosač.

[0007] Povoljno, molekuli multi-specifičnih antitela iz ovog otkrića minimiziraju količinu agregacije koja se vidi nakon prečišćavanja i maksimiziraju količinu monomera u formulacijama konstrukta pri farmaceutskim koncentracijama, uključujući održavanje visokih nivoa monomera tokom vremena prilikom skladištenja, na primer monomer može biti prisutan u količini od 50%, 60%, 70% ili 75% ili više, kao što je 80 ili 90% ili više, poput 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% ili više ukupnog proteina.

Detaljan opis pronalaska

[0008] "Multi-specifično antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na molekul antitela kako je ovde opisan i koji ima dva ili više vezujućih domena, na primer dva ili tri vezujuća domena.

[0009] U jednoj realizaciji konstrukt antitela je tri-specifično antitelo.

[0010] "Tri-specifično antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul antitela sa tri mesta vezivanja antigena, koja mogu nezavisno da vežu iste ili različite antigene. U jednom primeru, trispecifični molekul antitela vezuje dva različita antigena, tj. dva mesta vezivanja vezuju isti antigen, a treć e mesto vezivanja vezuje drugi, različiti antigen. Poželjno je da tri mesta vezivanja molekula trispecifičnog antitela prema pronalasku nezavisno vezuju tri različita antigena.

[0011] U jednoj realizaciji konstrukt je bi-specifično antitelo.

[0012] "Bi-specifični molekul", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul sa dva mesta vezivanja antigena, koja mogu vezati iste ili različite antigene.

[0013] U jednoj realizaciji postoje tri vezujuć a domena i svaki od tri vezuju ć a domena vezuje različite (različite) antigene.

[0014] U jednoj realizaciji postoje tri vezujuća domena i dva vezujuća domena se vezuju za isti antigen, uključujući vezivanje istog epitopa ili različitih epitopa za isti antigen, a treći vezujući domen vezuje različit antigen.

[0015] "Antigen-vezujuće mesto", kako se ovde koristi, odnosi se na deo molekula, koji sadrži par varijabilnih regiona, posebno kognatni par koji specifično interaguje sa ciljnim antigenom.

[0016] Vezujući domeni, kako se ovde koristi, uključuju antitelo sa jednim domenom, tj. varijabini region i antigenvezujuća mesta.

[0017] "Specifično", kako se ovde koristi, odnosi se na mesto vezivanja ili vezujući domen koji prepoznaje samo antigen za koji je specifično ili mesto vezivanja ili vezujući domen koji ima značajno veći afinitet vezivanja za antigen za koji je specifično u poređenju sa afinitetom za antigene za koje je nespecifično, na primer 5, 6, 7, 8, 9, 10 puta veći afinitet vezivanja.

[0018] Afinitet vezivanja se može meriti standardnim testom, na primer rezonancom površinskih plazmona, kao što je BIAcore.

[0019] U jednoj realizaciji, molekul multi-specifičnog antitela prema ovom otkriću je obezbeđen kao dimer teškog i lakog lanca:

Formule (I) i (II) respektivno, u kojima deo VH-CH1 zajedno sa delom VL-CL formira funkcionalni Fab ili Fab' fragment.

[0020] VH predstavlja varijabilni domen, na primer varijabilni domen teškog lanca. U jednoj realizaciji VH predstavlja varijabilni domen teškog lanca. U jednoj realizaciji VH je himerni varijabilni domen, odnosno, sadrži komponente izvedene iz najmanje dve vrste, na primer humane okvirne i ne-humane CDR-e. U jednoj realizaciji VH je humanizovan. U jednoj realizaciji VH je humani.

[0021] VL predstavlja varijabilni domen, na primer varijabilni domen lakog lanca. U jednoj realizaciji VL predstavlja varijabilni domen lakog lanca. U jednoj realizaciji VL je himerni varijabilni domen, što znači da sadrži komponente izvedene iz najmanje dve vrste, na primer humane okvirne i ne-humane CDR-e. U jednoj realizaciji VL je humanizovan. U jednoj realizaciji VH je humanizovan. U jednoj realizaciji VH je humani.

[0022] Generalno VH i VL zajedno čine koji antigen-vezujući domen. U jednoj realizaciji VH i VL čine kognatni par.

[0023] Kako se ovde koristi "Kognatni par" se odnosi na par varijabilnih domena iz jednog antitela, koje je generisano in vivo, tj. prirodnim uparivanjem varijabilnih domena izolovanih od domaćina. Kognatni par je dakle VH i VL par. U jednom primeru, kognatni par vezuje antigen ko-operativno.

[0024] Kako se ovde koristi "Varijabilni region" se odnosi na region u lancu antitela koji sadrži CDR-e i okvirni region, naročito pogodan okvirni region.

[0025] Varijabilni regioni za upotrebu u ovom otkriću će generalno biti izvedeni iz antitela, koje može biti generisano bilo kojim postupkom poznatim u tehnici.

[0026] Kako se ovde koristi "izvedeno iz" se odnosi na činjenicu da je sekvenca koja se koristi ili sekvenca koja je veoma slična sekvenci koja se koristi dobijena od originalnog genetskog materijala, kao što je laki ili teški lanac antitela.

[0027] Kako se ovde koristi, "Veoma sličan", se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja je na celoj svojoj dužini slična 95% ili više, kao što je 96, 97, 98 ili 99% slična.

[0028] Varijabini regioni za upotrebu u ovom pronalasku, kao što je ovde gore opisano za VH i VL, mogu biti iz bilo kog pogodnog izvora i mogu biti, na primer, potpuno humani ili humanizovani.

[0029] U jednoj realizaciji, vezujući domen formiran od VH i VL je specifičan za prvi antigen.

[0030] U jednoj realizaciji, vezujući domen formiran od V1 je specifičan za drugi antigen.

[0031] U jednoj realizaciji, vezujući domen formiran od V2 je specifičan za drugi ili treći antigen.

[0032] U jednoj realizaciji CH1 domen je prirodni domen 1 iz teškog lanca antitela ili njegovog derivata.

[0033] U jednoj realizaciji CL fragment, u lakom lancu, je konstantna kappa sekvenca ili konstantna lambda sekvenca ili njen derivat.

[0034] Derivat prirodnog domena kako se ovde koristi je namenjen da se odnosi na slučaj da su jedna, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina u prirodnom nizu zamenjene ili brisane, na primer za optimizovanje svojstava domena kao što je eliminisanje neželjenih svojstava, ali pri čemu se zadržavaju karakteristične osobine domena.

[0035] U jednoj realizaciji jedna ili više prirodnih ili inženjerisanih među-lančanih (tj. između lakih i teških lanaca) disulfidne veze su prisutne u funkcionalnom Fab ili Fab' fragmentu.

[0036] U jednoj realizaciji je prisutna "prirodna" disulfidna veza između CH1 i CL u polipeptidnim lancima Formule (I) i (II).

[0037] Kada je CL domen izveden ili iz Kapa ili Lambda, prirodni položaj veze koja formira cistein je 214 u humanom cKappa i cLambda (Kabat, 4. izdanje 1987).

[0038] Tačna lokacija disulfidne veze koja formira cistein u CH1 zavisi od konkretnog domena koji se stvarno koristi. Tako se, na primer, u humanom gama-1 prirodni položaj disulfidne veze nalazi na položaju 233 (Kabat, 4. izdanje 1987.). Položaji veze koja formira cistein za druge humane izotipove kao što su gama 2, 3, 4, IgM i IgD su poznati, na primer položaj 127 za humane IgM, IgE, IgG2, IgG3, IgG4 i 128 teškog lanca humanih IgD i IgA2B.

[0039] Opciono može postojati disulfidna veza između VH i VL polipeptida formule I i II.

[0040] U jednoj realizaciji, multi-specifično antitelo prema otkriću ima disulfidnu vezu u položaju ekvivalentnom ili odgovarajućem onom koji se prirodno javlja između CH1 i CL.

[0041] U jednoj realizaciji, konstantni region koji sadrži CH1 i konstantni region kao što je CL ima disulfidnu vezu koja je u položaju u kojem se ona prirodno ne javlja. Ona može biti inženjerisana u molekul uvođenjem cisteina u aminokiselinski lanac na potrebnom položaju ili položajima. Ova ne-prirodna disulfidna veza je kao dodatak ili kao alternativa prirodnoj disulfidnoj vezi prisutnoj između CH1 i CL. Cistein(i) u prirodnim položajima mogu biti zamenjeni aminokiselinom kao što je serin koja ne može da formira disulfidni most.

[0042] Uvođenje inženjerisanih cisteina može biti izvedeno bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Ove metode uključuju, ali nisu ograničene na, PCR mutagenezu sa preklapajućim produžavanjem, mutagenezu usmerenu na mesto ili kasetnu mutagenezu (videti, generalno, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). Kompleti za usmerenu mutagenezu su komercijalno dostupni, npr. QuikChange® Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA). Kasetna mutageneza može biti izvedena na bazi Wells et al., 1985, Gene, 34: 315-323. Alternativno, mutanti se mogu dobiti totalnom sintezom gena pomoću hibridizacije prajmera (anealing), ligacijom i PCR amplifikacijom i kloniranjem preklapajućih oligonukleotida.

[0043] U jednoj realizaciji, disulfidna veza između CH1 i CL je potpuno odsutna, na primer međulančani cisteini mogu biti zamenjeni drugom aminokiselinom, kao što je serin. Prema tome, u jednoj realizaciji ne postoje međulančane disulfidne veze u funkcionalnom Fab fragmentu molekula. Otkrića kao što je WO2005/003170, opisuju kako se dobijaju Fab fragmenti bez međulančane disulfidne veze.

[0044] V1 i V2 su oba dsscFv.

[0045] U jednoj realizaciji, V1 i V2 imaju isti varijabilni domen VH. U drugoj realizaciji, V1 i V2 imaju isti varijabilni domen VL. U jednoj realizaciji varijabilni domeni VH i VL su isti za V1 i V2. Ovo poslednje omogućava unakrsno povezivanje što može biti poželjno za neke ciljeve.

[0046] Dakle, u jednoj realizaciji je obezbeđen molekul multi-specifičnog antitela koji sadrži ili se sastoji od:

a) polipeptidnog lanca formule (I):

VH -CH1-X-V1;

i

b) polipeptidnog lanca formule (II):

VL-CL-Y-V2;

u kojima:

VH predstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1 predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer njegov domen 1; X predstavlja vezu ili linker;

Y predstavlja vezu ili linker;

V1 predstavlja dsscFv;

VL predstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CL predstavlja domen iz konstantnog regiona, na primer domen konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2 predstavlja dsscFv;

pri čemu svaki od VH/VL, V1 i V2 formira mesto vezivanja antigena, i

pri čemu samo jedan od VH/VL, V1 ili V2 ima specifičnost za serumski protein-nosač.

[0047] Kako se ovde koristi "jednolančani varijabilni fragment" ili "scFv" se odnosi na jednolančani varijabilni fragment koji sadrži ili se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL) koji je stabilizovan peptidnim linkerom između varijabilnih domena VH i VL. VH i VL varijabilni domeni mogu biti u bilo kojoj pogodnoj orijentaciji, na primer, C-terminus VH može biti povezan sa N-terminusom iz VL ili C-terminus VL može biti povezan sa N-terminusom iz VH.

[0048] Kako se ovde koristi „disulfidno-stabilizovani jednolančani varijabilni fragment“ ili „dsscFv“ se odnosi na jednolančani varijabilni fragment koji je stabilizovan peptidnim linkerom između varijabilnih domena VH i VL i takođe uključuje inter-domensku disulfidnu vezu između VH i VL.

[0049] Kako se ovde koristi "disulfidno-stabilizovani varijabilni fragment" ili "dsFv" se odnosi na jednolančani varijabilni fragment koji ne uključuje peptidni linker između VH i VL varijabilnih domena i umesto toga je stabilizovan interdomenskom disulfidnom vezom između VH i VL.

[0050] Kako se ovde koristi "jednodomensko antitelo" ili "sdAb", se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od jednog monomernog varijabilnog domena antitela, kao što su VH ili VL ili VHH.

[0051] U jednoj realizaciji, disulfidna veza između varijabilnih domena VH i VL od V1 i/ili V2 je između dve dole navedene rezidue (ako kontekst ne ukazuje drugačije, na donjoj listi se koristi Kabat numeracija). Gde god se poziva na Kabat numerisanje, relevantna referenca je Kabat et al., 1987, u Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA.

[0052] U jednoj realizaciji disulfidna veza je u položaju odabranom iz grupe koja sadrži:

• VH37 VL95C, videti na primer Protein Science 6, 781 -788 Zhu et al (1997);

• VH44 VL100 videti na primer; Biohemija 335451-5459 Reiter et al (1994); ili Journal of Biological Chemistry Vol.

269 Br. 28 str. 18327-18331 Reiter et al (1994); ili Protein Engineering, vol.10 br.12 pp. 1453-1459 Rajagopal et al (1997);

• VH44 VL105 videti na primer J Biochem.118, 825-831 Luo et al (1995);

• VH45 VL87 videti na primer Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

• VH55 VL101 videti na primer FEBS Letters 377135-139 Young et al (1995);

• VH100 VL50 videti na primer Biochemistry 291362-1367 Glockshuber et al (1990);

• VH100b VL49;

• VH98 VL46, videti na primer Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

• VH101 VL46;

• VH105 VL43 videti na primer; Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 str.7538-7542 Brinkmann et al (1993); ili Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994),

• VH106 VL57, videti na primer FEBS Letters 377135-139 Young et al (1995)

i položaju koji joj odgovara u paru varijabilnih regiona lociranih u molekulu.

[0053] U jednoj realizaciji, disulfidna veza nastaje između položaja VH 44 i VL 100.

[0054] Gore navedeni parovi aminokiselina se nalaze u položajima koji pogoduju zameni cisteinima tako da mogu biti formirane disulfidne veze. Cisteini mogu biti inženjerisani u ove željene položaje poznatim tehnikama. Prema tome, U jednoj realizaciji inženjerisani cistein prema ovom otkriću se odnosi na to gde je rezidua koja se prirodno javlja na datom položaju aminokiseline zamenjena cisteinskom reziduom.

[0055] Uvođenje inženjerisanih cisteina može se izvršiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Ove metode uključuju, ali nisu ograničene na, PCR mutagenezu sa preklapajućim produžavanjem, mutagenezu usmerenu na mesto ili kasetnu mutagenezu (videti, generalno, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). Kompleti za mutagenezu usmerenu na mesto su komercijalno dostupni, npr. QuikChange®Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagen, La Jolla, CA). Kasetna mutageneza može biti izvedena na bazi Wells et al., 1985, Gene, 34: 315-323. Alternativno, mutanti se mogu dobiti totalnom sintezom gena pomoću hibridizacije prajmera (anealing), ligacijom i PCR amplifikacijom i kloniranjem preklapajućih oligonukleotida.

[0056] Shodno tome, u jednoj realizaciji varijabilni domeni VH i VL od V1 i/ili varijabilni domeni VH i VL od V2 mogu biti povezani disulfidnom vezom između dva cisteinske rezidue, pri čemu je položaj para cisteinskih rezidua odabran iz grupe koju čine: VH37 i VL95, VH44 i VL100, VH44 i VL105, VH45 i VL87, VH100 i VL50, VH100b i VL49, VH98 i VL46, VH101 i VL46, VH105 i VL43 i VH106 i VL57.

[0057] U jednoj realizaciji varijabilni domeni VH i VL od V1 i/ili varijabilni domeni VH i VL od V2 mogu biti povezani disulfidnom vezom između dva cisteinske rezidue, jedne u VH i jedne u VL, koje su izvan CDR-a, pri čemu je položaj para cisteinskih rezidua odabran iz grupe koju čine VH37 i VL95, VH44 i VL100, VH44 i VL105, VH45 i VL87, VH100 i VL50, VH98 i VL46, VH105 i VL43 i VH106 i VL57.

[0058] U jednoj realizaciji varijabilni domeni VH i VL od V1 su povezani disulfidnom vezom između dve inženjerisane cisteinske rezidue, jedne na položaju VH44, i druge na VL100.

[0059] U jednoj realizaciji varijabilni domeni VH i VL od V2 su povezani disulfidnom vezom između dve inženjerisane cisteinske rezidue, jedne na položaju VH44, i druge na VL100.

[0060] U jednoj realizaciji VH domen V1 je vezan za X.

[0061] U jednoj realizaciji VL domen V1 je vezan za X.

[0062] U jednoj realizaciji VH domen V2 je vezan za Y.

[0063] U jednoj realizaciji VL domen V2 je vezan za Y.

[0064] U jednoj realizaciji X je veza.

[0065] U jednoj realizaciji Y je veza.

[0066] U jednoj realizaciji i X i Y su veze.

[0067] U jednoj realizaciji X je linker, poželjno peptidni linker, na primer peptid pogodan za povezivanje delova CH1 i V1.

[0068] U jednoj realizaciji Y je linker, poželjno peptidni linker, na primer peptid pogodan za povezivanje delova CL i V2.

[0069] U jednoj realizaciji i X i Y su linkeri. U jednoj realizaciji i X i Y su peptidni linkeri.

[0070] Termin "peptidni linker", kako se ovde koristi, odnosi se na peptid koji se sastoji od aminokiselina. Spektar pogodnih peptidnih linkera će biti poznat stručnjaku u ovoj oblasti.

[0071] U jednoj realizaciji peptidni linker je dužine 50 aminokiselina ili manje, na primer 20 aminokiselina ili manje, kao što je oko 15 aminokiselina ili manje, kao što je dužina od 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 aminokiselina.

[0072] U jednoj realizaciji linker je izabran iz sekvence prikazane u sekvencama 1 do 67.

[0073] U jednoj realizaciji linker je izabran iz sekvence prikazane u SEK ID BR: 1 ili SEK ID BR: 2.

[0074] U jednoj realizaciji X ima sekvencu SGGGGTGGGGS (SEK ID BR: 1).

[0075] U jednoj realizaciji Y ima sekvencu SGGGGTGGGGS (SEK ID BR: 1).

[0076] U jednoj realizaciji X ima sekvencu SGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 2). U jednoj realizaciji Y ima sekvencu SGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 2).

[0077] U jednoj realizaciji X ima sekvencu koja je data u SEK ID BR: 1, a Y ima sekvencu koja je data u SEK ID BR: 2.

[0078] U jednoj realizaciji X ima sekvencu koja je data u SEK ID BR: 69 ili 70. U jednoj realizaciji Y ima sekvencu koja je data u SEK ID BR: 69 ili 70. U jednoj realizaciji X ima sekvencu koja je data u SEK ID BR: 69 i Y ima sekvencu navedenu u SEK ID BR: 70.

Tabela 1. Sekvence zglobnih linkera

SEK ID BR: SEKVENCA

3 DKTHTCAA

4 DKTHTCPPCP

DKTHTCPPCPATCPPCPA

DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA

DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY

DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY

DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA

DKTHTCPSCPA

Tabela 2. Sekvence fleksibilnih linkera SEK ID BR: SEKVENCA

12 SGGGGSE

13 DKTHTS

14 (S)GGGGS

15 (S)GGGGSGGGGS

16 (S)GGGGSGGGGSGGGGS

17 (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

18 (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 19 AAAGSG-GASAS

20 AAAGSG-XGGGS-GASAS

21 AAAGSG-XGGGSXGGGS-GASAS

22 AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGS-GASAS

23 AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS 24 AAAGSG-XS-GASAS

25 PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY

26 ATTTGSSPGPT

27 ATTTGS

- GS

28 EPSGPISTINSPPSKESHKSP

29 GTVAAPSVFIFPPSD

30 GGGGIAPSMVGGGGS

31 GGGGKVEGAGGGGGS

32 GGGGSMKSHDGGGGS

33 GGGGNLITIVGGGGS

34 GGGGVVPSLPGGGGS

35 GGEKSIPGGGGS

36 RPLSYRPPFPFGFPSVRP

37 YPRSIYIRRRHPSPSLTT

38 TPSHLSHILPSFGLPTFN

39 RPVSPFTFPRLSNSWLPA

40 SPAAHFPRSIPRPGPIRT

41 APGPSAPSHRSLPSRAFG

42 PRNSIHFLHPLLVAPLGA

43 MPSLSGVLQVRYLSPPDL

44 SPQYPSPLTLTLPPHPSL

45 NPSLNPPSYLHRAPSRIS

46 LPWRTSLLPSLPLRRRP

47 PPLFAKGPVGLLSRSFPP

48 VPPAPVVSLRSAHARPPY

49 LRPTPPRVRSYTCCPTP-50 PNVAHVLPLLTVPWDNLR

51 CNPLLPLCARSPAVRTFP

(S) je opciono u sekvencama 14 do 18

[0079] Primeri rigidnih linkera uključuju peptidne sekvence GAPAPAAPAPA (SEK ID BR: 52), PPPP (SEK ID BR: 53) i PPP.

[0080] U jednoj realizaciji peptidni linker je albumin-vezujući peptid.

[0081] Primeri albumin-vezujućih peptida su dati u WO2007/106120 i obuhvataju:

Tabela 3

SEK ID BR: SEKVENCA

54 DLCLRDWGCLW

55 DICLPRWGCLW

56 MEDICLPRWGCLWGD

57 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE

58 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV

59 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK

60 EDICLPRWGCLWEDD

61 RLMEDICLPRWGCLWEDD

62 MEDICLPRWGCLWEDD

63 MEDICLPRWGCLWED

64 RLMEDICLARWGCLWEDD

65 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG

66 RAPESFVCYWETICFERSEQ

67 EMCYFPGICWM

[0082] Povoljna upotreba albumin-vezujućih peptida kao linkera može poveć ati poluživot molekula multi-specifičnog antitela.

[0083] U jednoj realizaciji postoji linker, na primer pogodan peptid za povezivanje varijabilnih domena VH i VL od V1.

[0084] U jednoj realizaciji postoji linker, na primer pogodan peptid za povezivanje varijabilnih domena VH i VL od V2.

[0085] U jednoj realizaciji, peptidni linker u dsscFv je u opsegu dužina oko 12 do 25 aminokiselina, kao što je 15 do 20 aminokiselina.

[0086] U jednoj realizaciji linker koji povezuje varijabilne domene VH i VL od V1 ima sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 68).

[0087] U jednoj realizaciji linker koji povezuje varijabilne domene VH i VL od V2 ima sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 68).

[0088] U jednoj realizaciji linker koji povezuje varijabilne domene VH i VL od V1 ima sekvencu SGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 69).

[0089] U jednoj realizaciji linker koji povezuje varijabilne domene VH i VL od V2 ima sekvencu SGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 69)

[0090] U jednoj realizaciji linker koji povezuje varijabilne domene VH i VL od V1 ima sekvencu SGGGGSGGGGTGGGGS (SEK ID BR: 70).

[0091] U jednoj realizaciji linker koji povezuje varijabilne domene VH i VL od V2 ima sekvencu SGGGGSGGGGTGGGGS SEK ID BR: 70).

[0092] Prema tome, u jednoj realizaciji je obezbeđen molekul multi-specifičnog antitela, koji sadrži ili se sastoji od:

a) polipeptidnog lanca formule (I):

VH-CH1-Y-V1;

i

b) polipeptidnog lanca formule (II):

VL-CL-Y-V2;

u kojima:

VH predstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1 predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer njegov domen 1;

X predstavlja vezu ili linker;

Y predstavlja vezu ili linker;

V1 predstavlja dsscFv;

VL predstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CL predstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2predstavlja dsscFv;

pri čemu svaki od VH/VL, V1 i V2 formira antigen-vezujuće mesto, i

[0093] Predstavljeno otkriće takođe obezbeđuje sekvence koje su 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% slične sekvenci koja je ovde otkrivena.

[0094] "Identitet", kako se ovde koristi, pokazuje da je na bilo kom određenom položaju u poravnatim sekvencama aminokiselinska rezidua identična između sekvenci.

[0095] "Sličnost", kako se ovde koristi, označava da se na bilo kom određenom položaju u poravnatim sekvencama, nalazi aminokiselinska rezidua sličnog tipa između sekvenci. Na primer, leucin može biti supstituisan za izoleucin ili valin. Ostale aminokiseline koje se često mogu zameniti uključuju, ali nisu ograničene na:

- fenilalanin, tirozin i triptofan (aminokiseline sa aromatičnim bočnim lancima);

- lizin, arginin i histidin (aminokiseline sa osnovnim bočnim lancima);

- aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance);

- asparagin i glutamin (aminokiseline sa amidnim bočnim lancima); i

- cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor).

[0096] Stepeni identiteta i sličnosti se mogu lako izračunati (Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLASTTM software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L.1997, Genome Res.7:649-656,).

[0097] Antitela za upotrebu u multispecifičnim konstruktima iz ovog pronalaska mogu biti generisana bilo kojom pogodnom metodom poznatom u tehnici.

[0098] Mogu se dobiti antitela generisana protiv polipeptida antigena, kada je imunizacija životinje neophodna davanjem polipeptida životinji, poželjno ne-humanoj životinji, korišćenjem dobro poznatih i rutinskih protokola, videti na primer Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Mnoge toplokrvne životinje, poput zečeva, miševa, pacova, ovaca, krava, kamila ili svinja mogu biti imunizovane. Međutim, miševi, zečevi, svinje i pacovi su uglavnom najpogodniji.

[0099] Monoklonska antitela mogu biti pripremljena bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, kao što je tehnika hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), the trioma technique, the human B-cell hybridoma technique (Kozbor et al 1983, Immunology Today, 4:72) and the EBV-hybridoma technique (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0100] Antitela takođe mogu biti generisana korišćenjem metoda pojedinačnih limfocitnih antitela kloniranjem i ekspresijom varijabilnih regiona imunoglobulina cDNK generisanih iz pojedinačnih limfocita odabranih za proizvodnju specifičnih antitela na primer, metodama koje su opisali Babcook, J. et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 i WO2004/106377.

[0101] Antitela za upotrebu u ovom otkriću takođe mogu biti generisana upotrebom različitih metoda ispoljavanja faga poznatih u tehnici i uključuju one koja su otkrili Brinkman et al. (u J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) i WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; i US 5.698.426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 5,969,108 i WO20011/30305.

[0102] U jednoj realizaciji, multi-specifični molekuli prema ovom otkriću su humanizovani.

[0103] Humanizovano (što uključuje CDR-graftovana antitela) kako se ovde koristi, se odnosi na molekule koji imaju

1

jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR-a) od ne-humane vrste i okvirni region od molekula humanog imunoglobulina (videti, na primer, US 5,585,089; WO91/ 09967). Podrazumeva se da će možda biti potrebno samo prenošenje rezidua CDR-a koje određuju specifičnost, a ne celokupnog CDR-a (videti, na primer, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Humanizovana antitela opciono mogu dalje da sadrže jednu ili više okvirnih rezidua izvedenih iz ne-humanih vrsta od kojih su CDR-i izvedeni.

[0104] Kako se ovde koristi, izraz "molekul humanizovanog antitela" se odnosi na molekul antitela u kojem teški i/ili laki lanac sadrži jedan ili više CDR-a (uključujući, ako je poželjno, jedan ili više modifikovanih CDR-a) iz antitela donora (npr. mišje monoklonsko antitelo) graftovanih u okvir varijabilnog regiona teškog i/ili lakog lanca antitela akceptora (npr. humanog antitela). Za pregled, vidi Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. U jednoj realizaciji, umesto da se prenosi ceo CDR, u okvir humanog antitela se prenosi samo jedna ili više rezidua koje određuju specifičnost iz bilo kojeg od gore opisanih CDR-a (vidi na primer, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). U jednoj realizaciji, samo rezidue koje određuju specifičnost iz jednog ili više gore opisanih CDR-a se prenose u okvir humanog antitela. U još jednoj realizaciji, samo rezidue koje određuju specifičnost iz svakog od gore opisanih CDR-a se prenose u okvir humanog antitela.

[0105] Kada se graftuju CDR-i ili rezidue koji određuju specifičnost, može se koristiti bilo koja odgovarajuća sekvenca okvira varijabilnog regiona akceptora uzimajući u obzir klasu/tip donorskog antitela iz kojeg potiču CDR-i, uključujući miša, primate i humane okvirne regione. Pogodno, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ima varijabilni domen koji obuhvata humane akceptorske regione kao i jedan ili više ovde navedenih CDR-a.

[0106] Primeri humanih okvira koji se mogu koristiti u ovom otkriću su KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat et al. supra). Na primer, KOL i NEWM se mogu koristiti za teški lanac, REI se može koristiti za laki lanac, a EU, LAY i POM se mogu koristiti i za teški i za laki lanac. Alternativno se mogu koristiti sekvence humanih klicinih ćelija;<oni su dostupni na:>http:// www 2.mrc1mb.cam.ac.uk/vbase/list2.php<.>

[0107] U molekulu humanizovanog antitela iz ovog otkrića, akceptorski teški i laki lanci ne moraju biti izvedeni iz istog antitela i, po želji, mogu da sadrže kompozitne lance koji imaju okvirne regione izvedene iz različitih lanaca.

[0108] Okvirni regioni ne moraju imati potpuno istu sekvencu kao oni iz akceptorskog antitela. Na primer, neuobičajene rezidue mogu biti zamenjene reziduama koje se češće javljaju za tu klasu ili tip akceptorskog lanca. Alternativno, izabrane rezidue u okvirnim regionima akceptora mogu biti zamenjene tako da odgovaraju rezidui nađenoj na istom položaju u antitelu donatora (videti Reichmann et al. 1998, Nature, 332, 323-324). Takve promene treba svesti na minimum neophodan za obnavljanje afiniteta antitela donora. Protokol za odabir rezidua u okvirnim regionima akceptora koji će možda trebati da budu promenjeni je naveden u WO91/09967.

[0109] Derivati okvirnih regiona mogu imati 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline zamenjene alternativnom aminokiselinom, na primer reziduom donora.

[0110] Donorske rezidue su rezidue donorskog antitela, tj. antitela od kojeg su CDR prvobitno izvedeni. Donorske rezidue mogu biti zamenjene odgovarajućom reziduom izvedenom iz okvira humanog receptora (rezidue akceptora).

[0111] U jednoj realizaciji, multi-specifična antitela iz ovog otkrića su potpuno humana, posebno jedan ili više varijabilnih domena su potpuno humani.

[0112] Potpuno humani molekuli su oni u kojima su varijabini regioni i konstantni regioni (kada su prisutni) i teškog i lakog lanca svi humanog porekla ili u osnovi identični sekvencama humanog porekla, ne nužno iz istog antitela. Primeri potpuno humanih antitela mogu uključivati antitela proizvedena, na primer gore opisanim metodama ispoljavanja faga i antitela proizvedena od miševa u kojima su mišji imunoglobulinski geni varijabilnih i opciono konstantnih regiona zamenjeni svojim humanim pandanima, npr. kako je u opštim crtama opisano u EP0546073, US5,545,806, US5,569,825, US5,625,126, US5,633,425, US5,661,016, US5,770,429, EP 0438474 i EP0463151.

[0113] U jednoj realizaciji, molekuli multi-specifičnih antitela iz ovog otkrića su sposobni za selektivno vezivanje dva, tri ili više različitih antigena od interesa.

[0114] U jednoj realizaciji, antigeni od interesa koji su vezani za antigen vezujući domen, formiran od VH/VL, ili V1 ili V2, su nezavisno izabrani od sa ćelijom asociranog proteina, na primer, ćelijski površinski protein na ćelijama kao što su ćelije bakterija, ćelije kvasaca, T-ćelije, B-ćelije, endotelne ćelije ili tumorske ćelije i solubilni protein.

[0115] Antigen od interesa takođe može biti bilo koji medicinski relevantan protein kao što su proteini koji su ushodno regulisani tokom bolesti ili infekcije, na primer receptori i/ili njihovi odgovarajući ligandi. Posebni primeri antigena uključuju ćelijske površinske receptore kao što su T ćelijski ili B ćelijski signalni receptori, ko-stimulatorni molekuli, inhibitori kontrolne tačke, receptori ćelija prirodnih ubica, imunoglobulinski receptori, receptori TNFR familije, receptori familije B7, adhezioni molekuli, integrini, citokinski/hemokinski receptori, GPCR, receptori faktora rasta, receptori kinaze, tkivno specifični antigeni, kancerski antigeni, receptori za prepoznavanje patogena, receptori komplementa, hormonski receptori ili solubilni molekuli kao što su citokini, hemokini, leukotrieni, faktori rasta, hormoni ili enzimi ili jonski kanali, epitopi, fragmenti i njihovi post-translaciono modifikovani oblici.

[0116] U jednoj realizaciji, molekul multispecifičnog antitela iz otkrića se može koristiti za funkcionalno menjanje aktivnosti antigena od interesa. Na primer, fuzioni protein antitela može direktno ili indirektno da neutrališe, antagonizuje ili agonizuje aktivnost pomenutog antigena.

[0117] U jednoj realizaciji V1 i V2 su specifični za isti antigen, na primer, vezuju isti ili različit epitop. U jednoj realizaciji V1 je specifičan za humani serumski albumin. U jednoj realizaciji V2 je specifičan za humani serumski albumin. U jednoj realizaciji V1 i V2 su specifični za dva različita antigena.

[0118] U jednoj realizaciji V1 i V2 su specifični za iste antigene, na primer iste ili različite epitope na istom antigenu.

[0119] U jednoj realizaciji, antigen od interesa vezan od VH/VL ili V1 ili V2 obezbeđuje sposobnost regrutovanja efektorskih funkcija, poput aktivacije puta komplementa i/ili regrutovanja efektorskih ćelija.

[0120] Regrutovanje efektorske funkcije može biti direktno kada je efektorska funkcija povezana sa ćelijom, kada pomenuta ćelija nosi molekul za regrutovanje na svojoj površini. Indirektno regrutovanje može nastati kada vezivanje antigena za domen vezanja antigena (kao što je V1 ili V2) u molekulu, prema predstavljenom otkriću za regrutacioni polipeptid, izaziva oslobađanje, na primer, faktora koji zauzvrat može direktno ili indirektno da regrutuje efektorsku funkciju, ili može biti preko aktivacije signalnog puta. Primeri uključuju IL2, IL6, IL8, IFNγ, histamin, C1q, opsonin i druge članove klasičnih i alternativnih kaskada aktivacije komplementa, kao što su C2, C4, C3-konvertaza i C5 do C9.

[0121] Kako se ovde koristi, "polipeptid za regrutaciju" uključuje FcγR kao što su FcγRI, FcγRII i FcγRIII, protein puta komplementa kao što su, ali bez ograničenja, C1q i C3, protein CD markera (marker Klastera Diferencijacije) ili njegov fragment koji zadržava sposobnost regrutovanja efektorske funkcije posredovane ćelijama bilo direktno ili indirektno. Polipeptid za regrutaciju takođe uključuje molekule imunoglobulina kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE i IgA koji poseduju efektorsku funkciju.

[0122] U jednoj realizaciji, antigena-vezujući domen (kao što je V1 ili V2 ili VH/VL) u molekulu multi-specifičnih antitela prema ovom otkriću ima specifičnost za protein puta komplementa, s tim što je posebno poželjan C1q.

[0123] Zatim, molekuli multi-specifičnih antitela iz ovog otkrića se mogu koristiti za helatiranje radionuklida na osnovu jednodomenskog antitela koje se vezuje za nukleidni helatorni protein. Takvi fuzioni proteini su korisni u terapeutskim pristupima kao što su imidžing ili ciljanje radionuklidima.

[0124] U jednoj realizaciji, domen vezivanja antigena unutar molekula prema ovom otkriću (kao što je V1 ili V2 ili VH/VL) ima specifičnost za serumski protein nosač, cirkulišuće molekule imunoglobulina ili CD35/CR1, na primer za obezbeđivanje produženog poluživota fragmenta antitela sa specifičnošću za navedeni antigen od interesa vezivanjem za pomenuti serumski protein nosač, cirkulišući molekul imunoglobulina ili CD35/CR1.

[0125] Kako se ovde koristi, "serumski protein nosač" uključuje protein koji vezuje tiroksin, transtiretin, glikoprotein α1-kiseline, transferin, fibrinogen i albumin, ili njihov fragment.

[0126] Kako se ovde koristi, "cirkulišući molekul imunoglobulina" uključuje IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, sIgA, IgM i IgD, ili fragment bilo koga od njih.

[0127] CD35/CR1 je protein prisutan u crvenim krvnim zrncima koji ima polu-život od 36 dana (normalan raspon od 28 do 47 dana; Lanaro et al., 1971, Cancer, 28(3):658-661).

[0128] U jednoj realizaciji, antigen od interesa za koji VH/VL ima specifičnost je serumski protein nosač, kao što je humani serumski nosač, kao što je humani serumski albumin.

[0129] U jednoj realizaciji, antigen od interesa za koji V1 ima specifičnost je serumski protein nosač, kao što je humani serumski nosač, kao što je humani serumski albumin.

[0130] U jednoj realizaciji, antigen od interesa za koji V2 ima specifičnost je serumski protein nosač, kao što je humani serumski nosač, kao što je humani serumski albumin.

[0131] Samo jedan od VH/VL, V1 ili V2 ima specifičnost za serumski protein nosač, kao što je humani serumski nosač, kao što je humani serumski albumin.

[0132] U jednoj realizaciji mesto vezivanja u konstruktu iz ovog otkrića sadrži 6 CDR-a, na primer SEK ID BR: 71 za CDRH1, SEK ID BR: 72 za CDRH2, SEK ID BR: 73 za CDRH3, SEK ID BR: 74 za CDRL1, SEK ID BR: 75 za CDRL2 i SEK ID BR: 76 za CDRL3.

[0133] U jednoj realizaciji, pomenutih 6 CDR-ova SEK ID BR: 71 do 76 su u položaju VH/VL u konstruktima iz ovog otkrića. U jednoj realizaciji, pomenutih 6 CDR-ova SEK ID BR: 71 do 76 su u položaju V1 u konstruktima iz ovog otkrića. U jednoj realizaciji pomenutih 6 CDR-a SEK ID BR: 71 do 76 su u položaju V2 u konstruktima iz ovog otkrića. U jednoj realizaciji, pomenutih 6 CDR-a SEK ID BR: 71 do 76 su u položaju V1 i V2 u konstruktima iz ovog otkrića. U jednoj realizaciji, pomenutih 6 CDR-ova SEK ID BR: 71 do 76 su u položaju VH/VL i V1 u konstruktima iz ovog otkrića. U jednoj realizaciji, pomenutih 6 CDR-ova SEK ID BR: 71 do 76 su u položaju VH/VL i V2 u konstruktima iz ovog otkrića.

[0134] U jednoj realizaciji mesto vezivanja albumina u konstruktima iz ovog otkrića sadrži teški varijabilni domen izabran od SEK ID BR: 77 i SEK ID BR: 78 i varijabilni domen lakog lanca odabran od SEK ID BR: 79 i SEK ID BR: 80, a posebno od SEK ID BR: 77 i 79 ili SEK ID BR: 78 i 80, respektivno, za teški i laki lanac. U jednoj realizaciji, ovi domeni su u položaju VH/VL u konstruktima iz ovog otkrića. U jednoj realizaciji ovi varijabilni domeni su u položaju V1. U jednoj realizaciji ovi varijabilni domeni su u položaju V2. U jednoj realizaciji ovi varijabilni domeni su u položaju V1 i V2. U jednoj realizaciji ovi varijabilni domeni su u položaju VH/VL i V1 u konstruktima iz ovog otkrića. U jednoj realizaciji ovi varijabilni domeni su u položaju VH/VL i V2 u konstruktima iz ovog otkrića. Kada su varijabilni domeni na dve lokacije u konstruktima iz ovog otkrića, isti par varijabilnih domena može biti na svakoj lokaciji ili se mogu koristiti dva različita para varijabilnih domena.

[0135] U jednoj realizaciji, molekuli multi-specifičnih antitela iz ovog otkrića su procesirani da se obezbedi poboljšani afinitet za ciljni antigen ili antigene. Takve varijante se mogu dobiti pomoću brojnih protokola maturacije afiniteta, uključujući mutiranje CDR-a (Yang et al. J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), premeštanje lanca (eng. chain shuffling) (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), upotreba mutatorskih sojeva E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), mešanje DNK (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), ispoljavanje faga (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) i sexual PCR (Crameri et al. Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al (supra) razmatraju ove metode maturacije afiniteta.

[0136] Poboljšani afinitet kako se ovde koristi u ovom kontekstu se odnosi na poboljšanje u odnosu na početni molekul.

[0137] Ako se želi, konstrukti multispecifičnog antitela za upotrebu u ovom otkriću mogu biti konjugovani sa jednim ili više efektorskih molekula. Podrazumeva se da efektorski molekul može sadržati jedan efektorski molekul ili dva ili više takvih molekula povezanih tako da formiraju jedan deo molekula koji može biti vezan za antitela iz ovog pronalaska. Kada je poželjno da se dobije fragment antitela vezan za efektorski molekul, to se može pripremiti standardnim hemijskim ili rekombinantnim DNK postupcima u kojima je fragment antitela povezan direktno ili preko agensa za kuplovanje sa efektorskim molekulom. Tehnike za konjugovanje takvih efektorskih molekula sa antitelima su dobro poznate u tehnici (videti, Hellstrom et al. Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al eds., 1987, pp.623-53; Thorpe et al 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Određeni hemijski postupci uključuju, na primer, one opisane u WO93/ 06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 i WO03031581. Alternativno, kada je efektorski molekul protein ili polipeptid, povezivanje se može postići upotrebom postupaka rekombinantne DNK, na primer kako je opisano u WO86/01533 i EP0392745.

[0138] Termin "efektorski molekul", kako se ovde koristi, uključuje, na primer, biološki aktivne proteine, na primer enzime, druga antitela ili fragmente antitela, sintetičke ili prirodno prisutne polimere, nukleinske kiseline i njihove fragmente, npr. DNK, RNK i njihove fragmente, radionuklide, naročito radiojodide, radioizotope, helirane metale, nanočestice i reporter grupe kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja se mogu detektovati NMR ili ESR spektroskopijom.

[0139] Ostali efektorski molekuli mogu da uključuju helatirane radionuklide kao što su 111In i 90Y, Lu177, Bizmut213, Kalifornijum252, Iridijum192 i Volfram188/Renijum188; ili lekove kao što su, ali ne ograničavajući se na, alkilfosfoholine, inhibitore topoizomeraze I, taksoide i suramin.

[0140] Ostali efektorski molekuli uključuju proteine, peptide i enzime. Enzimi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, proteolitičke enzime, hidrolaze, lijaze, izomeraze, transferaze. Proteini, polipeptidi i peptidi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, imunoglobuline, toksine kao što su abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin ili difterijski toksin, protein kao što su insulin, α-interferon, β-interferon, faktor rasta nerava, faktor rasta izveden iz trombocita ili aktivator plazminogena tkiva, trombotički agens ili anti-angiogeni agens, npr. angiostatin ili endostatin, ili modifikator biološkog odgovora kao što je limfokin, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), nervnog faktora rasta (NGF) ili drugi faktor rasta i imunoglobuline.

[0141] Ostali efektorski molekuli mogu sadržati detektabilne supstance korisne, na primer u dijagnozi. Primeri detektabilnih supstanci uključuju razne enzime, protetske grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale, radioaktivne nuklide, metale koji emituju pozitrone (za upotrebu u pozitronskoj emisionoj tomografiji) i neradioaktivne paramagnetne metalne jone. Vidi generalno US4,741,900 za jone metala koji se mogu konjugovati sa antitelima za upotrebu u dijagnostici. Pogodni enzimi uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu ili acetilholinesterazu; pogodne protetske grupe uključuju streptavidin, avidin i biotin; pogodni fluorescentni materijali uključuju umbelliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid i fikoeritrin; pogodni luminiscentni materijali uključuju luminol; pogodni bioluminiscentni materijali uključuju luciferazu, luciferin i aevorin; a pogodni radioaktivni nuklidi uključuju 1251, 1311, 111In i 99Tc.

[0142] U još jednoj realizaciji, efektorski molekul može povećati poluživot antitela in vivo, i/ili smanjiti imunogenost antitela i/ili poboljšati isporuku antitela preko epitelne barijere do imunog sistema. Primeri pogodnih efektorskih molekula ovog tipa uključuju polimere, albumine, proteine koji vezuju albumine ili jedinjenja koja vezuju albumine, kao što su ona opisana u WO05/117984.

[0143] Kada je efektorski molekul polimer, on generalno može biti sintetički ili prirodni polimer, na primer opciono supstituisani polialkilen ravnog ili razgranatog lanca, polialkenilen ili polioksialkilen, ili razgranati ili nerazgranati polisaharid, npr. homo- ili hetero-polisaharid.

[0144] Specifični opcioni supstituenti koji mogu biti prisutni na gore pomenutim sintetičkim polimerima uključuju jednu ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa.

[0145] Specifični primeri sintetičkih polimera uključuju opciono supstituisani poli (etilenglikol) ravnog ili razgranatog lanca, poli (propileneglikol) poli (vinilalkohol) ili njihove derivate, posebno opciono supstituisani poli (etilenglikol) kao što je metoksipol (etilenglikol) ili njihove derivate.

[0146] Specifični polimeri koji se javljaju u prirodi uključuju laktozu, amilozu, dekstran, glikogen ili njihove derivate.

1

[0147] Izraz "derivati" kako se ovde koristi je namenjen da uključuje reaktivne derivate, na primer tiol-selektivne reaktivne grupe kao što su maleimidi i slično. Reaktivna grupa može biti vezana za polimer direktno ili preko linkerskog segmenta. Podrazumeva se da će rezidua takve grupe u nekim slučajevima činiti deo proizvoda kao vezujuća grupa između fragmenta antitela i polimera.

[0148] Veličina polimera se može menjati po želji, ali će uglavnom biti u rasponu prosečne molekulske težine od 500Da do 50000Da, na primer od 5000 do 40000Da, kao što je od 20000 do 40000Da. Veličina polimera se može posebno odabrati na osnovu nameravane upotrebe proizvoda, na primer sposobnosti da se lokalizuje u određenim tkivima kao što su tumori ili produženja poluživota cirkulisanja (za pregled videti Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Tako, na primer, kada je proizvod namenjen da napusti cirkulaciju i prodre u tkivo, na primer za upotrebu u lečenju tumora, može biti korisno koristiti polimer male molekulske težine, na primer sa molekulskom težinom od oko 5000Da. Za primene u kojima proizvod ostaje u opticaju, može biti pogodno da se upotrebi polimer veće molekulske težine, na primer molekulske težine u opsegu od 20000Da do 40000Da.

[0149] Pogodni polimeri uključuju polialkilenski polimer, kao što je poli (etilen glikol) ili, naročito, metoksipol (etilen glikol) ili njegov derivat, a posebno sa molekulskom težinom u opsegu od oko 15000Da do oko 40000Da.

[0150] U jednoj realizaciji antitela za upotrebu u ovom otkriću su vezana za poli (etilenglikol) (PEG) ostatke. U jednom određenom primeru antitelo je fragment antitela i molekuli PEG mogu biti vezani kroz bilo koju raspoloživu aminokiselinsku funkcionalnu grupu bočnog lanca ili terminalnu aminokiselinsku funkcionalnu grupu koja se nalazi u fragmentu antitela, na primer bilo koju slobodnu amino, imino, tiol, hidroksilnu ili karboksilnu grupu. Takve aminokiseline se mogu prirodno javiti u fragmentu antitela ili mogu biti inženjerisane u fragment upotrebom metoda rekombinantne DNK (videti na primer US5,219,996; US 5,667,425; WO98/25971, WO2008/038024). Više lokacija se može koristiti za vezivanje dva ili više molekula PEG.

[0151] Pogodno PEG molekuli su kovalentno vezani kroz preko tiol grupe od najmanje jedne cisteinske rezidue smeštene u fragmentu antitela. Svaki molekul polimera vezan za modifikovani fragment antitela može biti kovalentno vezan za atom sumpora cisteinske rezidue smeštene u fragmentu. Kovalentna veza će generalno biti disulfidna veza ili, naročito, veza sumpor-ugljenik. Kada se kao tačka vezivanja koristi tiol grupa, mogu se koristiti odgovarajuće aktivirani efektorski molekuli, na primer tiol selektivni derivati kao što su maleimidi i derivati cisteina. Aktivirani polimer se može koristiti kao polazni materijal u pripremi polimer-modifikovanih fragmenata antitela kako je gore opisano. Aktivirani polimer može biti bilo koji polimer koji sadrži tiol reaktivnu grupu, kao što je α-halokarboksilna kiselina ili estar, npr. jodoacetamid, imid, npr. maleimid, vinil sulfon ili disulfid. Takvi polazni materijali se mogu dobiti komercijalno nabaviti (npr. kod Nektara, bivši Shearvater Polimers Inc., Huntsville, AL, USA) ili se mogu pripremiti od komercijalno dostupnih polaznih materijala koristeći konvencionalne hemijske postupke. Određeni molekuli PEG uključuju 20K metoksi-PEG-amin (dostupan kod Nektara, bivši Shearwater; Rapp Polymere; i SunBio) i M-PEG-SPA (dostupan kod Nektara, bivši Shearwater).

[0152] U jednoj realizaciji, Fab ili Fab' u molekulu je PEGilovan, t.j. ima PEG (poli (etilenglikol)) kovalentno vezan za njega, npr. prema metodi opisanoj u EP 0948544 ili EP1090037 [videti takođe "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. U jednoj ostvarenje PEG je vezano za cistein u predelu šarke. U jednoj realizaciji, PEG modifikovani Fab fragment ima maleimidnu grupu kovalentno vezanu sa jednom tiol grupom u modifikovanom zglobnom regionu. Lizinska rezidua može biti kovalentno vezana za maleimidnu grupu, a za svaku aminsku grupu na lizinskoj rezidui se može vezati polimer metoksipoli (etilenglikol) molekulske težine od približno 20.000Da. Ukupna molekularna težina PEG-a koji je vezan za Fab fragment može prema tome biti približno 40000Da.

[0153] Određeni molekuli PEG uključuju 2-[3-(N-maleimido) propionamido] etilamid od N,N'-bis (metoksipol(etilen glikol) MW 20.000) modifikovanog lizina, takođe poznatog kao PEG2MAL40K (dostupan kod Nektara, bivši Shearwater).

[0154] Alternativni izvori PEG linkera uključuju NOF koji snabdeva GL2-400MA2 (pri čemu je m u donjoj strukturi 5) i GL2-400MA (gde m je 2), a n je približno 450:

m je 2 ili 5

[0155] To znači da je svaki PEG oko 20000Da.

[0156] Još neki alternativni PEG efektorski molekuli sledećeg tipa:

su dostupni kod Dr Reddy, NOF i Jenkem.

[0157] U jednoj realizaciji obezbeđen je molekul antitela koji je PEGilovan (npr. sa ovde opisanim PEG-om), vezan preko cisteinske aminokiselinske rezidue na ili oko aminokiseline 226 u lancu, na primer aminokiselina 226 teškog lanca (sekvencijalno numerisanje).

[0158] U jednoj realizaciji je obezbeđena polinukleotidna sekvenca koja kodira molekul iz ovog otkrića, kao što je DNK sekvenca.

[0159] U jednoj realizaciji obezbeđena je polinukleotidna sekvenca koja kodira polipeptidne komponente molekula iz ovog otkrića, na primer:

a) polipeptidni lanac formule (I):

VH-CH1-X-V1;

i

b) polipeptidni lanac formule (II):

VL-CL-Y-V2;

u kojima:

VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer njegov domen 1;

X predstavlja vezu ili linker;

Y predstavlja vezu ili linker;

V1predstavlja dsscFv;

VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca,

CLpredstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca; kao što je Ckappa;

V2 predstavlja dsscFv;

pri čemu svaki od VH/VL, V1 i V2 formira mesto vezanja antigena, i

[0160] U jednoj realizaciji polinukleotid, kao što je DNK, je sadržan u vektoru.

[0161] Opšte metode pomoću kojih vektori mogu biti konstruisani, metode transfekcije i metode kultivacije su dobro poznate stručnjacima. S tim u vezi se poziva na „Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York i “Maniatis Manual” publikovan od Cold Spring Harbor Publishing.

[0162] Takođe je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži jedan ili više vektora za kloniranje ili ekspresiju koji sadrže jednu ili više DNK sekvenci koje kodiraju multispecifični protein iz ovog pronalaska. Bilo koji pogodan sistem ćelija domaćin/vektor se može koristiti za ekspresiju DNK sekvenci koje kodiraju molekul antitela iz ovog pronalaska. Mogu se koristiti bakterijski, na primer E. coli i drugi mikrobni sistemi ili eukariotski, na primer ekspresioni sistemi ćelija

1

domaćina sisara se takođe mogu koristiti. Pogodne ćelije domaćina sisara uključuju CHO, mijelom, ćelije NSO mijeloma i SP2 ćelije, COS ćelije ili hibridoma ćelije.

[0163] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju multispecifičnog proteina prema ovom otkriću, koji podrazumeva kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor iz ovog pronalaska pod uslovima pogodnim za vođenje do ekspresije proteina iz DNK koji kodira multispecifični protein iz predmetnog pronalaska, i izolovanje multispecifičnog proteina.

[0164] Za proizvodnju proizvoda koji sadrže i teški i laki lanac, ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora, prvim vektorom koji kodira polipeptid lakog lanca i drugim vektorom koji kodira polipeptid teškog lanca. Alternativno, može se koristiti jedan vektor, koji uključuje sekvence koje kodiraju polipeptide lakog i teškog lanca. U jednom primeru ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora, od kojih svaki kodira polipeptidni lanac molekula antitela iz ovog pronalaska.

[0165] U jednoj realizaciji ćelijska linija je transfektovana sa dva vektora od kojih svaki kodira različit polipeptid odabran između:

a) polipeptidnog lanca formule (I):

VH-CH1-X-V1;

b) polipeptidni lanac formule (II):

VL-CL-Y-V2;

u kojima:

VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca;

X predstavlja vezu ili linker;

Y predstavlja vezu ili linker;

V1predstavlja dsscFv;

VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CLpredstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2 predstavlja dsscFv;

pri čemu svaki od VH/VL, V1 i V2 formira mesto vezivanja antigena, i

[0166] Podrazumeva se da odnos svakog vektora transfektovanog u ć eliju doma ć ina može da varira kako bi se optimizovala ekspresija multi-specifičnog antitela. U jednoj realizaciji, kada se koriste dva vektora, odnos vektora može biti 1:1. U jednoj realizaciji u kojoj se koriste tri vektora, odnos vektora može biti 1:1:1. Razume se da stručna osoba može da pronađe optimalan odnos rutinskim ispitivanjem nivoa ekspresije proteina nakon transfekcije. Alternativno ili pored toga, nivoi ekspresije svakog polipeptidnog lanca multi-specifičnog konstrukta iz svakog vektora se može kontrolisati upotrebom istih ili različitih promotera.

[0167] Podrazumeva se da dve ili više ili kada su prisutne, tri polipeptidne komponente mogu biti kodirane polinukleotidom u jednom vektoru. Takođe se podrazumeva da kada su dve ili više, naročito tri ili više, polipeptidnih komponenata kodirane polinukleotidom u jednom vektoru, relativna ekspresija svake polipeptidne komponente se može menjati korišćenjem različitih promotera za svaki polinukleotid koji kodira polipeptidnu komponentu iz ovog otkrića.

[0168] U jednoj realizaciji vektor sadrži pojedinačnu polinukleotidnu sekvencu koja kodira dva, ili kada su prisutni, tri, polipeptidna lanca molekula multispecifičnog antitela iz ovog pronalaska pod kontrolom pojedinačnog promotera.

[0169] U jednoj realizaciji vektor sadrži pojedinačnu polinukleotidnu sekvencu koja kodira dva, ili kada su prisutna, tri polipeptidna lanca molekula multispecifičnog antitela iz ovog otkrića, pri čemu je svaka polinukleotidna sekvenca koja kodira svaki polipeptidni lanac pod kontrolom različitog promotera.

[0170] Multispecifični proteini prema ovom otkriću su eksprimirani u dobrim nivoima iz ćelija domaćina. Stoga se čini da su svojstva antitela i/ili fragmenata optimizovana i pogodna za komercijalno procesiranje.

[0171] Povoljno, molekuli multi-specifičnih antitela iz ovog otkrića minimiziraju količinu agregacije koja se zapaža nakon prečišćavanja i maksimiziraju količinu monomera u formulacijama konstrukta pri farmaceutskim koncentracijama, na primer monomer može biti prisutan u količini od 50%, 60 %, 70% ili 75% ili više, kao što je 80 ili 90% ili više, kao što je 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% ili više ukupnog proteina. U jednom primeru, prečišćeni uzorak molekula multi-specifičnog antitela iz ovog otkrića ostaje više od 98% ili 99% monomeran nakon 28 dana

1

skladištenja na 4 °C. U jednom primeru, prečišćeni uzorak molekula multi-specifičnog antitela iz ovog otkrića pri 5 mg/ml u fosfatnom puferskom fiziološkom rastvoru (PBS) ostaje više od 98% monomeran nakon 28 dana skladištenja na 4 °C.

[0172] Molekuli antitela iz ovog otkrića i kompozicije koje ih sadrže su korisni u lečenju, na primer u lečenju i/ili profilaksi patološkog stanja.

[0173] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje farmaceutsku ili dijagnostičku kompoziciju koja sadrži molekul antitela iz ovog otkrića u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, diluenata ili nosača. Shodno tome, obezbeđeno je antitelo iz ovog otkrića za upotrebu u lečenju i za proizvodnju leka, naročito za indikaciju koja je ovde opisana.

[0174] Kompozicija se obično isporučuje kao deo sterilne farmaceutske kompozicije koja obično uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija prema ovom otkriću može dodatno da sadrži farmaceutski prihvatljiv adjuvans.

[0175] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupak za pripremu farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije koja uključuje dodavanje i mešanje molekula antitela iz ovog otkrića zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, diluenata ili nosača.

[0176] Molekul antitela može biti jedini aktivni sastojak u farmaceutskoj ili dijagnostičkoj kompoziciji ili može biti udružen sa drugim aktivnim sastojcima, uključujući druge sastojke antitela, na primer anti-IL-1β, anti-T ćeliju, anti-IFNy ili anti-LPS antitela ili sastojke koji nisu antitela kao što su ksantini. Ostali pogodni aktivni sastojci uključuju antitela sposobna da indukuju toleranciju, npr. anti-CD3 ili anti-CD4 antitela.

[0177] U sledećoj realizaciji, antitelo, fragment ili kompozicija prema ovom otkriću se koristi u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim sredstvom.

[0178] Farmaceutske smeše pogodno sadrže terapeutski efikasnu količinu molekula antitela prema ovom pronalasku. Termin "terapeutski efikasna količina", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu terapeutskog agensa koja je potrebna za lečenje, poboljšanje ili sprečavanje ciljane bolesti ili stanja ili za pokazivanje terapeutskog ili preventivnog dejstva koji se može detektovati. Za bilo koje antitelo, terapeutski efikasna količina se u početku može proceniti bilo u testovima ćelijske kulture ili na životinjskim modelima, obično kod glodara, zečeva, pasa, svinja ili primata. Životinjski model se takođe može koristiti za određivanje odgovarajućeg opsega koncentracije i načina administracije. Takve informacije se zatim mogu koristiti za određivanje korisnih doza i načina administracije kod ljudi.

[0179] Precizna terapeutski efikasna količina za humanog subjekta zavisiće od težine bolesti, opšteg zdravstvenog stanja subjekta, starosti, težine i pola subjekta, dijete, vremena i učestalosti administracije, kombinacije(a) leka, osetljivosti reakcije i tolerancije/odgovora na terapiju. Ova količina se može utvrditi rutinskim eksperimentisanjem i ona je u okviru procene kliničara. Generalno, terapeutski efikasna količina biće od 0.01 mg/kg do 50 mg/kg, na primer 0.1 mg/kg do 20 mg/kg. Alternativno, doza može biti 1 do 500 mg dnevno, kao što je 10 do 100, 200, 300 ili 400 mg dnevno. Farmaceutske kompozicije mogu biti pogodno predstavljene u obliku jediničnih doza koje sadrže unapred određenu količinu aktivnog agensa prema pronalasku.

[0180] Kompozicije pacijentu mogu biti administrirane pojedinačno ili u kombinaciji (npr. simultano, sekvencijalno, sekvencijalno ili odvojeno) sa drugim agensima, lekovima ili hormonima.

[0181] Doza u kojoj se molekul antitela iz ovog otkrića administrira, zavisi od prirode stanja koje se leči, obima prisutnog zapaljenja i od toga da li se molekul antitela koristi profilaktički ili za lečenje postojećeg stanja.

[0182] Učestalost doze zavisiće od vremena poluraspada molekula antitela i trajanja njegovog efekta. Ako molekul antitela ima kratak poluživot (npr 2 do 10 sati) možda će biti potrebno davati jednu ili više doza dnevno. Alternativno, ako molekul antitela ima dug poluživot (npr. 2 do 15 dana), možda će biti potrebno davati dozu jednom dnevno, jednom nedeljno ili čak jednom u 1 ili 2 meseca.

[0183] Farmaceutski prihvatljiv nosač sam po sebi ne bi trebalo da indukuje proizvodnju antitela štetnih za pojedinca koji prima kompoziciju i ne bi trebalo da bude toksičan. Pogodni nosači mogu biti veliki, sporo metabolišući makromolekuli kao što su proteini, polipeptidi, lipozomi, polisaharidi, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne aminokiseline, aminokiselinski kopolimeri i neaktivne virusne čestice.

[0184] Mogu se koristiti farmaceutski prihvatljive soli, na primer soli mineralnih kiselina, kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati i sulfati, ili soli organskih kiselina, kao što su acetati, propionati, malonati i benzoati.

[0185] Farmaceutski prihvatljivi nosači u terapeutskim kompozicijama mogu dodatno da sadrže tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Pored toga, u takvim kompozicijama mogu biti prisutne pomoćne supstance, kao što su sredstva za vlaženje ili emulgovanje ili pH puferske supstance. Takvi nosači omogućavaju farmaceutskim kompozicijama da budu formulisane u obliku tableta, pilula, dražeja, kapsula, tečnosti, gelova, sirupa i suspenzija, koje pacijent može da proguta.

[0186] Pogodni oblici za primenu uključuju oblike pogodne za parenteralnu administraciju, npr. injekcijom ili infuzijom, na primer bolus injekcijom ili kontinualnom infuzijom. Kada je proizvod za injekciju ili infuziju, može imati oblik suspenzije, solucije ili emulzije u uljnom ili vodenom nosaču i može sadržati formulatorne agense, poput agensa

1

za suspendovanje, konzervansa, stabilizatora i/ili agensa za dispergovanje. Alternativno, molekul antitela može biti u suvom obliku, za rekonstituciju pre upotrebe sa odgovarajućom sterilnom tečnošću.

[0187] Kada se formulišu, kompozicije prema pronalasku mogu biti administrirane direktno subjektu. Subjekti koji se leče mogu biti životinje. Međutim, u jednom ili više izvođenja, preparati su prilagođeni za primenu na humanim subjektima.

[0188] U jednoj realizaciji, u formulacijama prema ovom otkriću, pH finalne formulacije nije sličan vrednosti izoelektrične tačke antitela ili fragmenta, jer ako je pH formulacije 7 onda pI od 8-9 ili više može biti odgovarajući. Bez namere za vezivanje za teoriju, smatra se da ovo na kraju može pružiti konačnu formulaciju sa poboljšanom stabilnošću, na primer antitelo ili fragment koji ostaje u rastvoru.

[0189] Farmaceutske kompozicije iz ovog otkrića mogu biti administrirane na bilo koji način, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralni, intravenozni, intramuskularni, intraarterijski, intramedularni, intratekalni, intraventrikularni, transdermalni, transkutani (npr. videti WO98/20734), potkožni, intraperitonealni, intranazalni, enteralni, topikalni, sublingvalni, intravaginalni ili rektalni put. Hiposprejevi se takođe mogu koristiti za administraciju farmaceutskih kompozicija prema pronalasku. Tipično, terapeutske smeše mogu biti pripremljene kao injekcije, ili kao tečni rastvori ili suspenzije. Čvrste forme pogodne za rastvaranje ili suspendovanje u tečnim nosačima pre injektiranja takođe mogu biti pripremljena. Poželjno je da se molekuli antitela iz ovog pronalaska daju subkutano, inhalacijom ili lokalno.

[0190] Direktna isporuka kompozicija će se generalno postići injekcijom, subkutano, intraperitonealno, intravenozno ili intramuskularno, ili isporučiti u intersticijalni prostor tkiva. Kompozicije takođe mogu biti administrirane u određeno tkivo od interesa. Tretman doziranja može biti raspored pojedinačnih doza ili raspored višestrukih doza.

[0191] Podrazumeva se da će aktivni sastojak u kompoziciji biti molekul antitela. Kao takav, biće podložan razgradnji u gastrointestinalnom traktu. Prema tome, ako se kompozicija administrira putem gastrointestinalnog trakta, kompozicija će morati da sadrži agense koji štite antitelo od razgradnje, ali koji oslobađaju antitelo nakon što se apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta.

[0192] Detaljna rasprava o farmaceutski prihvatljivim nosačima je dostupna u Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J.1991).

[0193] U jednoj realizaciji, formulacija je obezbeđena kao formulacija za lokalnu primenu, uključujući inhalaciju.

[0194] Pogodni inhalabilni preparati uključuju inhalabilne praškove, aerosolove sa dozatorom koje sadrže propelante ili inhalabilne rastvore bez propelanata (kao što su rastvori za nebulizaciju ili suspenzije). Inhalabilni praškovi prema ovom otkriću koji sadrže aktivnu supstancu se mogu sastojati samo od gore pomenutih aktivnih supstanci ili od smeše gore pomenutih aktivnih supstanci sa fiziološki prihvatljivim ekscipijentom.

[0195] Ovi inhalabilni praškovi mogu da sadrže monosaharide (npr. glukozu ili arabinozu), disaharide (npr. laktozu, saharozu, maltozu), oligo- i polisaharide (npr. dekstrane), polialkohole (npr. sorbitol, manitol, ksilitol), soli (npr. natrijum hlorid), kalcijum-karbonat) ili njihove mešavine. Pogodno se koriste mono- ili disaharidi, upotreba laktoze ili glukoze, naročito, ali ne i isključivo je u obliku njihovih hidrata.

[0196] Čestice za depoziciju u plućima zahtevaju veličinu manju od 10 mikrona, kao što je 1-9 mikrona, na primer od 0.1 do 5 µm, naročito od 1 do 5 µm. Veličina čestica aktivnog agensa (kao što su antitelo ili fragment antitela) je od primarne važnosti.

[0197] Propelanti koji se mogu koristiti za pripremu inhalabilnih aerosola su poznati u stanju tehnike. Pogodni propelanti se biraju između ugljovodonika kao što su n-propan, n-butan ili izobutan i halohidrokarbonati kao što su hlorovani i/ili fluorirani derivati metana, etana, propana, butana, ciklopropana ili ciklobutana. Gore pomenuti propelanti se mogu koristiti samostalno ili u njihovim smešama.

[0198] Naročito pogodni propelanti su halogenovani derivati alkana izabrani između TG 11, TG 12, TG 134a i TG227. Od gore pomenutih halogenovanih ugljovodonika, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoretan) i TG227 (1,1,1,2,3, 3,3-heptafluoropropan) i njihove smeše su posebno pogodni.

[0199] Inhalabilni aerosoli koji sadrže propelant mogu takođe da sadrže i druge sastojke kao što su ko-rastvarači, stabilizatori, površinski aktivna sredstva (surfaktanti), antioksidanti, lubrikanti i sredstva za podešavanje pH. Svi ovi sastojci su poznati u tehnici.

[0200] Inhalabilni aerosoli, u skladu sa pronalaskom, koji sadrže propelant mogu sadržati do 5 % tež. aktivne supstance. Aerosoli prema pronalasku sadrže, na primer, 0.002 do 5 tež.%, 0.01 do 3 % tež., 0.015 do 2 % tež., 0.1 do 2 % tež., 0.5 do 2 % tež. Ili 0.5 do 1 % tež. težina aktivne.

[0201] Alternativno, lokalna administracija na plućima takođe može biti administracija formulacije u vidu tečnog rastvora ili suspenzije, na primer, korišćenjem uređaja kao što je nebulizator, na primer, nebulizator povezan sa kompresorom (npr. nebulizator Pari LC-Jet Plus(R) povezan sa kompresorom Pari Master(R) koji proizvodi Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

[0202] U jednoj realizaciji, formulacija je obezbeđena u obliku diskretnih ampula koje sadrže jediničnu dozu za isporuku nebulizacijom.

1

[0203] U jednoj realizaciji antitelo se isporučuje u liofilizovanom obliku, za rekonstituciju ili alternativno, u obliku suspenzije.

[0204] Antitelo iz ovog otkrića se može isporučiti dispergovano u rastvaraču, npr. u obliku rastvora ili suspenzije. Može biti suspendovano u odgovarajućem fiziološkom rastvoru, npr. fiziološkom slanom rastvoru, farmakološki prihvatljivom rastvaraču ili puferskom rastvoru. Puferisani rastvori poznati u tehnici mogu sadržati 0.05 mg do 0.15 mg dinatrijum edetata, 8.0 mg do 9.0 mg NaCl, 0.15 mg do 0.25 mg polisorbata, 0.25 mg do 0.30 mg bezvodne limunske kiseline i 0.45 mg do 0.55 mg natrijum citrata na 1 ml vode tako da se postigne pH od oko 4.0 do 5.0. Kao što je gore pomenuto, suspenzija se može napraviti, na primer, od liofilizovanog antitela.

[0205] Terapeutske suspenzije ili formulacije rastvora mogu takođe da sadrže jedan ili više ekscipijenata. Ekscipijenti su dobro poznati u struci i uključuju pufere (npr. citratni pufer, fosfatni pufer, acetatni pufer i bikarbonatni pufer), aminokiseline, ureu, alkohole, askorbinsku kiselinu, fosfolipide, proteine (npr. serumski albumin), EDTA, natrijum hlorid, lipozome, manitol, sorbitol i glicerol. Rastvori ili suspenzije se mogu inkapsulirati u lipozome ili biorazgradive mikrosfere. Formulacija će generalno biti obezbeđena u suštinski sterilnom obliku primenom sterilnih proizvodnih procesa.

[0206] Ovo može uključivati proizvodnju i sterilizaciju filtracijom puferskog rastvora rastvarača koji se koristi za formulaciju, aseptičnu suspenziju antitela u sterilnom puferisanom rastvoru rastvarača i raspodeljivanje formulacije u sterilne posude postupcima poznatim prosečnim stručnjacima.

[0207] Formulacija za nebulizaciju u skladu sa ovim otkrićem može biti obezbeđena, na primer, u obliku pojedinačne dozne jedinice (npr. zaptivene plastične posude ili viali) upakovani u koverte od folije. Svaki vial sadrži jediničnu dozu u zapremini, npr.2 ml rastvarača/rastvora pufera.

[0208] Smatra se da su antitela iz ovog otkrića pogodna za isporuku nebulizacijom.

[0209] Takođe je predviđeno da se antitelo iz ovog pronalaska može primeniti upotrebom genske terapije. Da bi se to postiglo, DNK sekvence koje kodiraju teški i laki lanac molekula antitela pod kontrolom odgovarajućih komponenata DNK se uvode u pacijenta tako da se lanci antitela eksprimiraju od DNK sekvenci i sklapaju in situ.

[0210] Patološko stanje ili poremećaj mogu, na primer, biti izabrani iz grupe koju čine infekcije (virusne, bakterijske, gljivične i parazitske), endotoksični šok povezan sa infekcijom, artritis kao što je reumatoidni artritis, astma kao teška astma, hronična opstruktivna plućna bolest (HOBP), karlična inflamatorna bolest, Alzheimer-ova bolest, inflamatorna bolest creva, Crohnova bolest, ulcerozni kolitis, Peironiejeva bolest, celijakija, bolest žučne kese, pilonidalna bolest, peritonitis, psorijaza, vaskulitis, hirurška adhezija, moždani udar, dijabetes tipa I, lajmska bolest, meningoencefalitis, autoimunski uveitis, imunološki posredovani inflamatorni poremeć aji centralnog i perifernog nervnog sistema kao što je multipla skleroza, lupus (kao što je sistemski eritematozni lupus) i Guillain-Barr-ov sindrom, atopijski dermatitis, autoimunski hepatitis, fibrozni alveolitis, Grave-ova bolest, IgA nefropatija, idiopatska trombocitopenična purpura, Meniere-ova bolest, pemfigus, primarna bilijarna ciroma, sargeroze, sargijska bolest drugi autoimuni poremeć aji, pankreatitis, trauma (hirurška intervencija), bolest graft-versus-host, odbacivanje transplantata, bolesti srca, uključujuć i ishemijske bolesti poput infarkta miokarda, kao i ateroskleroza, intravaskularna koagulacija, resorpcija kostiju, osteoporoza, osteoartritis, parodontitis i hipohloridija.

[0211] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje molekul multi-specifičnog antitela prema predstavljenom pronalasku za upotrebu u lečenju ili profilaksi bola, naročito bola povezanog sa upalom.

[0212] Tako je prema ovom otkriću obezbeđeno multi-specifično antitelo za upotrebu u lečenju i metode lečenja koje ga koriste.

[0213] Multi-specifično antitelo prema pronalasku može se prečistiti postupkom za prečišćavanje koji obuhvata korake: izvođenje anionsko-izmenjivačke hromatografije u ne-vezujućem režimu tako da se nečistoće zadržavaju na koloni a antitelo se održava u nevezanoj frakciji. Ovaj korak se može izvesti, npr. pri pH oko 6-8.

[0214] Postupak dalje može obuhvatati inicijalni korak zarobljavanja koji koristi jonoizmenjivačku hromatografiju, izvedenu na primer pri pH od oko 4 do 5.

[0215] Postupak može sadržati i dodatne korake hromatografije da bi se proizvod osigurao i procesne nečistoće na odgovarajući način izdvojile iz toka proizvoda.

[0216] Postupak prečišćavanja takođe može da sadrži jedan ili više koraka ultra-filtracije, kao što je korak koncentracije i dijafiltracije.

[0217] Prečišćeni oblik kako se koristi supra je namenjen da se odnosi na čistoću od najmanje 90%, kao što je 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% tež/tež ili više.

[0218] Suštinski bez endotoksina generalno treba da se odnosi na sadržaj endotoksina od 1 EU po mg proizvoda antitela ili manje, kao što je 0.5 ili 0.1 EU po mg proizvoda.

[0219] Suštinski bez proteina ili DNK ćelije domaćina generalno treba da se odnosi na protein ćelije domaćina i/ili sadržaj DNK od 400 µg po mg proizvoda antitela ili manje, kao što je 100 µg po mg ili manje, naročito 20 µg po mg, prema potrebi.

[0220] Molekul antitela iz ovog pronalaska se takođe može koristiti u dijagnozi, na primer u in vivo dijagnozi i

1

imidžingu stanja bolesti.

[0221] "Obuhvata" u kontekstu ove specifikacije treba da znači uključuje. Kada je to tehnički prikladno, realizacije pronalaska se mogu kombinovati. Realizacije su ovde opisane kao da sadrže određene karakteristike/elemente.

[0222] Bilo koja realizacija koja je ovde posebno i eksplicitno iznesena može predstavljati osnovu izjave o odricanju odgovornosti bilo samostalno ili u kombinaciji sa jednom ili više daljih realizacija.

[0223] Ovo otkriće je dalje samo ilustrativno opisano u sledećim primerima, koji se odnose na prateće Slike, u kojima:

Kratak opis Slika

[0224]

Slika 1 prikazuje Fab-2xdsscFv i Fab-dsscFv-dsFv konstrukte iz predstavljenog otkrića.

Slika 2 prikazuje SDS-PAGE analizu proteinom G-prečišćenih, HEK293-eksprimiranih Fab1xdsscFv, 1xscFv i Fab-2xdsscFv proteina.

Slika 3 prikazuje G3000 SE HPLC analizu proteinom G-prečišćenih, HEK293-eksprimiranih Fab1xdsscFv, 1xscFv i Fab-2xdsscFv proteina

Slika 4 SDS-PAGE analiza prečišćenih, HEK293-eksprimiranih Fab-2xdsscFv#3 proteina

Slika 5 S200 SE HPLC analiza prečišćenih, HEK293-eksprimiranih Fab-2xdsscFv # 3 proteina

Slika 6 prikazuje SDS-PAGE analizu različitih proteinom G prečišćenih Fab-dsscFv-dsFv konstrukata iz predstavljenog otkrića.

(A) Fab-dsscFv-dsscFv uzorci. (B) Fab-dsscFv-dsFv uzorci

Slika 7 prikazuje G3000 SE HPLC analizu proteinom G prečišćenih Fab-dsscFv-dsFv konstrukata iz ovog otkrića.

Slika 8 prikazuje SDS-PAGE analizu različitih konstrukta prema ovom otkriću u redukujućim uslovima.

Slika 9 prikazuje G3000 SE-HPLC analizu vremenskog toka monomernih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab- 2xdsscFv formata Slika 10 prikazuje SDS-Page analizu proteinom-G prečišć enih EXPiHEK eksprimiranih formata Fab- 2xscFv i Fab-2xdsscFv

PRIMERI

[0225]

Fragmenti antitela za ANTIGEN 1 su obeleženi #1

Fragmenti antitela za ANTIGEN 2 su obeleženi #2

Fragmenti antitela za ANTIGEN 3 su obeleženi #3

Fragmenti antitela za ANTIGEN 4 su obeleženi #4

PRIMER 1: Fab-2xdsscFv

Konstrukcija plazmida za ekspresiju uć elijama sisara

[0226] Plazmidi za ekspresiju Fab#2-(HC)dsscFv#3, (LC)dsscFv#4 i Fab#2-(LC)dsscFv#3, (HC)dsscFv#4 (vidi Sliku 1), su konstruisani fuzijom scFv#3 i scFv#4 sa C-terminusom Km3 alotip humanog kappa konstantnog regiona lakog lanca # 2 pomoću fleksibilnog linkera SGGGGSGGGGS [ovde se takođe naziva S, 2xG4S] (SEK ID BR: 2), ili fuzijom scFv#3 i scFv#4 sa C-terminusom γ1 izotip humani gama-1 CH1konstantnog regiona, #2 teškog lanca, pomoću fleksibilnog linkera SGGGGTGGGGS [ovde se takođe naziva S, G4T, G4S] (SEK ID BR: 1). Pored toga, tačkaste mutacije su uvedene u DNK sekvence na odabranim reziduama u okvirnom regionu i vL#3/vL#4 i vH#3/vH#4. Mutacije (teški lanac G44C i laki lanac G100C) su uvedene kako bi se stvorila međulančana disulfidna veza između teškog i lakog lanca Fv#3. Mutacije (teški lanac G44C i laki lanac K100C) su uvedene kako bi se stvorila međulančana disulfidna veza između teškog i lakog lanca Fv#4. Fragmenti gena koji kodiraju scFv#4 i dsscFv#4 (vHvL i vLvH orijentacija) su proizvedeni hemijski i fuzionisani sa Fab#2 kako je gore opisano da se generiše:

Plazmid e1: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-vL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR 68])-vH#4;

Plazmid f1: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-dsvL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-dsvH # 4; Plazmid e2: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-vH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-vL#4;

Plazmid f2: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-dsvH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-dsvL#4; Plazmid g1 Teški#2-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1])-vL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-vH#4;

Plazmid h1:Teški#2-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1])-dsvL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-dsvH#4; Plazmid g2: Teški#2-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1])-vH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-vL#4; i

2

plazmid h2: Teški #2-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1])-dsvH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGG-GS [SEK ID BR: 68])-dsvL#4.

pND1 plazmid (Fab#2 Teški-(SGGGGTGGGGS SEK ID BR: 1)-dsvH#3- (GGGGSGGGGSGGGGS-GGGGS SEK ID BR: 68)-dsvL#3) [Plazmid i] je već bio dostupan. Fragment gena koji kodira dsHLscFv#3 je eksciziran iz pND1 i fuzionisan sa lakim lancem#2 kako je gore opisano da se dobije: Laki#2-(SGGGGSGGGGS SEK ID BR: 2)-ds-vH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEK ID BR: 68)-dsvL#3 [plazmid j].

Svi Fab fuzioni formati su klonirani u ekspresione vektore sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i sekvence SV40E poliA.

HEK293 ekspresija formata Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv

[0227] HEK293 ćelije su transfektovane odgovarajućim plazmidima koristeći Invitrogenov transfekcioni reagens 293fectin u skladu sa uputstvima proizvođača. Plazmidi su pomešani kako je prikazano u Tabeli 4 da bi se eksprimirali različiti konstrukti:

[0228] Odnos plazmida korišćenih za transfekcije je bio 1:1. Ukupno 50 µg plazmidne DNK je inkubirano sa 125 µl 293fectin 4.25 ml Optimem medijuma tokom 20 minuta na ST. Smeša je zatim dodata u 50 ml HEK293 ćelija u suspenziji pri 1 x 10<6>ćelija/ml i inkubirana uz mućkanje na 37 °C. Supernatanti su sakupljeni na dan 10 centrifugiranjem na 1500 g radi uklanjanja ćelija i supernatant je propušten kroz filter od 0.22 µm. Nivo ekspresije je određen pomoću Protein-G HPLC.

Tabela 5 prikazuje rezultate Protein-G HPLC testa. Kao što se može videti, nivoi ekspresije svih konstrukata su bili međusobno uporedivi, i pokrivali su opseg od 11-23 µg/ml. Oni označeni zvezdicom (*) su eksprimirani u zasebnoj transfekciji, zbog čega se apsolutni nivoi ekspresije LC-scFv#3, HC-scFv#4 ne mogu upoređivati sa HC-scFv#3, LC-scFv#4.

Prečišćavanje proteinom-G formata Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv eksprimiranih u HEK293

[0229] Supernatanti HEK293 ∼ 50ml su koncentrovani ∼ 25-tostruko do 2ml koncentratora sa prekidom molekulske mase od 10 kDa. Koncentrovani supernatanti su naneti na 1 ml HiTrap Protein-G FF kolonu (GE Healthcare) ekvilibrisanu u 20 mM fosfatu, 40mM NaCl pH7.4. Kolona je isprana sa 20mM fosfata, 40mM NaCl pH7.4 i vezani materijal je eluiran sa 0.1M glicin/HCl pH2.7. Pik elucije je zabeležen i pH podešen na∼ pH7.0 sa 2M Tris/HCl pH8.5. Elucije sa podešenim pH su koncentrovane i pufer zamenjen u PBS pH 7.4 korišćenjem koncentratora sa prekidom molekulske mase od 10 kDa.

SDS-PAGE analiza proteinom-G prečišćenih, HEK293 eksprimiranih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0230] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine 9.75 µl u koju je dodato 3.75 µl 4xLDS pufera za uzorke i 1.5 µl 100 mM N-etilmaleimida (ne-redukovani uzorci) ili 1.5 µl 10x NuPAGE redukujućeg sredstva (redukovani uzorci). Uzorci su vorteksovani, inkubirani na 70 °C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 o/min tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su naneti na 4-20% akrilamid Tris/Glicin SDS gel i držani oko 100 minuta na konstantnom naponu od 125 V. Korišćena je lestvica molekulske težine SeeBluePlus2 (Life Technologies). Gelovi su obojeni Instant Blue Protein bojom (Expedeon) i obezbojeni destilovanom vodom.

Očekivane veličine traka nakon redukujućeg i neredukujućeg SDS-PAGE su prikazane u Tabeli 6.

[0231] Za sve proteine je očekivano da neredukujući gel pokaže traku na ~100kDa, dok se na redukujućim gelovima očekivao dublet na ~50kDa sa jednakim bojenjem u obe trake. Za sve proteine Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv, redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali rasporede traka koji su ukazivali na to da su konstrukti pravilno eksprimirani i u pogledu položaja migracije i intenziteta bojenja dubletom od ~ 50kDa (Slika 2B, D). Dodatna gornja manja traka je u skladu sa neredukovanim proteinima pune dužine. Kao što se i očekivalo, disulfidno vezani multimeri se vide na neredukujućem gelu (Slika 2A, C), koji nestaju u redukujućim uslovima (Slika 2B, D). Manje trake pri ~50kDa na neredukujućem gelu (Slika 2A, C) mogu biti konzistentne sa nepotpunim stvaranjem ds veze između teškog i lakog lanca u Fab regionu.

G3000 SE-HPLC analiza Proteinom-G prečišćenih, HEK293 eksprimiranih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0232] 10 µg prečišćenih uzoraka proteina (100 µl 0.1 mg/ml osnovni razblažen u PBS) je ubrizgan u TSK Gel G3000SWXL, 7.8x300 mm, kolona (Tosoh) 3 dana nakon prečišćavanja i razvijen sa izokratskim gradijentom od 200 mM fosfata pH 7.0 pri 1 ml/min. Detekcija signala bila je apsorbansom na 280 nm. Rezultati su prikazani na Slici 3. Kao što se može videti sa Slike 3, nakon prečišćavanja proteinom-G, Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formati su bili 83-89% monomerni. Iako svi uzorci imaju slične nivoe monomera u testu, oni uzorci koji sadrže scFv kojem nedostaje Fv disulfid su u dinamičkom ekvilibrijumu. To znači da % monomera izmeren u testu za ove uzorke zavisi od koncentracije uzorka, koncentrisaniji uzorci daju veći % monomera, a manje koncentrovani uzorci daju niži % monomera. Nasuprot tome, uzorci u kojima oba scFv sadrže disulfid su stabilni i nisu u dinamičkoj ravnoteži. Stoga se % monomera izmeren u testu ne menja sa promenama u koncentraciji uzorka.

[0233] Kako su monomeri i multimeri u Fab-2xdsscFv formatima stabilni i nisu u dinamskoj ravnoteži, uzorci se lako mogu dalje prečišćavati da bi se povećao% monomera. Prečišćeni monomerni uzorci će takođe ostati monomerni čak i kada se poveća koncentracija konstrukta u datoj formulaciji, čineći tako konstrukte vrlo pogodnim za upotrebu u farmaceutskim preparatima. Suprotno tome, Fab-2xscFv može nakon prečišćavanja kao monomer biti predmet intermolekularne dinamičke razmene domena između vL i vH scFv domena. Pored toga, povećanom riziku od stvaranja dimera, trimera, strukture višeg reda i agregiranje takvih molekula je teško uočiti, jer se neagregirani oblici mogu razložiti u monomer nakon koraka razblaživanja koji se koriste tokom analitičkih metoda. Dakle, Fab-2xdsscFv obezbeđuju dodatnu jasnoću tokom analize farmaceutskih kompozicija.

CHOS ekspresija Fab-lxdsscFv-lkscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0234] CHOS ćelije su transfektovane odgovarajućim plazmidima metodama elektroporacije u razmeri od 1L. Plazmidi su pomešani kako je prikazano u Tabeli 7 da bi se protein eksprimirao. Kulture su uzgajane u CD-CHO medijumu dopunjenom sa 2 mM GlutaMAKS-a i inkubirane na 37 °C sa 8% CO2pri 140 o/min tokom 24 sata i potom inkubirane sledećih 13 dana na 32 °C. Četvrtog dana posle transfekcije, kulturi je dodat natrijum butirat u finalnoj koncentraciji od 3 mM. Na dan 14 nakon transfekcije, supernatanti kultura su sakupljeni centrifugiranjem i sterilisani filterom od 0.22 µm. Titri ekspresije su izmereni pomoću Protein G HPLC (Tabela 8).

[0235] 1L CHO supernatanti su koncentrovani ∼ 25-tostruko do ∼ 40 ml korišćenjem Amicon mešane ćelije sa prekidom molekulske mase od 10kDa. Koncentrovani supernatanti su stavljeni u sistem AKTA Express Purification sistem sa Protein G kolonom i PBS kao puferom za razdvajanje. Vezani materijal je eluiran sa 0.1 M glicin/HCl pH2.7 i pH je podešen na ∼ pH7.0 sa 2M Tris/HCl pH 8.5. Eluirani materijal je zatim koncentrovan pomoću koncentratora molekulske težine od 10 kDa, a rezultujući koncentrat je nanet na Superdex kolonu (GE Healthcare) za gel filtraciju sa PBS kao puferom za razdvajanje. Pojedinačni elucioni pikovi su prikupljeni i analizirani pomoću HPLC isključenjem po veličini da bi se odredila monomerna frakcija. Finalni monomerni protein je koncentrovan na 5 mg/ml u PBS i čuvan na 4 °C.

2

SDS-PAGE analiza Proteinom-G prečišćene, CHOS eksprimirane monomerne frakcije Fab-1xdsscFv-1xscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0236] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine 9.75 µl u koju je dodato 3.75 µl 4xLDS pufera za uzorke i 1.5 µl 100 mM N-etilmaleimida (ne-redukovani uzorci) ili 1.5 µl 10x NuPAGE redukujućeg sredstva (redukovani uzorci). Uzorci su vorteksovani, inkubirani na 70 °C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 o/min tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su naneti na 4-20% akrilamidni Tris/Glicin SDS gel i držani oko 100 minuta na konstantnom naponu od 125 V. Korišćene su lestvice molekulske težine Mark12 (Life Technologies). Gelovi su obojeni Instant Blue protein stain (Expedeon) i obezbojeni destilovanom vodom.

Očekivane veličine traka nakon redukujućeg i ne-redukujućeg SDS-PAGE su prikazane u Tabeli 9.

T b l 9

[0237] Za sve proteine se očekivalo da ne-redukujući gel pokaže traku na ∼ 100kDa, dok se od redukujućeg gela očekivalo da pokaže dublet na ∼ 50kDa sa jednakim bojenjem u obe trake.

Za sve Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv proteine, redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali rasporede traka koji su ukazivali da su konstrukti monomerni i pravilno eksprimirani i u pogledu položaja migracije i intenziteta bojenja sa dubletom na ~ 50kDa (Slika 8B, D). Dodatna gornja manja traka je u skladu sa ne-redukujućim proteinima pune dužine (Slika 8B, D). Za sve proteine, ne-redukujući gel je pokazao traku na ~ 100kDa, što ukazuje na protein pune dužine (Slika 8A, a). Manje trake pri ~ 50 kDa na ne-redukujućem gelu (Slika 8A, b) mogu biti u skladu sa nekompletnim formiranjem disulfidne veze između teškog i lakog lanca u Fab regionu.

Analiza vremenskog toka G3000 SE-HPLC monomernih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0238] 5 mg/ml prečišćenog monomera formata antitela je čuvano na 4 °C u PBS i analizirano na dan 4, dan 14 i dan 28 nakon prečišćavanja. Uzorci su razređeni u PBS na 10 µg i ubrizgani u TSK gel G3000SWXL, 7.8x300 mm, kolona (Tosoh) i razvijeni sa izokratskim gradijentom od 200 mM fosfata pH 7.0 pri 1 ml/min. Detekcija signala je bila pomoću apsorbancom na 280 nm. Rezultati su prikazani na Slici 9. Na dan 4 nakon prečišćavanja, analiza Fab-2xdsscFv je pokazala da je većina proteina bila monomerna na početku eksperimenta (pune linije) i da je ostala monomerna i stabilna tokom vremena, sa <1% definisanim kao multimeri (dimeri, trimeri, viši redovi i veliki agregati). Sa druge strane, otkrivena je veća pojava multimerizacije za Fab-1xdsscFv-1xscFv za koju je primećeno da se vremenom linearno povećava (isprekidane linije). Zapravo, čini se da je prevalencija multimerizacije izraženija kod formata koji sadrže ne-disulfidno stabilizovane scFv u orijentaciji VL/VH. Međutim, jasno je da su formati koji sadrže scFv kojem nedostaje Fv disulfid u dinamičkoj ravnoteži i skloniji su multimerizaciji tokom skladištenja od scFv koji su stabilizovani disulfidom. Zapravo, pokazalo se da formati koji sadrže scFv koji su oba disulfidno stabilizovani ostaju monomerni čak i kada je koncentracija proteina u datoj formulaciji povećana. To čini konstrukte u kojima oba scFv sadrže Fv disulfid idealno pogodnim za upotrebu u farmaceutskim preparatima, gde rizik od stvaranja viših redova multimera ili velikih agregata tokom perioda skladištenja mora biti zanemarljiv.

PRIMER 2: Fab-2xdsscFv (Bivalentni sa dva ista dsscFv)

Konstrukcija plazmida za ekspresiju u ćelijama sisara

[0239] Plazmidi za ekspresiju Fab#2-(HC)dsscFv#3, (LC)dsscFv#3 (vidi Sliku 4), su konstruisani fuzijom dsscFv # 3 za C-terminus Km3 alotip humanog kappa konstantnog regiona lakog lanca # 2 pomoću fleksibilnog linkera SGGGGSGGGGS [ovde se takođe naziva S, 2xG4S] (SEK ID BR: 2), ili fuzijom dsscFv # 3 za C-terminus, γ1 izotip humanog gama-1 CH1 konstantnog regiona teškog lanca #2, pomoću fleksibilnog linkera SGGGGTGGGGS [ovde se takođe naziva S, G4T, G4S] (SEK ID BR: 1). Tačkaste mutacije su uvedene u DNK sekvence na odabranim reziduama u okvirnom regionu i vL#3/vL#1 i vH#3/vH#1. Uvedene su mutacije (teški lanac G44C i laki lanac G100C) kako bi se stvorila međulančana disulfidna veza između teškog i lakog lanca Fv#3. pND1 plazmid (Fab#2 Teški- (SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1)-dsvH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68]) - dsvL#3) [Plazmid i] je već bio dostupan. Fragment gena koji kodira dsHLscFv#3 izrezan je iz pND1 i stopljen sa lakim lancem # 2 kako je gore opisano kako bi se dobilo: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2]) - dsvH#3- (GGGGS- GGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68]) - dsvL#3 [Plazmid j]. Fab Fuzioni formati su klonirani u ekspresione vektore sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i sekvence SV40E poliA.

HEK293 ekspresija Fab-2xdsscFv#3

[0240] HEK293 ćelije su transfektovane sa odgovarajućim plazmidima pomoću Invitrogen reagensa za transfekciju 293fectin prema uputstvima proizvođača. Plazmidi su pomešani kako je prikazano u Tabeli 10 da bi se eksprimirao protein:

[0241] Odnos plazmida korišćenih za transfekcije je bio 1:1. Ukupno 50 µg plazmidne DNK je inkubirano sa 125 µl 293fectin 4.25 ml Optimem medijuma tokom 20 minuta na ST. Smeša je zatim dodata u 50 ml HEK293 ćelija u suspenziji pri 1 x 106 ćelija/ml i inkubirana uz mućkanje na 37 °C. Supernatanti su sakupljeni na dan 10 centrifugiranjem na 1500g radi uklanjanja ćelija i supernatant je propušten kroz filter od 0.22 mm. Nivo ekspresije je određen pomoću Protein-G HPLC. Tabela 11 prikazuje rezultate protein-G HPLC testa. Nivo ekspresije bio je 20 µg/ml.

Prečišćavanje Fab-2xdsscFv#3 eksprimiranih u HEK293

[0242] Supernatanti ∼ 50 ml HEK293 su koncentrovani ∼ 25-tostruko do ∼ 2 ml pomoću centrifugalnih koncentratora sa prekidom molekulske mase od 30 kDa. Koncentrovani supernatanti su prečišćeni i dalje koncentrovani i pufer zamenjen u PBS pH 7.4 pomoću centrifugalnih koncentratora sa prekidom molekulske mase od 30 kDa.

SDS-PAGE analiza Protein-G prečišćenog, HEK293 eksprimiranog Fab-2xdsscFv#3.

[0243] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine 9.75 µl, u koju je dodato 3.75 µl 4xLDS pufera za uzorke i 1.5 µl 100 mM N-etilmaleimida (ne-redukovani uzorci) ili 1.5 µl 10x NuPAGE redukcionog sredstva (redukovani uzorci). Uzorci su vorteksovani, inkubirani na 70 °C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 o/min tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su naneti na 4-20% akrilamidni Tris/Glicin SDS gel i držani oko 100 minuta na konstantnom naponu od 125 V. Korišćena je lestvica molekularne težine SeeBluePlus2 (Life Technologies). Gelovi su obojeni Instant Blue protein stain (Expedeon) i obezbojeni destilovanom vodom. Očekivane veličine traka nakon redukujućeg i neredukujućeg SDS-PAGE su prikazane u Tabeli 12.

[0244] Očekivalo se da ne-redukujući gel pokaže traku na ∼ 100kDa, dok je očekivano da redukujući gel pokaže dublet na∼ 50kDa sa jednakim bojenjem u obe trake.

[0245] Redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali rasporede traka koji su ukazivali na to da su konstrukti pravilno eksprimirani i u pogledu položaja migracije i intenziteta bojenja sa dubletom na ~ 50kDa (Slika 4B), međutim, primećene su i neke dodatne manje vrste, verovatno zahvaljujući sub-optimalnoj šemi prečišćavanja, za razliku od standardne Protein G-posredovane metode prečišćavanja, koja se obično koristi za prečišćavanje Fab-a. Na neredukujućem gelu su uočeni disulfidno povezani multimeri (Slika 4A), koji nestaju u redukujućim uslovima (Slika 4B).

S200 SE-HPLC analiza prečišćenog, HEK293 eksprimiranog Fab-2xdsscFv#3

[0246] 10 µg prečišćenih uzoraka proteina (100 µl 0.1 mg/ml osnovni razblažen u PBS) je ubrizgano u Superdex 200 10/300 GL Tricorn kolonu (GE Healthcare) 3 dana nakon prečišćavanja i razvijeno sa izokratskim gradijentom PBS pH7.4 pri 1 ml/min, uz kontinuiranu detekciju pomoću apsorbance na 280 nm. Rezultati su prikazani na Slici 5. Kao što se može videti sa Slike 5, nakon prečišćavanja, Fab-2xdsscFv#3 format je bio 81% monomeran.

2

PRIMER 3: Fab-(HC)dsscFv-(LC)dsFv

Konstrukcija Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1(LC-vL povezani) plazmida za ekspresiju u ćelijama sisara

[0247] Fab#2 fuzioni proteini za ekspresiju Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dss-cFv # 3-(LC)dsFv#1(LC-vL vezani) (vidi Sliku 6), su napravljeni fuzijom dsscFv#1(dsvH-4kG4S-dsvL) ili dsvL#1 sa C-terminusom Km3 alotipa humanog kappa konstantnog regiona lakog lanca #2 pomoću fleksibilnog linkera SGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 69) da se generiše:

Laki#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 69])-dsscFv#1 [Plazmid b] i

Laki#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 69])-dsvL#1 [Plazmid c]; i

fuzijom HLdsscFv#3 (dsvH-4xG4S-dsvL) sa C-terminusom, γ1 izotipa humanog gama-1 CH1 konstantnog regiona teškog lanca#2 korišćenjem fleksibilnog linkera SGGGGSGGGGTGGGGS (SEK ID BR: 70) da se generiše:

Teški#2-(SGGGGSGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 70])-dsscFv#3 [Plazmid a].

[0248] Tačkaste mutacije (teški lanac G44C i laki lanac G100C) su uvedene u DNK sekvence na odabranim reziduama u okvirnom regionu vL#3, vH#3, vL#1 i vH#1 da bi se stvorila međulančana disulfidna veza između teškog i lakog lanca Fv#3 i Fv#1. Fab-fuzioni geni teškog i lakog lanca su klonirani u ekspresione vektore sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i SV40E poliA sekvence. Geni koji kodiraju:

Teški#2-(SGGGGSGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 70])-dsscFv#3 [Plazmid a] i

dsvH #1 slobodni domen [Plazmid d]

su proizvedeni hemijski i pojedinačno klonirani u ekspresione vektore sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i SV40E poliA sekvence.

Geni koji kodiraju dsscFv #1 i dsvL # 1 su proizvedeni hemijski i fuzionisani na C-terminal lakog lanca #2 da bi se stvorilo:

Laki#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 69])-dsscFv #1 [plazmid b] i

Laki#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 69])-dsvL#1 [plazmid c]

i celi konstrukti su klonirani u ekspresioni vektor sisara pod kontrolom promotera HCMV-MIE i SV40E poliA sekvence. HEK293 ekspresija sledećeg:

[0249] Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i

Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (LC-vL povezani)

HEK293 ćelije su transfektovane sa relevantnim plazmidima pomoću Invitrogen 293fectin reagensa za transfekciju u skladu sa uputstvima proizvođača. Plazmidi su pomešani kako sledi da bi se eksprimirali različiti konstrukti kao što je prikazano u donjoj Tabeli 13:

[0250] Za kombinaciju 2 plazmida odnos plazmida korišćenih za transfekcije su bili 1:1, dok je za kombinacije 3 plazmida odnos bio 1:1:1. Ukupno 50 µg plazmidne DNK je inkubirano sa 125 µl 293fectin 4.25 ml Optimem medijuma tokom 20 minuta na ST. Smeša je zatim dodata u 50 ml HEK293 ćelija u suspenziji, pri 1 x 106 ćelija/ml i inkubirana uz mućkanje na 37 °C. Supernatanti su sakupljeni na dan 10 centrifugiranjem na 1500 g da bi se uklonile ćelije, a supernatant je propušten kroz filter od 0.22 µm. Nivo ekspresije je određen pomoću Protein-G HPLC. Rezultati su prikazani u Tabeli 14. Kao što se može videti, nivoi ekspresije oba konstrukta bili su međusobno uporedivi (16-18 µg/ml). U literaturi su zabeleženi izveštaji da ekspresija Fv regiona kojima nedostaje ili linker između vL i vH

2

ili motiv dimerizacije koji bi vezao vL i vH imaju znatno niže nivoe ekspresije od povezanih Fvs. Iznenađujuće, ovo se ne ouočava u ovim podacima kada nije uočena značajna razlika između nivoa ekspresije svakog tipa konstrukata.

Proteinom-G prečišćeni HEK293 eksprimirani Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i Fab#2-(HC) dss-cFv#3-(LC)dsFv#1 (LC-vL vezani )

[0251] ∼ 50 ml HEK293 supernatanti su koncentrovani ∼ 25-tostruko do ∼ 2ml pomoću centrifugalnih koncentratora sa prekidom molekulske mase od 10kDa. Koncentrovani supernatanti su naneti na 1 ml HiTrap Protein-G FF kolonu (GE Healthcare) ekvilibrisanu u 20 mM fosfata, 40 mM NaCl pH7.4. Kolona je isprana sa 20mM fosfatom, 40mM NaCl pH7.4 i vezani materijal je eluiran sa 0.1M glicin/ HCl pH2.7. Pikovi elucije su prikupljeni i pH podešen na ∼ pH7.0 sa 2M Tris/HCl pH8.5. Elucije sa podešenim pH su koncentrovane i pufer zamenjen u PBS pH7.4 pomoću centrifugalnih koncentratora sa prekidom molekulske mase od 10 kDa.

SDS-PAGE analiza Protein G prečišćenih, HEK293 eksprimiranih Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC) dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (LC- vL vezani)

[0252] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine 9.75 µl, u koju je dodato 3.75 µl 4xLDS pufera za uzorke i 1.5 µl 100 mMN-etilmaleimida (ne-redukovani uzorci) ili 1.5 µl 10x NuPAGE redukujućeg agensa (redukovani uzorci). Uzorci su vorteksovani, inkubirani na 70 °C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 o/min tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su naneti na 4-20% akrilamidni Tris/Glicin SDS gel i držani oko 100 minuta na konstantnom naponu od 125 V. Korišćena je lestvica molekularne težine SeeBluePlus2 (Life Technologies). Gelovi su obojeni Instant Blue proteinskom bojom (Expedeon) i obezbojeni destilovanom vodom.

Rezultati su prikazani na Slici 6. Za Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1, je očekivano da ne-redukujući gel pokaže traku na ~100kDa, dok je očekivano da redukujući gel pokaže dublet na ∼ 50kDa sa približno jednakim obojenjem u obe trake. Za Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1(LC-vL vezani) je očekivano da ne-redukujući gel pokaže trake na ~100kDa, dok je očekivano da redukujući gel pokaže 3 trake pri ∼ 50, ∼ 36 i ∼ 13kDa sa bojenjem otprilike u odnosu 3:2:1 od gornje do donje trake.

[0253] Redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali rasporede traka koji su ukazivali na to da su konstrukti pravilno eksprimirani i u pogledu položaja migracije i intenziteta bojenja. Neredukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali značajne obrasce traka > 200 kDa za Fab-2xdsscFv koji su bili konzistentni sa multimerizacijom (Slika 6A, traka 2), ali je primećeno manje vrsta visoke molekulske težine u uzorku Fab-dsscFv-dsFv (Slika 6B, traka 2).

G3000 SE-HPLC analiza Proteinom-G prečišćenih, HEK293 eksprimiranih, Fab#2-(HC)dsscFv #3-(LC)dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1(LC-vL vezani)

[0254] Uzorci prečišćenog proteina od 10 µg (100 µl od 0.1 mg/ml osnovnog razblaženog u PBS) su ubrizgani u TSK Gel G3000SWXL, 7.8x300 mm, kolona (Tosoh) 3 dana posle prečišćavanja i razvijeni sa izokratskim gradijentom od 200mM fosfata pH7.0 pri 1ml/min. Detekcija signala je bila pomoću apsorbance na 280 nm.

Rezultati su prikazani na Slici 7. Nakon prečišćavanja Proteinom-G, Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (LC-vL vezani) je bio 91% monomeran, dok je Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 bio 30% monomeran. Poznato je da je dsscFv#1 posebno sklon multimerizaciji. S obzirom da se multimeri fizički pridružuju pomoću dscFv linkera (vL#1 ili vH#1 je uparen sa vH#1 ili vL#1 iz drugog polipeptidnog lanca), zamenom dsscFv#1 sa dsFv#1 (koji ne sadrži scFv linker), došlo je do značajnog povećanja procenta dobijenog monomera.

PRIMER 4 Biacore Afinitet i demonstracija simultanog vezivanja ciljnih antigena

[0255] Afiniteti vezivanja i kinetički parametri za interakcije Fab#2-(HC)dsHLscFv#3 (LC)dsHLscFv #4 su određeni pomoću rezonance površinskih plazmona (SPR) sprovedene na BIAcore T100 ili BIAcore 3000 pomoću CM5 senzorskih čipova (GE Healthcare Bio-Sciences AB) i HBS-EP (10mM HEPES (pH7.4), 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v surfaktanta P20) puferu za separaciju (engl. running buffer). Svi eksperimenti su izvedeni na 25 °C. Uzorci antitela su hvatani na površinu senzorskog čipa korišćenjem ili humanog Fa(ab')2-specifičnog kozjeg Fab (Jackson ImmunoResearch) ili sopstvenog, metodom kuće generisanog, anti-humanog CH1monoklonskog antitela. Kovalentna imobilizacija uhvaćenih antitela je postignuta standardnom hemijskom metodom kuplovanja amina do nivoa od 6000-7000 jedinica odgovora (RU). Antigen br. 2, br. 3 ili br.4 je titrisan odvojeno preko uhvaćenog antitela. Svaki ciklus ispitivanja se sastojao pre svega od uzimanja uzorka antitela pomoću injekcije 1 min, pre faze asocijacije koja se sastojala od injekcije antigena od 3 min, nakon čega je disocijacija praćena 10 min. Posle svakog ciklusa, površina za hvatanje je regenerisana sa 2x1

2

min injekcijama od 40 mM HC1, a zatim sa 5 mM NaOH tokom 30s. Korišćene brzine protoka su bile 10 µl min<-1>za hvatanje, 30 µl min<-1>za faze asocijacije i disocijacije i 10 µl min<-1>za regeneraciju. Kinetički parametri su određeni simultanim globalnim prilagođavanjem rezultujućih senzograma na standardni model vezivanja 1:1 korišćenjem softvera BIAcore T100 Evaluation v2.0.1 ili BIAcore 3000 BIAEvaluation v3.2. Rezultati su prikazani u Tabeli 15. Antitelo je pokazalo očekivane afinitete unutar pM - nM opsega za testirane antigene.

T b l 15

[0256] Potencijal Fab#2-(HC) dsHLscFv#3(LC) dsHLscFv#4 da se simultano vezuje za sva 3 antigena je procenjen hvatanjem tri-specifičnog antitela na senzorski čip preko imobilizovanog antihumanog IgG-F(ab')2. Svaki antigen ili mešani rastvor antigena #2, #3 i #4 je titrisan preko uhvaćenog antitela u injekcijama od 3 minuta. Odgovori vezivanja uočeni za nezavisne injekcije i kombinovani odgovori su prikazani u Tabeli 16. Odgovor vezivanja za kombinovani rastvor antigena #2/#3/#4 je bio ekvivalentan zbiru odgovora nezavisnih injekcija. Ovo potvrđuje da je Fab#2-(HC)dsHLscFv#3 (LC) dsHLscFv#4 sposoban da se istovremeno veže za sva 3 testirana antigena.

Primer 5 Poređenje prinosa monomera između Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0257] EXpiHEK ćelije su transfektovane sa odgovarajućim plazmidima pomoću postupaka elektroporacije u razmeri od 50 ml. Plazmidi su pomešani kako je prikazano u Tabeli 17 da bi se eksprimirao protein. Kulture su gajene u ekspresionom medijumu ExpiHEK i inkubirane na 37 °C sa 8% CO2pri 120 o/min tokom 16-18 sati, pre dodavanja pojačivača 1 i 2. Kulture su naknadno inkubirane još 4 dana na 37 °C. Supernatanti kultura su sakupljeni centrifugiranjem i sterilisani filterom od 0.22 µm. Titri ekspresije su izmereni pomoću Protein G GHPLC (Tabela 18).

Tabela 17:

2

Prečišćavanje Proteinom-G Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata eksprimiranih u EXPiHEK

[0258] Supernatanti su koncentrovani ∼ 25-tostruko na ∼ 2 ml pomoću centrifugalnih koncentratora sa prekidom molekulske mase od 10kDa. Koncentrovani supernatanti su prečišćeni pomoću Protein G HPLC upotrebom fosfatnog pufera pH 7.4. Vezani materijal je eluiran sa 0.1 M glicin/HCl pH2.7 i pH podešen na ∼ pH7.0 sa 2M Tris/HCl pH8.5. Eluirani materijal je koncentrovan pomoću koncentratora molekulske težine od 10 kDa i pufer je zamenjen u PBS. Prečišćeni protein je koncentrovan na ~ 4-5 mg/ml u PBS i čuvan na 4 °C.

SDS-PAGE analiza Proteinom-G prečišćenih, EKSPiHEK eksprimiranih Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata [0259] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine od 9.75 µl, u koju je dodat pufer za uzorke 3.75 µl 4xLDS i 1.5

2

µl 100 mM N-etilmaleimida (ne-redukovani uzorci) ili 1.5 µl 10x NuPAGE redukujućeg agensa (redukovani uzorci). Uzorci su vorteksovani, inkubirani na 70 °C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 o/min tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su naneti na 4-20% akrilamid Tris/Glicin SDS gel i držani oko 100 minuta na konstantnom naponu od 125 V. Korišćena je lestvica molekularne težine Seeblue2 (Life Technologies). Gelovi su obojeni Instant plavom proteinskom mrljom (Ekpedeon) i obojeni destilovanom vodom. Očekivane veličine traka nakon redukcionog i nereduktivnog SDS-PAGE su prikazane u Tabeli 19.

[0260] Za sve proteine se očekivalo da ne-redukujući gel pokaže traku na ∼ 100kDa, dok se za redukujuće gelove očekivalo da pokažu dublet na ∼ 50kDa sa jednakim obojenjem u obe trake.

Za sve proteine Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv, redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali rasporede traka koji su ukazivali na to da su konstrukti eksprimirani korektno i u pogledu položaja migracije i intenziteta bojenja sa dubletom na ~ 50kDa (Slika 10B, a). Dodatna gornja traka je konzistentna sa ne-redukovanim proteinima pune dužine (Slika 10B, b). Za sve proteine, neredukujući gel je pokazao traku na ~130 kDa, što ukazuje na protein pune dužine (Slika 10A, a). Trake na ~50 kDa na ne-redukujućem gelu (Slika 10A, b) mogu biti konzistentne sa nepotpunim formiranjem disulfidne veze između teškog i lakog lanca u Fab regionu.

G3000 SE-HPLC analiza Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0261] Prečišćeni proteini antitela pri ∼ 5 µg/ml su čuvani na 4 °C u PBS tokom 24 sata pre analize. Uzorci ekvivalentni koncentraciji od 25 µg su ubrizgani u TSK gel G3000SWXL, 7.8x300 mm, kolona (Tosoh) i razvijeni sa izokratskim gradijentom od 200 mM fosfata pH 7.0 pri 1 ml/min. Detekcija signala je bila sa apsorbancom na 280 nm. Rezultati su prikazani u Tabeli 20. Analiza je pokazala da su svi Fab-2xdsscFv proteini > 90% monomerni. S druge strane, otkrivena je veća pojava multimerizacije za sve Fab-2xscFv. Jasno je da su formati koji sadrže scFv sa Fv disulfidom više monomerni u poređenju sa scFv kojima nedostaje Fv disulfid. To ukazuje na prednost za korišćenje formata sa scFv koji sadrže Fv disulfide u pogledu odabira terapeutskuh molekula stabilnog kvaliteta, a takođe I svojstava koja bi bila korisna u procesu proizvodnje.

�

Claims

Patentni zahtevi:

1. Molekul multispecifičnog antitela koji sadrži ili se sastoji od:

a) polipeptidnog lanca formule (I):

VH-CH1-X-V1;

i

b) polipeptidnog lanca formule (II):

VL-CL-Y-V2;

gde:

VH predstavlja varijabilni domen teškog lanca;

X predstavlja vezu ili linker;

Y predstavlja vezu ili linker;

V1 predstavlja dsscFv;

VL predstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CL predstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2 predstavlja dsscFv

pri čemu svaki od VH/VL, V1 i V2 formira mesto vezivanja antigena, i

2. Molekul multispecifičnog antitela prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je serumski protein nosač izabran sa liste koju čine albumin, tiroksin-vezujući protein, transtiretin, α1-kiseli glikoprotein, transferin i fibrinogen, ili fragment bilo kojeg od njih.

3. Molekul multispecifičnog antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu serumski protein nosač je humani serum albumin i što pomenuti VH/VL ili V1 ili V2 koji imaju specifičnost za serumski protein nosač formiraju mesto vezivanja za albumin.

4. Molekul multispecifičnog antitela prema patentnom zahtevu 3, pri čemu mesto vezivanja za albumin sadrži SEK ID BR: 71 za CDRH1, SEK ID BR: 72 za CDRH2, SEK ID BR: 73 za CDRH3, SEK ID BR: 74 za CDRL1, SEK ID BR: 75 za CDRL2 i SEK ID BR: 76 za CDRL3; ili varijabilni domen teškog lanca izabran između SEK ID BR: 77 i SEK ID BR: 78 i varijabilni domen lakog lanca izabran između SEK ID BR: 79 i SEK ID BR: 80.

5. Molekul multispecifičnog antitela prema patentnom zahtevu 4, pri čemu su 6 CDR-a u SEK ID BR: 71 do SEK ID BR: 76, ili varijabilni domeni u SEK ID BR: 77 do SEK ID BR: 80 u položaju VH/VL ili V1 ili V2.

6. Molekul multispecifičnog antitela prema patentnom zahtevu 4 ili 5, pri čemu se varijabilni domen teškog lanca sekvence SEK ID BR: 78 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEK ID BR: 80 nalaze u položaju V2 i pri čemu je varijabilni domen lakog lanca ili varijabilni domen teškog lanca V2 vezan za Y, na primer kroz peptidnu vezu.

7. Molekul multispecifičnog antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu je molekul antitela sposoban da selektivno vezuje dva ili više različitih antigena od značaja.

8. Molekul multispecifičnog antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7, pri čemu su varijabilni domeni lakog i teškog lanca V1 i/ili varijabilni domeni lakog i teškog lanca V2 povezani disulfidnom vezom između dva inženjerisana cisteinska ostatka, pri čemu je položaj para cisteinskih ostataka VH44 i VL100 (numeracija prema Kabatu).

9. Molekul multispecifičnog antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 8, pri čemu X i/ili Y predstavljaju peptidni linker, na primer SEK ID BR: 1, 2, 69 i 70.

10. Polinukleotid koji kodira molekul multispecifičnog antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9.

11. Vektor koji sadrži polinukleotid definisan u patentnom zahtevu 10.

12.Ć elija doma ć in koja sadrži polinukleotid ili vektor iz patentnog zahteva 10 ili 11, respektivno.

13. Ć elija doma ć in koja sadrži dva vektora, prvi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira polipeptidni lanac formule (I) molekula multispecifičnog antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9, i drugi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira polipeptidni lanac formule (II) pomenutog molekula multispecifičnog antitela.

14. Postupak koji obuhvata ekspresiju molekula multispecifičnog antitela iz ć elije doma ć ina definisanog u patentnom zahtevu 12 ili patentnom zahtevu 13.

15. Farmaceutska kompozicija obuhvatajući molekul multispecifičnog antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9 i najmanje jedan ekcipijent.

16. Molekul multispecifičnog antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 15 za upotrebu u lečenju.

4